Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).
Abstract
Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren auf das Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp. Um die Belastung durch metastasierende Tumore im Gehirn zu verringern, müssen Lücken in grundlegenden und translationalen Kenntnissen behoben werden. Zu den größten Herausforderungen gehören ein Mangel an reproduzierbaren präklinischen Modellen und zugehörigen Werkzeugen. Dreidimensionale Modelle der Hirnmetastasierung können die relevanten molekularen und phänotypischen Daten liefern, die in Kombination mit speziellen Analysetools verwendet werden, um diesen Anforderungen gerecht zu werden. Darüber hinaus erzeugen Organ-on-a-Chip-Modelle von Patiententumorzellen, die die Hirnschranke des Blutes in die Mikroumgebung des Gehirns durchqueren, im Vergleich zu murinen Modellen schnell Ergebnisse und sind mit quantitativen Methoden interpretierbarer und somit für Tests mit hohem Durchsatz geeignet. Hier beschreiben und demonstrieren wir den Einsatz einer neuartigen 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische (mBBN), auf der mehrere Elemente der Nische über einen längeren Zeitraum (mehrere Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die Bilder mit einer innovativen konfokalen Tomographie-Technik rekonstruiert werden können; alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung (TME) in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und TME-Zell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Darüber hinaus zeigen wir, wie künstliche Intelligenz (KI) verwendet wird, um die intrinsischen phänotischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zur Metastasierung, zur Wirksamkeit therapeutischer Strategien und zur Rolle der TME in beiden zu beantworten.
Introduction
Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren zum Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp1,2. Eine Hauptfrage, die sich beim Studium der Krebsmetastasierung stellt, ist, wie Subklone aus der humoralen Umgebung des Blutkreislaufs in ein Organ wie das Gehirn3,4wandern. Diese Frage hat zu vielen Variationen von Migration, Invasion und Extravasation Assays geführt. Alle diese Methoden teilen den entscheidenden Schritt des Zählens oder Messens von Eigenschaften von Zellen, die sich als Reaktion auf einen Stimulus von einem Standort zum anderen bewegen. Die meisten migrationsfreundlichen Assays werden verwendet, um die zweidimensionale (2D) Migration von Krebszellen zu untersuchen. Diese haben eine Fülle von Wissen aufgeklärt; Sie rekapitulieren jedoch nicht den dreidimensionalen Charakter des in vivo-Systems, den andere Methoden5liefern können. Daher ist es notwendig, die Tumor-Mikroumgebung (TME) in dreidimensionalen (3D) Systemen zu untersuchen, aber die Analyseansätze für 3D-Strukturen sind begrenzt und oft inkonsistent.
Eines der beliebtesten 3D-Werkzeuge ist eine Boyden-Kammer, die aus einer Membran besteht, die an der Unterseite eines Brunnens aufgehängt ist und zwei verschiedene Bereiche trennt. Boyden führte den Test ein, um Leukozyten-Chemotaxis zu untersuchen4. Die unteren Bereiche können durch Chemie oder andere Mittel6,,7 variiert werden, um Zellen im oberen Bereich dazu zu bringen, in den unteren Bereich zu migrieren. Der häufigste Ansatz zur Quantifizierung der Anzahl der zellen, die migriert wurden, besteht darin, die Zellen von der Unterseite der Membran mithilfe einer Pufferlösung freizusetzen, sie zu lysieren und sie dann basierend auf der Menge des DNA-Gehalts in der Lösung7zu zählen. Dieser indirekte Ansatz ist aufgrund der Technikvariabilität anfällig für Bedienerfehler und das Verfahren zerstört Informationen über den Krebsphänotyp und die Mikroumgebung. Variationen des Boyden-Kammer-Assays beinhalten die Fixierung von Zugzellen, die auf der Membran verbleiben, liefert aber nur eine Anzahl von Zellen, die für die weitere Studie6,8,9nicht mehr lebensfähig sind.
Aufgrund der Einschränkungen der Boydenkammer und des Wachstums von Innovationen in der mikrofluidischen Gemeinschaft wurden Migrations-Assay-Chips entwickelt, die die Bewegung von Zellen als Reaktion auf einen Stimulus in eine Richtung anstatt drei10,11,12beobachten. Diese Migrationstests erleichtern die Kontrolle über Faktoren wie Strömung oder Einzelzelltrennung13,14, die eine bessere Interpretation der Ergebnisse ermöglichen; Ihr 2D-Format verliert jedoch unweigerlich einige dynamische Informationen. Jüngste Studien haben sich auf die Extravasation (d.h. die Bewegung von Zellen aus der Zirkulation in ein Gewebe, wie die Blut-Hirn-Schranke) in einer 3D-Umgebung14,15konzentriert. Der Extravasationsabstand in Gewebe und das Sondierungsverhalten, das an der zellulären Barriere/Membran auftritt, ist raffinierter als Messungen, die entweder mit der Boyden-Kammer oder einem 2D-Mikrofluid-Migrationsgerät16gewonnen wurden. Daher sind Geräte, die eine angemessene Bildgebung und Analyse der 3D-Extravasation ermöglichen, entscheidend, um diese ausgeklügelten Messungen zu erfassen, aber es fehlt in der Literatur.
Unabhängig von Migrationstests wurden robuste bildgebende Verfahren für die Magnetresonanztomographie (MRT) und Tomographie entwickelt, die gewebe im 3D-Raum17,18identifizieren und genau rekonstruieren können. Diese Techniken erfassen Bilder in Z-Stacks und Segmentteilen des Bildes basierend auf den Eigenschaften des Gewebes und konvertieren dann die segmentierten Bilder in dreidimensionale Netze19,20,21. Dies ermöglicht es Ärzten, in 3D einzelne Organe, Knochen und Gefäße zu visualisieren, um bei der chirurgischen Planung oder Hilfe bei der Diagnose von Krebs oder Herzerkrankungen zu helfen22,23. Hier zeigen wir, dass diese Ansätze für den Einsatz an mikroskopischen Proben und 3D-Extravasationsgeräten angepasst werden können.
Zu diesem Zweck haben wir die innovative konfokale Tomographie-Technik entwickelt, die hier vorgestellt wird und die Flexibilität bietet, die Extravasation von Tumorzellen über eine Membran zu untersuchen, indem bestehende Tomographie-Tools angepasst werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der gesamten Bandbreite des Verhaltens von Krebszellen, da sie mit einer zellulären Barriere interagieren, wie z. B. einer endotheliaalen Zellschicht. Krebszellen zeigen Sondierungsverhalten; einige können eindringen, bleiben aber in der Nähe der Membran, während andere die Barriere leicht durchqueren. Diese Technik ist in der Lage, Informationen über den Phänotyp der Zelle in allen Dimensionen24zu liefern. Mit diesem Ansatz zur Untersuchung der TME ist sowohl relativ kostengünstig, leicht zu interpretieren und reproduzierbar, im Vergleich zu komplexeren in vivo murinen Modellen. Die vorgestellte Methodik sollte eine starke Grundlage für die Untersuchung vieler Arten von Tumoren und Mikroumgebungen bieten, indem die Stromregion angepasst wird.
Wir beschreiben und demonstrieren die Verwendung einer 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische(MBBN)Plattform ( Abbildung 1 ), in der kritische Elemente der Barriere und Nische (mikrovaskuläre Endkörperzellen und Astrozyten des Gehirns) über einen längeren Zeitraum (ca. bis zu 9 Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die mit unserer konfokalen Tomographie rekonstruierten Bilder rekonstruiert werden können ( Abbildung2); alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Die Schnittstelle zur Blut-Hirn-Schranke mit der Gehirnnische besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, die durch Kellermembran, Astrozytenfüße und Pericyten25verstärkt werden. Wir konzentrierten uns selektiv auf die Astrozyten- und Endothelkomponenten, da sie für die Bildung und Regulierung der Blut-Hirn-Schranke wichtig sind. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und tumormikro-Umweltzell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Schließlich zeigen wir, wie maschinelles Lernen genutzt werden kann, um die intrinsischen phänotypischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen24. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zu Metastasen, therapeutischen Strategien und der Rolle der TME in beiden zu beantworten.
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Protocol
1. Bereiten Sie die Blut-Hirn-Schranke Nischenform
HINWEIS: Das Kultivierungsgerät, das auf dieser Plattform verwendet wird, ist ein PDMS-basiertes Gerüst, auf dem wir eine zelluläre Blut-Hirn-Barriere-Nische aufbauen. Es besteht aus zwei Teilen, die durch eine poröse Membran getrennt sind. Zur Vorbereitung der Blut-Hirn-Schranke Nische zwei SU-8 Formen mit Photolithographie gemacht sind notwendig26,27. Das Protokoll wird zuerst für die 100 m dicke Form beschrieben und dann werden Hinweise für die 200 m dicke Form gegeben.
- Um die Form vorzubereiten, reinigen Sie einen 4" Silizium-Wafer mit Aceton mit einer Squeeze-Flasche und trocknen Sie ihn dann mit einer Stickstoffpistole.
- Backen Sie den Siliziumwafer auf einer Kochplatte für 10 min bei 200 °C, um alle Restlösungsmittel zu entfernen.
- Zentrieren Sie den Siliziumwafer wiederum auf das Futter eines Spincoaters und geben Sie 1 ml SU8-2075 für die obere Form aus. Drehen Sie 5 s bei 500 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um den Photoresist zu zerstreuen, und dann 30 s bei 2200 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um eine 100 m dicke SU-8-Beschichtung zu erhalten. Eine Optimierung kann erforderlich sein, um die angegebene Dicke zu erreichen.
- Den Wafer bei 65 °C für 2 min weich backen und dann sofort bei 98 °C für 20 min.
- Legen Sie den Wafer in eine Photolithographielampe und positionieren Sie die Maske nach Standardverfahren zentriert auf den Wafer. Setzen Sie die SU-8 beschichteten Wafer mit einer Ausstrahlung von 230 mJ/cm2 UVB (360 nm ± 10 nm) aus. Ein Expositionsmatrix-Experiment kann durchgeführt werden, um die optimale Dosierung zu bestimmen. Maskendesigns sind in der Zusatzdatei 1verfügbar.
- Führen Sie ein Backen nach der Exposition bei 65 °C für 2 min und dann sofort bei 98 °C für 10 min, um die Haftung zu verbessern. Den Wafer auf 50 °C abkühlen.
- Entfernen Sie den nicht belichteten Widerstand mit SU-8 Photo-Developer. Spülen Sie den Wafer im Entwickler für 5 min in einem Bad und dann verwenden Sie eine Sprühflasche mit SU-8 Entwickler in einer chemischen Haube gefüllt, um zu agitieren und zu entfernen verbleibende ungeheilt SU-8. Mit einem 4-fachen Mikroskop kann beobachtet werden, ob alle ungehärteten SU-8 entfernt wurden. Eine weiße Linie an den Rändern der Photoresist-Features zeigt an, dass die SU-8 nicht vollständig entfernt wurde.
- Führen Sie ein letztes hartes Backen im Ofen bei 110 °C für 60 min.
- Befolgen Sie das gleiche Verfahren für die 200 m dicke Form mit SU-8 2075, passen Sie das Protokoll jedoch wie folgt an:
- Spin-Coater-Einstellungen: Drehen Sie für 5 s bei 500 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um den Photoresist zu zerstreuen, und dann 30 s bei 1300 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um eine 200 m dicke Beschichtung zu erhalten.
- Weich backen bei 65 °C für 2 min dann bei 98 °C für 40 min.
- Belichtungszeit von 340 mJ/cm2.
- Nach der Belichtung backen: 2 min bei 65 °C und dann 98 °C für 15 min.
- Schließlich silanisieren Sie jeden Wafer, indem Sie ihn in eine Vakuumkammer innerhalb einer chemischen Haube mit einem Kunststoffbehälter legen, in dem 3 Tropfen (150 l) Silanisierlösung (Trichloro perfluoroctylsilan) platziert wurden. Ziehen Sie ein Vakuum und lassen Sie über Nacht, damit der Dampf den Wafer zu beschichten. Dieser Schritt reduziert die Haftung zwischen SU-8 und PDMS und erhöht die Lebensdauer der Form.
VORSICHT: Trichlorperfluoroctylsilan sollte immer in der Dunstabzugshaube behandelt und von Wasserquellen ferngehalten werden. - Legen Sie einzelne Waferformen in 150 mm Petrischalen mit zwei Streifen doppelseitigem Klebeband. Stellen Sie sicher, dass die Wafer flach sind. Eine Alternative ist die Herstellung einer Aluminiumform, in der der Wafer platziert werden kann. Da die Aluminiumform eingeschlossen ist, wird sie Gussteile mit einer gleichmäßigen Dicke produzieren, während die Petrischale-Methode empfindlich auf die Neigung der Oberfläche reagiert. Die verbesserte Ebenheit der PDMS-Gussteile reduziert die nachgeschaltete konfokale Bildgebungszeit.
2. Form und Montage des PDMS Blut-Hirn-Schranke (BBB) Gerät
- Mischen Sie 75 g PDMS im Verhältnis 1:10 (Crosslinker:Base) nach Gewicht in einem Kunststoffbecher.
- Gießen Sie das PDMS über die Formen (1 mm dick für die 200 m dicke Form und 4 mm für die 100 m dicke Form) und entgasen Sie in einem Vakuum-Austauchgerät für eine Stunde oder bis alle Blasen entfernt sind. Über Nacht in einen 65 °C-Ofen stellen. Die 1 mm Dicke kann auf basis des Arbeitsabstandes des 10-fachen Objektivs im Konfokalmikroskop eingestellt werden.
- Nachdem das PDMS ausgehärtet ist, verwenden Sie eine Klinge, um sanft gegen den Wafer durch das PDMS um die Kanten zu schneiden. Schälen Sie das PDMS ab und schneiden Sie mit einer Klinge entlang der rechteckigen Führungen und einem 1,5 mm Biopsiespunsch die Ein- und Auslässe am Gerät. Bedecken Sie die PDMS-Geräteteile mit einem 48 mm breiten Verpackungsband, um sie vor Staub und Schmutz zu schützen.
- Als nächstes verwenden Sie Sezierschere, um ein 5 mm x 50 mm Rechteck aus Polycarbonat-Membran mit 5 m Poren zu schneiden und sie in einer Petrischale für den späteren Gebrauch zu speichern.
- Sammeln Sie folgendes: 200 l Pipettenspitze, 2 ml 1:10 PDMS gemischt mit Toluin im Verhältnis 2:3 Gewicht in einer Glasdurchstechflasche, eine Pasteur Pipette mit einer Quetschung, die vorbereiteten PDMS Ober- und Unterteile, die Membran, drei 50 mm x 75 mm Glasrutschen und transportieren sie alle zu einem Spincoater. Die folgenden Schritte für die Montage und Zellaussaat des Geräts sind in Abbildung 1dargestellt.
- Verwenden Sie die Pasteur-Pipette, um 1 ml PDMS:Toluen-Kleberlösung in einen 50 mm x 75 mm Glasschlitten auf dem Spannfutter des Spincoaters zu übertragen. Drehen Sie für 5 Sekunden bei 100 U/min (Beschleunigung 300 U/min) und 30 Sekunden bei 2000 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s).
- Legen Sie die Folie auf einen Tisch und bedecken Sie sie mit einer PDMS-Oberkammer und einer unteren Kammer, so dass die PDMS-Flächen mit in sie eingegossenen Features die Folie kontaktieren und der Kleber auf die PDMS-Fläche übertragen wird, wobei der Umfang aller Features umrissen wird.
- Drehen Sie die PDMS-Oberkammer auf einen anderen Schlitten mit der Nachoben-Kleberbeschichtung und legen Sie die Membran vorsichtig zwischen den Ein- und Auslässen über das Gerät. Legen Sie die 200-L-Spitze in die PDMS:Tolumol-Kleberlösung, bis sie etwas in die Spitze eingelassen hat. Berühren Sie die Spitze zwischen jedem Ein- und Auslass, um einen kleinen Tropfen in der Nähe des Membranrandes zu platzieren, wo er das PDMS berührt.
- Entfernen Sie die andere Hälfte des Geräts und legen Sie es mit der Leimbeschichtung nach unten, während Sie die Ein- und Auslässe auf den beiden Teilen ausrichten.
- Legen Sie das montierte Gerät über Nacht bei 37 °C in einen Ofen, um den Kleber auszuhärten. In ein Vakuumglockenglas mit Trockenmittel geben und zwei Tage dehydrieren lassen. Dies ist ein entscheidender Schritt, um das Toluin verdampfen zu lassen und die Konsistenz der Aussaat des Geräts zu verbessern, indem der absorbierte Wasserdampf in der Laborluft reguliert wird.
3. Seed das Gehirn Mikro-Umgebung in das Gerät
- Zellkultur und Reagenzien: Bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen, erhalten Sie die folgenden Reagenzien und Zellen. Kultivieren Sie alle Zelllinien in einem Inkubator, der bei 37 °C in 5%CO2eingestellt ist.
- Bewahren Sie menschliche dreifach-negative Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) und MDA-MB-231-BR-GFP-Zellen (erhalten von Patricia Steeg, PhD) in DMEM mit 4,5 g/L Glukose, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 10% FBS und 1x Antimykotik. Erstellen Sie MDA-MB-231-GFP-Leuchtstoffzellen, indem Sie mDA-MB-231-Zellen mit leerem Vektor pLL-EV-GFP lentivirus transduzieren. Sortieren Sie die transduzierte GFP+ Population mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) vor dem Experimentieren.
- Pflege der mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns hCMEC/D3 in EGM-2-Medium. Erstellen Sie hCMEC/D3-DsRed Fluoreszenzzellen, indem Sie hCMEC/D3 mit leerem Vektor pLL-3.7-dsRed lentivirus transduzieren. Entfernen Sie alle nicht transducierten, nicht fluoreszierenden Zellen aus der Kultur mit FACS vor der experimentellen Anwendung.
- Pflegen Sie normale menschliche Astrozyten (NHA) in DMEM, ergänzt mit 4,5 g/L Glukose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM Natriumpyruvat, 1x N-2 Wachstumsergänzung und 1x Antimykotik. Verewigen Sie die Astrozyten, indem Sie den pLOX-TERT-iresTK lentiviralen Vektor transduzieren (Addgene 12245). Erstellen Sie den Vektor mit Plasmid psPAX2 und Hüllkurvenplasmid pMD2.G (Addgene 12260 und 12259).
- Entfernen Sie ein Gerät aus dem Vakuum-Desiccator und legen Sie es mit nach unten gerichteten Einlässe auf eine Metall- oder Papieroberfläche (d. h. Klebeband) und legen Sie es in eine Plasmakammer. Legen Sie auch einen 50 mm x 75 mm Glasschlitten in die Plasmakammer. Ziehen Sie ein Vakuum und behandeln Sie dann mit Plasma bei 80 W für 30 s.
- Entfernen Sie schnell die Glasrutsche und das Gerät aus der Plasmakammer und legen Sie das Gerät mit den Einlässe nach oben auf den Glasschlitten ausgerichtet mit einer Führung (Ergänzungsdatei 2). Dadurch entsteht eine dauerhafte Verbindung zwischen PDMS und Glasrutsche und kann nicht neu positioniert werden.
- Als nächstes schneiden Sie die Spitzen von 16, 200 l Pipettenspitzen, 2 mm von der Spitze. Legen Sie die Pipettenspitzen in alle Ein- und Auslässe ein. Das Gerät kann an dieser Stelle wieder in den Vakuum-Austrocknungsor gelegt werden, wenn es nicht bereit ist, die Zellen auszusäen.
- Legen Sie das Gerät wieder in die Plasmakammer und behandeln Sie es mit Plasma für 8 min bei 200 W. Nachdem das Gerät abgekühlt ist (5 min) von der Plasmabehandlung, legen Sie es in einen sterilen Sekundärbehälter, wie eine transparente Pipettenspitzenbox. Führen Sie den nächsten Schritt innerhalb von 15 min oder die Wirksamkeit der Plasmabehandlung kann reduziert werden, was zu Verstopfung.
- Einige Tage vor der Experimentierkultur Petrischalen von 1 x 106 Endothelzellen (hCMEC/D3-DsRed) und 1 x 106 Astrozyten (NHA). Während der 8-min-Plasmabehandlung bereitet das Gerät eine Kollagenlösung vor, die aus 0,5 ml 3 mg/ml PureCol Typ I Rinderkollagen mit 64 l mit 0,8 m NaHCO3 und 20 l 10x hochglukosem (250 mM) MEM besteht. 5,0 x 105 NHA-Zellen in der Kollagenlösung suspendieren. Bewahren Sie die Lösung auf Eis auf, während sie nicht verwendet wird.
- Übertragen Sie 120 l der Kollagen-/Astrozyten-/Mikroglialösung durch die Pipettenspitze für die untere Kammer in das Gerät(Abbildung 1 Rote Pfeile). Lassen Sie die Lösung über die Kammer in die gegenüberliegende Pipettespitze leiten. Nachdem alle vier Kanäle des Gerätes gefüllt sind, legen Sie den Chip imCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 1 h oder bis das Kollagen gesetzt ist.
- Nach den Kollagen-Sets alle Pipettenspitzen füllen, die die Bodenkammer mit einer Mischung aus kompletten Medien füttern. Für Chips, die Endothelzellen und Astrozyten enthalten, wird eine 50:50-Mischung aus endothelialen: Astrozytenmedien verwendet.
- Beschichten Sie die obere Kammer mit 2% Wachstumsfaktor reduziert Matrigel in kompletten endothelialen Medien mit der oberen Kammer Pipettenspitze (Abbildung 1 Blaue Pfeile) und legen Sie in den Inkubator für 1 Stunde.
- Spülen Sie die obere Kammer mit der angegebenen Medienmischung und alternative, welche Spitze mit Endothelzellen gesät wird (Abbildung 1 Grüne Pfeile). 1 x 106 Endothelzellen in 1 ml Endothelmedien und Samen 30 l alle 15 min in abwechselnde obere Kammerspitzen für eine gleichmäßige Abdeckung aussetzen. Samen-Endothelzellen in jede obere Kammerspitze zweimal, für insgesamt 4 mal pro Kammer.
- Nach der endgültigen Aussaat der Endothelzellen alle Spitzen mit der Medienmischung füllen und das Gerät bei 37 °C und 5%CO2im Inkubator platzieren, das alle 12 stunden in beiden Kammern wechselt.
4. Überwachung des Fortschreitens der endotheliaalen Schichtbildung
- Die vollständige Abdeckung des Kanals durch die Endothelschicht wird nach 3 Tagen beobachtet. Verwenden Sie eine von zwei Methoden, um die Abdeckung der Endothelbarriere zu überwachen: Fluoreszenz oder TEER. Die hCMEC/D3-DsRed Fluoreszenz und entsprechend % Abdeckung über den Kanalbereich kann mit ImageJ quantifiziert werden.
- Öffnen Sie die TIFF-Datei in ImageJ-Vertreter der hCMEC/D3-DsRed-Barriere. Klicken Sie in der ImageJ-Software auf Datei > Öffnen, um die Datei auszuwählen.
- Führen Sie alle Z-Ebenen des Bildes mit der maximalen Intensität nach folgenden Tastenbefehlen und Optionen zusammen: Bild > Stapel > Z-Projekt > Alle Z-Slices, Maximale Intensität.
- Führen Sie einen Farbschwellenwert aus, der für alle mikrofluidischen Chips gleich ist, die mit dieser Methode bewertet werden. Für die vorgestellte Studie haben wir einen Schwellenwert von 450 verwendet. Verwenden Sie das Schwellenwertmenü in ImageJ unter: Bild > Anpassen > Schwellenwert.
- Legen Sie die zu erfassenden Messungen mit den folgenden Befehlen und Optionen fest: Analysieren > Messungen > Grenzwert auf Schwellenwert, Flächenfraktion.
- Wählen Sie einen repräsentativen Bereich des mikrofluidischen Kanals aus, der gemessen werden soll, indem Sie ein Feld zeichnen. Das Box-Tool befindet sich im Hauptmenü von ImageJ. Messen Sie 3 technische Replikationen, die am Anfang, in der Mitte und am Ende jedes mikrofluidischen Kanals mit der gleichen Boxgröße positioniert sind.
- Analysieren Sie jeden Kanal, und zeichnen Sie den Flächenanteil auf, der die % endotheliale Abdeckung darstellt. Exportieren Sie diese Messungen als Tabellenkalkulationsdateien, um die Daten mit den folgenden Befehlen zu zeichnen und zu visualisieren: Analysieren > Messen.
- Alternativ können Sie TEER auf Impedanzspektroskopie-basierter TEER verwenden, um endotheliale enge Knoten pro Fläche zu messen. Die Quantifizierung der Endothelbarriere mit TEER ist ein Proxy für die Integrität der Endothelschicht als Barriere.
- Positionieren Sie zwei Elektroden im Ein- und Auslass der oberen und unteren Kammern.
- Quantifizieren Sie die Impedanz der endothelialen Monoschicht als Kombination der Widerstände, Induktivitäten und Kapazitäten im Chip nach einem Modell, das von Srinivasan etal. 28,29vorgeschlagen wurde.
5. Samen krebszellen in das Gerät
- Nachdem die Endothelschicht gereift ist, samen Krebszellen in das Gerät. Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 x 106 Krebszellen in kompletten Krebszellmedien vor.
- Tauschen Sie die Medien im Chip aus, um die Zellkulturnährstoffe aufzufüllen.
- Säen Sie jeden oberen Kammerkanal mit 30 l Krebszellen in Suspension und legen Sie das Gerät dann für 15 min wieder in den Inkubator. Säen Sie die Krebszellen immer auf der gleichen Seite aller vier oberen Kammerkanäle in einem einzigen Gerät.
- Tauschen Sie das Gerät mit neuen Medien aus, und füllen Sie die Tipps alle 12 Stunden auf, bis das Gerät für das metastasierende Verhalten ababgebildet wird.
6. Stellen Sie sich die Tumor-Mikroumgebung durch konfokale Bildgebung vor
- Verwenden Sie zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt (1, 2 oder 9 Tage) konfokale Bildgebung, um ein 3D-Bild des Kanals zu erfassen. Diesen Schritt führen wir auf einer Nikon A1 mit den hier beschriebenen Einstellungen aus. Dieser Schritt ist automatisiert, und jeder Kanal benötigt 20-40 min, um abzubilden, je nachdem, wie viele fluoreszierende Kanäle enthalten sind und die Z-Tiefe benötigt wird, um die Positionen aller Zellen abzudecken.
- Schalten Sie das Mikroskop ein, öffnen Sie die Software und legen Sie die Inkubatorabdeckung auf das Mikroskop.
- Stellen Sie die Mikroskop-Stufenheizung auf 37 °C und CO2 bis 5%, falls verfügbar.
- Nachdem sich der Mikroskop-Inkubator stabilisiert hat, legen Sie das Gerät mit der 50 mm x 75 mm Halterung in die Mikroskopstufe.
- Konzentrieren Sie sich auf eine Seite des Geräts (links, wenn sie mit der mitgelieferten Analysesoftware verwendet werden soll) mit einem 10-fachen Objektiv und legen Sie die Z-Höhe auf Null fest. Unter den Z-Stack-Einstellungen wird ein Bereich von 100 m über und 200 m unterhalb der Fokusebene enthalten. Verwenden Sie dann die Sticheinstellung, um die Anzahl der X- und Y-Felder auf 1 bzw. 9 mit 15 % Überlappung festzulegen. Stellen Sie das Loch auf das empfohlene Minimum und die Z-Schicht-Höhe auf 9 m fest. Passen Sie die Helle Feldbelichtung so an, dass die poröse Membran sichtbar ist. Schalten Sie die Anregungslaser für die Kanäle dsRed (561 nm) und GFP (488 nm) ein und passen Sie die fluoreszierenden Laserleistungen und Cutoffs so an, dass jeder Kanal sichtbar ist, ohne die Pixel zu überblonen.
- Überprüfen Sie, ob alle Felder im Fokus stehen, wenn Sie überschritten werden. Wenn dies der Fall ist, geben Sie einen Ausgabedateinamen (001.nd2) für das Bild ein, und starten Sie das Experiment, um das konfokale 3D-Bild automatisch zu erfassen.
7. Messung der Tumormikroumgebung mittels konfokaler Tomographie
- Verwenden Sie die konfokale Tomographie, um eine Reihe von Metriken und Messungen zu schätzen, die die einzelnen Zellen und die Tumor-Mikroumgebung innerhalb des Geräts beschreiben. Die konfokale tomographische Analyse (Abbildung 2) wandelt einen konfokalen Z-Stack in eine dreidimensionale Darstellung der Zellen um. Mithilfe eines benutzerdefinierten Python-Skripts in der Jupyter-Notebook-/Laborumgebung wird dann eine Ebene mit der Zellschicht abgeglichen, die die Blut-Hirn-Schranke wie Membran30bilden. Schließlich machen Sie phänotyptische Messungen der Krebszellpopulationen (Tabelle 1).
- Führen Sie diese Analyse am Ende eines Experiments oder über einen Zeitverlauf aus. Installieren Sie python und die entsprechenden Bibliotheken gemäß dem referenzierten Softwarehandbuch, und öffnen Sie dann die Software von Windows Command Prompt, indem Sie den Befehl "conda activate" ausführen, gefolgt von "jupyter lab". Die Jupyter-Umgebung wird innerhalb des Standardbrowsers geladen.
- Doppelklicken Sie im Jupyter-Datei-Explorer auf das Jupyter-Notizbuch "contom.ipynb", um es zu öffnen. Führen Sie die Zelle unter dem Titel Bibliotheken importieren, benutzerdefinierte Klassen/Funktionen und richten Sie das Notizbuch ein, indem Sie auf die Notizbuchzelle und dann auf die Wiedergabeschaltfläche klicken. Alle folgenden Notizbuchzellen werden nach demselben Ansatz ausgeführt. Beachten Sie, dass sich hier Notizbuch "Zelle" auf einen Block von Python-Code innerhalb des Jupyter-Notebooks bezieht.
- Bereiten Sie die Daten vor. Dieser Algorithmus verwendet das Visualisierungs-Toolkit (VTK), um den Z-Stack und dreidimensionale Daten17zu manipulieren und anzuzeigen.
- Platzieren Sie die bereitgestellte . XLSX-Datei ("Experiment Tracker.xlsx") im gleichen Windows-Ordner wie das Jupyter-Notebook. Die Datei verfolgt Experimente und Schnittstellen mit dem Jupyter-Notebook. Platzieren Sie die ND2-Datei aus Abschnitt 6 in einem Unterordner mit dem Namen "-Experiment_XXX-Konfokal"" unterhalb des Standorts des Jupyter-Notizbuchs. Zusätzliche Experimentordner können innerhalb hinzugefügt werden, indem Sie die "XXX" an die numerische ID anpassen, die neuen Ordnern zugewiesen ist.
- Beschriften Sie den ersten Experimentordner "Experiment_001" und die ND2-Datei "001.nd2". Konvertieren Sie zunächst die ND2-Bildgebungsdatei in eine genähte TIFF-Datei mit mehreren Bildern, die durch den Farbkanal getrennt ist. Führen Sie die Notizbuchzelle unter dem Titel "Lesen Sie den konfokalen z-Stack in den Speicher" mit der Save_tiff_from_ND2 () Funktion unkommentiert30aus. Die ND2-Datei ist ein proprietäres Imaging-Format von Nikon, daher ist es notwendig, es in ein Format zu konvertieren, mit dem Open-Source-Software kompatibel ist.
HINWEIS: Das TIFF (Tag Image File Format) wird verwendet, weil es allgegenwärtig ist, 16 Bit kompatibel, leicht in VTK importiert werden kann und mehrere Bilder in einer einzigen Datei gespeichert werden können, was für Z-Stack-Images geeignet ist. Durch Ausführen der Notizbuchzelle wird ein Bild aus der ND2-Datei gelesen, Informationen der Farbe extrahiert und XYZ-Positionen speichern Sie dieses Bild dann in einem numpy Array gemäß einer vorgegebenen Struktur. Anschließend wird das Array als TIFF-Datei mit der Python-Bibliothek tifffile gespeichert.
- Konvertieren von Bilddaten in 3D-Modell
- Importieren Sie die TIFF-Datei mithilfe eines 3D-Renderings in VTK (vtkTIFFReader), um die Zellen zu visualisieren (Abbildung 2). Wählen Sie einen Schwellenwert basierend auf der Farbe der Zellen im Bild aus. Zur Verdeutlichung stellt das VTK-Objekt einen Pixelblock (X, Y, Z) im Raum (Volumen) dar, aber nur bestimmte Pixel (grün oder rot) stellen Zellen dar, der Rest sind Hintergrund oder Rauschen (schwarz).
- Legen Sie daher einen Opazitätsfilter auf das Volume fest, der den Hintergrund entfernt, um zu bestätigen, dass nur die Zellen übrig bleiben, was die Fluoreszenz übrig bleibt. Verwenden Sie dazu die Jupyter-Notebookzelle mit dem Titel "Opazitätswerte für jeden Mikroskopkanal ändern", indem Sie die Channel_alpha Wertvariablen (d. h. GFP_alpha) anpassen. Visualisieren Sie den Effekt mithilfe der Notizbuchzelle View a 3D rendering, um zu überprüfen, ob der Schwellenwert korrekt festgelegt ist.
- Speichern Sie die Deckkraftwerte in der Kalkulationstabelle, die im nächsten Schritt verwendet werden sollen. Konvertieren Sie die Volumendaten in einzelne 3D-Objekte, die jeweils eine Zelle im Bild darstellen, indem Sie eine Technik namens Marschwürfel31verwenden. Dieser Algorithmus extrahiert ein polygonales Netz einer Isooberfläche aus dreidimensionalen diskreten Skalarfeldern von Voxeln.
- Verwenden Sie den Deckkraftwert im Marching Cubes-Algorithmus, um jede Zelle vom Hintergrund zu trennen. Führen Sie diesen Schritt für alle fluoreszierenden Zellen aus, die in jedem Mikroskopkanal identifiziert werden, indem Sie Voxelbild in ein dreieckiges Netz konvertieren und als VTK-Datei im Notizbuch speichern.
- Einbau einer Ebene an die Membran
- Passen Sie eine Ebene an die Endothelbarriere an, indem Sie zuerst die Zellzentroide lokalisieren (Notebook-Zelle: Analysieren Sie den RFP-Kanal (Endothelbarriere)). Durchlaufen der Listennetze im Volume und Extrahieren der Regionen, die nicht über einen PolyDataConnectivityFilter verbunden sind, aus VTK. Berechnen Sie den Schwerpunkt jedes Netzes, und fügen Sie die Messung einer Liste von Zentroiden hinzu, die nach Netzen filtern, die zu groß oder zu klein sind (<50, >1000000 Voxel).
- Passen Sie eine Ebene an die Liste der Zentroide für die Endothelzellen mit einer Minimierung der Fehlermethode an (Notebook-Zelle: Anpassen einer Ebene an die RFP-Zentroide (Endothelbarriere)) ( Abbildung2, Abbildung 3)32. Überprüfen Sie die Passung der Ebene, indem Sie die Ebene und die Zentroide zeichnen, und passen Sie sie bei Bedarf manuell an (mit Theta, Beta und z), indem Sie die Notizbuchzelle mit dem Titel Visualize RFP-Zentroide und Ebenenanpassungausführen.
- Nachdem das Flugzeug ordnungsgemäß montiert wurde, speichern Sie die Normale des Flugzeugs in der Experiment Tracker-Datei . XLSX-Datei für die zukünftige Verwendung.
- Analysieren Sie die beschreibenden Merkmale einzelner Krebszellen für die folgenden Deskriptoren (Tabelle 1).
HINWEIS: Wenn der Computer, der die Analyse durchführt, verzögert, ist eine Analyse mit hohem Durchsatz über Hochleistungsrechnen eine Option. Dieser Algorithmus ist auf Standard-Laptops für die Analyse einer kleinen Anzahl von Zellen nützlich, vtK ist jedoch nicht gut für eine große Anzahl von einzelkundigen Objekten geeignet (>1000). Daher ist es optional, den angepassten Algorithmus zu verwenden, um auf einem Hochleistungs-Computing-Cluster zu funktionieren. Dies ermöglicht eine schnelle Analyse von Experimenten mit vielen Zellen (Abbildung 2). Alle 7.5 wird durch Ausführen der Notebook-Zellen mit dem Titel Analysieren Sie die verbleibenden Mikroskopkanäle für phänotypische Deskriptoren und Lesen Sie in der Experiment_tracker Informationen und analysieren Sie die Kanäle, die vorhanden sind.- Messen Sie die Extravasation der Krebszellen: Messen Sie nach der Charakterisierung der Endothelschicht mit einer Ebene das Volumen jeder Krebszelle, die durch die Membran gewandert ist. Schneiden Sie jede Zelle (boolesch), so dass das Netz unter der Membran gehalten wird und der Teil über der Membran entfernt wird33. Schließen Sie dann das offene Netz (vtkFillHoles).
- Berechnen Sie den normalen und den neuen Schwerpunkt des abgeschnittenen Netzes neu. Messen Sie das Volumen und die Position jeder abgeschnittenen Krebszelle für die Analyse. Das Volumen entspricht der Anzahl der Voxel, die die Netzfüllungen jeder einzelnen Zelle ausfüllen. Berechnen Sie den Abstand zwischen der Endothelebene und der Position jeder Krebszelle.
- Messen Sie den zellulären Phänotyp: Berechnen Sie die Morphologie jeder Krebszelle, indem Sie ihre Form, ihr Volumen und ihre Position berücksichtigen.
- Messen Sie die Extravasation der Krebszellen: Messen Sie nach der Charakterisierung der Endothelschicht mit einer Ebene das Volumen jeder Krebszelle, die durch die Membran gewandert ist. Schneiden Sie jede Zelle (boolesch), so dass das Netz unter der Membran gehalten wird und der Teil über der Membran entfernt wird33. Schließen Sie dann das offene Netz (vtkFillHoles).
- Überprüfen Sie die Messungen und speichern Sie sie in einer Kalkulationstabelle oder einem Diagramm. Führen Sie die Notizbuchzelle mit dem Titel Überprüfen, ob Zentroide genau gemessen wurden, und es erscheint ein Rendern, das die zentroiden zeigt, die oben auf dem abgebildeten Volumen nach Zelltyp identifiziert wurden. Nachdem alle Experimente durchgeführt werden, exportieren Sie den vollständigen Datensatz als einzelne Tabellenkalkulationsdatei, indem Sie die Experimente eingeben, die durch ID in die Notizbuchzelle mit dem Titel Exportieren der Daten als einzelne Data.XLSX-Datei für die Variablenexperimente, die die angegebenen Experimentiads ersetzen, eingeschlossen werden sollen. Wenn Sie den abgeschlossenen Datensatz überprüfen, zeichnen Sie ihn mit der Notizbuchzelle "Entfernung extravasated strip plot. Das Diagramm wird in der Notizbuchumgebung angezeigt und in der Datei gespeichert.
8. Analysieren Sie die zugehörigen Eigenschaften mit Künstlicher Intelligenz
HINWEIS: Identifizieren Sie metastasierende phänotypische Funktionen mithilfe von Algorithmen für künstliche Intelligenz.
- Führen Sie die binäre Klassifizierung mit Orange gemäß dem schema in Abbildung 5 und Der ergänzenden Datei 3aus. Starten Sie Orange von einer zweiten Windows-Eingabeaufforderung aus, indem Sie "conda activate" gefolgt von "python -m Orange.canvas" eingeben und in der Eingabeaufforderung auf Neu klicken. Orange ist eine Drag-and-Drop-basierte Software, also ordnen Sie die Funktionen an, indem Sie jedes Element aus dem linken Menü auf die Leinwand ziehen, um der Zusatzdatei 3zu entsprechen. Nachdem dies abgeschlossen ist, doppelklicken Sie auf das Dateisymbol und wählen Sie die Datei Data.XLSX.
- Filtern Sie die Daten, um fehlerhafte Messungen zu entfernen, die als solche definiert sind, bei denen ein boolescher Vorgang fehlgeschlagen ist, oder um parametrische Variablenwerte außerhalb bekannter Grenzen mithilfe des Symbols "Zeilen auswählen" zu zuweisen. Doppelklicken Sie auf das Symbol, und legen Sie Bedingungen fest, die dem Filter entsprechen, z. B. "Sphericity liegt zwischen 0 und 1". Bedingungen für 8.2.1, 8.2.2 und 8.2.3.
- Filterabstand extravasierte Messungen im Bereich von -100-200 m.
- Filtern Sie Sphäritätsmessungen der Zellform bis zu 0-1.
- Filtern Sie Krebszellvolumenmessungen bis zu 0-2000 Voxeln.
- Verwenden Sie alle parametrischen Variablen (Tabelle 1), um das Hirnmetastasierende MDA-MB-231-BR-GFP und das nicht-hirnmetastasierende MDA-MB-231-GFP zu klassifizieren. Doppelklicken Sie auf das Symbol Spalten aus dem Canvas auswählen. Verwenden der Schaltfläche > zum Verschieben verfügbarer Variablen in Features, Zielvariablenoder Metaattribute. Die einzige Variable, die eine Zielvariable sein sollte, ist eine metastasierende Bezeichnung, die definiert, ob Zellen im Datensatz als metastasiert (1) oder nicht (0) betrachtet werden. Experimentvariablen können im Abschnitt Metaattribute platziert werden.
- Beispiel für eine Schulung (80%) und Testsatz (20%). Doppelklicken Sie auf das Daten-Sampler-Symbol, und aktivieren Sie einen Sampling-Typ des festen Datenanteils: Stellen Sie auf 80 % fest, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen reproduzierbar und stifizieren. Stratify und Cross-Validieren des Trainingssatzes mit 10 Falten gegen jedes Modell/Klassifier. Doppelklicken Sie auf Test & Score und wählen Sie Kreuzvalidierung mit Anzahl der Falten: auf 10 und Stratified aktiviert. Legen Sie die Zielklasse auf 1fest.
- Verwenden Sie bei dieser Methode neuronale Netzwerke und Lernalgorithmen für random Forest, da sie für die Daten robust sind. Wählen Sie im Symbol "Zufallswald" die Anzahl der Bäume aus, die 50 sein sollen, und wählen Sie keine anderen Optionen aus. Wählen Sie innerhalb des Neuronen-Symbols Neuronen pro verstecktem Layer: 100, Aktivierung: ReLu, Solver: Adam, Alpha: 0.0001und Max Iterationen: 200. Diese Einstellungen variieren jedoch erheblich je nach Studie und sollten vor der Anwendung gut verstanden werden.
- Nachdem Sie den Canvas-Bereich eingerichtet haben, doppelklicken Sie auf jedes Symbol aus Datei auf Beispieldaten, und klicken Sie entweder auf Anwenden oder Senden von Daten. Doppelklicken Sie auf Test & Score und die Trainingsdaten beginnen, ein Modell mit den Algorithmen zu entwickeln. Nach dem Training des Machine Learning-Modells öffnen Sie Test & Score erneut und wählen Sie Test on Test Data aus, und schließen Sie das Popupfenster, um die Leistung des Modells zu bewerten, indem Sie die Zellen im Chip entsprechend der Wahrscheinlichkeit klassifizieren, dass sie gehirnmetastasiert von 0 bis 1 sind.
- Speichern sie die Leistung des Machine Learning-Modells in einer Datei (Tabelle 2). Schließen Sie den Bereich unter der Kurve (AUC) des ROC, die Genauigkeit und den F1-Score ein. Speichern Sie eine zweite Datei, die die einzelnen metastasierenden Indizes und Klassifizierungswahrscheinlichkeiten enthält. Doppelklicken Sie auf das Symbol Speichern und klicken Sie auf Speichern unter, um die Klassifizierungswahrscheinlichkeiten zu speichern. Ebenso kann die ROC-Kurve durch Doppelklicken auf das SYMBOL ROC-Analyse angezeigt werden und die Modellleistung kann durch Doppelklicken auf das Symbol Confusion Matrix berechnet werden.
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Representative Results
Mit dieser Technik analysierten wir Zelltypen, die mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen gekennzeichnet sind. Wir demonstrieren die Verwendung dieses Ansatzes mit einem mit hCMEC/D3-DsRed und nicht fluoreszierenden Astrozyten formulierten SmBBN-Chip. Die mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns wurden auf eine poröse Membran (5 m Track geätzte Poren) gesät und in einem Inkubator34 bei 37 °C unter 5%CO2platziert. Nach drei Tagen wurde die Konfluenz der Endothelschicht mittels Mikroskopie bestätigt und dann Krebszellen auf die Endothelschicht gelegt. Zwei Brustkrebs-Zelllinien, ein hirnsuchender Klon mit dem Begriff MDA-MB-231-BR-GFP und elterliche MDA-MB-231-GFP-Zellen wurden in den smBBN-Chip eingegeben, der eine astrozytische Gehirnnische35,36,37,38,39,40,41enthält. Die SmBBN-Chips wurden bei 1, 2 und 9 Tagen mit einem konfokalen Mikroskop mit 3 Kanälen (dsRed, GFP und Brightfield) mit einem 10-fachen Objektiv mit Z-Slices alle 9 m und 1x9 XY-Nähten zur Abdeckung der gesamten Membranfläche abgebildet. Dieses Mikroskop hielt während des Bildgebungsprozesses eine Temperatur von 37 °C bei, um die Belastung der Zellen zu minimieren.
Gezeigt wird ein repräsentatives Bild eines kompletten SmBBN-Chips (Abbildung 3A) und einer endotheliale Abdeckung (Abbildung 3B-D). Endothelbarrieren mit hoher und geringer Abdeckung werden quantifiziert, um festzustellen, dass die SmBBN-Chips für die Zugabe von Krebszellen geeignet sind (Abbildung 3B). Repräsentative Bilder eines für Experimente akzeptablen, konfluenten Endothelbarrieres(Abbildung 3C) und eines sbbN-Chips mit besonders schlechter Endothelabdeckung, der für die Zugabe von Krebszellen nicht geeignet ist, sind vorgesehen (Abbildung 3D). Die langfristige Kultivierung von Endothelzellen kann zu einer Abdeckung führen, die sich über die Membran hinaus erstreckt, die die oberen und unteren SmBBN-Chipkammern trennt. Endothelzellen wachsen oft sowohl auf der Oberseite als auch direkt unter der Membran, was die Bewegung von Krebszellen in den Nischenraum des Gehirns nicht beeinflusst, sondern die Ebene schwierig machen kann. Aufgrund der Variabilität der Spanfertigung und der endothelialen Abdeckung der Membran werden repräsentative Ebenen zu einer normalen flachen Endothelbarriere passen(Abbildung 3E), und eine atypische gekrümmte Membran wird als Referenz angezeigt (Abbildung 3F). Das Trocknen des Geräts in einem Ofen bei einer Temperatur über 40 °C kann eine gekrümmte Membran verursachen, wie gezeigt.
Wir beobachteten phänotypische Unterschiede der MDA-MB-231-BR-GFP und der elterlichen MDA-MB-231-GFP-Zelllinie, wenn wir auf astrocytischem MBBN stießen, die mit der entwickelten konfokalen tomographischen Analyse quantifiziert wurden. Die 4 phänotypischen Deskriptoren, die für die Eingabe in den Machine Learning-Algorithmus verwendet werden (Tabelle 1), sind in Abbildung 4dargestellt.
Die extravasierte Entfernung stellt den Abstand in m zwischen der Endothelbarriere und jeder Krebszellenposition im SmBBN-Chip dar (Abbildung 4A). Die Endothelbarriere befindet sich bei 0 m. Abstände <0 m stellen Krebszellen dar, die in der Strömungskammer verblieben sind. Entfernungen >0 m zeigen Krebszellen an, die durch die Endothelbarriere extravasiert wurden und in den Nischenraum des Gehirns gelangt sind. Nach 1-tägiger Exposition gegenüber dem mBBN wurden sowohl MDA-MB-231-BR-GFP als auch MDA-MB-231-GFP innerhalb der Endothelbarriere positioniert. Nach 2 und 9 Tagen Interaktion wanderte jedoch eine Teilmenge des MDA-MB-231-BR-GFP >100 m in die astrozytische Gehirnnische, während die elterlichen MDA-MB-231-GFP-Zellen in der Nähe der Endothelbarriere blieben. Wir lösten die Krebszellpositionen an der Endothelbarriere/Gehirnnischenschnittstelle, indem wir das Volumen jeder Krebszelle berechneten, die die Endothelbarriere durchlaufen hat. Der resultierende Prozentsatz stellt eine nach Volumen extravasierte Krebszelle dar (Abbildung 4B). Ein 0% extravasated by cell volume indicates cancer cells that remain on top of the endothelial barrier, ranging to 100% when a cancer cell has completely extravasated through the endothelial barrier and resides in the brain nischen space. Die elterlichen MDA-MB-231-GFP-Zellen interagieren zunächst mit der Endothelbarriere nach 1-Tag der Exposition gegenüber dem 'mBBN-Chip, die <50% nach Volumen extravasiert wurden. Bei 2 und 9 Tagen halten die MDA-MB-231-GFP-Zellen einen erheblichen Anteil der Zellen aufrecht, die über der Barriere abseits des Nischenraums des Gehirns blieben. Die MDA-MB-231-BR-GFP-Zellen hielten einen Anteil der Zellen, die >100% extravasiert waren, vor allem zum 2-Tage-Zeitpunkt.
Die Krebszellform änderte sich im Laufe der Exposition smBBN dramatisch. Repräsentative Bilder der Krebszellen zu jedem Zeitpunkt sind in Abbildung 4Cdargestellt. Die morphologische Quantifizierung der Krebszellform wurde mit Sphärizität berechnet, die zellvolumen und Oberfläche ausmacht (Abbildung 4D). Die Sphärizitätsmetrik reicht von 0-1, wobei 1 eine perfekte Kugel darstellt. Sowohl MDA-MB-231-BR-GFP als auch MDA-MB-231-GFP-Zellen waren hochkugelförmige 1-Tage-Post-Seeding in den smBBN-Chip. Nach 2- und 9-tägiger Interaktion im SmBBN-Chip tendierten beide Krebszelllinien dazu, ihre sphärische Form zu verringern, wenn auch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Neben der Krebszellform wird das Volumen in Voxeln jeder Krebszelle auch mit hilfe der konfokalen tomographischen Analyse quantifiziert. Jede Krebszelllinie wurde in Abbildung 4E-Fin zwei Gruppen geschichtet: "out", die die Krebszellen darstellen, die durch die Endothelbarriere (>90% extravasiert durch die Barriere) und "in" die Population von Zellen, die mit der Endothelbarriere interagieren, aber nicht extravasatiert (<90% extravasatiert), durchliefen. Die Subpopulationen von Krebszellen, die in die astrozytäre Nische extravasiert wurden, waren kleiner als die Krebszellen, die in Wechselwirkung mit der Endothelbarriere blieben, aber nicht vollständig bis zum Gehirn extravasatierten.
Das hirnsuchende MDA-MB-231-BR-GFP zeigte ein phänotypisches Muster in den mBBN-Chips, das sich von den elterlichen MDA-MB-231-GFP unterscheidet, die genutzt werden können, um zwischen hirnmetastasieren und nicht-hirnmetastasieren Krebszellen mit maschinellem Lernen zu unterscheiden. Die Daten wurden nach dem Zufallsprinzip in Trainings- und Validierungs-Datasets aufgeteilt, um das Modell zu trainieren und Validierungstests durchzuführen. Zum Trainieren des Modells wurden nach dem Filtern der Daten insgesamt 38.859 Zellen verwendet und das Modell anhand von 9.714 Einzelzellen getestet. Das trainierte Modell wurde auf die Krebszelllinien und PDX-generierten Krebszellen angewendet, die in astrozytischen mBBN-Chips (4 isoliert von Patientenhirnmetastasen einer Vielzahl von primären Tumortypen und 1 primärem Brustkrebstumor) analysiert wurden, um einen Index der metastasierenden Wahrscheinlichkeit des Gehirns zu generieren (Abbildung 5). Es wurden acht verschiedene Methoden zur Klassifizierung des maschinellen Lernens getestet: Naive Buchten, zufälliger Wald, Entscheidungsbaum, k-nächsterNachbar(kNN), stochastischer Gradientenabstieg, neuronales Netzwerk und Adaboost. Das Ergebnis jeder Methode ist in Tabelle 2dargestellt. Neuralnetwork und Adaboost waren die beiden leistungsstärksten Klassifizierungsmethoden, die für die Verwendung mit Daten empfohlen werden, die mit der AUC von 0,920 bzw. 0,928 generiert wurden. Darüber hinaus zeigten sie eine Genauigkeit von 0,833 und 0,853. Der Durchschnitt der Genauigkeit und Rückruf (F1) für das neuronale Netzwerk und Adaboost Methoden waren 0.847 und 0.860. Aus früheren Arbeiten, bei denen wir diesen Ansatz auf PDX-Proben von nicht-metastasierenden Brusttumoren und bekannten metastasierenden Proben (Brust, Lunge, Eierstock, Zunge) angewendet haben, fanden wir heraus, dass derselbe Ansatz, der auf die PDX-Proben angewendet wurde, eine genaue Identifizierung der metastasierenden Zellen von den nicht-metastasierenden ermöglichten. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse für jeden Machine Learning-Algorithmus, der auf die PDX-Daten angewendet wird, wobei sich die gleichen Methoden als die robustesten erwiesen (Neural network und Adaboost (Random Forest). Von den 143 Zellen, die im Testsatz für die PDX-Proben verwendet wurden, waren 71 nicht metastasiert, 46 waren metastasierende Brust, 11 waren metastasierende Zunge, 13 waren metastasierende Lunge und 2 waren metastasierende Eierstöcke. Jeder Zelltyp erzeugte eine Gesamtgenauigkeit von 0,88, aber das Individuum hatte die folgenden ungefähren Genauigkeiten: nicht-metastasierende Brust: 0,96, metastasierende Brust: 0,80, metastasierende Zunge: 0,80, metastasierende Lunge: 0,92, metastasierender Eierstock: 1,0
Abbildung 1: Experimenteller Workflow. (A) Schematische Darstellung des Mikrofluidien-Baugruppenprozesses. Ein Spinner wird verwendet, um einen dünnen Film von PDMS zu deponieren: Tolumolkleber auf einem 50 mm x 75 mm Glasschlitten. Jede Hälfte des SmBBN-Geräts wird kanalseitig zum Kleber gestempelt und dann mit einer Polycarbonatmembran (5 m Poren) zwischen den Geräteteilen des smBBN-Geräts montiert. Die Geräte von mBBN werden in einem 37 °C-Ofen für 24 h platziert, um den Kleber zu härten. Die Geräte werden dann vor dem experimentellen Gebrauch mindestens 48 h lang in einem Vakuumaustrocknungsgerät getrocknet. Ein MBBN-Gerät und ein 50 mm x 75 mm Glasschlitten werden mit einer Plasmabehandlung aktiviert und miteinander verklebt. Die an den Spitzen geschnittenen Standard-P200-Pipetten werden in alle Ein- und Auslässe des SmBBN-Geräts eingesetzt. Anschließend wird das fertige Gerät durch eine 8 min (200 W) Plasmabehandlung sterilisiert und dann in einen sterilen Sekundärbehälter überführt. (B) Schematische Übersicht über die Nutzung des mikrofluidischen Gerätegerüsts, um eine zelluläre Blut-Hirn-Schranke und Gehirn Nische Mikro-Umgebung zu schaffen. In einem Biosicherheitsschrank wird eine Mischung von Astrozyten in Kollagen in die Boden-MBBN-Gerätekammer gesät und bei 37 °C für 1 h verfestigt. Matrigel wird verwendet, um die Membran durch die obere Durchflusskammer für 1 h bei 37 °C zu beschichten. Dann werden Endothelzellen in eine Spitze der oberen Kammer gesät und können fließen und sich 15 min absetzen. Diese Aussaat wird x4 wiederholt, abwechselnd eingrichtet die Fließkammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Übersicht über die konfokale tomographische Analyse. Die Software beginnt mit der Umwandlung eines mikroskopisch kopischen konfokalen Z-Stack-Bildes in ein 3D-Modell der Zellen unter Verwendung von Segmentierung und 3D-Netzen. Das Programm berechnet dann die Mittelposition jeder Zelle (Zentroid) und passt eine Ebene an die Endothelbarriere an. Phänosemessungen jeder einzelnen Zelle werden dann tabellarisch dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Enddothel-Barriereabdeckung und Flugzeugbefestigung. (A) Repräsentativer Schaltplan und Abbild eines SmBBN-Geräts. Die gestrichelte weiße Linie im Schaltplan der oberen Ansicht gibt den Bereich des Geräts an, der in der Querschnittsansicht dargestellt wird. (B) Vergleich der hohen und niedrigen endotheliaalen Abdeckung von MBBN-Geräten vor der Anwendung von Krebszellen. Welch-Zwei-Probe-T-Test, *** p < 0,1*10-4. (C) Repräsentatives Bild der hohen endotheliale Abdeckung. Das gestrichelte weiße Feld innerhalb des Einschubschemas eines 'mBBN-Geräts gibt die Position der Endothelzellen innerhalb des Geräts an. Skalieren Von Übersichts- und Einschubbildern = 200 m (D) Repräsentatives Bild mit geringer endotheliale Abdeckung. Maßstabsbalken von Übersichts- und Einschubbildern = 200 m . (E) Beispielebene für die Passung einer flachen Endothelbarriere. Das grüne Rechteck stellt die Position der Endothelebene dar. Punkte stellen einzelne Endothelzellen dar, die die Barriere bilden. Gelbe Punkte sind Endothelzellen über der Ebene, und violette Punkte sind Zellen, die unter die Ebene fallen. Endothelzellen über der Ebene (gelbe Punkte) weisen eine Tendenz auf, die Seitenwände und die Oberseite des Geräts zu wachsen, um eine Röhre zu bilden. (F) Beispielebene passen eines 'mBBN-Geräts mit einer gekrümmten Ebene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung zellulärer Phänotypen von hirnmetastasischen und elterlichen Zellphänotypen in astrozytischen Bluthirnnischen mikrofluidischen Chips. (A) Streifen Sie die Entfernung sm von Krebszellen von der Endothelbarriere bei 1, 2 und 9 Tagen. Die gestrichelte schwarze Linie bei 0 m stellt die Endothelbarriere dar. Rote Felder zeigen eine Teilmenge von MDA-MB-231-BR-GFP-Zellen an, die weit in die Gehirnnische migriert enden. (B) Geigenplot des prozentualen Gesamtvolumens der Krebszellen, die durch die Endothelbarriere bei 1, 2 und 9 Tagen extravasiert werden. Kurze gestrichelte Linien stellen Quartile dar, längere gestrichelte Linien stellen den Mittelwert dar. (C) Repräsentative Bilder der Morphologie von Krebszellen in mBBN-Geräten. Skala bar = 25 m. (D) Geigendiagramm der Sphärizität von Krebszellen in dem Gerät von mBBN bei 1, 2 und 9 Tagen. Sphärität reicht von 1: sphärisch bis 0: nicht kugelförmig. (E) Box-Plot des MDA-MB-231-GFP-Zellvolumens im Gerät 'mBBN in Voxel für Zellen, die außerhalb der Endothelbarriere (out) ruhen, und Zellen, die durch die Barriere extravasiert sind (in). (F) Box-Plot des MDA-MB-231-BR-GFP-Zellvolumens im Gerät mBBN in Voxeln für Zellen, die außerhalb der Endothelbarriere (out) ruhen, und Zellen, die durch die Barriere extravasiert sind (in). Die Box zeigt die Quartile und Schnurrhaare erweitern, um den Anteil des Interquartilbereichs über die niedrigen und hohen Quartile zu zeigen. Paarweise Wilcoxon Rank Sum und Kruskal-Wallis mit Dunns mehrfachen Vergleichen, *** p < 0.1*10-4. Reproduziert aus Referenz24 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der Klassifizierung von Krebszellen durch maschinelles Lernen. (A) Überblick über maschinelles Lernen. Veranschaulicht den Prozess der Aufteilung der aus der konfokalen Tomographie gesammelten Daten, des Filterns der Daten, des Trainings des Machine Learning-Algorithmus mithilfe der 10-fachen Validierung und anschließender Prüfung des Modells anhand einer Zufallsstichprobe von 20 % der Daten, die reserviert wurden. Das ausgewählte Modell kann dann auf neue Daten angewendet werden, um den metastasierenden Index einzelner Zellen zu erfassen. (B) ROC-Kurven, die die Leistung von 8 verschiedenen Machine Learning-Algorithmen für MDA-231-BRP und MDA-231-GFP-Zellenkultur für 1, 2 und 9 Tage vor der Bildgebung anzeigen. Dies ist repräsentativ für den Typ der Kurve, die analysiert werden soll, um die Leistung des trainierten Modells zu verstehen. (C) ROC-Kurven für 8 verschiedene Machine Learning-Algorithmen, die auf patientenabgeleitete Xenograft (PDX) dissoziierte Zellen angewendet werden, die für 2 Tage kultiviert wurden. Dies ist repräsentativ für den Typ der Kurve, die analysiert werden soll, um die Leistung des trainierten Modells zu verstehen. Reproduziert aus Referenz24 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Feature | Deskriptor |
| Tumorzelle | % extravasiert in die Nische |
| Tumorzelle | Volumen |
| Tumorzelle | Sphericity |
| Tumorzelle | Entfernung extravasated |
| Tumorzelle | Live-Zelle 2D-Migration |
| Mikrometastasierung | Porosität |
| Mikrometastasierung | Stromale Interaktion |
| Mikrometastasierung | Alter |
| Mikrometastasierung | Wachstumsrate |
| Stromalzelle | Volumen |
| Stromalzelle | Entfernung von nahe gelegenen Krebszellen |
| Stromalzelle | Entfernung von der Endothelbarriere |
| Stromalzelle | Form |
Tabelle 1: Liste der Deskriptoren nach Feature-Typ. Die phänotypische Charakterisierung von Tumorzellen wird mit hilfe eines Panels von Deskriptoren dargestellt. Das rote Feld zeigt die Deskriptoren an, die verwendet wurden, um die metastasierende Wahrscheinlichkeit des Gehirns über maschinelles Lernen vorherzusagen.
| Krebszellen | |||
| Methode | Auc | Genauigkeit | F1 |
| Neurales Netzwerk | 0.925 | 0.84 | 0.847 |
| AdaBoost | 0.928 | 0.853 | 0.86 |
| Random Forest | 0.925 | 0.849 | 0.855 |
| Entscheidungsbaum | 0.898 | 0.817 | 0.827 |
| Knn | 0.775 | 0.702 | 0.718 |
| Logistische Regression | 0.769 | 0.735 | 0.751 |
| Naive Buchten | 0.745 | 0.715 | 0.73 |
| Sgd | 0.73 | 0.73 | 0.737 |
| PDX Krebszellen | |||
| Methode | Auc | Ca | F1 |
| Neurales Netzwerk | 0.972 | 0.881 | 0.878 |
| Random Forest | 0.964 | 0.888 | 0.887 |
| AdaBoost | 0.957 | 0.881 | 0.879 |
| Baum | 0.954 | 0.867 | 0.865 |
| Logistische Regression | 0.897 | 0.832 | 0.831 |
| Naive Buchten | 0.896 | 0.846 | 0.849 |
| Knn | 0.882 | 0.818 | 0.814 |
| Sgd | 0.861 | 0.86 | 0.853 |
Tabelle 2: Vergleich von Methoden des maschinellen Lernens zur Klassifizierung von Krebszellen und PDX-Krebszellen nach metastasierendem Potenzial des Gehirns.
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Discussion
Wir haben eine neue Methode entwickelt und vorgestellt, die Werkzeuge anpasst, die häufig in klinischen bildgebenden Analysen zur Messung der Extravasation und Migration von Krebszellen durch eine Endothelbarriere in das Hirngewebe verwendet werden. Wir stellen dar, dass dieser Ansatz sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Messungen nützlich sein kann; wir haben seine Verwendung auf einem 3D-Mikrofluidsystem demonstriert, das die Gehirnvaskulatur rekapituliert. Krebszellmessungen, einschließlich extravasierter Entfernung, Prozent, die nach Volumen, Sphärität und Volumen extravasiert werden, werden mit dieser Technik quantifiziert. Entfernung extravasiert und Prozent extravasated durch Volumen ermöglichen es dem Benutzer, die Position der Krebszellen innerhalb des Chips zu rekonstruieren, um Extravasation über die Barriere und Migration innerhalb des Gewebes zu bewerten. Zellformmessungen wie Sphärizität und Volumen beziehen sich auf die dynamischen Bewegungen oder die Funktion der Zelle zu jedem Zeitpunkt. Migrische MDA-MB-231-BR-GFP-Zellen weisen einen hohen Sphärizitätsgrad auf, wenn sie ursprünglich in das Gerät von mBBN eingeführt werden, und werden weniger kugelförmig, da sie ihre Bewegung verringern und beginnen, die Nische zu besiedeln. Das Gesamtzellvolumen des MDA-MB-231-GFP und des MDA-MB-231-BR-GFP unterschied sich aufgrund der unterschiedlichen Form der Zelllinien. Krebszellen, die die Endothelbarriere überschreiten, sind abgerundeter als die Zellen, die nicht durch die Barriere durchqueren, so dass kleinere runde Zellen in der Lage sein könnten, effizienter über die Endothelschicht zu extravasieren.
Innerhalb des Protokolls gibt es zwei wichtige Schritte, die den Erfolg erleichtern. Die erste tritt während der Montage des oberen und unteren Teils des SmBBN-Geräts auf, die durch die poröse Membran getrennt sind. Obere und untere Geräteteile müssen so verkleben, dass sich die Ein- und Auslässe überlappen, aber nicht von der Membran dazwischen verdeckt werden, um den richtigen Durchfluss zu fördern. Alle Geräte mit schlechter Paarung der oberen und unteren Geräteteile oder Membranausrichtung werden verworfen, um Qualitätsschwankungen zu minimieren. Nachfolgendes Backen zur Aushärtung des PDMS:Tolumol-Klebers zur Montage des Geräts ist bei 37 °C entscheidend, um mit flachen Membranen die Herstellung von mBBN-Geräten herzustellen. Backtemperaturen von mehr als 37 °C neigen dazu, Geräte mit einer gekrümmten Membran zu produzieren, die die Bildanalyse erschwert, insbesondere wenn eine Ebene an die Endothelbarriere angeschlossen wird. Der zweite kritische Schritt erfolgt während der Aussaat der Endothelbarriere. Die Aussaat enden in mindestens fünfzehn Minuten intervallig zwischen den beiden Einlässe, die den oberen Teil des Geräts zuführen, um eine zufällige Verteilung der Endothelzellen auf die Membran des Geräts zu gewährleisten. Das Aussaat des Kollagengemisches, das Astrozyten enthält, in den Chip kann eine Fehlerbehebung und Änderung des laborspezifischen Protokolls erfordern. Wenn die Membranoberfläche des Geräts nicht hydrophob ist, füllt das Kollagen sowohl den unteren als auch den oberen Teil des Geräts und wird so eingestellt, dass es den gesamten Fluss durch den oberen Teil des Geräts verstopft. Der Zweck der abschließenden Plasmagasbehandlung ist es, das Gerät hydrophob zu machen. In diesem Fall empfehlen wir eine Anpassung der Plasmagasbehandlung des Gerätes, um die Hydrophobie zu erhöhen.
Wir haben mit diesem Ansatz einige Einschränkungen festgestellt. Beispielsweise kann der Ansatz, der zur Induzieren von Zellfluoreszenz verwendet wird, die Bildqualität beeinträchtigen. Bei verwendung von Live-Zell-Tracking-Farbstoffen besteht das fluoreszierende Muster aus kleinen Flecken, während transfizierte oder transducierte Expression von Fluorophoren ein einheitliches Muster erzeugt. Das fleckige Muster erfordert zusätzliches und manchmal fehleranfälliges Clustering von Pixeln. Darüber hinaus hängt die Empfindlichkeit der Messung von der Sorgfalt ab, die während der Bildgebung erfolgt. Bilder mit höherer Auflösung und mehr Z-Slices verbessern die Auflösung, benötigt aber auch mehr Zeit zum Abbilden und Analysieren. Zellen, die berühren, können auch fälschlicherweise als große Einzelzelle analysiert werden. Dies ist ein Problem für viele automatisierte Bildgebungssysteme, kann aber auf zwei Arten behoben werden. Die erste ist, dass die Endothelschicht viele Zellen berührt, aber ihre Kombination hat vernachlässigbare Auswirkungen auf die endgültige Position der Schnittebene. Die zweite ist die Anzahl der Krebszellen ist niedrig genug, dass es selten ist, dass sie berühren. Fehler, die beim Anpassen der Ebene auftreten, können aus mehreren Gründen auftreten. Die erste ist, dass einige Endothelzellen während der Zellkultur von der zentralen Membran weggewandert sein könnten. Dies kann dazu führen, dass Endothelzellen den gesamten Kanal überziehen oder in den kollagengefüllten Raum eindringen und so die Messung verzerren. Eine weitere Fehlerquelle ist paradoxerweise die manuelle Anpassung der Ebene, um den vorherigen Fehler zu beheben. Wiederholungs- und Reproduzierbarkeitsstudien haben jedoch festgestellt, dass dies nur minimale Auswirkungen hat. Schließlich haben wir beobachtet, dass unter bestimmten Umständen das boolesche Schneiden des Zellnetzes fehlschlagen kann oder der Algorithmus zum Schließen des geschnittenen Netzes ebenfalls fehlschlagen kann. Die hier verwendeten Techniken sind der aktuelle "Stand der Technik", und diese Probleme werden derzeit von algorithmischen Wissenschaftlern angegangen.
Die Ergebnisse der Schulung der Machine Learning-Algorithmen (AI) mit Daten, die durch die konfokale Tomographie des smBBN gesammelt wurden, zeigen, dass die beträchtliche Anzahl einzelner Zellen, die durch diesen Ansatz analysiert werden, dazu beitragen kann, Probleme der Erfassung von Heterogenität in Krebszellen anzugehen. Ein AUC größer als 0,9 gilt als leistungsfähiger Klassifier. Hier haben wir eine AUC von 0,928 demonstriert. Wir gehen davon aus, dass die Leistung weiter zunehmen wird, wenn die Methode verbessert wird. Wie bei allen KI-Methoden ist darauf zu achten, dass der Trainingsdatensatz sorgfältig ausgewählt wird, so dass er im Großen und Ganzen die Art der Daten darstellt, mit denen getestet werden soll. Aus diesem Grund können wir erwarten, dass sich die Leistung verschlechtern würde, wenn das Modell beispielsweise direkt auf Patientenproben angewendet würde, ohne das Modell zuvor einer robusten Sammlung von Patientenproben auszusetzen. Wir zeigen dies hier bis zu einem gewissen Grad, indem wir 1-Tage-, 2-Tage- und 9-Tage-Messungen für die Krebszellen in das Modell einbeziehen, verglichen mit dem 2-Tage-Tag, der für die vorherige Arbeit verwendet wurde. Wir beobachten, dass die breite Stichprobe die Leistung des Modells leicht reduziert und zeigt, wie empfindlich einige der schlechteren Methoden sein können, was darauf hindeutet, dass Benutzer möglicherweise mehrere Modelle an ihren Daten testen möchten. Tabelle 2, in der die PDX-Ergebnisse beschrieben werden, zeigt eine insgesamt gute Leistung. Die einzelnen PDX-Typen zeigen jedoch, dass der Anteil der zellen, die aus jeder Probe gemessen werden, unterschiedlich ist und die Leistung für jeden Ursprungsort beeinflussen kann. Beispielsweise produzierte die Eierstockprobe nur zwei Zellen für den Testsatz. Im Gegensatz dazu, metastasierender Brustkrebs, der eine größere Population hatte. Dieser Datensatz sollte zeigen, dass die Zellen in der Nische überleben und analysiert werden können, aber auch die Interpretierpflege unterstreicht. Änderungen an der Zielvariablen können Forscher auch bei der Identifizierung von Unterklonen mit anderen Merkmalen wie Wechselwirkungen mit Stromalzellen oder stillem Verhalten führen.
Dieser Ansatz ist wichtig, da mehr Labore Membran-on-a-Chip-Systeme wie Blut-Hirn-Schranke auf einem Chip, Lunge auf einem Chip und Darm auf einem Chip11,42übernehmen. Die meisten dieser Späne sind so zusammengesetzt, dass die Membran parallel zum Bildgebungssystem ist, was bisher bedeutete, dass es schwierig wäre zu messen, wann und wie viele Zellen von einer Seite der Membran auf die andere15,,28verschoben wurden. Darüber hinaus bieten vertikal ausgerichtete Chips im Vergleich zu horizontal ausgerichteten Chips eine viel größere Membranfläche, die den Dynamikbereich des Experiments erhöht. Da die Ausrichtung der Membran für diese Analysetechnik nicht entscheidend ist, könnte die konfokale Tomographie neue In-vitro-Experimente ermöglichen. Zum Beispiel wäre die Bildgebung der Extravasation von Brustkrebszellen aus dem murinen Fettpolster in den Blutkreislauf mit diesen Methoden ansprechbar. Dies könnte den Forschern helfen, zu identifizieren, wie die Krebszellen die Schnittstelle zwischen Brust-ECM und Gefäß untersuchen.
Abschließend haben wir eine Methodik vorgestellt, um ein 3D-Mikrofluid-Gerät zu konstruieren, das die Nische des Bluthirns rekapituliert und zeigt, wie konfokale Tomographie und maschinelles Lernen für die Analyse verwendet werden können. Auf dieser Plattform identifizierten wir hirnmetastasierende Krebszellmerkmale, die auf der Grundlage ihres Verhaltens innerhalb des Gerätes zwischen metastasierenden und nicht-metastasierenden PDX-Krebszellen unterscheiden. Zukünftige Arbeiten werden die klinische Anwendbarkeit dieser Plattform als Diagnose zur Vorhersage von Hirnmetastasen verbessern. Wir glauben, dass die Bereitstellung dieser Plattform nützlich und interessant für Labore sein wird, die Zellen jeder Art messen müssen, die über eine Membran migrieren oder extravasieren. Dies ist von Bedeutung, da präklinische Modelle der Tumor-Mikroumgebung immer ausgefeilter werden, so dass die Technik der Modelle und unterstützende Software. Um eine robuste Analyse der Daten zu unterstützen, haben wir dieses Tool als einfach zu bedienendes, gemeinsam genutztes Python-Notebook mit Installationsanweisungen30verpackt.
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Disclosures
Es gibt keine Angaben zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken dem Steeg Lab am National Cancer Institute für die großzügige Spende von MDA-MB-231-BR-GFP Zellen. Die konfokale Mikroskopie wurde am University of Michigan Biointerfaces Institute (BI) durchgeführt. Die Durchflusszytometrie wurde an der University of Michigan Flow Cytometry Core durchgeführt. Virale Vektoren wurden von der University of Michigan Vector Core erstellt. Wir danken auch Kelley Kidwell für die Anleitung bei der statistischen Analyse dieser Daten.
Finanzierung:
C.R.O. wurde teilweise von einem NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) und 1R21CA245597-01 unterstützt. T.M.W. wurde teilweise von 1R21CA245597-01 und dem National Center for Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer UL1TR002240 unterstützt. Die Finanzierung von Materialien und Charakterisierung wurde von National Cancer Institute of the National Institutes of Health unter der Auszeichnung Nr. 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation und der Breast Cancer Research Foundation bereitgestellt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel - growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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