Summary
Her præsenterer vi en protokol for forberedelse og dyrkning af en blod-hjerne barriere metastatisk tumor mikro-miljø og derefter kvantificere sin tilstand ved hjælp af konfokale billeddannelse og kunstig intelligens (machine learning).
Abstract
Hjernemetastaser er de mest dødelige kræftlæsioner; 10-30% af alle kræftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på kun ~ 5-20 måneder, afhængigt af kræfttype. For at reducere hjernen metastatisk tumor byrde, huller i grundlæggende og translationel viden skal løses. Store udfordringer omfatter en mangel på reproducerbare prækliniske modeller og tilhørende værktøjer. Tredimensionelle modeller af hjernemetastase kan give de relevante molekylære og fænotopypiske data, der bruges til at imødekomme disse behov, når de kombineres med dedikerede analyseværktøjer. Desuden, sammenlignet med murine modeller, organ-on-a-chip modeller af patient tumorceller gennemkører blod-hjerne barrieren i hjernen mikromiljø generere resultater hurtigt og er mere fortolkes med kvantitative metoder, således modtagelige for høj gennemløb test. Her beskriver og demonstrerer vi brugen af en ny 3D-mikrofluidic blodtaopni -platform (μmBBN) platform, hvor flere elementer i nichen kan dyrkes i en længere periode (flere dage), fluorescerende afbildet af konfokal mikroskopi og billederne rekonstrueret ved hjælp af en innovativ konfokal tomografiteknik; alle havde til formål at forstå udviklingen af mikro-metastase og ændringer i tumor mikro-miljø (TME) i en repeterbar og kvantitativ måde. Vi demonstrerer, hvordan man fabrikere, frø, billede, og analysere kræftceller og TME cellulære og humorelle komponenter, ved hjælp af denne platform. Desuden viser vi, hvordan kunstig intelligens (AI) bruges til at identificere de iboende fænofyrste forskelle i kræftceller, der er i stand til at passere gennem en model μmBBN og til at tildele dem et objektivt indeks over hjernens metastatiske potentiale. De datasæt, der genereres ved denne metode, kan bruges til at besvare grundlæggende og translationelle spørgsmål om metastase, effekten af terapeutiske strategier og TME's rolle i begge.
Introduction
Hjernemetastaser er de mest dødelige kræftlæsioner; 10-30% af alle kræftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på kun ~ 5-20 måneder, afhængigt af kræft type1,,2. Et hovedspørgsmål, der opstår, når man studerer kræftmetastase er, hvordan sub kloner migrere fra humoral miljø i blodbanen i et organ som hjernen3,4. Dette spørgsmål har ført til mange variationer af migration, invasion, og ekstravasation assays. Alle disse metoder deler det kritiske trin for at tælle eller måle egenskaber af celler, der flytter fra et sted til et andet som reaktion på en stimulus. De fleste migration assays let tilgængelige bruges til at studere to-dimensionelle (2D) migration af kræftceller. Disse har belyst et væld af viden; De opsummerer dog ikke in vivo-systemets tredimensionelle karakter, som andre metoder kan give5. Derfor er det nødvendigt at studere tumor mikro-miljø (TME) i tre-dimensionelle (3D) systemer, men analysen tilgange til rådighed for 3D-strukturer er begrænsede og ofte inkonsekvent.
Et af de mest populære 3D-værktøjer er et Boyden kammer, der består af en membran suspenderet i bunden af en brønd, der adskiller to forskellige regioner. Boyden introducerede analysen for at studere leukocyt chemotaxis4. De nederste regioner kan varieres efter kemi eller på andenmåde 6,7 for at få celler i den øvre region til at migrere til den nedre region. Den mest almindelige metode til at kvantificere antallet af celler, der har migreret, er at frigive cellerne fra bunden af membranen ved hjælp af en bufferløsning, lyse dem, og derefter tælle dem baseret på mængden af DNA-indhold iopløsningen 7. Denne indirekte tilgang er tilbøjelig til operatørfejl på grund af teknikvariation, og proceduren ødelægger oplysninger om kræftfæstypen og mikromiljøet. Variationer af Boyden kammer assay indebærer fiksering af migrerende celler, der forbliver på membranen, men giver kun en optælling af celler, der ikke længere er levedygtige for fortsat undersøgelse6,8,9.
På grund af begrænsninger i Boyden kammer og væksten af innovationer i mikrofluidic samfund, migration assay chips er blevet udviklet som observerer bevægelse af celler som reaktion på en stimulus i én retning i stedet fortre 10,11,12. Disse migrationsanalyser letter kontrollen over faktorer som flow eller enkeltcelleseparation13,14, der muliggør en bedre fortolkning af resultaterne., men deres 2D-format uundgåeligt mister nogle dynamiske oplysninger. Nylige undersøgelser har fokuseret på ekstravasation (dvs. flytning af celler fra omsætning til et væv, såsom blod-hjerne barrieren) i et 3D-miljø14,,15. Ekstravasationen afstand til væv og sondering adfærd, der opstår på den cellulære barriere / membran er mere raffineret end målinger udledes ved hjælp af enten Boyden kammer eller en 2D microfluidic migration enhed16. Således er enheder, der muliggør passende billedbehandling og analyse af 3D-ekstravasation, afgørende for at fange disse avancerede målinger, men mangler i litteraturen.
Uafhængigt af migrationsanalyser er der udviklet robuste billeddannelsesteknikker til mri-billeddannelse (magnetic resonans imaging) og tomografi, der er i stand til at identificere og nøjagtigt rekonstruere væv i 3D-rum17,18. Disse teknikker erhverve billeder i z-stakke og segment dele af billedet baseret på egenskaberne af vævet og derefter konvertere de opdelte billeder i tre-dimensionelle masker19,20,21. Dette gør det muligt for læger at visualisere i 3D individuelle organer, knogler og fartøjer til støtte i kirurgisk planlægning eller støtte i diagnosticering af kræft ellerhjertesygdomme 22,23. Her vil vi vise, at disse tilgange kan tilpasses til brug på mikroskopiske prøver og 3D-udstyrsenheder.
Til dette formål udviklede vi den innovative konfokale tomografi teknik, præsenteret heri, som giver fleksibilitet til at studere ekstravasation af tumorceller på tværs af en membran ved at tilpasse eksisterende tomografi værktøjer. Denne fremgangsmåde gør det muligt at studere den fulde vifte af kræft celle adfærd, som de interagerer med en cellulær barriere, såsom en endotel cellelag. Kræftceller udviser sondering adfærd; nogle kan invadere, men forblive tæt på membranen, mens andre krydser barrieren let. Denne teknik er i stand til at give oplysninger om fænotype af cellen i alle dimensioner24. Ved hjælp af denne tilgang til at studere TME er både relativt billigt, let at fortolke, og reproducerbare, sammenlignet med mere komplekse in vivo murine modeller. Den præsenterede metode bør give et stærkt grundlag for studiet af mange typer af tumorer og mikro-miljøer ved at tilpasse den stromale region.
Vi beskriver og demonstrerer brugen af en 3D-mikrofluidic blodtaopni -platform (μmBBN) platform (figur1), hvor kritiske elementer i barrieren og nichen (hjernemikalieotolære endotelceller og astrocytter) kan dyrkes i en længere periode (ca. op til 9 dage), fluorescerende afbildet af konkorkal mikroskopi og billederne rekonstrueret ved hjælp af vores konfokale tomografiteknik (figur 2); alle havde til formål at forstå udviklingen af mikro-metastase og ændringer i tumor mikro-miljø i en repeterbar og kvantitativ måde. Blod-hjerne barrieren interface med hjernen niche er sammensat af hjernen mikrovaskulære endotelceller, der er styrket af kælderen membran, astrocyte fødder, og pericytes25. Vi fokuserede selektivt på astrocyt- og endotelkomponenterne i betragtning af deres betydning i dannelsen og reguleringen af blod-hjernebarrieren. Vi demonstrerer, hvordan man fabrikere, frø, billede, og analysere kræftceller og tumor mikro-miljø cellulære og humorelle komponenter, ved hjælp af denne platform. Endelig viser vi, hvordan machine learning kan bruges til at identificere de iboende fænofyrste forskelle i kræftceller, der er i stand til transit gennem en model μmBBN og til at tildele dem et objektivt indeks af hjernen metastatisk potentiale24. De datasæt, der genereres ved denne metode, kan bruges til at besvare grundlæggende og translationelle spørgsmål om metastase, terapeutiske strategier og TME's rolle i begge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered blod-hjerne barrieren niche skimmel
BEMÆRK: Den dyrkning enhed, der anvendes i denne platform er en PDMS baseret stillads, at vi bygger en cellulær blod hjerne barriere niche på. Det er lavet af to dele adskilt af en porøs membran. For at forberede blod-hjerne barrieren niche to SU-8 forme lavet ved hjælp af fotolitografi er nødvendige26,27. Protokollen vil blive beskrevet for 100 μm tyk skimmel først og derefter noter vil blive givet for 200 μm tyk skimmel.
- For at forberede formen, rense en 4 "silicium wafer ved hjælp af acetone med en squeeze flaske og derefter tørre det med en nitrogen pistol.
- Siliciumwaferen bages på en kogeplade i 10 minutter ved 200 °C for at fjerne alt restopløsningsmiddel.
- Til gengæld centrere silicium wafer på chuck af en spin coater og dispensere 1 ml SU8-2075 for den øverste mug. Spin for 5 s ved 500 rpm (acceleration 300 rpm / s) for at sprede fotoresisten og derefter 30 s ved 2200 rpm (acceleration 300 rpm / s) for at opnå en 100 μm tyk SU-8 belægning. Optimering kan være nødvendig for at opnå den angivne tykkelse.
- Bær waferen bages på en kogeplade ved 65 °C i 2 min. og derefter straks ved 98 °C i 20 min.
- Placer wafer i en fotolitografilampe og placer masken centreret på waferen i henhold til standardprocedurer. Su-8 belagte vafler eksponeres med en udstråling på 230 mJ/cm2 UVB (360 nm ± 10 nm). En eksponering matrix eksperiment kan udføres for at bestemme den optimale dosering. Maskedesign fås i supplerende fil 1.
- Der udføres en eftereksponering bages ved 65 °C i 2 min og derefter straks ved 98 °C i 10 min for at forbedre vedhæftningen. Waferen afkøles til 50 °C.
- Fjern den ikke-eksponerede modstand ved hjælp af SU-8 foto-udvikler. Skyl wafer i udvikleren i 5 minutter i et bad og derefter bruge en sprayflaske fyldt med SU-8 udvikler i en kemisk hætte til at ophidse og fjerne resterende uhærdet SU-8. Et 4x mikroskop kan bruges til at observere, om alle de uhærdede SU-8 er blevet fjernet. En hvid linje på kanterne af fotoresistensfunktionerne angiver, at SU-8 ikke er blevet fjernet helt.
- Udfør en sidste hård bages i en ovn ved 110 °C i 60 min.
- Følg samme procedure for den 200 μm tykke form ved hjælp af SU-8 2075, men juster protokollen til følgende:
- Spin coater indstillinger: Spin for 5 s ved 500 rpm (acceleration 300 rpm / s) for at sprede fotoresist og derefter 30 s ved 1300 RPM (acceleration 300 rpm / s) for at opnå en 200 μm tyk belægning.
- Blød bages ved 65 °C i 2 min og derefter ved 98 °C i 40 min.
- Eksponeringstid på 340 mJ/cm2.
- Efter eksponering bages: 2 min ved 65 °C, og derefter 98 °C i 15 min.
- Endelig silanize hver wafer ved at placere dem i et vakuumkammer inde i en kemisk hætte med en plastbeholder, hvor 3 dråber (~ 150 μL) af silanisering opløsning (Trichloro perfluoro octyl silan) er blevet placeret. Træk i et vakuum og lad natten over for at lade dampen til pels wafer. Dette trin reducerer vedhæftning mellem SU-8 og PDMS, hvilket øger formens levetid.
FORSIGTIG: Trichlorperfluoroctansili skal altid håndteres i røghætten og holdes væk fra vandkilder. - Placer individuelle wafer forme i 150 mm petriskåle ved hjælp af to strimler af dobbeltsidet tape. Sørg for, at wafere er flade. Et alternativ er at fremstille en aluminiumsform, inden for hvilken wafer kan placeres. Fordi aluminiumsformen er lukket, vil den producere afstøbninger med en ensartet tykkelse, mens petriskålsmetoden er følsom over for hældning af overfladen, er den placeret på. Den forbedrede fladhed af PDMS kaster reducerer downstream konfokale billeddannelse tid.
2. Form og saml PDMS-blod-hjernebarrieren (BBB)
- Bland 75 g PDMS i et forhold på 1:10 (Crosslinker:Base) efter vægt i en plastikkop.
- Hæld PDMS over forme (1 mm tyk for 200 μm tyk skimmel og 4 mm for 100 μm tyk skimmel) og degas i et vakuum ekssiccator i en time, eller indtil alle boblerne er blevet fjernet. Der er en ovn på 65 °C natten over. Tykkelsen på 1 mm kan justeres på baggrund af arbejdsafstanden for 10x-målet i det konfokale mikroskop.
- Efter PDMS har hærdet bruge en klinge til forsigtigt at skære mod wafer gennem PDMS omkring kanterne. Skræl PDMS af, og brug en klinge til at skære langs de rektangulære styre og en 1,5 mm biopsipund for at åbne indløb og udtag på enheden. Dæk PDMS-enhedens dele med 48 mm bred emballagetape for at holde den ren for støv og snavs.
- Næste brug dissektion saks til at skære en 5 mm x 50 mm rektangel polycarbonat membran med 5 μm porer og gemme det inde i en petriskål til senere brug.
- Opsaml følgende: 200 μL pipettespids, 2 ml 1:10 PDMS blandet med toluen i et forhold på 2:3 efter vægt i et glasglas, en Pasteur pipette med en squeeze pære, de forberedte PDMS øvre og nedre dele, membranen, tre 50 mm x 75 mm glasrutsjebaner og transportere det hele til en spin coater. Følgende trin til montering og cellesåning af anordningen er vist i figur 1.
- Brug Pasteurpipetten til at overføre 1 ml PDMS:toluenlimopløsning til en 50 mm x 75 mm glasrutsjebane på spincoaterens borepande. Spin i 5 sekunder ved 100 omdrejninger i minuttet (acceleration 300 omdr.//min.) og 30 sekunder ved 2000 omdrejninger i minuttet (acceleration 300 omdr./s).
- Placer dias på et bord og dække det med en PDMS øverste kammer og en nedre kammer, således at PDMS ansigter med funktioner støbt ind i det kontakte dias og limen overføres til PDMS ansigt, skitserer omkredsen af alle funktioner.
- Vend PDMS øverste kammer på en anden slide med limbelægningen opad og placer forsigtigt membranen på tværs af enheden mellem indløb og udtag. Placer 200 μL spidsen i PDMS:toluen limopløsningen, indtil den har ugudelige nogle i spidsen. Tryk på spidsen mellem hver indløb og udløb for at placere en lille dråbe nær kanten af membranen, hvor den kommer i kontakt med PDMS.
- Fjern den anden halvdel af enheden og læg den på med limbelægningen nede, mens ind- og udtagene på de to dele flugter.
- Den samlede enhed sættes i en ovn ved 37 °C natten over for at hærde limen. Overførsel til en vakuum klokke krukke med tørremiddel og lad dehydrere i to dage. Dette er et afgørende skridt for at gøre det muligt for Toluen at fordampe og forbedre konsistensen af såning enheden ved at regulere den absorberede vanddamp i laboratoriet luft.
3. Frø hjernen mikro-miljø i enheden
- Cellekultur og reagenser: Før denne protokol påbegyndes, skal følgende reagenser og celler anskaffes. Dyrk alle cellelinjer i en inkubator, der er indstillet til 37 °C i 5% CO2.
- Opretholde humane triple-negative brystkræft celle linje MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) og MDA-MB-231-BR-GFP celler (fremstillet af Patricia Steeg, PhD) i DMEM med 4,5 g / L glukose, suppleret med 2 mM L-glutamin, 10% FBS og 1x antibiotika-antimykotisk. Opret MDA-MB-231-GFP fluorescerende celler ved at transducere MDA-MB-231 celle med tomme vektor pLL-EV-GFP lentivirus. Sorter den transduced gfp+ population ved hjælp af fluorescensaktiv sortering (FACS) før forsøg.
- Opretholde humane hjerne mikrovaskulære endotelceller hCMEC/D3 i EGM-2 medium. Opret hCMEC/D3-DsRed fluorescerende celler ved at transducere hCMEC/D3 med tom vektor pLL-3.7-dsRed lentivirus. Fjern alle ikke-transfucerede, ikke-fluorescerende celler fra kulturen ved hjælp af FACS før eksperimentel brug.
- Opretholde normale menneskelige astrocytter (NHA) i DMEM suppleret med 4,5 g/L glukose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM natriumpyruvat, 1x N-2 vækst supplement, og 1x antibiotika-antimykotisk. Udødeliggør astrocytterne ved at transducere pLOX-TERT-iresTK lentiviral vektor (Addgene 12245). Opret vektoren ved hjælp af plasmid psPAX2 og konvolut plasmid pMD2.G (Addgene 12260 og 12259).
- Fjern en μmBBN-enhed fra vakuumudsiccatoren, og placer den på en metal- eller papiroverflade (dvs. tape) med indløbene nedad og sæt den ind i et plasmakammer. Ansk afstænnes også en 50 mm x 75 mm glasrutsjebane i plasmakammeret. Træk et vakuum og derefter behandle med plasma ved 80 W for 30 s.
- Fjern hurtigt glasrutsjebanen og enheden fra plasmakammeret, og anlæg enheden med indløbene opad på glasrutsjebanen justeret ved hjælp af en vejledning(Supplerende fil 2). Dette vil skabe en permanent binding mellem PDMS og glas dias og kan ikke re-positioneret.
- Derefter skæres spidserne af 16, 200 μL pipettespidser, 2 mm fra spidsen. Sæt pipettespidserne i alle indløb og udtag. Enheden kan placeres tilbage i vakuumeksiccatoren på dette tidspunkt, hvis den ikke er klar til at lægge cellerne.
- Anbesting enheden tilbage i plasmakammeret og behandle med plasma i 8 min ved 200 W. Når enheden er afkølet (5 min) fra plasmabehandlingen, skal den være inde i en steril sekundær beholder, som en gennemsigtig pipettespidsboks. Udfør det næste trin inden for ~ 15 min eller effektiviteten af plasma behandling kan reduceres fører til tilstopning.
- Flere dage før eksperimentkulturen Petriskåle på 1 x 106 endotelceller (hCMEC/D3-DsRed) og 1 x 106 astrocytter (NHA). Mens enheden gennemgår 8 min plasmabehandling, forberedes en kollagenopløsning bestående af 0,5 ml 3 mg/ml PureCol type I kvægkollagen med 64 μL på 0,8 M NaHCO3 og 20 μL 10x højglukose (250 mM) MEM. 5,0 x 105 NHA-celler i kollagenopløsningen skal suspenderes. Opløsningen fastholdes på isen, mens den ikke er i brug.
- Overfør 120 μL af kollagen/astrocyt/mikrogliaopløsningen ind i enheden gennem pipettespidsen til det nederste kammer (Figur 1 Røde pile). Lad opløsningen væge hen over kammeret i den modsatte pipettespids. Når alle fire kanaler på anordningen er fyldt, skal spånen i CO2-inkubatoren være 37 °C og 5 % CO2 i 1 time, eller indtil kollagen er indstillet.
- Efter kollagen sæt, fylde alle pipette tips fodring det nederste kammer med en blanding af komplette medier. For chips, der indeholder endotelceller og astrocytter, anvendes en 50:50 blanding af endotel:astrocyt media.
- Coat det øverste kammer med 2% vækst-faktor reduceret Matrigel i komplette endotel medier ved hjælp af det øverste kammer pipette spids(Figur 1 Blå pile) og sted i inkubatoren i 1 time.
- Skyl det øverste kammer med den angivne medieblanding, og suppleant hvilken spids der er seedet med endotelceller (Figur 1 Grønne pile). Suspension 1 x 106 endotelceller i 1 ml endotel medier og frø 30 μL hver 15 min i skiftevis øvre kammer tips til jævn dækning. Frø endotelceller i hver øvre kammer spids to gange, for i alt 4 gange pr kammer.
- Efter den endelige såning af endotelceller udfyldes alle spidserne med medieblandingen, og anordningen i inkubatoren sættes i ved 37 °C og 5 % CO2,hvor mediet skiftes i begge kamre hver 12.
4. Monitor progression af endotellaget dannelse
- Komplet dækning af kanalen ved endotellaget observeres efter 3 dage. Brug en af to metoder til at overvåge dækningen af endotelbarrieren: Fluorescens eller TEER. fluorescensen hCMEC/D3-DsRed og i henhold til % dækning på tværs af kanalområdet kan kvantificeres ved hjælp af ImageJ.
- Åbn TIFF-filen i ImageJ, der er repræsentativ for hCMEC/D3-DsRed-barrieren. Klik på Filer > Åbn i ImageJ-softwaren for at vælge filen.
- Flet alle billedets Z-lag ved hjælp af den maksimale intensitet efter disse tastekommandoer og -indstillinger: Billede > Stakke > Z-projekt > Alle Z-udsnit, Maksimal intensitet.
- Udfør en farvetærskel, der er den samme på tværs af alle mikrofluidiske chips, der vurderes ved hjælp af denne metode. I den fremlagte undersøgelse anvendte vi en tærskel på 450. Brug tærskelmenuen i ImageJ på: Billede > Juster > Tærskel.
- Angiv de målinger, der skal registreres ved hjælp af følgende kommandoer og indstillinger: Analysér > Angiv målinger > Begræns til tærskelværdi, Områdefraktion.
- Vælg et repræsentativt område af den mikrofluidiske kanal, der skal måles ved at tegne en boks. Boksværktøjet er placeret i hovedmenuen i ImageJ. Mål 3 tekniske replikater placeret i begyndelsen, midten og slutningen af hver mikrofluidic kanal ved hjælp af samme kassestørrelse.
- Analysér hver kanal, og registrere områdefraktionen, der repræsenterer dækningen % af endotelet. Eksporter disse målinger som regnearksfiler for at afbilde og visualisere dataene ved hjælp af følgende kommandoer: Analysér > Mål .
- Som et alternativ, bruge Impedance spektroskopi-baserede TEER til at måle endotel stramme vejkryds pr område. Kvantificering af endotelbarrieren ved hjælp af TEER er en proxy for etdotellagets integritet som en barriere.
- Placer to elektroder i indløb og udløb af de øvre og nedre kamre.
- Kvantificer impedansen af endotelmonsmonstologen som en kombination af modstand, induktans og kapacitans i chippen efter en model foreslået af Srinivasan et al.28,29.
5. Frø kræftceller ind i enheden
- Efter endotellaget er modnet, frø kræftceller ind i enheden. Forbered en 1 ml opløsning på 1 x 106 kræftceller i komplette kræftcellemedier.
- Udveksle medierne i chippen til at genopbygge cellekultur næringsstoffer.
- Frø hver øverste kammer kanal med 30 μL kræftceller i suspension og derefter placere enheden tilbage i inkubatoren i en 15 min. Altid frø kræftceller på samme side af alle fire øverste kammer kanaler inden for en enkelt enhed.
- Byt enheden med nye medier og genopfyld spidserne hver 12.
6. Image tumor mikro-miljø ved konfokal billeddannelse
- På det ønskede eksperimentelle tidspunktspunkt (1, 2 eller 9 dage) skal du bruge konfokal billeddannelse til at tage et 3D-billede af kanalen. Vi udfører dette trin på et Nikon A1 ved hjælp af de indstillinger, der er beskrevet her. Dette trin er automatiseret, og hver kanal kræver 20-40 min til billedet afhængigt af hvor mange fluorescerende kanaler er inkluderet, og Z-dybde er nødvendig for at dække placeringen af alle cellerne.
- Tænd for mikroskopet, åbn softwaren, og placer inkubatordækslet på mikroskopet.
- Indstil mikroskopets scenevarmer til 37 °C og CO2 til 5 %, hvis det er tilgængeligt.
- Når mikroskopkubatoren er stabiliseret, skal anordningen sættes ind i mikroskopstadiet ved hjælp af 50 mm x 75 mm holderen.
- Fokuser på den ene side af enheden (venstre, hvis der skal bruges med den medfølgende analyse software) med en 10x mål og indstille Z højde som nul. Under z-stack indstillinger, omfatter en rækkevidde på 100 μm over og 200 μm under fokus plan. Brug derefter syningsindstillingen til at indstille antallet af X- og Y-felter til henholdsvis 1 og 9 med overlapning på 15 %. Sæt pinhole til sit anbefalede minimum og z-lag højde til 9 μm. Juster den lyse felteksponering, så den porøse membran er synlig. Tænd for excitation lasere for de bered (561 nm) og GFP (488 nm) kanaler og justere fluorescerende laser beføjelser og cutoffs, således at hver kanal er synlig uden at overeksponere pixels.
- Kontroller, at alle felter er i fokus, når de er trådt over. Hvis det er tilfældet, skal du angive et outputfilnavn (001.nd2) for billedet og starte eksperimentet for automatisk at tage 3D-konfokale billeder.
7. Mål tumor mikro-miljø via konfokal tomografi
- Brug konfokal tomografi en tilgang til at anslå et sæt målinger og målinger, der beskriver de enkelte celler og tumor mikro-miljø i enheden. Konfokal tomografisk analyse (Figur 2) konverterer en konfokal z-stack til en tredimensionel repræsentation af cellerne. Ved hjælp af en brugerdefineret python script inden for Jupyter notebook / lab miljø, et fly er derefter matches til det lag af celler, der danner blod-hjerne barrieren sommembran 30. Endelig foretage fænootypiske målinger af kræftcellepopulationer (Tabel 1).
- Udføre denne analyse i slutningen af et eksperiment eller over et tidsforløb. Installer python og de relevante biblioteker i henhold til den refererede software guide, derefter åbne softwaren fra Windows Kommandoprompt ved at køre kommandoen "conda aktivere", efterfulgt af "jupyter lab". Jupyter-miljøet indlæses i standardbrowseren.
- Fra Jupyter file explorer dobbeltklik på Jupyter notebook "contom.ipynb" for at åbne den. Kør cellen under titlen Importér biblioteker, brugerdefinerede klasser/funktioner og opsætning af notesbogen ved at klikke på notesbogcellen og derefter klikke på knappen Afspil. Alle notesbogceller nedenfor udføres ved hjælp af den samme fremgangsmåde. Bemærk, at her notebook "celle" refererer til en blok af python kode i Jupyter notebook.
- Forbered dataene. Denne algoritme bruger VTK (visualiseringsværktøjskassen) til at manipulere og vise z-stacken og tredimensionelle data17.
- Placer den medfølgende . XLSX-filen ("Experiment Tracker.xlsx") i samme windows-mappe som den bærbare Jupyter-pc. Filen sporer eksperimenter og grænseflader med Jupyter notebook. Placer ND2-filen fra afsnit 6 i en undermappe med titlen "\Experiment_XXX\Confocal\" under placeringen af Jupyter-pc'en. Yderligere eksperiment mapper kan tilføjes inden for ved at justere "XXX" til det numeriske id tildelt nye mapper.
- Mærl den første eksperimentmappe "Experiment_001" og ND2-filen "001.nd2". Først skal du konvertere ND2-billedfilen til en syet TIFF-fil med flere billeder adskilt af en farvekanal. Gør dette ved at udføre notesbogcellen under titlen "Læs den konfokale z-stak i hukommelsen" med funktionen Save_tiff_from_ND2 () ukommenteret30. ND2-filen er et proprietært billedformat fra Nikon, og det er derfor nødvendigt at konvertere den til et format, som open source-software er kompatibelt med.
BEMÆRK: TIFF (Tag Image File Format) bruges, fordi det er allestedsnærværende, 16 bit kompatibel, let importeres til VTK, og flere billeder kan gemmes i en enkelt fil, hvilket er passende for z-stack billeder. Udførelse af notesbog celle vil læse i et billede fra ND2-filen, udtrække oplysninger om farven og XYZ positioner derefter gemme dette billede i en numpy array i henhold til en forudbestemt struktur. Derefter gemmes matrixen som en TIFF-fil ved hjælp af python-bibliotekets tifffile.
- Konverter billeddata til 3D-model
- Importer TIFF-filen til VTK (vtkTIFFReader) ved hjælp af en 3D-gengivelse for at visualisere cellerne (Figur 2). Vælg en tærskel baseret på farven på cellerne i billedet. VTK-objektet repræsenterer en blok af pixel (X, Y, Z) i rummet (lydstyrke), men kun visse pixel (grøn eller rød) repræsenterer celler, resten er baggrund eller støj (sort).
- Derfor skal du indstille et opacitetsfilter på diskenheden, som fjerner baggrunden, bekræfte, at det, der er tilbage, kun er cellerne. Gør dette ved hjælp af Jupyter notebook celle med titlen, Ændre opacitet værdier for hver mikroskop kanal ved at justere Channel_alpha værdi variabler (dvs. GFP_alpha). Visualisere effekten ved hjælp af notesbogcellen med titlen Få vist en 3D-gengivelse for at kontrollere, at tærsklen er angivet korrekt.
- Gem opacitetsværdierne i regnearket, så de kan bruges i næste trin. Konverter volumendataene til individuelle 3D-objekter, der hver repræsenterer en celle i billedet ved hjælp af en teknik, der kaldes marcherendekuber 31. Denne algoritme udtrækker en polygonal maske af en isosurface fra tre-dimensionelle diskrete skalar felter af voxels.
- Brug opacitetsværdien i algoritmen for marchkuber til at adskille hver celle fra baggrunden. Gennemfør dette trin for alle fluorescerende celler, der er identificeret i hver mikroskopkanal, ved at køre Konverter voxel-billede til en trekantet maske, og gem som en VTK-fil i notesbogen.
- Montering af et fly til membranen
- Sæt et fly på endotelbarrieren ved først at lokalisere cellecentroiderne (notesbogcelle: Analysér RFP-kanalen (endotelbarriere)). Gentage gennem listemaskerne i diskenheden og udtrække de områder, der ikke er tilsluttet ved hjælp af et PolyDataConnectivityFilter fra VTK. Beregn centroiden af hver maske, og føj målingen til en liste over centroiderfiltrering for masker, der er for store eller for små (<50, >1000000 voxels).
- Monter et plan på listen over centroider til endotelcellerne ved hjælp af en minimering af fejlmetoden (notesbogcelle: Monter et plan på RFP-centroiderne (endotelbarriere)) (Figur 2, Figur 3)32. Undersøg flyets pasform ved at afbilde planet og centroider, og juster om nødvendigt manuelt (ved hjælp af theta, beta og z) ved at køre notesbogcellen med titlen Visualize RFP centroids og plane fit.
- Når flyet er korrekt monteret, skal du gemme det normale af flyet i Eksperimenttrackerfilen . XLSX-fil til fremtidig brug.
- Analysér de beskrivende egenskaber ved de enkelte kræftceller for følgende beskrivelser (tabel 1).
BEMÆRK: Hvis den computer, der udfører analysen, halter, er analyse af høj overførselshastighed via højtydende databehandling en mulighed. Denne algoritme er nyttig på standard bærbare computere til analyse af et lille antal celler, men VTK er ikke velegnet til et stort antal individuelle objekter (>1000). Derfor er det valgfrit at bruge den tilpassede algoritme til at fungere på en højtydende computerklynge. Dette muliggør hurtig analyse af forsøg med mange celler (figur 2). Alle 7,5 opnås ved at køre notebook celler med titlen Analysere de resterende mikroskop kanaler for fænotopypiske beskrivelser og Læs i Experiment_tracker oplysninger og analysere de kanaler, der findes.- Mål ekstravasationen af kræftcellerne: Efter at have karakteriseret endotellaget med et plan, skal du måle mængden af hver kræftcelle, der har migreret gennem membranen. Klip hver celle (boolesk), så masken under membranen holdes, og delen over membranen fjernes33. Luk derefter den åbne maske (vtkFillHoles).
- Genberegn den normale og den nye centroid af klippede mesh. Mål mængden og placeringen af hver klippet kræftcelle til analyse. Volumen svarer til antallet af voxels masken fyld af hver enkelt celle. Beregn afstanden mellem endotelplanet og hver kræftcelles position.
- Mål den cellulære fænotype: Beregn morfologien for hver kræftcelle ved at indregne dens form, volumen og position.
- Mål ekstravasationen af kræftcellerne: Efter at have karakteriseret endotellaget med et plan, skal du måle mængden af hver kræftcelle, der har migreret gennem membranen. Klip hver celle (boolesk), så masken under membranen holdes, og delen over membranen fjernes33. Luk derefter den åbne maske (vtkFillHoles).
- Valider målingerne, og gem i et regneark eller et plot. Kør notesbogcellen med titlen Kontroller, at centroider blev målt nøjagtigt, og der vises en gengivelse, der viser de centroider, der er identificeret oven på den afbildede diskenhed efter celletype. Når alle eksperimenterne er udført eksportere hele datasæt som en enkelt regnearksfil ved at skrive de eksperimenter, der skal medtages af id i notesbogen celle med titlen Eksportere data som en enkelt Data.XLSX fil for variabler eksperimenter erstatter de givne eksperiment-id'er. experiments Hvis du kontrollerer det færdige datasæt, skal du afbilde det ved hjælp af notesbogcellen Med titlen Afstand ekstravaseret strimmelplot. Plottet vises i notesbogens miljø og gemmes i filen.
8. Analysere de relaterede egenskaber ved hjælp af kunstig intelligens
BEMÆRK: Identificer metastatiske fænotypiske funktioner ved hjælp af algoritmer til kunstig intelligens.
- Udfør binær klassificering ved hjælp af Orange i henhold til skemaet vist i figur 5 og supplerende fil 3. Start Orange fra en anden Windows-kommandoprompt ved at skrive "conda activate" efterfulgt af "python -m Orange.canvas", og klik på Ny fra prompten. Orange er en træk og slip baseret software, så arrangere funktionerne ved at trække hvert element fra menuen til venstre på lærredet for at matche supplerende fil 3. Når det er fuldført, skal du klikke på ikonet Filer og vælge .XLSX datafil.
- Filtrer dataene for at fjerne dårlige målinger, der er defineret som dem, der ikke har en boolesk handling eller giver parametriske variable værdier uden for kendte grænser ved hjælp af ikonet "Vælg rækker". Dobbeltklik på ikonet, og angiv de betingelser, der svarer til filteret, f.eks. Opret betingelser for 8.2.1, 8.2.2 og 8.2.3.
- Filterafstand ekstravaserede målinger til at variere fra -100-200 μm.
- Filtrer sfæriske målinger af celleform til at variere fra 0-1.
- Filter kræft celle volumen målinger til at variere fra 0-2000 voxels.
- Brug alle parametriske variabler (tabel 1) til at klassificere hjernemetamstatisk MDA-MB-231-BR-GFP og ikke-hjernemetastik MDA-MB-231-GFP. Dobbeltklik på ikonet Vælg kolonner på lærredet. Brug af knappen > til at flytte tilgængelige variabler til enten funktioner, destinationsvariabler ellermetaattributter . Meta Attributes Den eneste variabel, der skal være en målvariabel, er en metastatisk etiket, der definerer, om celler i datasættet betragtes som metastatiske (1) eller ej (0). Eksperimentvariabler kan placeres i sektionen Metaattributter.
- Prøve dataene i en træning (80 %) og testsæt (20 %). Dobbeltklik på ikonet Dataeksempel, og vælg en stikprøvetype med fast del af data: Angiv til 80 %, og vælg replikerbare og stratificerede afkrydsningsfelter. Stratify og krydsvalidere træningssættet ved hjælp af 10 folder mod hver model/klassificering. Dobbeltklik på Test og score, og vælg Krydsvalidering med antal folder: sæt til 10 og Stratificeret markeret. Indstil målklassen til 1.
- I denne metode, bruge Neural Networks og Random Forest læring algoritmer, som de er robuste for data. I ikonet Tilfældig skov skal du vælge antallet af træer, der skal være 50, og vælg ikke andre indstillinger. Inden for Neural Network ikonet vælge Neuroner pr skjult layer: 100, Aktivering: ReLu, Problemløser: Adam, Alpha: 0,0001, og Max Iterationer: 200. Men, disse indstillinger vil variere betydeligt efter undersøgelse og bør forstås godt før ansøgning.
- Når du har konfigureret lærredet, skal du klikke på hvert ikon fra Fil til eksempeldata og enten trykke på Anvend eller Send data. Dobbeltklik på Test og score, og træningsdataene vil begynde at blive brugt til at udvikle en model ved hjælp af algoritmerne. Efter træning af maskinlæringsmodellen skal du genåbne Test & Score og vælge Test på testdata og lukke pop op-vinduet for at score modellens ydeevne ved at klassificere cellerne i chippen i henhold til sandsynligheden for, at de er hjernemetastik fra 0 til 1.
- Gem maskinlæringsmodellens ydeevne i en fil (Tabel 2). Medtag området under roc'ens kurve (AUC), nøjagtigheden og F1-scoren. Gem en anden fil, der indeholder de enkelte metastatiske indekser og klassificeringssandsynligheder. Dobbeltklik på ikonet Gem, og klik på Gem som for at skrive for at arkivere klassifikationssandsynlighederne. På samme måde kan ROC-kurven ses ved at dobbeltklikke på ikonet ROC-analyse, og modellens ydeevne kan beregnes ved at dobbeltklikke på ikonet Confusion Matrix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne teknik analyserede vi celletyper mærket med forskellige fluorescerende proteiner eller farvestoffer. Vi demonstrerer brugen af denne fremgangsmåde med en μmBBN chip formuleret med hCMEC/D3-DSRed og ikke-fluorescerende astrocytter. De mikrovaskulære endotelceller i hjernen blev seedet på en porøs membran (5 μm spor ætsede porer) og anbragt i en inkubator34 ved 37 °C under 5% CO2. Efter tre dage blev sammenløbet af endotellaget bekræftet via mikroskopi, og derefter blev kræftceller placeret oven på endotellaget. To brystkræft cellelinjer, en hjernesøgende klon kaldet MDA-MB-231-BR-GFP, og forældrenes MDA-MB-231-GFP celler blev input til μmBBN chip, der indeholder en astrocytisk hjerne niche35,36,37,38,39,40,41. ΜmBBN-chipsene blev afbildet ved 1, 2 og 9 dage ved hjælp af et konfokalt mikroskop med 3 kanaler (dsRed, GFP og Brightfield) med et 10x mål med Z-skiver hver 9 μm og 1x9 XY-syning til at dække hele membranområdet. Dette mikroskop opretholdt en temperatur på 37 °C under billeddannelsesprocessen for at minimere belastningen på cellerne.
Der vises et repræsentativt billede af en komplet μmBBN-chip (Figur 3A) og endoteldækning (Figur 3B-D). Endotelbarrierer med høj og lav dækning kvantificeres for at fastslå, at μmBBN-chips er egnede til tilsætning af kræftceller (figur 3B). Repræsentative billeder af en μmBBN-chip med en sammenløbet endotelbarriere, der er acceptabel til forsøg (Figur 3C) og en μmBBN-chip med særlig dårlig endoteldækning, der ikke er egnet til tilsætning af kræftceller (Figur 3D). Langsigtet dyrkning af endotelceller kan resultere i dækning, der spænder ud over membranen, der adskiller top og bund μmBBN chip kamre. Endotelceller vokser ofte både oven på og direkte under membranen, hvilket ikke påvirker kræftcellebevægelser ind i hjernens nicherum, men kan gøre flyet i form af svært. På grund af membranens variabilitet og endoteldækning af membranen vises repræsentative planer, der passer til en normal flad endotelbarriere (Figur 3E), og en atypisk buet membran vises som reference (figur 3F). Tørring af apparatet i en ovn ved en temperatur på over 40 °C kan forårsage en buet membran som vist.
Vi observerede fænotypiske forskelle i MDA-MB-231-BR-GFP og forældre MDA-MB-231-GFP celle linje, når de støder astrocytiske μmBBN, der blev kvantificeret ved hjælp af den udviklede konfokale tomografiske analyse. De 4 fænogiede beskrivelser, der anvendes til input i maskinindlæringsalgoritmen (tabel 1) , vises i figur 4.
Afstand ekstravaseret repræsenterer afstanden i μm mellem endotelbarrieren og hver kræftcelleposition i μmBBN-chippen (Figur 4A). Endotelbarrieren er placeret ved 0 μm. Afstande <0 μm repræsenterer kræftceller, der forblev i strømningskammeret. Afstande > 0 μm angiver kræftceller, der har ekstravaseret gennem endotelbarrieren og indtastet hjernen niche plads. Efter 1 dages eksponering for μmBBN blev både MDA-MB-231-BR-GFP og MDA-MB-231-GFP placeret inden for endotelbarrieren. Men efter 2 og 9-dages interaktion en delmængde af MDA-MB-231-BR-GFP migreret > 100 μm i astrocytiske hjernen niche, mens forældreneS MDA-MB-231-GFP celler forblev i nærheden af endotelbarrieren. Vi løste kræftcellepositioner ved endotelbarrieren/hjernens nichegrænseflade ved at beregne mængden af hver kræftcelle, der har passeret gennem endotelbarrieren. Den resulterende procentdel repræsenterer kræftcelle ekstravaseret efter volumen (Figur 4B). En 0% ekstravaseret af celle volumen angiver kræftceller, der forbliver på toppen af endotel barriere, der spænder til 100%, når en kræftcelle har helt ekstravaseret gennem endotel barrieren og er bosat i hjernen niche rum. Forældrenes MDA-MB-231-GFP-celler interagerer i første omgang med endotelbarrieren efter 1 dags eksponering for μmBBN-chippen, der var <50% ekstravaseret efter volumen. På 2, og 9-dage MDA-MB-231-GFP celler opretholde en betydelig andel af celler, der forblev på toppen af barrieren væk fra hjernen niche plads. MDA-MB-231-BR-GFP-cellerne opretholdt en andel af celler, der var >100 % ekstravaseret, især på 2-dages-tidspunktet.
Kræftcelleformen ændrede sig dramatisk i løbet af varigheden af eksponeringen for μmBBN. Repræsentative billeder af kræftcellerne på hvert tidspunkt er afbildet i figur 4C. Morfologisk kvantificering af kræftcelleformen blev beregnet ved hjælp af sfæriskhed, der tegner sig for cellevolumen og overfladeareal (Figur 4D). Den sfæriske metriske spænder fra 0-1, med 1 repræsenterer en perfekt kugle. Både MDA-MB-231-BR-GFP og MDA-MB-231-GFP celler var meget sfærisk 1-dages post såning i μmBBN chip. Efter 2- og 9-dages interaktion i μmBBN-chippen, tendensde begge kræftcellelinjer til at reducere deres sfæriske form, om end i forskellige hastigheder. Ud over kræftcelleform kvantificeres volumen i voxels af hver kræftcelle også ved hjælp af konfokal tomografisk analyse. Hver kræftcellelinje blev stratificeret i to grupper i figur 4E-F: "out", der repræsenterer de kræftceller, der passerede gennem endotelbarrieren (>90% ekstravaseret gennem barrieren) og "in", populationen af celler, der interagerer med endotelbarrieren, men ikke ekstravaserer igennem (<90% ekstravaseret). Kræftcelle delpopulationer, der ekstravasated i den astrocytiske niche var mindre i størrelse i forhold til kræftceller, der forblev i samspil med endotelbarrieren, men ikke fuldt udstyre igennem til hjernen.
Den hjernesøgende MDA-MB-231-BR-GFP afslørede et fænofyrsmønster i de μmBBN-chips, der adskiller sig fra forældrenes MDA-MB-231-GFP, der kan udnyttes til at skelne mellem hjernemetasteriske og ikke-hjernemetastiske kræftceller ved hjælp af maskinlæring. Dataene blev tilfældigt opdelt i trænings- og valideringsdatasæt for at træne modellen og udføre valideringstest. For at træne modellen blev der i alt brugt 38.859 celler efter filtrering af data, og modellen blev testet mod 9.714 individuelle celler. Den uddannede model blev anvendt på kræft cellelinjer og PDX-genereret kræftceller, der blev analyseret i astrocytiske μmBBN chips (4 isoleret fra patientens hjerne metastaser af en række primære tumortyper, og 1 primær brystkræft tumor) til at generere et indeks over hjernen metastatisk sandsynlighed (Figur 5). Otte forskellige machine learning klassificering metoder blev testet: Naive bugter, tilfældig skov, beslutning træ, k-nærmestenabo (kNN), stokastiske gradient afstamning, neurale netværk, og Adaboost. Resultatet af hver metode er vist i tabel 2. Neurale netværk og Adaboost var de 2 bedst præsterende klassificeringsmetoder, der anbefales til brug med data genereret ved hjælp af μmBBN platform med en AUC på 0,920 og 0,928, hhv. Desuden viste de en nøjagtighed på 0,833 og 0,853. Gennemsnittet af præcision og tilbagekaldelse (F1) for Neural netværk og Adaboost metoder var 0.847 og 0.860. Fra tidligere arbejde, hvor vi anvendt denne tilgang til PDX prøver af ikke-metastatisk bryst tumor og kendte metastatiske prøver (bryst, lunge, æggestokkene, tungen) fandt vi, at den samme tilgang anvendes til PDX prøver aktiveret nøjagtig identifikation af de metastatiske celler fra de ikke-metastatiske dem. Tabel 2 viser resultaterne for hver maskinlæringsalgoritme, der anvendes på PDX-data, hvor de samme metoder viste sig at være de mest robuste (Neural-netværk og Adaboost (Random Forest). Af de 143 celler, der blev anvendt i testsættet til PDX-prøverne, var 71 ikke metastatiske, 46 var metastatisk bryst, 11 var metastatisk tunge, 13 var metastatisk lunge, og 2 var metastatisk ovarie. Hver celletype producerede en samlet nøjagtighed på 0,88, men individet havde følgende omtrentlige nøjagtigheder: ikke-metastatisk bryst: 0,96, metastatisk bryst: 0,80, metastatisk tunge: 0,80, metastatisk lunge: 0,92, metastatisk æggestokkene: 1,0
Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang. aA) Skematisk repræsentation af den mikrofluidiske enhedssamlingsproces. En spinner bruges til at deponere en tynd film af PDMS:toluen lim på en 50 mm x 75 mm glas dias. Hver halvdel af μmBBN enheden er stemplet kanal side vender limen og derefter samlet med en polycarbonat membran (5 μm porer) mellem μmBBN enhed dele. ΜmBBN-enhederne anbringes i en 37 °C ovn i 24 timer for at hærde limen. Anordninger tørres derefter i en vakuumeksiccator i mindst 48 timer før forsøgsbrug. En μmBBN-enhed og en 50 mm x 75 mm glasrutsjebane aktiveres med en plasmabehandling og bindes sammen. Standard P200-pipetter, der skæres ved spidserne, indsættes i alle μmBBN-enhedsindløb og -udtag. Den færdige μmBBN-enhed steriliseres derefter med en 8 min (200 W) plasmabehandling og overføres derefter til en steril sekundær beholder. (B) Skematisk overblik over at udnytte den mikrofluidiske enhed stilladser til at skabe en cellulær blod hjerne barriere og hjernen niche mikro-miljø. Inde i en biosikkerhed kabinet, en blanding af astrocytter i kollagen er seedet i bunden μmBBN enhed kammer og lov til at størkne i 1 time ved 37 °C. Matrigel bruges til at belægge membranen gennem det øverste flowkammer i 1 time ved 37 °C. Derefter endotelceller er seedet i en spids af det øverste kammer og lov til at flyde og nøjes med 15 min. Denne såning gentages x4, skiftevis sider af flowkammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over konfokal tomografisk analyse. Softwaren begynder med at konvertere en mikroskopisk konfokal Z-stack billede til en 3D-model af cellerne ved hjælp af segmentering og 3D-masker. Programmet beregner derefter den midterste position af hver celle (centroid) og passer et plan til endotelbarrieren. Fænotopypiske målinger af hver enkelt celle er derefter tabuleret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Endotelbarrieredækning og planmontering. a) Repræsentativt skematisk og billede af en μmBBN-enhed. Den stiplede hvide linje i det øverste visningsskema angiver det område af enheden, der er repræsenteret i tværsnitsvisningen. B)Sammenligning af høj og lav endoteldækning af μmBBN-anordninger forud for anvendelse af kræftceller. Welch to-prøve t-test, *** p < 0,1 * 10-4. cC) Repræsentativt billede af høj endoteldækning. Den stiplede hvide boks i en μmBBN-enheds indsatte skematiske angiver placeringen af endotelcellerne i enheden. Skalabjælker af oversigt og indsatte billeder = 200 μm. (D) Repræsentativt billede af lav endoteldækning. Skalabjælker for oversigt og indsatte billeder = 200 μm. (E) Eksempel planpasning af en flad endotelbarriere. Det grønne rektangel repræsenterer placeringen af endotelplanet. Prikker repræsenterer enkelte endotelceller, der udgør barrieren. Gule prikker er endotelceller over planet, og lilla prikker er celler, der falder under planet. Endotelceller over planet (gule prikker) udviser en tendens til at vokse op sidevægge og toppen af enheden til at danne et rør. (F)Eksempel plan passer af en μmBBN enhed med et buet plan. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kvantificering af cellulære fænotyper af hjerne-metastatiske og forældrecelle fænotyper i astrocytiske blod brain niche microfluidic chips. a)Stripplot af afstand i μm af kræftceller fra endotelbarrieren ved 1, 2 og 9-dage. Den stiplede sorte linje ved 0 μm repræsenterer endotelbarrieren. Røde bokse angiver en delmængde af MDA-MB-231-BR-GFP-celler, der migrerede langt ind i hjernens niche. (B) Violin plot af den procentvise samlede mængde kræftceller ekstravaseret gennem endotel barrieren på 1, 2 og 9-dage. Korte stiplede linjer repræsenterer kvartiler, længere stiplede linje repræsenterer middelværdi. cC) Repræsentative billeder af kræftcellernes morfologi i μmBBN-anordningen. Skalabar = 25 μm.(D)Violinplot af kræftcellernes sfæriske karakter i μmBBN-anordningen ved 1, 2 og 9 dage. Sfæriskhed spænder fra 1: sfærisk til 0: ikke sfærisk. (E)Boks plot af MDA-MB-231-GFP celle volumen i μmBBN enhed i voxels for celler, der hviler uden for endotelbarrieren (ud) og celler, der ekstravaserede gennem barrieren (i). (F)Boks plot af MDA-MB-231-BR-GFP celle volumen i μmBBN enhed i voxels for celler, der hviler uden for endotel barrieren (ud) og celler, der ekstravaserede gennem barrieren (i). Boksen viser kvartiler og whiskers udvide for at vise andelen af interkvartil området forbi de lave og høje kvartiler. Pairwise Wilcoxon Rank Sum og Kruskal-Wallis med Dunn's flere sammenligninger, *** p < 0,1 * 10-4. Gengivet fra reference24 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative resultater af klassificeringen af maskinlæring af kræftceller. (A) Oversigt over maskinlæring. Demonstrerer processen med at opdele data indsamlet fra konfokal tomografi, filtrere data, træne machine learning algoritme ved hjælp af 10-fold validering og derefter teste modellen mod en tilfældig stikprøve på 20% af de data, der var reserveret. Den valgte model kan derefter anvendes på nye data for at indsamle det metastatiske indeks for individuelle celler. (B) ROC kurver, der viser udførelsen af 8 forskellige machine learning algoritmer til MDA-231-BR-GFP og MDA-231-GFP celler kultur for 1, 2 og 9-dage før billeddannelse. Dette er repræsentativt for den type kurve, der skal analyseres for at forstå ydeevnen af den uddannede model. (C) ROC kurver for 8 forskellige machine learning algoritmer anvendes til patient afledt xenograft (PDX) dissocierede celler dyrket i 2-dage. Dette er repræsentativt for den type kurve, der skal analyseres for at forstå ydeevnen af den uddannede model. Gengivet fra reference24 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Funktion | Deskriptoren |
| Tumorcelle | % ekstravaseret ind i nichen |
| Tumorcelle | Volumen |
| Tumorcelle | Sfæriskhed |
| Tumorcelle | Afstand ekstravaseret |
| Tumorcelle | 2D-overførsel i levende celle |
| Mikrometastase | Porøsitet |
| Mikrometastase | Stromal interaktion |
| Mikrometastase | Alder |
| Mikrometastase | Vækstrate |
| Stromal celle | Volumen |
| Stromal celle | Afstand fra nærliggende kræftceller |
| Stromal celle | Afstand fra endotelbarriere |
| Stromal celle | Form |
Tabel 1: Liste over beskrivelser efter funktionstype. Den fæotypiske karakterisering af tumorceller er repræsenteret ved hjælp af et panel af beskrivelser. Den røde boks angiver de beskrivelser, der er blevet brugt til at forudsige hjernens metastatiske sandsynlighed via machine learning.
| Kræftceller | |||
| Metode | Auc | Nøjagtighed | F1 |
| Neurale netværk | 0.925 | 0.84 | 0.847 |
| AdaBoost | 0.928 | 0.853 | 0.86 |
| Tilfældig skov | 0.925 | 0.849 | 0.855 |
| Beslutning Tree | 0.898 | 0.817 | 0.827 |
| Knn | 0.775 | 0.702 | 0.718 |
| Logistisk regression | 0.769 | 0.735 | 0.751 |
| Naive Bugter | 0.745 | 0.715 | 0.73 |
| Sgd | 0.73 | 0.73 | 0.737 |
| PDX Kræftceller | |||
| Metode | Auc | Ca | F1 |
| Neurale netværk | 0.972 | 0.881 | 0.878 |
| Tilfældig skov | 0.964 | 0.888 | 0.887 |
| AdaBoost | 0.957 | 0.881 | 0.879 |
| Træ | 0.954 | 0.867 | 0.865 |
| Logistisk regression | 0.897 | 0.832 | 0.831 |
| Naive Bugter | 0.896 | 0.846 | 0.849 |
| Knn | 0.882 | 0.818 | 0.814 |
| Sgd | 0.861 | 0.86 | 0.853 |
Tabel 2: Sammenligning af maskinindlæringsmetoder til klassificering af kræftceller og PDX-kræftceller efter hjernens metastatiske potentiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet og præsenteret en ny metode, der tilpasser værktøjer, der ofte anvendes i kliniske billedanalyser til måling af ekstravasation og migration af kræftceller gennem en endotelbarriere til hjernevæv. Vi udgør denne fremgangsmåde kan være nyttig for både in vivo og in vitro målinger; vi har vist sin anvendelse på en 3D microfluidic system recapitulating hjernen vaskulatur. Kræft celle målinger, herunder afstand ekstravaseret, procent ekstravaseret af volumen, sfæriskhed, og volumen er kvantificeret ved hjælp af denne teknik. Afstand ekstravaseret og procent ekstravasated af volumen tillader brugeren at rekonstruere placeringen af kræftceller i chippen til at vurdere ekstravasation på tværs af barrieren og migration i vævet. Celleformmålinger som sfæriskhed og volumen er relateret til cellens dynamiske bevægelser eller funktion på hvert tidspunkt. Migrerende MDA-MB-231-BR-GFP celler udviser en høj grad af sfæriskhed, når de først indføres i μmBBN enheden og bliver mindre sfærisk i form, da de mindsker deres bevægelse og begynder at kolonisere nichen. Den samlede cellevolumen for MDA-MB-231-GFP og MDA-MB-231-BR-GFP varierede på grund af forskellen i cellelinjernes form. Kræftceller, der krydser endotelbarrieren, er mere afrundede end de celler, der ikke krydser gennem barrieren, og dermed kan mindre runde celler være i stand til at ekstravasere på tværs af endotellaget mere effektivt.
Der findes to kritiske trin i protokollen, der letter succesen. Den første forekommer under samlingen af μmBBN enheden øvre og nedre dele, der er adskilt af den porøse membran. Øvre og nedre enhed dele skal parre sig således, at indløb og afløb overlapper hinanden, men ikke er tilstukne af membranen i mellem at fremme korrekt flow. Alle μmBBN-enheder med dårlig parring af de øvre og nedre enhedsdele eller membranjusteringen kasseres for at minimere udsving i kvaliteten. Efterfølgende bagning for at helbrede PDMS:toluen lim til at samle enheden er afgørende for at udføre ved 37 °C til at producere μmBBN enheder med membraner, der er flade. Bagetemperaturer, der overstiger 37 °C tendens til at producere enheder med en buet membran, der gør billedanalyse vanskelig, især når montering et plan til endotel barrieren. Det andet kritiske skridt sker under såning af endotelbarrieren. Såningerne bør finde sted med mindst femten minutters mellemrum mellem de to indløb, der giver den øverste del af anordningen for at sikre tilfældig fordeling af endotelcellerne på enhedens membran. Såning af kollagenblandingen, der indeholder astrocytter i chippen, kan kræve fejlfinding og ændring af den laboratoriespecifikke protokol. Hvis enhedens membranoverflade ikke er hydrofobisk, vil kollagen fylde både enhedens nederste og øverste dele og indstille, så den tilstopler alle flow gennem den øverste del af enheden. Formålet med den endelige plasmagasbehandling er at gøre enhedens overflade hydrofobe. I dette tilfælde anbefaler vi justering af plasmagasbehandlingen af anordningen for at øge hydrofobiciteten.
Vi har observeret nogle begrænsninger med denne tilgang. For eksempel kan den tilgang, der anvendes til at fremkalde cellefluorescens påvirke billedkvaliteten. Når du bruger levende celle tracking farvestoffer, lysstofrør mønster er lavet af små pletter, mens transficeret eller transduced udtryk for fluorophores producerer et ensartet mønster. Plettet mønster kræver yderligere og undertiden fejlbehæftede klyngedannelser af pixel. Derudover er følsomheden af målingen afhængig af den omhu, der tages under billeddannelse. Billeder med højere opløsning og flere z-udsnit forbedrer opløsningen, men det tager også længere tid at afbilde og analysere. Celler, der rører ved, kan også analyseres forkert som en stor enkelt celle. Dette er et problem for mange automatiserede billedsystemer, men kan løses på to måder. Den første er, at endotellaget har mange celler, der rører, men deres kombination har ubetydelig indvirkning på den endelige placering af beskæringsplanet. Den anden er antallet af kræftceller er lavt nok, at det er sjældent, at de rører. Fejl, der indføres ved montering af flyet, kan forekomme af flere årsager. Den første er, at nogle endotelceller kan have migreret væk fra den centrale membran under cellekultur. Dette kan resultere i endotelceller belægning hele kanalen eller invaderer kollagen fyldt plads, og dermed skæve målingen. En anden kilde til fejl er paradoksalt nok den manuelle justering af flyet for at rette den tidligere fejl. Men, repeterbarhed og reproducerbarhed undersøgelser har fundet dette at have minimal effekt. Endelig bemærkede vi, at under visse omstændigheder kan den booleske skæring af cellemasken mislykkes, eller algoritmen til at lukke snitmasket kan også mislykkes. De teknikker, der anvendes her, er den nuværende "state of the art", og disse problemer er i øjeblikket ved at blive behandlet af algoritmiske forskere.
Resultaterne af uddannelse af machine learning algoritmer (AI) mod data indsamlet af konfokale tomografi af μmBBN viser, at det betydelige antal individuelle celler analyseret ved denne fremgangsmåde kan bidrage til at løse problemer med at opfange heterogenitet findes i kræftceller. En AUC større end 0,9 betragtes som en højtydende klassificering. Her viste vi en AUC på 0,928. Vi forventer, at efterhånden som metoden forbedres, vil resultaterne fortsætte med at stige. Som med alle AI-metoder skal man være opmærksom på at vælge træningsdatasættet omhyggeligt, så det stort set repræsenterer den type data, der forventes at blive testet mod. Derfor kan vi forvente, at præstationen vil forringes, hvis modellen for eksempel blev anvendt direkte på patientprøver uden først at udsætte modellen for en robust samling af patientprøver. Vi viser dette her til en vis grad ved at inkludere 1-dages, 2-dages og 9-dages målinger for kræftcellerne i modellen i forhold til den 2-dages dag, der blev brugt til det foregående arbejde. Vi bemærker, at den brede stikprøve reducerer modellens ydeevne en smule og viser, hvor følsomme nogle af de dårligere præsterende metoder kan være, hvilket tyder på, at brugerne måske ønsker at teste flere modeller på deres data. Tabel 2, der beskriver PDX-resultater, viser en generel god præstation. De enkelte PDX-typer viser imidlertid, at andelen af celler målt fra hver prøve er forskellig og kan påvirke ydeevnen for hvert oprindelsessted. For eksempel producerede æggestokkene prøven kun to celler til testsættet. I modsætning hertil metastatisk brystkræft, som havde en større befolkning. Dette datasæt havde til formål at vise, at cellerne overlever i nichen og kan analyseres, men fremhæver også fortolkende pleje er nødvendig. Ændringer i målvariablen kan også vejlede forskere i at identificere subkloner med andre træk såsom interaktioner med stromale celler eller quiescent adfærd.
Denne fremgangsmåde er vigtig, da flere laboratorier vedtage membran on-a-chip-systemer såsom blod hjerne barrieren på en chip, lunge på en chip og tarm på en chip11,42. Størstedelen af disse spåner samles, så membranen er parallel med billeddannelsessystemet, hvilket indtil nu har betydet, at det ville være vanskeligt at måle, hvornår og hvor mange celler der er flyttet fra den ene side af membranen til denanden 15,28. I forhold til vandret orienterede spåner giver vertikalt orienterede spåner desuden et meget større membranområde, der øger eksperimentets dynamiske område. Da orienteringen af membranen ikke er kritisk for denne analyseteknik, kan konfokal tomografi desuden potentielt muliggøre nye in vitro-eksperimenter. For eksempel, billeddannelse ekstravasation af brystkræftceller fra murine fedt pad i blodet ville være tilgængelig ved disse metoder. Dette kunne hjælpe forskerne med at identificere, hvordan kræftcellerne sonde grænsefladen mellem brystet ECM og fartøj.
Afslutningsvis præsenterede vi en metode til at konstruere en 3D-mikrofluidisk enhed, der opsummerer blodtaopnien og demonstrerer, hvordan man bruger konfokal tomografi og maskinlæring til analyse. Ved hjælp af denne platform identificerede vi hjernemetastikkræftcelleegenskaber, der skelner mellem hjernemetasteriske og ikke-metastatiske PDX-kræftceller baseret på deres adfærd i μmBBN-enheden. Fremtidige arbejde vil forbedre den kliniske anvendelighed af denne platform som en diagnostisk mod at forudsige hjernen metastaser. Vi mener, at have præsenteret denne platform vil være nyttigt og interessant at laboratorier, der har brug for at måle celler af enhver type migrerende eller ekstravasating på tværs af en membran. Dette er af betydning som prækliniske modeller af tumor mikro-miljø bliver stadig mere sofistikeret, så skal engineering af modeller og støtte software. For at hjælpe med en robust analyse af de data, vi har pakket dette værktøj som en enkel at bruge, delt python notebook med installationsvejledning30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen oplysninger at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Steeg Lab, på National Cancer Institute for den generøse donation af MDA-MB-231-BR-GFP celler. Konfokal mikroskopi blev udført på University of Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flow cytometri blev udført på University of Michigan Flow Cytometri Core. Virale vektorer blev skabt af University of Michigan Vector Core. Vi takker også Kelley Kidwell for vejledning i statistisk analyse af disse data.
Finansiering:
C.R.O. blev delvist støttet af et NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) og 1R21CA245597-01. T.M.W. blev delvist støttet af 1R21CA245597-01 og National Center for Advancing Translational Sciences fra National Institutes of Health under Award Number UL1TR002240. Finansiering af materialer og karakterisering blev leveret af National Cancer Institutes of National Institutes of Health under tildeling nummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation, og Breast Cancer Research Foundation. Indholdet er udelukkende ophavsmændenes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel - growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
- Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
- Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
