Summary
Denne protokol præsenterer en arbejdsgang for submm 2D visualisering af flere labile uorganiske næringsstoffer og forurenende opløste arter ved hjælp af diffusive gradienter i tynde film (DGT) kombineret med massespektrometri billeddannelse. Opløst prøveudtagning og kemisk analyse i høj opløsning er beskrevet i detaljer for kvantitativ kortlægning af opløste stoffer i jordstængler.
Abstract
Vi beskriver en metode til todimensionel (2D) visualisering og kvantificering af fordelingen af labile (dvs. ærbødig adsorberet) uorganisk næringsstof (f.eks. P, Fe, Mn) og forurenende stof (f.eks. Metoden kombinerer vaskbaseret opløst prøvetagning ved hjælp af diffusive gradienter i tyndfilmsteknik (DGT) med rumligt afløst kemisk analyse ved hjælp af laserablation, der er induktivt koblet plasmamassespektrometri (LA-ICP-MS). DGT-teknikken er baseret på tynde hydrogels med homogent fordelte analysandselektive bindingsfaser. De mange forskellige bindende faser gør det muligt at fremstille forskellige DGT-geltyper efter enkle gelfremstillingsprocedurer. Til DGT-geludrulning i rhizosfæren dyrkes planter i flade, gennemsigtige vækstbeholdere (rhizotroner), som giver minimal invasiv adgang til et jorddyrket rodsystem. Efter en prævækstperiode anvendes DGT-geler på udvalgte regioner af interesse for in situ solute sampling i rhizosfæren. Derefter hentes DGT-geler og forberedes til efterfølgende kemisk analyse af de bundne opløste stoffer ved hjælp af LA-ICP-MS line-scan imaging. Anvendelse af intern normalisering ved hjælp af 13C og ekstern kalibrering ved hjælp af matrixmatchede gelstandarder giver yderligere mulighed for kvantificering af 2D-opløste fluxer. Denne metode er unik i sin evne til at generere kvantitative, sub-mm skala 2D-billeder af multi-element opløst fluxes i jord-plante miljøer, overstiger opnåelige rumlige opløsning af andre metoder til måling opløste stigninger i rhizosfæren betydeligt. Vi præsenterer anvendelsen og evalueringen af metoden til billeddannelse af flere kationiske og anioniske opløste arter i rhizosfæren af jordbaserede planter og fremhæver muligheden for at kombinere denne metode med komplementære opløste billeddannelsesteknikker.
Introduction
Næringsstof erhvervelse af afgrøder er en vigtig faktor i fastsættelsen af afgrødeproduktivitet. Processerne for effektiv optagelse af næringsstoffer af afgrøder er blevet undersøgt intenst, især de mekanismer, der styrer næringsstoftilgængelighed til og næringsstof internalisering af planterødder på jord-rod interface, rhizosfæren, er anerkendt for deres rolle i afgrøden næringsstof erhvervelse. Vigtige processer for optagelse af næringsstoffer omfatter: næringsstoftransport mod roden; dynamisk udligning af sorptionen mellem arter, der er opløst i jordens porevand, og arter, der er bundet til faste jordoverflader mikrobiel konkurrence om næringsstoffer mikrobiel mineralisering af næringsstoffer, der er indeholdt i jordens organiske materiale; og næringsstof internalisering i roden symplasme. Optagelsen af uorganiske spormetal (oid) forurenende stoffer kontrolleres i vid udstrækning af de samme mekanismer.
Afhængigt af næringsstof- og forureningstilgængelighed, planteefterspørgsel og diffusitet i jorden kan der observeres differentialnæringsmønstre i rhizosfæren. For stærkt omstændelige elementer med forholdsvis høje internaliseringsrater (f.eks. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), udtømning af labile (dvs. reversibly adsorberet) element fraktion i forhold til bulk jord er fundet, med udtømning zone bredder ofte ≤1 mm, mens der for mere mobile næringsstoffer såsom NO3-, udtømning zoner kan strække sig op til flere centimeter1. Desuden er akkumulering af elementer som Al og Cd blevet observeret, når tilgængeligheden overstiger planteoptagelseshastighederne2,3.
I betragtning af rhizosfærens betydning for næringsstof - og kontaminantcykling er der udviklet flere teknikker til måling af den plantetilgængelsesfraktion ved høj rumlig opløsning4,5. Men måling af små labile opløste distributioner har vist sig at være udfordrende af flere grunde. En væsentlig vanskelighed er at udtage prøver af meget små (lave μL-afstande) mængder jord og/eller porevand på definerede positioner, der støder op til levende planterødder, for at løse de stejle næringsgradienter i rhizosfæren. En metode til at løse dette problem er at bruge mikrosugkopper til ekstraktion af porevandsprøver6. Med denne metode målte A. Göttlein, A. Heim og E. Matzner7 jord porewater næringsstofkoncentrationer i nærheden af Quercus robur L. rødder ved en rumlig opløsning på ~ 1 cm. En vanskelighed ved at analysere μL-mængder jord eller jordopløsning er, at disse små prøvemængder i kombination med de lave koncentrationer af alle arter undtagen de vigtigste næringsarter kræver meget følsomme kemiske analyseteknikker.
Et alternativt system, der er i stand til at løse næringsstofgradienter ved en opløsning ned til ~ 0,5 mm, er at dyrke en rodmåtte på overfladen af en jordblok med et tyndt hydrofilt membranlag, der adskiller jord fra rødderne8,9. I denne konfiguration kan opløste stoffer passere gennem membranen, og rødder kan optage næringsstoffer og forurenende stoffer fra jorden, mens rodudstråler kan spredes i jorden. Efter etableringen af et tæt rodlag kan jordblokken udtages prøver og skæres i skiver til opnåede jordprøver til efterfølgende ekstraktion af grundstoffraktioner. På denne måde kan endimensionale næringsstoffer og forurenende gradienter, der er gennemsnit på tværs af et relativt stort område (~ 100 cm2), analyseres.
En anden udfordring er at få prøver af labile, plante-tilgængelige element fraktion, da de fleste kemiske jord udvinding teknikker fungerer meget forskelligt i forhold til de mekanismer, hvormed planter optage næringsstoffer og forurenende stoffer. I mange jordudvindingsprotokoller blandes jorden med en ekstraktionsopløsning med det formål at etablere en (pseudo-)ligevægt mellem opløst og sorbed elementfraktion. Men planter internaliserer kontinuerligt næringsstoffer og nedbryder derfor ofte gradvist rhizosfærens jord. Selvom ligevægtsudvindingsprotokoller er blevet bredt vedtaget som jordprøver, da de er lette at implementere , repræsenterer den ekstraherede næringsstoffraktion ofte ikke den plantetilgedningsfraktion godt10,11,12,13. Synkemetoder , der kontinuerligt nedbryder den udtagne jord til næringsstoffer , er blevet foreslået som fordelagtige metoder og kan bedre ligne den underliggende næringsstofoptagelsesmekanisme ved at efterligne rodoptagelsesprocesserne10,11,14,15.
Ud over de ovenfor beskrevne metoder er der udviklet ægte billeddannelsesapplikationer, der er i stand til at måle kontinuerlige parameterkort med opløsninger ≤ 100 μm på tværs af synsfelter på flere cm2, for specifikke grundstoffer og jordkemiske (bio)kemiske parametre5. Autoradiografi kan bruges til at afbilde grundstoffordelingen i rhizosfæren, forudsat at der er egnede radioisotoper til rådighed16. Planaropoder gør det muligt at visualisering af vigtige kemiske jordbundsparametre såsom pH og pO 217,18,19, og enzymaktivitet eller samlede proteinfordelinger kan kortlægges ved hjælp af fluorescerende indikatorbilleddannelsesteknikker som f.eks. Mens zymografi og autoradiografi er begrænset til måling af en enkelt parameter ad gangen, pH og pO2 billeddannelse ved hjælp af planar optodes kan gøres samtidigt. De mere traditionelle rodmåtteteknikker giver kun 1D-information, mens mikrosugkopper giver punktmålinger eller 2D-oplysninger med lav opløsning, men begge tilgange giver mulighed for multielementanalyse. For nylig, PD Ilhardt, et al.25 præsenteret en ny tilgang ved hjælp af laser induceret opdeling spektroskopi (LIBS) til at kortlægge 2D samlede multi-element distributioner ved en opløsning på ~ 100 μm i jord-rod kerne prøver, hvor det naturlige element distribution blev bevaret ved omhyggelig prøve forberedelse.
Den eneste teknik, der er i stand til målrettet 2D-prøvetagning af flere næringsstoffer og forurenende stoffer opløst ved høj rumlig opløsning, er de diffusive gradienter i tynde film (DGT) teknik, en vask-baseret prøveudtagning metode, immobiliserer labile spormetal (loid) arter in situ på et bindende materiale indlejret i en hydrogel lag26,27. DGT blev indført som en kemisk speciation teknik til måling af labile opløste stoffer i sedimenter og vand, og blev snart vedtaget til brug i jord28. Det muliggør sub-mm skala multi-element opløst billeddannelse, som oprindeligt blev demonstreret i en flod sediment29, og er blevet udviklet yderligere til sin anvendelse i anlægget rhizosfærerne30,31,32,33.
Til DGT-prøvetagning påføres et gelark af en størrelse på ca. 3 cm x 5 cm på en enkelt planterod, der vokser i overfladelaget af en jordblok, med en hydrofil membran, der adskiller gelen fra jorden. I løbet af kontakttiden spredes labile næringsstoffer og/eller forurenende stoffer mod gelen og bindes straks af det bindende materiale, der er indbygget i gelen. På denne måde etableres en koncentrationsgradient og dermed en kontinuerlig nettoflux mod gelen og hersker i prøvetagningstiden. Efter prøveudtagning kan hydrogelen fjernes og analyseres ved hjælp af en analytisk kemisk teknik, der giver mulighed for rumligt løst analyse. En højt specialiseret og hyppigt anvendt teknik til dette formål er laser ablation induktivt koblet plasma massespektrometri (LA-ICP-MS). I nogle tidlige undersøgelser blev der også anvendt mikropartikelinduceret røntgenemission (PIXE)29. DGT-prøvetagning kombineret med LA-ICP-MS-analyse giver mulighed for kemisk billeddannelse med flere grundelementer ved en rumlig opløsning på ~100 μm. Hvis der anvendes meget følsomme ICP-MS-teknikker (f.eks. sektorfelt ICP-MS), kan der opnås usædvanligt lave detektionsgrænser. I en undersøgelse af effekten af limning på Zn og Cd optagelse af majs15, vi var i stand til at kortlægge labile Cd i majs rhizosfæren i uforurenet jord med en grænse for påvisning af 38 pg cm-2 af Cd per gel område. DGT, planar optodes og zymografi er afhængige af spredning af målelementet fra jord til et gellag, som kan udnyttes til kombineret anvendelse af disse metoder med henblik på samtidig eller fortløbende at forestille sig et stort antal parametre, der er relevante for vegetabilsk næringsstof- og kontaminantoptagelse. Detaljerede oplysninger om analytiske kemiske aspekter af DGT-billeddannelse , om mulighederne for at kombinere DGT og andre billeddannelsesmetoder og om dets anvendelser gennemgås grundigt i ref.34,35.
I denne artikel beskriver vi, hvordan man udfører et opløst billedeksperiment ved hjælp af DGT-teknikken på rødder af jordbaserede planter i et umættet jordmiljø, herunder plantedyrkning, gelfremstilling, gelapplikation, gelanalyse og billedgenerering. Alle trin er uddybet i detaljer, herunder noter om kritiske trin og eksperimentelle alternativer.
Protocol
1. Fremstilling af DGT-geler
BEMÆRK: Der findes flere DGT-geltyper til 2D-billeddannelse af labile opløste arter med høj (sub mm) rumlig opløsning35. Her er fremstillingen af tre velkaraktererede højopløsnings-DGT-bindingsgeler, der anvendes i opløste billedbehandlingsapplikationer, kort opsummeret. Laboratorieprocedurer for analyse af sporstoffer samt detaljerede fremstillingsprocedurer for alle præsenterede HR-DGT-geler er beskrevet i afsnit S1 og S2i supplerende oplysninger ( SI ).
- Polyurethanbaseret blandet anion- og kationbindingsgel (HR-MBG; SI S2.1)31
- Der fremstilles en polyurethangelaffjedring med homogent spredte zirconiumfaser (IV) hydroxid og iminodiacetatfaser (IDA).
- Gelaffjedringen belægges i en tynd film på en glasplade, og geldannelsen påbegyndes ved fordampning af opløsningsmidler for at opnå en 0,1 mm tynd, tåresikker blandet anion og kationbindingsgel (HR-MBG).
- Polyacrylamid-zirconia anionbindingsgel (HR-ABG; SI S2.2)36
- Fremstille en 0,4 mm tynd agarose krydsbundet polyacrylamidgel (APA) efter etablerede gelstøbningsprocedurer37 (se SI S2.4 for en detaljeret protokol for APA-fremstillingen).
- Udfælde zirconium (IV) hydroxid faser i den præfabrikerede APA gel for at opnå en 0,4 mm tynd anion bindende gel (HR-ABG).
- Polyacrylamid-iminodiacetate kationbindingsgel (HR-CBG; SI S2.3)38
- Forbered en polyacrylamid gel suspension med homogent spredte IDA faser.
- Kast gelen mellem to glasplader og start polymeriseringsreaktionen for at opnå en 0,4 mm tynd kationbindingsgel (HR-CBG), hvor IDA-faserne afregnes til den ene side af gelen.
2. Plantedyrkning
BEMÆRK: Forsøgssystemet bruger rhizotroner4 (Figur 1) til at dyrke planter i umættet jord til opløst billeddannelse. For det første beskrives rhizotronjordfyldning og vanding, så gives detaljer om den eksperimentelle plantevækst. Nærmere oplysninger om rhizotrondesignet og jordsubstratforberedelsen, inden den fyldes i rhizotronen, findes i SI-afsnit S3.
Figur 1: Rhizotron design (ikke at skalere). (A) Eksploderet visning af en rhizotron vækstbeholder. (B) Samlet rhizotron under plantevækst. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Rhizotron jordfyldning
- Før du fylder rhizotronen med forfugtet jord (gravimetrisk vandindhold,
er kendt; se SI S3.2), skal du lukke vandhullerne på bagsiden af rhizotronen ved hjælp af klæbebånd og fjerne frontpladen og dens fikseringsskinner og skruer. - Den tomme jordstængle (undtagen forplade, skinner og skruer), otte 5 cm x 11 cm akrylplader og 16 klemmer (Tabel over materialer) afvejes, og summen af vægtene registreres.
- Fastgør en lille akrylplade i bunden af rhizotronen ved hjælp af to klemmer på hver side med trykket fra klemmerne rettet mod rhizotronrammen, så pladen ikke bøjer indad, og lydstyrken er konstant.
- Hæld rhizotronen lidt mod den lille plastplade og fyld med for fugtet jord op til en højde på ~ 4 cm (Figur 2A). Fordel jorden inde i rhizotronen ved at omrøre rhizotronen lidt og forsigtigt komprimere jorden med et par mm (afhængigt af de specifikke jordegenskaber) med et komprimeringsværktøj (Figur 2B).
- Gentag 2.1.3 - 2.1.4, indtil rhizotronen er fyldt med jord (Figur 2C). Efterlad et hul på ~ 3 cm øverst til den efterfølgende plantning af frøplanter i rhizotronen.
- Afveje jordfyldte rhizotron (herunder 8 små plader og 16 klemmer) og registrere vægten. Fra dette trækkes den tomme rhizotronvægt opnået i 2.1.2 og registrerer vægtforskellen, dvs. massen af fugtig
jord, (g), i rhizotronen. - Massen af tør jord i rhizotronen,
(g), ifølge Eq. 1, og beregn derefter den tørre jordmassetæthed 
(g cm-3) i rhizotronen ifølge Eq. 2.
Her
(cm3)er det samlede indre volumen af rhizotronen.
BEMÆRK: Typiske værdier i rhizotronen er mellem 1,0-1,4 g cm-3. Må ikke overstige 1,5 g cm-3, da rodvæksten kan blive hæmmet over denne værdi. - Placer den jordfyldte rhizotron på en støttekasse, og fjern alle klemmer og små plader fra rhizotronen (Figur 2D). Rengør forsigtigt rhizotronrammen (dvs. kanterne) ved hjælp af silkepapir, da de resterende jordpartikler på rammen kan forårsage lækager.
BEMÆRK: Den blottede jordoverflade skal være homogen og jævnet med jorden uden revner eller huller. Hvis ikke, tøm rhizotronen og gentag 2.1.2 - 2.1.8. - To stykker polytetrafluorethylen (PTFE)(Tabel over materialer)folie til 22 cm x 13 cm hver. Derudover skæres et stykke plastfolie til 46 cm x 15 cm. Optag summen af PTFE og plastfolie vægte. Placer det første stykke PTFE folie på den øverste halvdel af den udsatte jordoverflade i rhizotronen, der strækker sig ~ 1 cm over jordoverfladen øverst på rhizotronen.
- Fastgør forsigtigt PTFE-folien til rhizotronrammen ved hjælp af tape(Figur 2E). Start med at fastgøre det ene hjørne øverst på rhizotronen først, efterfulgt af det modsatte hjørne og til sidst de to hjørner længere nede i rhizotronen. Påfør spænding ved fastgørelse af hjørnerne 2-4 for at sikre en flad folieoverflade. Hvis folder opstår, skal du åbne og fastgøre båndet igen i individuelle hjørner (ikke alle på én gang), indtil alle folder er fjernet, og PTFE-folien er flad og sammenhængende med jordoverfladen.
- Placer det andet stykke PTFE folie på den nederste ende af rhizotronen, overlappende den øverste PTFE folie stykke med ~ 1 cm. Gentag 2.1.10 for fastsættelse af den anden PTFE folie til rhizotron.
- Læg plastfolien (46 cm x 15 cm) på PTFE-folierne. Plastfolien fastgøres ved hjælp af fikseringsproceduren som beskrevet i 2.1.10.
- Placer en frontplade på den jordfyldte og foliedækkede rhizotron. Placer en skinne rundt om hver side af rhizotronen og stram skruerne i hånden for at fastgøre skinnerne og dermed frontpladen til rhizotronen. Skruerne er placeret mod den lukkede side af rhizotronen, dvs. siden med vandhullerne (Figur 1A).
- Før du fylder rhizotronen med forfugtet jord (gravimetrisk vandindhold,
er kendt; se SI S3.2), skal du lukke vandhullerne på bagsiden af rhizotronen ved hjælp af klæbebånd og fjerne frontpladen og dens fikseringsskinner og skruer.
jord, (g), i rhizotronen.
(g), ifølge Eq. 1, og beregn derefter den tørre jordmassetæthed 
(g cm-3) i rhizotronen ifølge Eq. 2.
(cm3)er det samlede indre volumen af rhizotronen.
Figur 2: Rhizotron samling og påfyldning til at dyrke planter i jorden for opløst billeddannelse i rhizosfæren. (A)Jordfyldning i rhizotronen. (B) Komprimering af den fyldte jord ved hjælp af et komprimeringsværktøj. (C) Jordfyldt rhizotron med små akrylplader og klemmer. d) Jordfyldt rhizotron med eksponeret jordoverflade. (E) Jordfyldt rhizotron delvist dækket af en beskyttende PTFE-folie. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Rhizotronhåndtering og DGT-gelapplikation. (A) Jordvanding ved hjælp af 10 mL pipettespidser i vandhullerne på bagsiden af rhizotronen. (B) Plantning af kimplanter (angivet som grønne pletter) i den jordfyldte og lukkede rhizotron. (C) Rhizotron beplantet med Salix smithiana stiklinger og fjernet frontplade og plastfolie dække. (D) Omhyggeligt afskalning af PTFE-foliedækslet inden DGT-gelpåføringen. (E) Høj opløsning foto af jord-rod interface ROI. (F) Påføring af frontpladen, der er udstyret med DGT-gelen, på rhizotronen. (G)Foto af investeringsafkastet med DGT-gelen anvendt under opløst prøveudtagning. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Vanding af jorden
- Bestem vandholdingskapaciteten (WHC) af den eksperimentelle jord i rhizotronen. Med henblik herpå fremstilles to rhizotroner med åben bund, og de fyldes med jord som angivet i punkt 2.1. Fuldt mætte disse åbne, jordfyldte rhizotroner ved nedsænkning i en vandbeholder i 16 timer og dræne rhizotronerne i 8 timer.
- Der udtages en sammensat jordprøve på ~50 g fra tilfældige steder i de åbne rhizotroner, og prøven tørres ved 105 °C for at bestemme i henhold til Eq. S1. Den bestemte svarer til jordens WHC og udtrykkes derfor som
(g g-1). - Definer målet i den eksperimentelle rhizotron. I vækstfasen skal der fastsættes en mængde på 60 % af WHC (dvs. WHC-faktoren)
for at forsyne anlæggene med en tilstrækkelig mængde vand, samtidig med at man undgår anoxiske forhold i rhizotronen. - Den samlede vandmasse, der skal tilsættes,
(g), beregnes for at overrisle jorden i rhizotronen ved målet i henhold til Eq. 3. Tegner sig for massen af vand til stede i jorden i rhizotronen, 
(g).
- Divider med antallet af rhizotronvandhuller (her 14) for at opnå den vandmasse, der skal tilsættes i hvert vandhul. Tilsæt vand ved at skubbe 10 mL pipettespidser ind i vandhullerne og lade vandet strømme ind i jorden ved tyngdekraften (Figur 3A).
- Plantevækst
- For spirefrø fra forsøgsplanten (f.eks. på vådt filterpapir) i henhold til de specifikke frøspiringskrav, indtil radicleen opstår (op til 1 cm lang).
- Plant op til to frøplanter i rhizotronen som angivet i figur 3B. Ved plantning tilsættes ~ 5 mL vand direkte til kimplanterne for at understøtte deres vækst. Dæk den øverste åbning af rhizotronen i de første ~ to dage efter plantning med en gennemsigtig, fugtbevarende film (Tabel over materialer). Wrap rhizotron i aluminiumsfolie for at forhindre mikrofytisk vækst.
BEMÆRK: Bortset fra frøplanter kan plantestiklinger også dyrkes i rhizotroner. - Overfør den plantede rhizotron til et vækstrum med miljømæssige forhold (dvs. temperatur, fugtighed, lysintensitet) indstillet til de specifikke plantekrav. Hæld rhizotronen ved 25°-35° for at sikre rodudvikling langs frontpladen via gravitropisme.
- Under plantevækst opretholdes målvandindholdet i rhizotronen ved periodisk vanding hver 2-4 dage ved hjælp af rhizotronvandhullerne som beskrevet i 2.2.5. Hold jordoverfladen på toppen åbning fugtig ved regelmæssige tilføjelser af ~ 5 mL vand.
BEMÆRK: Hvis planterne dyrkes i længere perioder, og plantebiomassen forventes at reducere mængden af vand, der tilsættes rhizotronen, betydeligt ved hjælp af den foreslåede metode, skal der redegøres for vægten af plantebiomassen ved at dyrke planter i separate rhizotronreplikater og høste og veje plantevævene med bestemte intervaller. - Når rødderne når et passende sted langs frontpladen, fortrinsvis i midten af rhizotronen, anvende DGT geler til prøveudtagning af rhizosfæren opløst distribution.
(g g-1).
for at forsyne anlæggene med en tilstrækkelig mængde vand, samtidig med at man undgår anoxiske forhold i rhizotronen.
(g), beregnes for at overrisle jorden i rhizotronen ved målet 
(g).
3. Prøveudtagning af opløst distribution
- Gel ansøgning
- Forhøjelse af rhizotronen fra 60 % til 80 % 24 timer før gelpåføring som beskrevet i 2.2.4.-2.2.5. Dette sikrer god jord-gel kontakt og giver mulighed for opløst diffusion i gelen og samtidig undgå anoxiske jordforhold under opløst prøveudtagning.
- Tag en ny, syrerenset frontplade, juster den på den rhizotron, der bruges til prøveudtagning, og marker de interesseregioner (ROI'er) på pladen. Overfør pladen til en laminar flow bænk eller andre støv-og metal-fri miljø, umærket side vender op.
- Skær DGT-bindingsgelen på en akrylstøtte til den krævede rektangulære størrelse svarende til ROI, normalt omkring 3 cm × 5 cm, ved hjælp af PTFE-belagte barberblade. Skær gelen ved at trykke i stedet for at skubbe barberbladet for at sikre et klart snit. Placer det rektangulære gelstykke på den umærkede side af pladen på den markerede placering af ROI.
BEMÆRK: Hvis DER anvendes HR-MBG, kan der tilsættes en 100 μm tynd afstandsfolie under gelen for at sikre, at gelen er i god kontakt med jordrodssystemet. - Skær en 10 μm tynd polycarbonatmembran (0,2 μm porestørrelse; Tabel over materialer) til en størrelse, der strækker gelstørrelsen med ≥1 cm i hver side og placerer membranen på gelen. Påfør noget vand for at fjerne luftbobler fra stakken.
- Ret membranen langs alle fire kanter ved hjælp af vinyl elektrisk tape(Table of Materials). I processen skal du forsigtigt fjerne luftbobler fanget i mellem gelen og membranen ved hjælp af plastcetter. Båndet må kun komme i kontakt med membranen og ikke med gelen.
BEMÆRK: Hvis båndet kommer i kontakt med gelen, er luftbobler fanget mellem gelen og membranen, eller den endelige membranoverflade viser folder, skal gel/membranstakken samles igen, da opløste svømninger i gelen kan blive forringet35 (gentag 3.1.3 - 3.1.5). - Placer rhizotronen på et stativ, fjern skinnerne og løft forsigtigt frontpladen af (Figur 3C). Plastfolien fjernes, PTFE-folien skæres af i rhizotronens kanter, og PTFE-folien skrælles langsomt af for at undgå forstyrrelser i jordrodssystemet (Figur 3D).
- Tag et ortogonalt foto af investeringsafkastet ved hjælp af et digitalt DSLR-kamera (single-lens reflex)(Table of Materials)for at lette fortolkningen og præsentationen af den opløste fordeling baseret på jordstrukturen og rodmorfologien (figur 3E). Brug et kamerastativ og, hvis det er muligt, et makroobjektiv. Juster kameraet, så midten af billedet svarer til midten af INVESTERINGSAFKASTET, og kameraets fokusplan er parallelt med jordoverfladen. Medtag en skalalinje (f.eks. en lineal) på billedet.
- Sæt pladen udstyret med gel/membranstakken fast på den åbne rhizotron (Figur 3F). Juster derfor den ene kant af pladen med en kant af rhizotronen og 'bøj' forsigtigt pladen mod jorden. Denne anvendelsesmåde hjælper med at undgå luftbobler mellem gel/ membranstakken og jordrodssystemet. Fastgør frontpladen ved hjælp af skinner og skruer.
BEMÆRK: Dette trin er kritisk og skal udføres omhyggeligt. Pladen kan ikke flyttes efter at have etableret kontakt mellem gel/membranstakken og jordrodssystemet uden at fortrænge jord og rødder. - Registrer det nøjagtige starttidspunkt for geludrulning, og tag et billede af den anvendte gel ved ROI som angivet i 3.1.7 (Figur 3G). Wrap rhizotronen i aluminiumsfolie og overføres til vækstrummet indtil udgangen af den opløste prøvetagningsperiode (ofte 24 timer).
- Forhøjelse
- Hentning af gel
- Placer rhizotronen på en støtteboks, løft forsigtigt frontpladen af og skyl gel/membranstakken på pladen med vand for at vaske vedhængende partikler af(Figur 4A). Registrer det nøjagtige sluttidspunkt for geludrulning. Prøve jord fra ROI at bestemme den faktiske wjord i rhizotronen i henhold til Eq. S1.
- Overfør frontpladen til laminar flowbænken, gel/membranstakken med forsiden mod. Gelen hentes fra frontpladen ved forsigtigt først at fjerne båndet langs alle fire kanter og derefter polycarbonatmembranen, der dækker gelen (Figur 4B). Påfør vand for at hjælpe gelen til at flyde frit på en tynd film af vand på pladen med jord-kontakt side vender op.
BEMÆRK: Det er vigtigt at holde styr på gelretningen. Gelsiden, der udsættes for jorden og rødderne, skal altid vende op (mod brugeren).
- Geltørring
- Skær et rektangulært stykke gel blotting papir (Tabel over materialer) og læg et lidt mindre stykke af en polyethersulfon membran (0,45 μm pore størrelse; Tabel over materialer) på toppen.
- Gelen overføres fra pladen til gel blottingpapir/membranstakken ved hjælp af plastcweezer, jordkontaktsiden med forsiden mod hinanden. Gelen skal være afslappet (dvs. ikke strakt) og helt flad uden luftbobler mellem gel og membran. Påfør noget vand på gel blotting papir / membran stakken for at lette gel overførsel og positionering.
- Gel blotting-papiret/membranen/gelstakken dækkes fuldstændigt med et stykke plastfolie, og gelprøven mærkes, og dens retning på plastfolien (Figur 4C). Gel blottingpapiret/membranen/gel/plastfoliestakken anbringes i en vakuumgeltørrer (Materialetabel) og tørres, indtil stakken er helt udtørret (typisk 48-72 timer). For HR-MBG skal du indstille temperaturen til 50-55 °C, så HR-ABG og HR-CBG bedst tørrer ved stuetemperatur.
- Fjern gel blottingpapiret fra den tørrede stak og overfør gelen, som nu er uadskilleligt fusioneret med polyethersulfonmembranen, i en lynlåspose. Plastfoliedækslet forbliver på gelen indtil kort før LA-ICP-MS-analysen.
- Medtag et gelstykke fra det originale gelark som en metodet blank, som ikke bliver udsat for jord. Metodens blanke gel er identisk med prøvegelen efter 3.3.2 - 3.3.4.
Figur 4: DGT-geludtagning og forberedelse til tørring ved opløst prøveudtagning. (A)Plade med DGT gel og rhizotron umiddelbart efter opløst prøveudtagning. (B) Hentning af DGT-gelen fra pladen i en laminarflowbænk. (C) Stak af gel blotting papir / polyethersulfon membran / DGT gel / plastfolie dække til gel tørring. Bemærk, at gelen er lidt farvet efter dens indsættelse på rhizosfæren jord. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Kemisk analyse af DGT-bindingsgelen
BEMÆRK: I denne protokol foretages analysen af opløst distribution på DGT-bindingsgelen af LA-ICP-MS ved hjælp af et nanosekund 193 nm ArF excimer LA-system udstyret med en to-volumen ablationscelle koblet til en firedobbelt ICP-MS (Figur 5). Alle instrumenter er anført i materialeoversigten. Alternativt kan nanosekund 213 nm eller 266 nm solid state LA-systemer anvendes36,39,40,41,42,43. Hvis der kræves øget følsomhed eller masseopløsning, er sektorfelt-ICP-MS et alternativ til firdobbelt ICP-MS15,44. Nærmere oplysninger om udarbejdelsen af DGT-gelstandarder for ekstern kalibrering og kobling af LA-systemet til det firedobbelte ICP-MS findes i SI-afsnit S4 og S5.
Figur 5: LA-ICP-MS-opsætning til DGT-gelanalyse. (A) Nanosekund 193 nm ArF excimer LA-system og firdobbelt ICP-MS. (B) Tørrede geler monteret på glasplader og fastgjort på LA-prøvestadiet klar til indføring i ablationscellen. (C) Forstøvergas (Ar) fra ICP-MS og aerosolbærergas (han eller Ar) fra ablationscelle, der er tilsluttet ICP'et via en tovejs Y-splitter- og fakkeladaptermontering. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Prøveforberedelse til LA-ICP-MS
- De tørrede gelprøver, standarder og metodeemner overføres (som sammenlægges med polyethersulfonmembranstøtten) på individuelle stykker dobbeltsidet klæbebånd (Tabel over materialer), gelsiden vender op. Beskær overskydende bånddele for at spare plads i ablationscellen.
- Monter de tørrede geler på glasplader. Brug individuelle glasplader til hver gelprøve, standardserie eller metodetæd for at muliggøre fleksibelt arrangement på LA-prøvestadiet (typisk størrelse på 10 cm × 10 cm). Brug en glasscutter til at justere glaspladens størrelse efter behov. Glaspladerne fastgøres med gelerne på LA-prøvestadiet (Figur 5B) ved hjælp af plasticin (Materialetabel). Geloverfladen udjævnes ved at justere scenegulvet og låse prøvestadiet i ablationscellen.
- LA-ICP-MS-analyse af linjescanning
- Par LA-systemet med ICP-MS som angivet i SI-afsnit S5. I LA-softwaren (Table of Materials) skal du indstille kameralysindstillingerne (dvs. 'Ring', 'Coax' og 'Transmitteret') for at belyse geloverfladen i ablationscellen og fokusere på geloverfladen ved at justere z-akseafstanden. Flyt til tilfældige steder på tværs af cellen for at sikre, at alle geloverflader er i fokus.
- Angiv LA-parametrene i vinduet 'Laser Setup' i LA-softwaren. Typiske indstillinger, der anvendes i LA-ICP-MS-linjescanningsanalyse af DGT-geler, er: tilstand kontinuerlig; energiproduktion 20-30%; gentagelseshastighed 10-20 Hz punktdiameter 100-200 μm scanningshastighed 150-250 μm s-1.
BEMÆRK: Parametrene skal optimeres til den anvendte type gel og kan variere. Parametre kan også forbedres for at øge signal til støjforhold, rumlig opløsning eller reducere anskaffelsestider afhængigt af den eksperimentelle og instrumentale opsætning. Brug en relativt lav energiproduktion (≤40 %) og gentagelseshastighed (≤25 Hz) for at undgå at trænge gennem gelerne ind i bagmaterialerne39. Sørg for, at laserscanningshastigheden ≤ punktdiameteren divideret med den samlede varighed af ICP-MS-scanningscyklussen (se 4.2.6) for at undgå komprimering af datapunkterne og dermed et tab af opløsning i scanningsretning45. Ved indstilling af en staffagediameter på 200 μm og en samlet varighed af ICP-MS-scanningscyklussen ≤ på0,25s skal scanningshastigheden f.eks. - Vælg stregværktøjet, og tegn et enkelt, ~1 mm langt stregmønster på tværs af en gelstandard. Højreklik på stregmønsteret i vinduet 'Scanningsmønstre', og kontroller, at LA-parametrene er angivet i 4.2.3. er blevet vedtaget. Brug værktøjet 'Dupliker scanninger' til at duplikere denne linje fire gange med en interlinjeafstand (afstand mellem linjens centrum) større end staffagediameteren (Figur 6). Denne fremgangsmåde giver i alt fem parallelle linjer pr. gelstandard (n = 5). Gentag dette trin for hver gelstandard, kalibreringst blank og metoden er tom.
- Flyt til gelprøven, og tegn en enkelt linje langs den øverste kant af det rektangulære område, der skal analyseres. Dupliker linjen for at oprette parallelle linjer for hele prøveområdet som angivet i punkt 4.2.3. Brug en interline-afstand på 300-400 μm. Sørg for, at fokus (z-akseafstand) er indstillet korrekt for hvert start- og slutpunkt for hver linje.
BEMÆRK: Analysens rumlige opløsning er højere langs scanningsretningen sammenlignet med interline-afstanden. Derfor kan start- og slutpunkterne på linjerne bedst følge analysandens hældningers retning. For rhizosfæregradienter er dette normalt vinkelret på rodaksen (Figur 6). - I ICP-MS-softwaren (Table of Materials) skal du konfigurere en tidsløst metode ' DataOnly' på skærmen 'Method', vælge en eller flere egnede isotop(er) for hver analysand og medtage 13C som intern normaliseringsstandard31,36,40,41,42. Kontroller, at detektionen af isotoper ikke forringes af interferens46.
- Angiv den samlede varighed af scanningscyklussen for ICP-MS-metoden ('Est. læsetid') til ≤0,5 s med passende opholdstider pr. isotop (typisk mellem 10-50 ms). Indstil ICP-MS 'Readings' til 1, og ret værdien 'Readings/Replicate' for at indstille den samlede måletid pr. prøve ('Est. Sampling Time'), dvs. Dette afhænger af de specifikke LA-parametre og linjeafstande, der er fastsat i 4.2.2 - 4.2.4.
- Til datarapportering skal du bruge tilstanden intensitet kontra tidsdatasamling og angive indstillingen 'Indstillingen For skrivningaf filer ' til 'Ny pr. eksempel' for at oprette en individuel datafil (her .xl) for hver ablationslinje.
- Der skaloprettesen batcheksempelsekvens på skærmen ICP-MS 'Sample', hvor hver eksempelpost svarer til en individuel ablationslinje, der er angivet i 4.2.3 - 4.2.4.
- Klik på 'Analyser batch' for at starte eksempelsekvensen på ICP-MS, som venter med dataindsamling, indtil den udløses af den første laserpuls (se SI S5 for at få oplysninger om udløserkonfigurationen).
- I LA-softwaren skal du vælge alle de linjer, der skal analyseres, og kontrollere, at ICP-MS-metoden ('Est. Sampling Time', se 4.2.6.) svarer til varigheden af de enkelte linjeafblationer, som typisk er forskellig for gelprøver, standarder og metodeb blanktegn. Gentag 4.2.6. for at justere ICP-MS-metoden, hvis det er nødvendigt.
- Klik på 'Emission' i vinduet 'LaserEnergi' for at genoplade laserhovedet, og klik derefter på 'Kør' for at åbne vinduet 'Kør eksperiment'. Her skal du vælge 'Kun valgte mønstre', indstille 'Udvaskningsforsinkelse' til 20-30 s, markere feltet 'Aktiver laser under scanninger' og indstille 'Laseropvarmningstid' til 10 s.
- Klik på 'Kør' i vinduet 'Kør eksperiment' for at starte analysen af linjescanningen og overvåge den rå signalintensitet i antal pr. sekund (cps) for hver isotop på ICP-MS i realtid. Hver linje skal starte ('Laser Warmup Time', 10 s) og ende ('Washout Delay', 20-30 s) med en gas blank.
- Overvåg laserfluxen (J cm-2)under analysen for at vurdere laserstabiliteten. Hvis udsvinget varierer meget, skal du afbryde analysen og kontrollere, at laserkilden og/eller dens spejlsystem er fuldt funktionsdygtigt.
- Efter analysen skal du stoppe ICP-MS-plasmaet og indstille bæregasstrømshastigheden på LA-systemet til 0 mL min-1. Fjern gelerne fra ablationscellen og opbevar dem i lynlåsposer til videre brug.
Figur 6: Skematisk over FORSØGSDESIGNET DGT LA-ICP-MS (ikke til skala). Illustrationen viser den DGT-baserede in situ-opløste prøvetagning i rhizosfæren og LA-ICP-MS-kortlægningen af opløste fordeling på geloverfladen, herunder et nærbillede, der viser eksemplariske linjescanningsdimensioner og -parametre. Bemærk, at DGT-gelen vendes vandret, når den overføres fra rhizosfærens jord til glaspladen, som angivet ved rektanglets placering i det nederste hjørne af DGT-gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Databehandling og kalibrering
- Importer rådatafilen (.xl) for hver ablated linje i regnearkssoftware (Tabel over materialer). Den rå datatabel viser ICP-MS-aflæsningerne (datapunkter) for hver isotop i cps og de tilsvarende tidspunkter i s. Vis alle linjer ved siden af hinanden i forskellige kolonner.
- Vurder linjescanningsdataene for signalstabiliteten af den interne standard (13C) og passende udvaskningstider.
- Beregn en gennemsnitlig gastæmning for hver isotop fra alle gasb blanke værdier, der er registreret før linjens ablations (dvs. i løbet af laseropvarmningstiden), og træk den gennemsnitlige gastæt fra de tilsvarende rå intensiteter for hver isotop for at korrigere for baggrundssignalet.
- Påfør intern normalisering ved at dividere signalintensiteten af hver isotop (cps) med signalintensiteten af den interne standard (cps) for hvert datapunkt for at korrigere for variationer i mængden af ablated materiale og instrumental drift.
- Beskær data før starten og efter afslutningen af hver ablated linje for at fjerne baggrundssignalet. Transponer datatabellen for at hente en gittermatrix, hvor hver række svarer til en ablated linje og hver kolonne til en normaliseret isotopintensitetsværdi. Adskil matricer for hver isotop i individuelle regneark.
- Det gennemsnitlige normaliserede signalintensitetsforhold pr. isotop beregnes for kalibreringsstandarderne og kalibreringsprøven, og kalibreringsfunktionen (y = ax + b) beregnes ved hjælp af en lineær regressionsmodel med gelstandard analysandbelastningerne (μg cm-2; se SI S4) som x-værdier. Kalibreringsfunktionen for hver isotop for linearitet47.
- Anvend kalibreringsfunktionen på eksempeldatamatrixen. De normaliserede signalintensitetsforhold
konverteres til gelanalytbelastninger 
(μg cm-2) og derefter til tidsgennemsniterede opløste fluxer 
(pg cm-2 s-1) for hver isotop og datapunkt i henhold til Eq. 4 og Eq. 5:
Her er en hældning af kalibreringslinjen, b er kalibreringslinjens skæringspunkt, og t(er) er geludrulningstiden under opløst prøveudtagning. - Gem den kalibrerede eksempeldatamatrix for hver analysand som txt-fil.
- Oprettelse af afbildning
BEMÆRK: Sørg for at undgå pixel interpolation under alle trin i billedgenerering, da dette kan føre til kunstigt glattede opløste fluxgradienter i de resulterende billeder.- Importer den kalibrerede eksempeldatamatrix (.txt) som tekstbillede i billedanalysesoftwaren (Tabel over materialer).
- Afstanden pr. pixel beregnes i x-retning (dvs. sideværts opløsning) ved at gange laserscanningshastigheden med den samlede varighed af ICP-MS-scanningscyklussen (f.eks. hvis der antages en scanningshastighed på 200 μm s-1 og en samlet varighed af scanningscyklussen på 0,25 s, svarer sideopløsningen til 50 μm). Afstanden pr. pixel i y-retning svarer til den interline-afstand (Figur 6).
- Beregn billedets højde-bredde-forholdskorrektionsfaktor. Del derfor afstanden pr. pixel i y-retning (f.eks. 300 μm) med afstanden pr. pixel i x-retning (f.eks. 50 μm). Anvend den opnåede y/x-korrektionsfaktor (i dette eksempel 6) under 'Skala'. Påfør afstanden pr. pixel (i μm eller mm) i x-retning som skalering under 'Angiv skala'.
- Anvend en'Slå tabel op',dvs. Tilføj en 'Kalibreringslinje', og gem det opløste billede som en tiff-fil.
- Kopier det opløste billede ved hjælp af kommandoen 'Kopier til system' i billedanalysesoftwaren, og indsæt det i desktop publishing-softwaren ( Table ofMaterials). Skaler-match, juster og komponer det opløste billede med billedet af investeringsafkastet opnået i 3.1.7.
BEMÆRK: Før du kopierer, skal du ændre størrelsen på det opløste billede ved f.eks.
konverteres til gelanalytbelastninger 
(μg cm-2) og derefter til tidsgennemsniterede opløste fluxer 
(pg cm-2 s-1) for hver isotop og datapunkt i henhold til Eq. 4 og Eq. 5:
| DGT gel fabrikation | Dyrkning af planter | In situ-opløst prøveudtagning | LA-ICP-MS solute flux kortlægning |
| HR-MBG 1 uge |
Jordforberedelse 1 uge |
Gel ansøgning 1 time pr. gel |
Prøveforberedelse 1 time pr. gel |
| HR-ABG 3 dage |
Rhizotron samling 2 timer pr replikat |
Opløst prøvetagningsperiode variabel, typisk 24 timer |
LA-ICP-MS-analyse 1 dag pr. gel |
| HR-CBG 3 dage |
Plantevækst afhængig af studier |
Hentning af gel 1 time pr. gel |
Databehandling 4 timer pr gel |
| Geltørring 2-3 dage |
Oprettelse af afbildning 10 min pr. billede |
Tabel 1: Omtrentlige tidspunkter for generelle trin i DGT LA-ICP-MS-teknikken.
Representative Results
For at demonstrere DGT-billeddannelsesmetodens kapacitet og datadetaljer udarbejdede vi sub mm, 2D flux-fordelingen af flere labile næringsstoffer og forurenende opløste arter i jord, der støder op til rødderne af Fagopyrum esculentum og Salix smithiana (Figur 7). De omtrentlige tidspunkter for protokollens generelle proceduretrin er anført i tabel 1.
Solute billeder i figur 7 blev genereret i tre forskellige undersøgelser ved hjælp af enten HR-MBG eller HR-CBG bindende geler. De kemiske billeder viser 2D-opløst fluxfordeling ved en rumlig opløsning på 82-120 μm langs x-aksen og 300-400 μm langs y-aksen, afhængigt af de anvendte LA-ICP-MS-parametre. Da der ikke blev anvendt interpolation under billedkalibrering og tilpasning af størrelse, repræsenterer enkelte pixel målte datapunkter. Justering af de opløste billeder med et fotografisk billede af ROI afslører, at sub-mm, 2D opløst flux fordeling af forskellige elementer er meget varierende i henhold til jordstruktur og rodmorfologi. Dette kan tilskrives den differentierede biogeokemiske adfærd af elementerne i jord-rhizosphere-plantesystemet og deres interaktion med jordmatrixen og planterødderne.
I figur 7A labile uorganiske Mg, Al, P, Mn og Fe opløst fluxes blev visualiseret omkring en ung F. esculentum rod dyrket i karbonat-fri jord befrugtet med NH4NO3. Den sub-mm opløste fordeling viste zoner med nedsat Al, P og Fe fluxes sammen med ældre rodsektioner på grund af rodoptagelse, og stærkt øgede Mg, Al, P, Mn og Fe fluxes ved roden spids på grund af lokaliserede P mobilisering processer af F. esculentum roden. Bemærk, at rodspidsen er placeret noget bag jordoverfladen og derfor næppe synlig i det fotografiske billede. Figur 7B viser fordelingen af labile spormetaller, herunder Mn, Fe, Zn, Cd og Pb omkring en rod af metaltolerante S. smithiana dyrket i en jord moderat forurenet med Zn, Cd og Pb. De opløste billeder visualiserede tydelig udtømning især af Zn, Cd og Pb på den umiddelbare rodposition, der viser, at S. smithiana rødder fungerer som en lokaliseret vask for labile spormetaller i forurenet jord. Desuden kan lokaliserede stigninger i Zn, Cd og Pb flux observeres, hvilket indikerer akkumulering af disse spormetaller ved den umiddelbare jordrodsgrænseflade.
Ud over multi-elementært opløst billeddannelse kan den præsenterede metode også kombineres med komplementære diffusionsbaserede billeddannelsesteknikker såsom planar optodes34. Dette fremgår af figur 7C, hvor distributionen af labile spormetaller i S. smithianas rhizosfære blev lokaliseret sammen med fordelingen af pH ved hjælp af en kombineret planær optode-DGT-kationbindinggel 33. Jordsubstratet blev befrugtet med (NH4)2SO4, hvilket førte til et pH-fald langs rodakserne med ~ 1 enhed sammenlignet med bulkjord. PH-reduktionerne blev co-lokaliseret med øgede opløste fluxer af Mn, Fe, Co, Ni, Cu og Pb, hvilket tyder på pH-induceret metalopløselighed.
Desuden viser disse eksempelresultater nogle af de potentielle billedgenstande, der kan opnås. For eksempel kan strukturelle jordinhomogeneiteter, f.eks. observeret som en vandret linje i den nederste tredjedel af ROI-billedet af figur 7A, forårsage jord-gel-kontaktafbrydeligheder, hvilket resulterer i begrænset diffusion på dette sted i bindingsgelen. Omvendt kan overdreven jordkomprimering i rhizotronen føre til dårlig porøsitet, hvilket resulterer i et kunstigt skift af jordens redox-status mod anoxi. Dette er illustreret i figur 7B, hvor omfattende områder med højt forhøjede Mn og Fe fluxes i de opløste billeder visuelt matchet med et tæt lag jord i ROI billedet. Dette tyder på en nedsat jord redox potentiale på grund af høj jord komprimering, hvilket resulterer i reduktiv opløsning og opløselighed af de meget redox-følsomme elementer. Omhyggelig rhizotronfyldning og visuel inspektion af jordoverfladen direkte efter påfyldning anbefales derfor.
Figur 7: Sub-mm 2D-fordeling af labile næringsstoffer og forurenende grundarter på tværs af forskellige jordrodsgrænseflader. (A)Fordeling af anioniske P og kationiske Mg, Al, Mn og Fe solutes omkring en ung F. esculentum rod. Co-lokaliseret prøveudtagning af anioniske og kationiske opløste blev opnået ved hjælp af HR-MBG i 24 timer ved en jord vandmætning på ~ 75% WHC. Al-, P- og Mn-billederne vises som kalibrerede fDGT-værdier (pg cm-2 s-1), mens Mg- og Fe-billeder viser 13C-normaliserede intensiteter. Skalalinjen repræsenterer 1 cm. Dette tal er tilpasset fra ref.48. (B) Der blev udtaget prøver af fordelingen af Mn, Fe, Zn, Cd og Pb omkring en S. smithiana-rod dyrket i jord, der var moderat forurenet med Zn, Cd og Pb. Der blev udtaget prøver af kationiske spormetalsoller ved hjælp af HR-CBG i 20 timer ved en jordvandmætning på ~80 % WHC. Alle billeder vises som kalibrerede fDGT-værdier (pg cm-2 s-1). Skalalinjen repræsenterer 0,5 cm. Dette tal er tilpasset fra ref.3. ( C) Fordeling af pH og flere kationiske opløste stoffer omkring S. smithiana rødder dyrket i jord tilsat Cd. Co-lokalisering af pH og opløst dynamik blev opnået ved hjælp af en ændring af HR-MBG-protokollen, der giver mulighed for samtidig opløst prøveudtagning og planar optode imaging33. Billederne Mn, Cu, Zn og Cd vises som kalibrerede fDGT-værdier (pg cm-2 s-1), mens Fe-, Co-, Ni- og Pb-billeder viser 13C-normaliserede intensiteter. Skalalinjen repræsenterer 1 cm. Dette tal er tilpasset fra ref.33. De fremlagte tal er gengivet fra de nævnte artikler3,33,48 licenseret i henhold til CC BY. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Klik her for at hente denne fil.
Discussion
Den opløste billedprotokol, der præsenteres her, er en alsidig metode til at visualisere og kvantificere 2D-næringsstoffer og forurenende fluxer i jord-plantemiljøer. Det er unikt i sin evne til at generere sub-mm skala multi-element billeder af labile opløst arter på jord-rod interface, overstiger opnåelige rumlige opløsning af alternative metoder til måling af opløste stigninger i rhizosfæren væsentligt4. DGT's målrettede in situ-prøvetagningsmetode i kombination med en meget følsom kemisk analysemetode som LA-ICP-MS gør det lettere at foretage en detaljeret undersøgelse af opløst fluxdynamik omkring individuelle planterødder, der dyrkes i jord eller lignende substrater. På grund af den vaskbaserede prøvetagningsproces afspejler de opnåede billeder den visualiserede opløstes labilitet og er derfor et skøn over deres plantetilgængelighed10. Selv om den metode-iboende måling af opløste fluxer bærer betydelige fordele som fortolkelighed som plante-tilgængelige næringsstof fraktioner, flux målinger er langt mindre ligetil at forstå end porewater koncentration målinger. DGT-standardprøvetagningsgeometrien i bulkjordanvendelser (navnlig de 0,8 mm tykke diffusionsgeler, der anvendes i denne opsætning) gør det muligt at sammenligne den faktiske porevandskoncentration, csoln, og et skøn over den tidsgennemsnitige porevandkoncentration ved hjælp af en GDT-måling i løs vægt ogfor fortolkningen af disse parametre vedrørende genforsyningsdynamikken for en opløst art. En sådan sammenligning kan imidlertid ikke foretages på grundlag af gdt-billeddannelse med meget tynde diffusionslag, da de afledte cDGT-værdier er urealistisk små34. DGT's billeddannelsesresultater er derfor ikke altid enkle og hurtige at fortolke og kan ofte ikke direkte sammenlignes med mere konventionelle målinger af porevandskoncentrationen.
Ved anvendelse af metoden skal et par kritiske trin nøje overvejes, hovedsagelig relateret til påfyldning og vanding af rhizotronvækstbeholderne. Under påfyldning af jorden i rhizotronen er det meget vigtigt at undgå at komprimere jorden for meget, da planterødderne ikke kan trænge stærkt komprimeret jord og rodvækst vil blive hæmmet. Vi har observeret rødder, der undgår stærkt komprimeret jord og vokser langs rhizotronvækstbeholderens indre kanter, hvor jorden normalt er mindre komprimeret. I dette tilfælde kan individuelle rødder placeret i midten af rhizotronerne, hvor DGT-geler kan anvendes bekvemt, slet ikke udvikle sig og effektivt hæmme vellykket gelapplikation. I vores laboratorium viste erfaringen, at tørjords bulktætheder på 1,0-1,4 g cm-3 tillader uhindret rodudvikling. Desuden er overdreven jordkomprimering også en potentiel kilde til artefakter vedrørende opløseligheden af rødoxfølsomme elementer og biogeokemisk forbundne arter. Da det samlede porevolumen reduceres, og porediameterfordelingen flyttes mod lavere diametre i stærkt komprimeret jord, er der mindre luftfyldt porevolumen med større diameter til rådighed, hvilket kan føre til reduktive forhold lokalt. Derfor kan MnIII/IV- og FeIII-oxider reduceres, hvilket fører til øgede Mn2+ og Fe2+ fluxer. Opløsningen af Fe-oxider, som er vigtige sorptionssteder, f.eks. Et lignende problem kan opstå, hvis vækstbeholderne vandes for meget. Fordampning via det lille jordoverfladeareal øverst på vækstbeholderen er lav, og jorden kan forblive vandmættet i op til flere uger efter plantningen, hvilket også kan forårsage redox-artefakter.
En anden vigtig overvejelse er den kemiske funktionalitet af den fabrikerede HR-DGT bindegel. Ved at følge protokollen opnås tynde geler med en homogen fordeling af bindingsfaser. Hvis gelerne har områder med inhomogen materialefordeling (f.eks. huller i gelen eller aggregater af bindende faser), skal disse områder fjernes, eller hvis den er for omfattende, skal gelfremstillingsprotokollen gentages. Hvis gelen fremstilles korrekt, skal den være i stand til at binde de målsolutearter, der diffunderer i gelen straks og kvantitativt27, hvilket bestemmes af den analysandspecifikke gelbindingskapacitet. Selv om overskridelse af gelkapaciteten er mindre problematisk i uforurenet jord, bør det overvejes i metalforurenet jord og saltvandsjordmiljøer. Mætning af gelbindingsfaserne vil ikke kun forringe den kvantitative opløste prøvetagning, men også resultere i lateral diffusion af opløste stoffer mellem bindende faser i gelen, hvilket fører til en ubestemt lokalisering af små opløste flux-egenskaber. Hvis der således forventes meget store mængder labile næringsstof-/kontaminantarter i måljordmiljøet, bør der udføres indledende test. Til vurdering af forventede DGT-belastninger kan prøvetagning af STEMPEL i bulkjord efterfulgt af gelefering og vådkemisk analyse anvendes15,49. Hvis det er nødvendigt, kan DGT's udrykningstider justeres for at reducere gelkontakttiden og dermed undgå gelmætning over kapacitetstærsklerne. Omvendt kan indledende test også være nyttige til at identificere påkrævede gelkontakttider og/eller LA-ICP-MS-følsomheder, hvis der forventes meget lave opløste belastninger, hvilket kan være vigtigt for kortlægning af sporstofsoluter på naturlige jordbaggrundsniveauer15. Desuden bør den korrekte DGT-gelfunktion verificeres, inden den anvendes på forsøgsbasen, via kontrolleret indlæsning af geler ved udarbejdelsen af DGT LA-ICP-MS-kalibreringsstandarder. Gelstandarden giver en matrixmatchet analysandbelastning, der kan bruges til at vurdere, om prøvegelbelastningen bestemt af LA-ICP-MS ligger inden for det forventede interval. Hvis operatøren ikke er i stand til at opnå et signal, der er forskelligt fra gassen og metoden, skal han sikre sig, at laboratorieprocedurerne for analyse af sporstoffer er gennemført, og at alle protokoltrin er udført korrekt. Nogle gange vendes DGT-gelen ved et uheld efter opløst prøvetagning med den jordudsatte, belastede side mod glaspladen i stedet for laserstrålen, hvilket resulterer i lave signalintensiteter og fejlagtigt vendt funktioner i de endelige opløste fluxbilleder.
Under LA-ICP-MS-analysen genereres en stor mængde data, hvilket tager lang tid at evaluere. I vores laboratorium bruger vi interne dataevalueringsscripts, der er skræddersyet til vores måldataoutputformat ved hjælp af standardregnearksoftware. Efter halvautomatisk sortering og kalibrering udføres billed plotning ved hjælp af open source, open access billedanalyseværktøjer (ImageJ, Fiji50). Denne tilgang giver fuld kontrol over datasortering, evaluering og præsentation, hvilket er vigtigt, fordi de indsamlede data svarer til rektangulære og ikke kvadratiske pixel, som skal vises korrekt i de genererede opløste kort. Desuden bør enhver pixel interpolation omhyggeligt undgås under databehandling. Pixel interpolation fører til udjævnede stigninger i de kemiske billeder, hvilket resulterer i blødgjorte, ofte cirkulære elementfordelingsfunktioner og er derfor en uønsket ændring af de oprindelige data. Pixel interpolation er en standardprocedure i omskalering og omformatering af handlinger i mange billedbehandlingssoftwareprodukter, men kan fravælges normalt.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den beskrevne metode er et betydeligt fremskridt for forståelsen af næringsstof- og kontaminantdynamik i naturlige jord-rhizosphere-plantesystemer. Ud over DGT-applikationer kan metoden kombineres med andre diffusionsbaserede billeddannelsesteknikker som planaroptodes3,33,42,43,48,51 og zymografi20,21,22,23,24og kan udvikles yderligere til at inkludere yderligere elementer og jordparametre.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev medfinansieret af den østrigske videnskabsfond (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) og den østrigske videnskabsfond (FWF) og delstaten Niederösterreich: P27571-BBL (Jakob Santner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
| Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
| Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
| Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
| Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
| Clamp | Local warehouse | n/a | |
| Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
| DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
| DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
| Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
| Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
| Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
| Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
| Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
| High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
| HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
| Horizontal shaker | GFL | 305 | |
| HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
| ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
| Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
| Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
| LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
| LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
| Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
| Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
| Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
| Overhead shaker | GFL | 3040 | |
| Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
| pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
| pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
| Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
| Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
| Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
| Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
| PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
| PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
| PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
| Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
| Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
| Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
| Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
| Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
| Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
| Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
| Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
| Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
| ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |
References
- Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
- Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
- Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
- Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
- Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
- Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
- Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
- Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
- Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
- Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
- Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
- Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
- Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
- Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
- Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
- Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
- Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
- Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
- Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
- Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
- Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
- Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
- Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
- Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
- Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
- Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
- Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
- Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
- Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
- Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
- Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
- Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
- Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
- May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
- Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
- Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
- Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).
