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मिट्टी में लैबिल, अकार्बनिक पौधे पोषक तत्वों और संदूषकों का दो-आयामी दृश्य और मात्राकरण

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61661
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

Summary

यह प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के साथ संयुक्त पतली फिल्मों (डीजीटी) में डिफ्यूरिव ग्रेडिएंट का उपयोग करके कई लैबिल अकार्बनिक पोषक तत्वों और संदूषक सोल्यूट प्रजातियों के उप-मिमी 2डी दृश्य के लिए एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है। स्थलीय पौधों के राइजोसस्फीयर में सोल्यूट के मात्रात्मक मानचित्रण के लिए सोल्यूट सैंपलिंग और हाई-रेजोल्यूशन केमिकल एनालिसिस का विस्तार से वर्णन किया गया है।

Abstract

हम दो आयामी (2D) दृश्य और प्रयोगशाला के वितरण के परिमाणीकरण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं (यानी, उप-मिलीमीटर (~ 100 माइक्रोन) स्थानिक संकल्प पर पौधों की जड़ों (राइजोस्फीयर') के निकट मिट्टी में अकार्बनिक पोषक तत्व (उदाहरण के लिए, पी, फे, एमएन) और संदूषक (उदाहरण के लिए, एएस, सीडी, पीबी) सोल्यूट प्रजातियां। विधि पतली फिल्मों (डीजीटी) तकनीक में डिफ्यूरिव ग्रेडिएंट्स द्वारा सिंक-आधारित सोल्यूट नमूने को जोड़ती है, जिसमें लेजर एब्लेशन द्वारा स्थानिक रूप से हल किए गए रासायनिक विश्लेषण के साथ प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला-आईसीपी-एमएस) को जोड़ा गया है। डीजीटी तकनीक पतले हाइड्रोगेल पर आधारित है जिसमें सजातीय रूप से वितरित विश्लेषण-चयनात्मक बाध्यकारी चरण हैं। उपलब्ध बाध्यकारी चरणों की विविधता सरल जेल निर्माण प्रक्रियाओं का पालन करते हुए विभिन्न डीजीटी जेल प्रकारों की तैयारी के लिए अनुमति देती है। राइजोस्पीयर में डीजीटी जेल तैनाती के लिए, पौधों को फ्लैट, पारदर्शी विकास कंटेनरों (राइजोट्रॉन) में उगाया जाता है, जो मिट्टी में विकसित रूट सिस्टम तक न्यूनतम आक्रामक पहुंच को सक्षम करते हैं। पूर्व-विकास अवधि के बाद, डीजीटी जैल को राइजोसस्फीयर में सीटू सोल्यूट नमूने में रुचि के चयनित क्षेत्रों पर लागू किया जाता है। बाद में, डीजीटी जैल को ला-आईसीपी-एमएस लाइन-स्कैन इमेजिंग का उपयोग करके बाध्य सॉल्यूट्स के बाद के रासायनिक विश्लेषण के लिए वापस लाया जाता है और तैयार किया जाता है। मैट्रिक्स-मिलान जेल मानकों का उपयोग करके 13सी और बाहरी अंशांकन का उपयोग करके आंतरिक सामान्यीकरण का उपयोग करना 2डी सॉल्यूट फ्लक्स के मात्राकरण के लिए आगे की अनुमति देता है। यह विधि मिट्टी-पौधों के वातावरण में बहु-तत्व सोल्यूट फ्लक्स की मात्रात्मक, उप-मिमी स्केल 2डी छवियों को उत्पन्न करने की अपनी क्षमता में अद्वितीय है, जो राइजोस्पायर में सोल्यूट ग्रेडिएंट्स को मापने के लिए अन्य तरीकों के प्राप्त स्थानिक संकल्प से अधिक है। हम स्थलीय पौधों के राइजोस्पीयर में कई एंटिक और एनियोनिक सोल्यूट प्रजातियों की इमेजिंग के लिए विधि का आवेदन और मूल्यांकन प्रस्तुत करते हैं और पूरक सोल्यूट इमेजिंग तकनीकों के साथ इस विधि के संयोजन की संभावना को उजागर करते हैं।

Introduction

फसल पौधों द्वारा पोषक तत्वों का अधिग्रहण फसल उत्पादकता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। फसलों द्वारा पोषक तत्वों के कुशल तेज को नियंत्रित करने वाली प्रक्रियाओं का तीव्रता से अध्ययन किया गया है, विशेष रूप से मिट्टी की जड़ इंटरफेस, राइजोस्पायर में पौधों की जड़ों द्वारा पोषक तत्वों की उपलब्धता और पोषक तत्वों के आंतरिककरण को नियंत्रित करने वाले तंत्र, फसल पोषक तत्व अधिग्रहण में उनकी भूमिका के लिए पहचाने जाते हैं। पौधों के पोषक तत्वों के तेज के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में शामिल हैं: जड़ की ओर पोषक तत्व परिवहन; मिट्टी के पानी और ठोस मिट्टी की सतहों से बंधे प्रजातियों में घुली प्रजातियों के बीच गतिशील सोरपेशन संतुलन; पोषक तत्वों के लिए माइक्रोबियल प्रतियोगिता; मिट्टी के कार्बनिक पदार्थ में निहित पोषक तत्वों का माइक्रोबियल खनिजीकरण; और जड़ सिम्प्लास्म में पोषक तत्वों का आंतरिककरण। अकार्बनिक ट्रेस धातु (oid) संदूषकों का तेज काफी हद तक एक ही तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है।

मिट्टी में पोषक तत्व और संदूषक उपलब्धता, पौधों की मांग और विसारण के आधार पर, राइजोस्पाइयर में अंतर पोषक तत्व पैटर्न देखा जा सकता है। तुलनात्मक रूप से उच्च आंतरिककरण दरों (जैसे, पी, फे, एमएन, जेडएन, आसॅ्, सीडी, पीबी) के साथ दृढ़ता से सोरण तत्वों के लिए, थोक मिट्टी की तुलना में लैबिल (यानी, रिवर्सिबल एसोबेड) तत्व अंश की कमी पाई जाती है, जिसमें कमी क्षेत्र की चौड़ाई अक्सर ≤1मिमीहोती है, जबकि अधिक मोबाइल पोषक तत्वों जैसे कि एन 3-,कमी क्षेत्र कईसेंटीमीटरतक बढ़ सकते हैं। इसके अलावा , अल और सीडी जैसे तत्वों का संचय तब देखा गया है जब उपलब्धता पौधों की तेजदरों से अधिक होजाती है 2,3.

पोषक तत्वों और संदूषक साइकिलिंग में राइजोस्पीव प्रक्रियाओं के महत्व को देखते हुए, उच्च स्थानिक संकल्प पर पौधे उपलब्ध तत्व अंश को मापने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है4,5। हालांकि, छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला solute वितरण को मापने के लिए कई कारणों के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है । एक बड़ी कठिनाई के लिए बहुत छोटे (कम μL रेंज) मिट्टी की मात्रा का नमूना है और/या जीवित संयंत्र जड़ों के निकट परिभाषित पदों पर porewater राइजोस्फेयर में खड़ी पोषक तत्व ढाल को हल करने के लिए । इस समस्या के समाधान के लिए एक दृष्टिकोण पोरजल नमूनों की निकासी के लिए माइक्रो-सक्शन कप का उपयोग करनाहै 6. इस विधि के साथ, ए गोटलिन, ए हेम और ई. मैट्ज़नर7 ने क्वेरकस रोबर एल रूट्स के आसपास मिट्टी के पापोरवॉटर पोषक तत्वों की सांद्रता को ~ 1 सेमी के स्थानिक संकल्प पर मापा। मिट्टी या मिट्टी के समाधान की μL मात्रा का विश्लेषण करने की एक कठिनाई यह है कि इन छोटे नमूना मात्रा, सभी लेकिन प्रमुख पोषक तत्वों की प्रजातियों की कम सांद्रता के साथ संयोजन में, अत्यधिक संवेदनशील रासायनिक विश्लेषण तकनीकों की आवश्यकता होती है ।

एक वैकल्पिक प्रणाली, जो एक संकल्प पर पोषक तत्वों के ढाल को ~ 0.5 मिमी तक हल करने में सक्षम है, मिट्टी के ब्लॉक की सतह पर एक जड़ चटाई विकसित करना है, जिसमें एक पतली हाइड्रोफिलिक झिल्ली परत जड़ों से मिट्टी को अलग करती है8,9। इस विन्यास में, सॉल्यूट झिल्ली के माध्यम से गुजर सकते हैं और जड़ें मिट्टी से पोषक तत्वों और संदूषकों को ले जा सकती हैं जबकि जड़ से मिट्टी में फैल सकती है। एक घने जड़ परत की स्थापना के बाद, मिट्टी ब्लॉक का नमूना लिया जा सकता है और तत्व अंशों के बाद निकालने के लिए प्राप्त मिट्टी के नमूनों के लिए कटा हुआ जा सकता है। इस तरह, अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र (~ 100 सेमी2)में औसतन एक आयामी पोषक तत्व, और संदूषक ढाल का विश्लेषण किया जा सकता है।

एक और चुनौती लैबिल, पौधे उपलब्ध तत्व अंश के नमूने प्राप्त करना है, क्योंकि अधिकांश रासायनिक मृदा निष्कर्षण तकनीक उन तंत्रों की तुलना में बहुत अलग ढंग से काम करती हैं जिनके द्वारा पौधे पोषक तत्वों और संदूषकों को लेते हैं। कई मिट्टी-निष्कर्षण प्रोटोकॉल में, मिट्टी को भंग और शर्बत तत्व अंश के बीच एक (छद्म-) संतुलन स्थापित करने के उद्देश्य से एक निष्कर्षण समाधान के साथ मिलाया जाता है। हालांकि, पौधे लगातार पोषक तत्वों को आंतरिक बनाते हैं और इसलिए, अक्सर उत्तरोत्तर राइजोस्फीयर मिट्टी को कम करते हैं। यद्यपि संतुलन निष्कर्षण प्रोटोकॉल को मिट्टी परीक्षणों के रूप में व्यापक रूप से अपनाया गया है क्योंकि उन्हें लागू करना आसान है, निकाले गए पोषक तत्व अंश अक्सर पौधे उपलब्ध पोषक तत्व अंश को अच्छी तरह से10,11,12, 13का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। सिंक विधियां जो पोषक तत्वों के लिए नमूना मिट्टी को लगातार कम करती हैं , को लाभप्रद तरीकों के रूप में प्रस्तावित किया गया है और जड़ तेज प्रक्रियाओं की नकल करके अंतर्निहित पोषक तत्व तेज तंत्र के समान हो सकते हैं10,11,14,15।

ऊपर वर्णित तरीकों के अलावा, वास्तविक इमेजिंग अनुप्रयोग, कई सेमी2 के दृश्य के क्षेत्रों में संकल्प ≤100 माइक्रोन के साथ निरंतर पैरामीटर मानचित्रों को मापने में सक्षम विशिष्ट तत्वों और मिट्टी (जैव) रासायनिक मापदंडों5के लिए विकसित किया गया है। ऑटोरेडियोग्राफी का उपयोग राइजोस्पीयर में तत्व वितरण को चित्रित करने के लिए किया जा सकता है बशर्ते कि उपयुक्त रेडियोआइसोटोप16उपलब्ध हों। प्लानर ऑप्टोड्स महत्वपूर्ण मृदा रासायनिक मापदंडों जैसे पीएचऔर पीएओ217, 18,19और एंजाइम गतिविधि या कुल प्रोटीन वितरण का दृश्य तैयार करने में सक्षम होते हैं, जैसे कि मृदा जाइमोग्राफी20 ,21, 22, 23और/या रूट ब्लॉटिंग विधियां24। जबकि जाइमोग्राफी और ऑटोरेडियोग्राफी एक समय में एक पैरामीटर के माप तक सीमित हैं, प्लानर ऑप्टोड का उपयोग करके पीएच और पीओ2 इमेजिंग समवर्ती रूप से किया जा सकता है। अधिक पारंपरिक रूट मैट तकनीक केवल 1D जानकारी प्रदान करती है, जबकि माइक्रो सक्शन कप बिंदु माप या कम रिज़ॉल्यूशन 2D जानकारी प्रदान करते हैं, हालांकि दोनों दृष्टिकोण बहु-तत्व विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। हाल ही में, पी डीइल्हार्ट, एट अल25 ने मिट्टी-रूट कोर नमूनों में ~ 100 माइक्रोन के संकल्प पर 2डी कुल बहु-तत्व वितरण को मैप करने के लिए लेजर प्रेरित ब्रेकडाउन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एलआईयूएस) का उपयोग करके एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रस्तुत किया, जहां सावधानीपूर्वक प्राकृतिक तत्व वितरण को सावधानीपूर्वक तैयार करने के नमूने द्वारा संरक्षित किया गया था।

उच्च स्थानिक संकल्प पर कई पोषक तत्वों और संदूषक solutes के लक्षित 2D नमूने में सक्षम एकमात्र तकनीक पतली फिल्मों (डीजीटी) तकनीक में विसारक ढाल है, एक सिंक आधारित नमूना विधि है जो एक हाइड्रोजेल परत26,27में एम्बेडेड एक बाध्यकारी सामग्री पर सीटू में लैबिल ट्रेस धातु (loid) प्रजातियों को स्थिर करती है। डीजीटी को तलछट और पानी में लैबाइल सॉल्यूट्स को मापने के लिए एक रासायनिक विशिष्टता तकनीक के रूप में पेश किया गया था, और जल्द ही मिट्टी28में इसके उपयोग के लिए अपनाया गया था। यह उप-मिमी स्केल मल्टी-एलिमेंट सोल्यूट इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिसे शुरू में नदी तलछट29में प्रदर्शित किया गया था, और इसे30, 31, 32, 33में पौधे राइजोस्फेयर में इसके आवेदनकेलिए और विकसित किया गयाहै।

डीजीटी नमूने के लिए, लगभग 3 सेमी x 5 सेमी के आकार की एक जेल शीट को एक पौधे की जड़ पर लागू किया जाता है जो मिट्टी के ब्लॉक की सतह परत में बढ़ रहा है, जिसमें एक हाइड्रोफिलिक झिल्ली मिट्टी से जेल को अलग करती है। संपर्क समय के दौरान, लैबिल पोषक तत्व और/या संदूषक जेल की ओर फैलते हैं और जेल में शामिल बाध्यकारी सामग्री से तुरंत बंधे होते हैं । इस तरह, एक एकाग्रता ढाल, और इस प्रकार जेल की ओर एक निरंतर शुद्ध प्रवाह स्थापित किया जाता है और नमूना समय के दौरान प्रबल होता है। नमूने के बाद, हाइड्रोगेल को हटाया जा सकता है और एक विश्लेषणात्मक रासायनिक तकनीक का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है जो स्थानिक रूप से हल किए गए विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस उद्देश्य के लिए एक अत्यधिक विशिष्ट और अक्सर उपयोग की जाने वाली तकनीक लेजर एब्लेशन है जो प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला-आईसीपी-एमएस) को जोड़ती है। कुछ शुरुआती अध्ययनों में, माइक्रो पार्टिकल प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (PIXE) का भी उपयोग किया गयाथा। LA-आईसीपी-एमएस विश्लेषण के साथ संयुक्त डीजीटी नमूना ~ 100 माइक्रोन के स्थानिक संकल्प पर बहु-तत्व रासायनिक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। यदि अत्यधिक संवेदनशील आईसीपी-एमएस तकनीकों (जैसे, क्षेत्र क्षेत्र आईसीपी-एमएस) कार्यरत हैं, तो पता लगाने की असाधारण रूप से कम सीमा प्राप्त की जा सकती है। मक्का15द्वारा जेडएन और सीडी तेज पर लिमिंग के प्रभाव पर एक अध्ययन में, हम प्रति जेल क्षेत्र सीडी के 38 पीजी सेमी-2 का पता लगाने की सीमा के साथ अकांमित मिट्टी में मक्का राइजोस्फीयर में लैबिल सीडी का नक्शा बनाने में सक्षम थे। डीजीटी, प्लानर ऑप्टोड्स, और ज़िमोग्राफी मिट्टी से लक्ष्य तत्व के प्रसार पर एक जेल परत में भरोसा करते हैं, जिसका एक साथ, या लगातार, पौधों के पोषक तत्वों और संदूषक तेज के लिए प्रासंगिक बड़ी संख्या में मापदंडों की छवि के लिए इन तरीकों के संयुक्त अनुप्रयोग के लिए शोषण किया जा सकता है। डीजीटी इमेजिंग के विश्लेषणात्मक रासायनिक पहलुओं के बारे में विस्तृत जानकारी, डीजीटी और अन्य इमेजिंग विधियों के संयोजन की क्षमता पर, और इसके अनुप्रयोगों पर रेफरी34,35में व्यापक रूप से समीक्षा की जाती है।

इस लेख में हम वर्णन करते हैं कि पौधों की खेती, जेल निर्माण, जेल आवेदन, जेल विश्लेषण और छवि पीढ़ी सहित एक असंतृप्त मिट्टी के वातावरण में स्थलीय पौधों की जड़ों पर डीजीटी तकनीक का उपयोग करके एक सोल्यूट इमेजिंग प्रयोग कैसे किया जाए। सभी कदमों को विस्तार से बताया गया है, जिसमें महत्वपूर्ण कदमों और प्रायोगिक विकल्पों पर नोट शामिल हैं ।

Protocol

1. डीजीटी जैल का निर्माण

नोट: कई डीजीटी जेल प्रकार उच्च (उप-मिमी) स्थानिक संकल्प35पर लैबिल सोल्यूट प्रजातियों की 2डी इमेजिंग के लिए उपलब्ध हैं। यहां, सोल्यूट इमेजिंग अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले तीन अच्छी तरह से विशेषता वाले उच्च संकल्प (एचआर) डीजीटी बाध्यकारी जैल के निर्माण को संक्षेप में संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है। ट्रेस तत्व विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला प्रक्रियाओं, साथ ही सभी प्रस्तुत एचआर-डीजीटी जैल की विस्तृत निर्माण प्रक्रियाओं को सहायक सूचना (एसआई) अनुभाग S1 और S2में वर्णित किया गया है।

  1. पॉलीयूरेथेन आधारित मिश्रित एनियन और आयन बाइंडिंग जेल (एचआर-एमबीजी; एसआई S2.1)31
    1. सजातीय रूप से फैले जिरकोनियम (चतुर्थ) हाइड्रोक्साइड और इमिनोडायटेट (आईडीए) चरणों के साथ एक पॉलीयूरेथेन जेल निलंबन तैयार करें।
    2. एक पतली फिल्म में जेल निलंबन को एक ग्लास प्लेट पर कोट करें और 0.1 मिमी-पतली, आंसू-प्रूफ मिश्रित एनियन और cation बाइंडिंग जेल (एचआर-एमबीजी) प्राप्त करने के लिए सॉल्वेंट वाष्पीकरण द्वारा जेल गठन शुरू करें।
  2. पॉलीएक्रिलामाइड-जिरकोनिया एनियन बाइंडिंग जेल (एचआर-एबीजी; एसआई S2.2)36
    1. स्थापित जेल कास्टिंग प्रक्रियाओं37 के बाद 0.4 मिमी-पतली एगर उठे क्रॉस-लिंक्ड पॉलीएक्रिलेमाइड जेल (एपीए) को फैब्रिकेट करें (एपीए निर्माण के विस्तृत प्रोटोकॉल के लिएएसआई एस2.4 देखें)।
    2. 0.4 मिमी-पतली एनियन बाइंडिंग जेल (एचआर-एबीजी) प्राप्त करने के लिए प्रीकास्ट एपीए जेल में जिरकोनियम (चतुर्थ) हाइड्रोक्साइड चरणों को प्रीसिपिएट करें।
  3. पॉलीएक्रीलामाइड-इमिनोडायसेटेशन ईनिंग जेल (एचआर-सीबीजी; एसआई S2.3)38
    1. सजातीय रूप से फैले आईडीए चरणों के साथ एक पॉलीएक्रीलामाइड जेल निलंबन तैयार करें।
    2. दो ग्लास प्लेटों के बीच जेल कास्ट करें और 0.4 मिमी-पतली सीस बाइंडिंग जेल (एचआर-सीबीजी) प्राप्त करने के लिए बहुलीकरण प्रतिक्रिया शुरू करें जहां आईडीए चरणों को जेल के एक तरफ बसाया जाता है।

2. पौधों की खेती

नोट: प्रायोगिक प्रणाली solute इमेजिंग के लिए असंतृप्त मिट्टी में पौधों को विकसित करने के लिए राइजोट्रॉन4 (चित्रा 1)का उपयोग करता है । सबसे पहले, राइजोट्रॉन मिट्टी भरने और पानी का वर्णन किया जाता है, फिर प्रायोगिक पौधे के विकास पर विवरण दिया जाता है। राइजोट्रॉन में भरने से पहले राइजोट्रॉन डिजाइन और मिट्टी सब्सट्रेट तैयार करने के विवरण एसआई सेक्शन S3में प्रस्तुत किए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: राइजोट्रॉन डिजाइन (पैमाने पर नहीं)। (क)एक राइजोट्रॉन विकास कंटेनर का विस्फोट दृश्य । (ख)पौधों की वृद्धि के दौरान इकट्ठे राइजोट्रॉन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. राइजोट्रॉन मिट्टी भरने
    1. पूर्व-गीला मिट्टी (ग्रेविमेट्रिक पानी की सामग्री, ज्ञात है) के साथ राइजोट्रॉन भरने से Equation 6 पहले; एसआई S3.2देखें), चिपकने वाले टेप का उपयोग करके राइजोट्रॉन के पीछे पानी के छेद को बंद करें और सामने की प्लेट और उसके निर्धारण रेल और शिकंजा को हटा दें।
    2. खाली राइजोट्रॉन (सामने की प्लेट, रेल और शिकंजा को छोड़कर), आठ 5 सेमी x 11 सेमी ऐक्रेलिक प्लेटें और 16 क्लैंप(सामग्री की तालिका)का वजन करें और वजन का योग रिकॉर्ड करें।
    3. प्रत्येक तरफ दो क्लैंप का उपयोग करके राइजोट्रॉन के तल पर एक छोटी ऐक्रेलिक प्लेट संलग्न करें, जिसमें राइजोट्रॉन फ्रेम पर निर्देशित क्लैंप का दबाव होता है, इसलिए प्लेट अंदर की ओर झुकती नहीं है और मात्रा स्थिर है।
    4. राइजोट्रॉन को छोटे प्लास्टिक प्लेट की ओर थोड़ा झुकाएं और ~ 4 सेमी(चित्रा 2A)की ऊंचाई तक पूर्व-गीली मिट्टी से भरें। राइजोट्रॉन को थोड़ा उत्तेजोन द्वारा उत्तेजोट्रॉन के अंदर मिट्टी वितरित करें और धीरे-धीरे मिट्टी को कुछ मिमी (विशिष्ट मिट्टी विशेषताओं के आधार पर) द्वारा एक कॉम्पैक्टेशन उपकरण(चित्रा 2B)के साथ सेक करें।
    5. दोहराएं 2.1.3 - 2.1.4 जब तक राइजोट्रॉन मिट्टी(चित्रा 2C)से भरा न हो जाए। राइजोट्रॉन में रोपण के बाद रोपण के लिए शीर्ष पर ~ 3 सेमी का अंतर छोड़ दें।
    6. मिट्टी से भरे राइजोट्रॉन (8 छोटी प्लेटें और 16 क्लैंप सहित) वजन का वजन करें और वजन रिकॉर्ड करें। इससे, 2.1.2 में प्राप्त खाली राइजोट्रॉन वजन को घटाएं और वजन अंतर, यानी, राइज़ोट्रॉन में नम मिट्टी के द्रव्यमान Equation 7 (जी) को रिकॉर्ड करें।
    7. ईक्यू 1 के अनुसार राइजोट्रॉन, (जी) में सूखी मिट्टी के द्रव्यमान Equation 8 की गणना करें, और फिर ईक्यू 2 के अनुसार राइजोट्रॉन में सूखी मिट्टी थोक घनत्व, Equation 9 (जी सेमी-3)की गणना करें।
      Equation 1
      Equation 2
      यहां, Equation 10 (सेमी3)राइजोट्रॉन की कुल आंतरिक मात्रा है।
      नोट: Equation 9 राइजोट्रॉन में विशिष्ट मान 1.0-1.4 ग्रामसेमी-3 केबीच हैं। 1.5 ग्राम सेमी-3 से अधिक न करें क्योंकि रूट विकास इस मूल्य से ऊपर बाधित हो सकता है।
    8. एक सपोर्ट बॉक्स पर मिट्टी से भरे राइजोट्रॉन को रखें और राइजोट्रॉन(चित्रा 2डी)से सभी क्लैंप और छोटी प्लेटों को हटा दें। ऊतक कागज का उपयोग करके राइजोट्रॉन फ्रेम (यानी, किनारों) को सावधानीपूर्वक साफ करें, क्योंकि फ्रेम पर शेष मिट्टी के कण लीक का कारण बन सकते हैं।
      नोट: उजागर मिट्टी की सतह सजातीय और किसी भी दरार या अंतराल के बिना राइजोट्रॉन फ्रेम के साथ समतल होना चाहिए । यदि नहीं, तो राइजोट्रॉन खाली करें और 2.1.2 - 2.1.8 दोहराएं।
    9. पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई)(सामग्री की तालिका) पन्नी केदो टुकड़ों को 22 सेमी x 13 सेमी तक काटें। इसके अलावा प्लास्टिक फॉयल का एक टुकड़ा 46 सेमी x 15 सेमी तक काट लें। पीएफई और प्लास्टिक फॉयल वजन का योग रिकॉर्ड करें। राइजोट्रॉन में उजागर मिट्टी की सतह के शीर्ष आधे पर PTFE पन्नी का पहला टुकड़ा रखें, जो राइजोट्रॉन के शीर्ष पर मिट्टी के स्तर पर ~ 1 सेमी का विस्तार करता है।
    10. चिपकने वाले टेप(चित्रा 2E)का उपयोग करके पीएफई फॉयल को राइजोट्रॉन फ्रेम में सावधानी से ठीक करें। पहले राइजोट्रॉन के शीर्ष पर एक कोने को ठीक करके शुरू करें, इसके विपरीत कोने के बाद और अंत में दो कोनों को आगे राइजोट्रॉन के नीचे करें। एक फ्लैट पन्नी सतह सुनिश्चित करने के लिए कोनों को 2-4 ठीक करते समय तनाव लागू करें। यदि सिलवटों उभरने, खुला और फिर से व्यक्तिगत कोनों पर टेप ठीक (सभी एक बार में नहीं) जब तक सभी सिलवटों हटा रहे है और PTFE पन्नी मिट्टी की सतह के साथ सपाट और समीपस्थ है ।
    11. राइजोट्रॉन के निचले छोर पर पीएफई फॉयल का दूसरा टुकड़ा रखें, ऊपरी पीएफई फॉइल पीस को ~ 1 सेमी से ओवरलैप करें। राइजोट्रॉन को दूसरी पीएफई फॉयल को ठीक करने के लिए 2.1.10 दोहराएं।
    12. प्लास्टिक पन्नी (46 सेमी x 15 सेमी) पीएफई पन्नी पर रखें। 2.1.10 में विस्तृत के रूप में निर्धारण प्रक्रिया का उपयोग कर प्लास्टिक पन्नी को ठीक करें।
    13. मिट्टी से भरे और पन्नी से ढके राइजोट्रॉन पर एक फ्रंट प्लेट रखें। राइजोट्रॉन के प्रत्येक पक्ष के चारों ओर एक रेल रखें और पटरियों को ठीक करने के लिए हाथ से शिकंजा कसें और इस प्रकार, सामने की प्लेट को राइजोट्रॉन को। शिकंजा राइजोट्रॉन के बंद पक्ष की ओर तैनात हैं, यानी, पानी छेद(चित्रा 1A)के साथ पक्ष ।

Figure 2
चित्रा 2: राइजोट्रॉन असेंबली और राइजोस्फेयर में सॉउट इमेजिंग के लिए मिट्टी में पौधों को विकसित करने के लिए भरना। (ए)राइजोट्रॉन में मिट्टी भरना। (B)कॉम्पिटिशन टूल का इस्तेमाल करते हुए भरी हुई मिट्टी का कॉम्पिटिशन। (ग)मिट्टी से भरे राइजोट्रॉन में छोटी एक्रेलिक प्लेटें और क्लैंप । (घ)मिट्टी से भरा राइजोट्रॉन जो आनित मिट्टी की सतह के साथ होता है। (ई)मिट्टी से भरा राइजोट्रॉन आंशिक रूप से एक सुरक्षात्मक PTFE पन्नी के साथ कवर किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: राइजोट्रॉन हैंडलिंग और डीजीटी जेल आवेदन। (क)राइजोट्रॉन के पीछे पानी के छेद में 10 एमएल पिपेट युक्तियों का उपयोग करके मिट्टी में पानी। (ख)रोपण का रोपण (हरे धब्बे के रूप में इंगित) मिट्टी से भरे और बंद राइजोट्रॉन में। (ग)राइजोट्रॉन ने सालिक्स स्मिथियाना कटिंग के साथ लगाया और फ्रंट प्लेट और प्लास्टिक फॉइल कवर को हटा दिया । (घ)डीजीटी जेल आवेदन से पहले पीएफई फॉइल कवर को सावधानीपूर्वक छीलना। (ई)मिट्टी-रूट इंटरफेस आरओआई की हाई-रेजोल्यूशन फोटो। (F)राइजोट्रॉन पर डीजीटी जेल से लैस फ्रंट प्लेट का आवेदन। }डीजीटी जेल के साथ आरओआई की फोटो सोल्यूट सैंपलिंग के दौरान लगाई गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. मिट्टी को पानी देना
    1. राइजोट्रॉन में प्रायोगिक मिट्टी की जल धारण क्षमता (डब्ल्यूएचसी) का निर्धारण करें। इस उद्देश्य के लिए, एक खुले तल के साथ दो राइजोट्रॉन का निर्माण करें और उन्हें धारा 2.1 में निर्दिष्ट मिट्टी से भरें। पूरी तरह से 16 घंटे के लिए एक पानी के कंटेनर में विसर्जन करके इन खुले, मिट्टी से भरे राइजोट्रॉन तर और 8 घंटे के लिए राइजोट्रॉन नाली ।
    2. खुले-नीचे राइजोट्रॉन में यादृच्छिक स्थानों से ~ 50 ग्राम का एक समग्र मिट्टी का नमूना लें और Eq. S1 के अनुसार निर्धारित करने के लिए 105 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सूख Equation 6 लें। निर्धारित Equation 6 मिट्टी के WHC से मेल खाती है और इसलिए, Equation 11 (जी जी-1)के रूप में व्यक्त किया जाता है।
    3. प्रायोगिक राइजोट्रॉन में लक्ष्य को परिभाषित Equation 6 करें। विकास चरण Equation 6 के दौरान, राइजोट्रॉन में एनोक्सिक स्थितियों से बचने के दौरान पर्याप्त मात्रा में पानी के साथ पौधों की आपूर्ति करने के लिए डब्ल्यूएचसी (यानी डब्ल्यूएचसी फैक्टर) का 60% निर्धारित Equation 12 करें।
    4. Equation 13ईक्यू 3 के अनुसार लक्ष्य पर राइजोट्रॉन में मिट्टी की सिंचाई करने के लिए पानी के कुल द्रव्यमान की गणना Equation 6 करें। राइजोट्रॉन, (जी) में मिट्टी में मौजूद पानी के द्रव्यमान के लिए खाते Equation 14 हैं।
      Equation 3
    5. Equation 13प्रत्येक पानी छेद में जोड़े जाने वाले पानी के द्रव्यमान को प्राप्त करने के लिए राइजोट्रॉन पानी छेद (यहां 14) की संख्या से विभाजित करें। पानी के छेद में 10 एमएल पिपेट टिप्स को धक्का देकर पानी जोड़ें और गुरुत्वाकर्षण(चित्र 3 ए)द्वारा पानी के प्रवाह को मिट्टी में प्रवाहित कर दें।
  2. पौधों की वृद्धि
    1. प्रायोगिक पौधे के पूर्व अंकुरित बीज (उदाहरण के लिए, गीले फिल्टर पेपर पर) विशिष्ट बीज अंकुरण आवश्यकताओं के अनुसार जब तक रेडिकल उभर नहीं जाता (1 सेमी लंबा) ।
    2. चित्रा 3बीमें दर्शाए गए राइजोट्रॉन में दो रोपण तक पौधे लगाएं । रोपण में, उनके विकास का समर्थन करने के लिए सीधे रोपण में ~ 5 एमएल पानी जोड़ें। एक पारदर्शी, नमी बनाए रखने वाली फिल्म(सामग्रीकी तालिका) के साथ रोपण के बाद पहले ~ दो दिनों के लिए राइजोट्रॉन के शीर्ष उद्घाटन को कवर करें। माइक्रोफाइटिक विकास को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में राइजोट्रॉन लपेटें।
      नोट: रोपण के अलावा, राइजोट्रॉन में पौधों की कटाई की भी खेती की जा सकती है।
    3. लगाए गए राइजोट्रॉन को पर्यावरणीय स्थितियों (यानी तापमान, आर्द्रता, प्रकाश तीव्रता) के साथ एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें, जो विशिष्ट पौधे की आवश्यकताओं के लिए निर्धारित है। ग्रेविट्रोपिज्म के माध्यम से सामने की प्लेट के साथ जड़ विकास सुनिश्चित करने के लिए राइजोट्रॉन को 25 डिग्री-35 डिग्री पर झुकाएं।
    4. पौधे के विकास के दौरान, 2.2.5 में विस्तृत के रूप में राइजोट्रॉन पानी छेद का उपयोग करके हर 2-4 दिनों में समय-समय पर पानी देकर राइजोट्रॉन में लक्षित पानी की मात्रा को बनाए रखता है। ~ 5 एमएल पानी के नियमित अतिरिक्त द्वारा मिट्टी की सतह को शीर्ष उद्घाटन नम रखें।
      नोट: यदि पौधों को विस्तारित अवधि के लिए उगाया जाता है और पौधे बायोमास से प्रस्तावित विधि द्वारा राइजोट्रॉन में जोड़े गए पानी की मात्रा में काफी कमी आने की उम्मीद है, तो अलग-अलग राइजोट्रॉन प्रतिकृति और कटाई में पौधों को उगाकर पौधे बायोमास के वजन के लिए खाते हैं और परिभाषित अंतराल पर पौधे के ऊतकों का वजन करते हैं।
    5. एक बार जड़ें सामने की प्लेट के साथ एक उपयुक्त स्थान तक पहुंचने के बाद, अधिमानतः राइजोट्रॉन के केंद्र में, राइजोफेरिक सोल्यूट वितरण के नमूने के लिए डीजीटी जैल लागू करें।

3. सोल्यूट वितरण का नमूना

  1. जेल आवेदन
    1. Equation 6 Equation 11 2.2.4 में विस्तृत के रूप में जेल आवेदन से पहले 60% से 80% 24 घंटे के लिए राइजोट्रॉन Equation 11 में वृद्धि। यह अच्छी मिट्टी-जेल संपर्क सुनिश्चित करता है और सोल्यूट नमूने के दौरान एनोक्सिक मिट्टी की स्थिति से बचने के दौरान जेल में सोल्यूट प्रसार की अनुमति देता है।
    2. एक नया, एसिड साफ सामने की थाली ले लो, यह नमूने के लिए इस्तेमाल किया राइजोट्रॉन पर संरेखित करें, और थाली पर ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों को चिह्नित करें । प्लेट को एक लैमिनार प्रवाह पीठ या किसी अन्य धूल-और धातु मुक्त वातावरण में स्थानांतरित करें, अचिह्नित पक्ष का सामना करना पड़ रहा है।
    3. डीएफईई-लेपित रेजर ब्लेड का उपयोग करके, आरओआई के अनुरूप आवश्यक आयताकार आकार के लिए एक्रेलिक समर्थन पर डीजीटी बाध्यकारी जेल को काटें, आमतौर पर लगभग 3 सेमी × 5 सेमी। एक स्पष्ट कटौती सुनिश्चित करने के लिए रेजर ब्लेड फिसलने के बजाय दबाकर जेल काटें। आयताकार जेल के टुकड़े को आरओआई के चिह्नित स्थान पर प्लेट के अचिह्नित पक्ष पर रखें।
      नोट: यदि एचआर-एमबीजी का उपयोग किया जाता है, तो जेल के नीचे 100 माइक्रोन-थिन स्पेसर फॉयल जोड़ा जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जेल मिट्टी-रूट प्रणाली के साथ अच्छे संपर्क में है।
    4. 10 माइक्रोन-पतली पॉली कार्बोनेट झिल्ली (0.2 माइक्रोन पोर आकार) काटें; सामग्री की तालिका) एक आकार के लिए जो प्रत्येक पक्ष पर ≥1 सेमी तक जेल के आकार को बढ़ाता है और झिल्ली को जेल पर रखता है। ढेर से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए कुछ पानी लगाएं।
    5. विनाइल इलेक्ट्रिकल टेप(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके सभी चार किनारों के साथ झिल्ली को ठीक करें। इस प्रक्रिया में, प्लास्टिक चिमटी का उपयोग करके जेल और झिल्ली के बीच में फंसे हवा के बुलबुले को ध्यान से हटा दें। टेप केवल झिल्ली के संपर्क में होना चाहिए न कि जेल के साथ।
      नोट: यदि टेप जेल के संपर्क में आता है, तो हवा के बुलबुले जेल और झिल्ली के बीच फंस जाते हैं, या अंतिम झिल्ली सतह सिलवटों को दिखाती है, जेल/झिल्ली के ढेर को फिर से इकट्ठा करने की आवश्यकता होती है क्योंकि जेल में घुलनशील के विसारक प्रवाहको 35 (दोहराने 3.1.3 - 3.1.5) को फिर से इकट्ठा किया जा सकता है।
    6. एक स्टैंड पर राइजोट्रॉन रखें, पटरियों को हटा दें और ध्यान से सामने की प्लेट(चित्रा 3C)से उठा लें। प्लास्टिक की पन्नी निकालें, राइजोट्रॉन के किनारों पर पीएफई पन्नी को काट लें और मिट्टी-रूट सिस्टम(चित्रा 3 डी)की अशांति से बचने के लिए धीरे-धीरे पीएफई पन्नी को छील दें।
    7. मिट्टी की संरचना और रूट आकृति विज्ञान(चित्रा 3E)के आधार पर सोल्यूट वितरण की व्याख्या और प्रस्तुति की सुविधा के लिए एक डिजिटल सिंगल-लेंस रिफ्लेक्स (डीएसएलआर) कैमरा(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके आरओआई की एक ऑर्थोगोनल फोटो लें। एक कैमरा स्टैंड का उपयोग करें और, यदि उपलब्ध हो, एक मैक्रो लेंस । कैमरे को संरेखित करें ताकि तस्वीर का केंद्र आरओआई के केंद्र से मेल खाता है, और कैमरे का फोकस विमान मिट्टी की सतह के समानांतर है। तस्वीर में एक स्केल बार (जैसे, एक शासक) शामिल करें।
    8. खुले राइजोट्रॉन(चित्रा 3F)के लिए जेल/झिल्ली ढेर से लैस प्लेट संलग्न करें । इसलिए, प्लेट के एक किनारे को राइजोट्रॉन के किनारे के साथ संरेखित करें और धीरे-धीरे मिट्टी की ओर प्लेट को 'मोड़' दें। आवेदन का यह तरीका जेल/झिल्ली के ढेर और मिट्टी की जड़ प्रणाली के बीच हवा के बुलबुले से बचने में मदद करता है । पटरियों और शिकंजा का उपयोग कर सामने की थाली को ठीक करें।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है और ध्यान से किए जाने की जरूरत है । मिट्टी और जड़ों को विस्थापित किए बिना जेल/झिल्ली के ढेर और मिट्टी की जड़ प्रणाली के बीच संपर्क स्थापित करने के बाद प्लेट को स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है ।
    9. जेल तैनाती के सटीक शुरुआती समय को रिकॉर्ड करें और 3.1.7(चित्रा 3G)में दिए गए आरओआई में तैनात जेल की एक तस्वीर लें। एल्यूमीनियम पन्नी में राइजोट्रॉन लपेटें और सोल्यूट नमूना अवधि (अक्सर 24 घंटे) के अंत तक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें।
  2. जेल पुनर्प्राप्ति
    1. एक समर्थन बॉक्स पर राइजोट्रॉन प्लेस, ध्यान से सामने की थाली से उठा और पानी के साथ थाली पर जेल/झिल्ली ढेर कुल्ला कणों(चित्रा 4A)का पालन धोने के लिए । जेल तैनाती के सटीक अंतिम समय रिकॉर्ड करें। ईक्यू एस1 के अनुसार राइजोट्रॉन में वास्तविक डब्ल्यूमिट्टी का निर्धारण करने के लिए आरओआई से नमूनामिट्टी।
    2. सामने की प्लेट को लैमिनार प्रवाह पीठ में स्थानांतरित करें, जेल/झिल्ली ढेर का सामना करना पड़ रहा है। सभी चार किनारों के साथ पहले टेप को ध्यान से हटाकर सामने की प्लेट से जेल को पुनः प्राप्त करें और फिर जेल(चित्रा 4B)को कवर करने वाली पॉलीकार्बोनेट झिल्ली। पानी के लिए पानी लागू करने के लिए जेल की मदद करने के लिए मिट्टी के साथ थाली पर पानी की एक पतली फिल्म पर स्वतंत्र रूप से तैरने के लिए संपर्क पक्ष का सामना करना पड़ रहा ।
      नोट: जेल ओरिएंटेशन का ट्रैक रखना महत्वपूर्ण है। मिट्टी और जड़ों के संपर्क में जेल की ओर हमेशा (उपयोगकर्ता की ओर) का सामना करना चाहिए।
  3. जेल सुखाने
    1. जेल ब्लॉटिंग पेपर(सामग्री की तालिका) काएक आयताकार टुकड़ा काटें और पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली (0.45 माइक्रोन पोर आकार) का थोड़ा छोटा टुकड़ा रखें; सामग्री की तालिका) शीर्ष पर।
    2. प्लास्टिक चिमटी, मिट्टी से संपर्क पक्ष का सामना करना पड़ का उपयोग कर जेल दाग कागज/झिल्ली ढेर पर थाली से जेल हस्तांतरण । जेल को आराम दिया जाना चाहिए (यानी, फैला हुआ नहीं) और पूरी तरह से सपाट, जेल और झिल्ली के बीच किसी भी हवा के बुलबुले के बिना। जेल स्थानांतरण और स्थिति की सुविधा के लिए जेल ब्लॉटिंग पेपर/झिल्ली स्टैक पर कुछ पानी लगाएं।
    3. जेल ब्लॉटिंग पेपर/झिल्ली/जेल स्टैक को पूरी तरह से प्लास्टिक फॉयल के टुकड़े से कवर करें और प्लास्टिक फॉयल(चित्रा 4C)पर जेल के नमूने और इसके अभिविन्यास को लेबल करें । जेल ब्लॉटिंग पेपर/झिल्ली/जेल/प्लास्टिक फॉइल स्टैक को वैक्यूम जेल ड्रायर(सामग्रियों की टेबल)में रखें और तब तक सूखा रखें जब तक कि स्टैक पूरी तरह से डिसिकेटेड न हो जाए (आमतौर पर 48-72 घंटे) । एचआर-एमबीजी के लिए, तापमान को 50-55 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें, एचआर-एबीजी और एचआर-सीबीजी के लिए कमरे के तापमान पर सबसे अच्छा सूखा।
    4. सूखे स्टैक से जेल ब्लॉटिंग पेपर निकालें और जेल को स्थानांतरित करें, जो अब एक ज़िप बैग में पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली के साथ अविभाज्य रूप से विलय हो गया है। प्लास्टिक पन्नी कवर जेल पर रहता है जब तक शीघ्र ही ला-आईसीपी-एमएस विश्लेषण से पहले ।
    5. एक विधि खाली है, जो मिट्टी के संपर्क में नहीं मिलता है के रूप में मूल जेल शीट से एक जेल टुकड़ा शामिल हैं। 3.3.2 - 3.3.4 के बाद नमूना जेल के समान विधि खाली जेल की प्रक्रिया करें।

Figure 4
चित्रा 4: डीजीटी जेल पुनर्प्राप्ति और सोल्यूट सैंपलिंग पर सूखने की तैयारी। }एसओयूटी सैंपलिंग के बाद सीधे डीजीटी जेल और राइजोट्रॉन के साथ प्लेट। (ख)लैमिनार फ्लो बेंच में प्लेट से डीजीटी जेल की पुनः प्राप्ति । (ग)जेल सुखाने के लिए जेल ब्लॉटिंग पेपर/पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली/डीजीटी जेल/प्लास्टिक फॉइल कवर का ढेर । ध्यान दें कि राइजोसस्फेयर मिट्टी पर अपनी तैनाती के बाद जेल थोड़ा रंग का होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. डीजीटी बाध्यकारी जेल का रासायनिक विश्लेषण

नोट: इस प्रोटोकॉल में, डीजीटी बाध्यकारी जेल पर सोल्यूट वितरण का विश्लेषण ला-आईसीपी-एमएस द्वारा एक नैनोसेकंड 193 एनएम एआरएफ एक्सीमर ला सिस्टम का उपयोग करके पूरा किया जाता है जो दो-वॉल्यूम एब्लेशन सेल से लैस होकर क्वाड्रूल आईसीपी-एमएस(चित्रा 5)के साथ मिलकर होता है। सभी उपकरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं। वैकल्पिक रूप से, नैनोसेकंड 213 एनएम या 266 एनएम ठोस-राज्य ला सिस्टम36,39,40,41,42,43लागू किया जा सकता है। यदि बढ़ी हुई संवेदनशीलता या जन संकल्प की आवश्यकता है, तो क्षेत्र क्षेत्र आईसीपी-एमएस क्वाड्रपोल आईसीपी-एमएस15,44काविकल्प है। बाहरी अंशांकन के लिए डीजीटी जेल मानकों की तैयारी और क्वाड्रपोल आईसीपी-एमएस को ला सिस्टम के युग्मन के बारे में विवरण एसआई अनुभाग S4 और S5में प्रस्तुत किए जाते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: डीजीटी जेल विश्लेषण के लिए ला-आईसीपी-एमएस सेटअप। (A)नैनोसेकंड 193 एनएम एआरएफ एक्सीमर ला सिस्टम और क्वाड्रपोल आईसीपी-एमएस। (ख)सूखे जैल कांच की प्लेटों पर चढ़कर और एब्लेशन सेल में परिचय के लिए तैयार ला नमूना चरण पर तय किया । (C)आईसीपी-एमएस से नेबुलाइजर गैस (एआर) और एरोसोल कैरियर गैस (वह या एआर) दो तरह के वाई-स्प्लिटर और टॉर्च एडाप्टर फिटिंग के जरिए आईसीपी से जुड़े एब्लेशन सेल से । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. ला-आईसीपी-एमएस के लिए नमूना तैयारी
    1. सूखे जेल नमूनों, मानकों और विधि रिक्त स्थान (जो पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली समर्थन के साथ विलय किए जाते हैं) को डबल-तरफा चिपकने वाले टेप(सामग्री की तालिका) केव्यक्तिगत टुकड़ों पर स्थानांतरित करें, जेल की ओर का सामना करना पड़ रहा है। एब्लेशन सेल में जगह बचाने के लिए फसल अतिरिक्त टेप भागों।
    2. सूखे जैल को ग्लास प्लेटों पर माउंट करें। ला नमूना चरण (10 सेमी × 10 सेमी का विशिष्ट आकार) पर लचीली व्यवस्था की अनुमति देने के लिए प्रत्येक जेल नमूना, मानक श्रृंखला, या विधि खाली के लिए व्यक्तिगत ग्लास प्लेटों का उपयोग करें। जरूरत के अनुसार ग्लास प्लेट के आकार को समायोजित करने के लिए ग्लासकटर का उपयोग करें। प्लास्टिकिन(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके ला नमूना चरण(चित्रा 5B)पर जैल के साथ ग्लास प्लेटों को ठीक करें। स्टेज फ्लोर को एडजस्ट करके जेल की सतह को लेवल करें और सैंपल स्टेज को एब्लेशन सेल में लॉक करें।
  2. ला-आईसीपी-एमएस लाइन-स्कैन विश्लेषण
    1. एसआई सेक्शन S5में निर्दिष्ट आईसीपी-एमएस के लिए ला सिस्टम को जोड़ा गया। ला सॉफ्टवेयर(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)में एब्लेशन सेल में जेल की सतह को रोशन करने और जेड-एक्सिस डिस्टेंस को एडजस्ट कर जेल की सतह पर फोकस करने के लिए कैमरा लाइट सेटिंग्स (यानी'रिंग','कॉक्स'और'ट्रांसमिटेड')सेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए सेल भर में यादृच्छिक स्थानों पर जाएं कि सभी जेल सतहों पर ध्यान केंद्रित किया जाए।
    2. ला सॉफ्टवेयर की'लेजर सेटअप'विंडो में ला पैरामीटर सेट करें। डीजीटी जैल के ला-आईसीपी-एमएस लाइन-स्कैन विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली विशिष्ट सेटिंग्स हैं: मोड निरंतर; ऊर्जा उत्पादन 20-30%; पुनरावृत्ति दर 10-20 हर्ट्ज; स्पॉट व्यास 100-200 माइक्रोन; स्कैन स्पीड 150-250 माइक्रोन एस-1.
      नोट: पैरामीटर का उपयोग किए जाने वाले जेल के प्रकार के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है और भिन्न हो सकते हैं। प्रयोगात्मक और वाद्य सेटअप के आधार पर शोर अनुपात, स्थानिक संकल्प, या अधिग्रहण के समय को कम करने के लिए संकेत बढ़ाने के लिए मापदंडों को भी बढ़ाया जा सकता है। अपेक्षाकृत कम ऊर्जा उत्पादन (≤40%) और दोहराव दर (≤25 हर्ट्ज) समर्थन सामग्री39में जैल के माध्यम से मर्मज्ञ से बचने के लिए . सुनिश्चित करें कि लेजर स्कैन गति कुल आईसीपी-एमएस स्कैन चक्र अवधि (4.2.6 देखें) द्वारा विभाजित स्पॉट व्यास ≤ है ताकि डेटापॉइंट के संपीड़न से बचा जा सके और इस प्रकार स्कैन दिशा45में रिज़ॉल्यूशन का नुकसान हो सके। उदाहरण के लिए, 200 माइक्रोन का स्पॉट व्यास और 0.25 एस की कुल आईसीपी-एमएस स्कैन चक्र अवधि स्थापित करते समय, स्कैन की गति ≤800 माइक्रोन एस-1होनी चाहिए।
    3. लाइन टूल का चयन करें और एक जेल मानक में एक एकल, ~ 1 मिमी लंबी लाइन पैटर्न बनाएं। 'स्कैनपैटर्न'विंडो में लाइन पैटर्न पर सही क्लिक करें और सत्यापित करें कि ला पैरामीटर 4.2.3 में सेट करते हैं। गोद ले लिए गए हैं। इस लाइन को चार बार डुप्लिकेट करने के लिए'डुप्लीकेट स्कैन'टूल का इस्तेमाल करें, जिसमें स्पॉट व्यास(चित्रा 6)से बड़ी इंटरलाइन दूरी (लाइन सेंटर के बीच की दूरी) है। यह दृष्टिकोण प्रति जेल मानक(एन = 5) कुल पांच समानांतर लाइनें प्रदान करता है। प्रत्येक जेल मानक, अंशांकन खाली और विधि खाली के लिए इस कदम को दोहराएं।
    4. जेल के नमूने पर जाएं और आयताकार क्षेत्र के शीर्ष किनारे के साथ एक ही रेखा का विश्लेषण किया जाए। 4.2.3 में निर्दिष्ट पूरे नमूना क्षेत्र के लिए समानांतर लाइन बनाने के लिए लाइन को डुप्लिकेट करें। 300-400 माइक्रोन की इंटरलाइन दूरी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक पंक्ति के प्रत्येक स्टार्ट और एंड पॉइंट के लिए फोकस (जेड-एक्सिस दूरी) सही ढंग से सेट किया गया है।
      नोट: विश्लेषण का स्थानिक संकल्प इंटरलाइन दूरी की तुलना में स्कैन दिशा के साथ अधिक है। इसलिए, लाइनों के शुरू और अंत बिंदु सबसे अच्छा विश्लेषण ढाल की दिशा का पालन कर सकते हैं। राइजोस्पेयर ग्रेडिएंट्स के लिए, यह आमतौर पर रूट एक्सिस(चित्र 6)के लंबवत होते हैं।
    5. आईसीपी-एमएससॉफ्टवेयर(मैटेरियल्स की तालिका)में'विधि'स्क्रीन में एक समय-हल किए गए'डेटा केवल'विधि की स्थापना, प्रत्येक विश्लेषण के लिए एक या अधिक उपयुक्त आइसोटोप (एस) का चयन करें और 13सी को आंतरिक सामान्यीकरण मानक31, 36,40, 41,42के रूप में शामिल करें। सत्यापित करें कि आइसोटोप का पता46हस्तक्षेप से बिगड़ा नहीं है ।
    6. आइसीपी-एमएस विधि (' एस्ट रीडिंग टाइम ') की कुल स्कैन चक्र अवधि को आइसोटोप (आमतौर पर 10-50 एमएस के बीच) के लिए उपयुक्त निवास समय के साथ ≤0.5 एस तक सेटकरें। आईसीपी-एमएस'रीडिंग'को 1 में सेट करें और प्रति सैंपल कुल माप समय(' एस्ट सैंपलिंग टाइम'), यानीप्रति व्यक्तिगत एब्लेशन लाइन निर्धारित करने के लिए'रीडिंग/दोहराने'मूल्य में बदलाव करें। यह विशिष्ट ला मापदंडों और लाइन दूरी 4.2.2 - 4.2.4 में निर्धारित पर निर्भर करता है।
    7. डेटा रिपोर्टिंग के लिए एक तीव्रता बनाम समय डेटा संग्रह मोड का उपयोग करें और प्रत्येक एब्लेशन लाइन के लिए एक व्यक्तिगत डेटा फ़ाइल (यहां .xl) बनाने के लिए'फाइल राइट ऑप्शन'को'न्यू प्रति सैंपल'सेट करें।
    8. आईसीपी-एमएस ' सैंपल स्क्रीन में एक'बैच'नमूनाअनुक्रम स्थापित करें, जिसमें प्रत्येक नमूना प्रविष्टि 4.2.3 - 4.2.4 में सेट की गई एक व्यक्तिगत एब्लेशन लाइन के अनुरूप है।
    9. क्लिक करें'विश्लेषण बैच'आईसीपी-एमएस पर नमूना अनुक्रम शुरू करने के लिए, जो डेटा अधिग्रहण के साथ इंतजार करेगा जब तक कि यह पहले लेजर पल्स से ट्रिगर नहीं हो जाता (ट्रिगर कॉन्फ़िगरेशन पर विवरण के लिए एसआई S5 देखें)।
    10. ला सॉफ्टवेयर में, विश्लेषण करने के लिए सभी लाइनों का चयन करें और सत्यापित करें कि आईसीपी-एमएस विधि('एस्ट सैंपलिंग टाइम',देखें 4.2.6.) व्यक्तिगत लाइन एब्लेशन की अवधि से मेल खाता है, जो आमतौर पर जेल के नमूनों, मानकों और विधि रिक्त स्थान के लिए अलग होता है। दोहराएं 4.2.6। यदि आवश्यक हो तो आईसीपी-एमएस विधि को समायोजित करने के लिए।
    11. क्लिक करें लेजर हेड को रिचार्ज करने के लिए'लेजर एनर्जी'विंडो में'एमिशन'और फिर'रन एक्सपेरिमेंट'विंडो खोलने के लिए'रन'क्लिक करें। यहां'चुनिंदा पैटर्न ओनली'को सेलेक्ट करें,'वॉशआउट देरी'को 20-30 एस सेट करें,'इनकमेंट लेजर ऑफ स्कैन्स'बॉक्स पर टिक करें और'लेजर वार्मअप टाइम'को 10 एस सेट करें।
    12. 'रनएक्सपेरिमेंट'विंडो में'रन'विंडो पर क्लिक करें लाइन स्कैन एनालिसिस शुरू करने और रियल टाइम में आईसीपी-एमएस पर हर आइसोटोप के लिए काउंट्स प्रति सेकंड (सीपीएस) में रॉ सिग्नल तीव्रता की निगरानी करें। प्रत्येक पंक्ति शुरू ('लेजर Warmup समय', 10 एस) और अंत ('वॉशआउट देरी', 20-30 एस) एक गैस खाली के साथ शुरू करना चाहिए ।
    13. लेजर स्थिरता का आकलन करने के लिए विश्लेषण के दौरान लेजर फ्लेंस (जे सेमी-2)की निगरानी करें। यदि प्रवाह काफी हद तक बदलता है, विश्लेषण गर्भपात, और सत्यापित करें कि लेजर स्रोत और/
    14. विश्लेषण के बाद, आईसीपी-एमएस प्लाज्मा को रोकें और ला सिस्टम पर वाहक गैस प्रवाह दर को 0 एमएलन्यूनतम-1पर सेट करें। एब्लेशन सेल से जैल निकालें और आगे के उपयोग के लिए ज़िप बैग में स्टोर करें।

Figure 6
चित्रा 6: डीजीटी ला-आईसीपी-एमएस प्रायोगिक डिजाइन (पैमाने पर नहीं) की योजनाबद्ध । इस दृष्टांत में राइजोसस्फीयर में सीटू सोल्यूट सैंपलिंग में डीजीटी आधारित और जेल की सतह पर सोल्यूट वितरण के ला-आईसीपी-एमएस मैपिंग को दर्शाया गया है, जिसमें अनुकरणीय लाइन-स्कैन आयाम और मापदंडों को दर्शाया गया है । ध्यान दें कि डीजीटी जेल को कांच की प्लेट पर राइजोस्फीयर मिट्टी से स्थानांतरित किए जाने पर डीजीटी जेल क्षैतिज रूप से फ़्लिप किया जाता है, जैसा कि डीजीटी जेल के नीचे कोने में आयत की स्थिति से संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. डेटा प्रोसेसिंग और अंशांकन
    1. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर(सामग्रीकी तालिका) में प्रत्येक एब्लेटेड लाइन के लिए कच्चे डेटा फ़ाइल (.xl) आयात करें। कच्चे डेटा तालिका सीपीएस में प्रत्येक आइसोटोप के लिए आईसीपी-एमएस रीडिंग (डेटापॉइंट) और एस में इसी समय अंक दिखाता है। अलग-अलग कॉलम में एक-दूसरे के बगल में सभी लाइनों को सूचीबद्ध करें।
    2. आंतरिक मानक(13सी) और पर्याप्त वॉशआउट समय की सिग्नल स्थिरता के लिए लाइन-स्कैन डेटा का मूल्यांकन करें।
    3. लाइन एब्लेशन (यानी, लेजर वार्म-अप समय के दौरान) से पहले दर्ज किए गए सभी गैस खाली मूल्यों से प्रत्येक आइसोटोप के लिए एक औसत गैस खाली की गणना करें और पृष्ठभूमि सिग्नल के लिए सही करने के लिए प्रत्येक आइसोटोप के लिए इसी कच्चे तीव्रता से औसत गैस खाली घटाएं।
    4. प्रत्येक डेटापॉइंट के लिए आंतरिक मानक (सीपीएस) की सिग्नल तीव्रता को विभाजित करके आंतरिक सामान्यीकरण लागू करें ताकि सामग्री की मात्रा में भिन्नता और वाद्य बहाव में भिन्नता को सही किया जा सके।
    5. शुरू होने से पहले और पृष्ठभूमि संकेत को हटाने के लिए प्रत्येक एब्लेटेड लाइन के अंत के बाद फसल डेटा। ग्रिड मैट्रिक्स प्राप्त करने के लिए डेटा टेबल को स्थानांतरित करें जहां प्रत्येक पंक्ति एक एब्लेटेड लाइन और प्रत्येक कॉलम को सामान्यीकृत आइसोटोप तीव्रता मूल्य से मेल खाती है। प्रत्येक आइसोटोप के लिए मैट्रिस को अलग-अलग वर्कशीट में अलग करें।
    6. अंशांकन मानकों और अंशांकन रिक्त के लिए प्रति आइसोटोप औसत सामान्यीकृत संकेत तीव्रता अनुपात की गणना करें और जेल मानक एनालाइट लोडिंग(μg सेमी-2;सी एस 4देखें) के साथ एक रैखिक प्रतिगमन मॉडल का उपयोग करके अंशांकन समारोह (वाई = एकड़ + बी)की गणना करें। 47के लिए प्रत्येक आइसोटोप के अंशांकन कार्य का मूल्यांकन करें .
    7. नमूना डेटा मैट्रिक्स के लिए अंशांकन समारोह लागू करें। सामान्यीकृत सिग्नल तीव्रता अनुपात को, Equation 15 जेल एनालिट लोडिंग, Equation 15 (μgसेमी-2)में परिवर्तित करें, और बाद में समय-औसत सॉल्यूट फ्लक्स, Equation 17 (पीजी सेमी-2 एस-1),प्रत्येक आइसोटोप और डेटापॉइंट के लिए Eq. 4 और Eq. 5 के अनुसार:
      Equation 4
      Equation 05
      यहां, एक अंशांकन लाइन की ढलान है, बी अंशांकन लाइन का अवरोधन है, और टी (एस) सोल्यूट नमूने के दौरान जेल तैनाती का समय है।
    8. टीएक्सटी-फाइल के रूप में प्रत्येक विश्लेषण के लिए कैलिब्रेटेड नमूना डेटा मैट्रिक्स को सहेजें।
  2. छवि पीढ़ी
    नोट: छवि पीढ़ी के सभी चरणों के दौरान किसी भी पिक्सेल इंटरपोलेशन ऑपरेशन से बचना सुनिश्चित करें, क्योंकि इससे परिणामस्वरूप छवियों में कृत्रिम रूप से चिकनी सॉल्यूट फ्लक्स ग्रेडिएंट हो सकते हैं।
    1. इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर(टेबल ऑफ मैटेरियल)में टेक्स्ट इमेज के रूप में कैलिब्रेटेड सैंपल डेटा मैट्रिक्स (.txt) आयात करें।
    2. एक्स-डायरेक्शन (यानी पार्श्व रिज़ॉल्यूशन) में लेजर स्कैन गति को कुल आईसीपी-एमएस स्कैन चक्र अवधि (उदाहरण के लिए, 200 माइक्रोन एस-1 की स्कैन गति और 0.25 एस की कुल स्कैन चक्र अवधि मानते हुए, पार्श्व संकल्प 50 μm के बराबर है) के साथ लेजर स्कैन गति को गुणा करके प्रति पिक्सेल की गणना करें। वाई-दिशा में प्रति पिक्सेल की दूरी इंटरलाइन दूरी(चित्रा 6)के बराबर है।
    3. छवि के आस्पेक्ट रेशियो सुधार कारक की गणना करें। इसलिए, एक्स-डायरेक्शन (जैसे, 50 माइक्रोन) में प्रति पिक्सेल दूरी को वाई-दिशा (उदाहरण के लिए, 300 माइक्रोन) में विभाजित करें। 'स्केल'के तहत प्राप्त वाई/एक्स करेक्शन फैक्टर (इस उदाहरण 6 में) लागू करें। एक्स-निर्देशन में प्रति पिक्सेल (माइक्रोन या एमएम में) दूरी को'सेट स्केल'के तहत स्केलिंग के रूप में लागू करें।
    4. सॉलाइट इमेज में केमिकल ग्रेडिएंट्स के बेहतर विजुअलाइजेशन के लिए'लुक अप टेबल'यानी छद्म कलर स्केल लगाएं और डिस्प्ले रेंज की लोअर/अपर लिमिट को कंट्रोल करने के लिए इमेज 'कलर बैलेंस' को एडजस्ट करें। एक'अंशांकन बार'जोड़ें और झगड़ा-फ़ाइल के रूप में घुलनशील छवि को बचाने के लिए।
    5. इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर में'कॉपी टू सिस्टम'कमांड का इस्तेमाल करते हुए सॉल्यूट इमेज को कॉपी करें और डेस्कटॉप पब्लिशिंग सॉफ्टवेयर(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)में चिपका दें। स्केल-मैच, संरेखित करें और 3.1.7 में प्राप्त आरओआई की तस्वीर के साथ सोल्यूट छवि की रचना करें।
      नोटः नकल करने से पहले, 10 के'एक्स स्केल'और'सेटस्केल' के तहत 10 के'वाई स्केल'को लागू करने के माध्यम से सॉल्यूट इमेज को आकार दें ताकि हाई-रिजॉल्यूशन पब्लिशिंग के लिए पर्याप्त पिक्सल सुनिश्चित किया जा सके।
डीजीटी जेल निर्माण पौधों की खेती सीटू सोल्यूट सैंपलिंग में ला-आईसीपी-एमएस सॉल्यूट फ्लक्स मैपिंग
एचआर-एमबीजी
1 सप्ताह 		मिट्टी की तैयारी
1 सप्ताह 		जेल आवेदन
1 घंटे प्रति जेल 		नमूना तैयार करना
1 घंटे प्रति जेल
एचआर-एबीजी
3 दिन 		राइजोट्रॉन असेंबली
2 घंटे प्रति दोहराने 		सोल्यूट नमूना अवधि
चर, आम तौर पर 24 घंटे 		ला-आईसीपी-एमएस विश्लेषण
1 दिन प्रति जेल
एचआर-सीबीजी
3 दिन 		पौधों की वृद्धि
अध्ययन पर निर्भर 		जेल पुनर्प्राप्ति
1 घंटे प्रति जेल 		डाटा प्रोसेसिंग
4 घंटे प्रति जेल
जेल सुखाने
2-3 दिन 		छवि पीढ़ी
10 मिनट प्रति छवि

तालिका 1: डीजीटी ला-आईसीपी-एमएस तकनीक के सामान्य चरणों के लिए अनुमानित समय।

Representative Results

डीजीटी इमेजिंग विधि की क्षमता और डेटा विस्तार को प्रदर्शित करने के लिए, हमने फगोपाइरम एस्क्यूरेंटम और सालिक्स स्मिथियाना (चित्रा 7)की जड़ों से सटे मिट्टी में कई लैबिल पोषक तत्वों और संदूषक सोल्यूट प्रजातियों के उप-मिमी, 2डी फ्लक्स वितरण को संकलित किया। प्रोटोकॉल के सामान्य प्रक्रियात्मक चरणों के लिए अनुमानित समय तालिका 1में प्रस्तुत किया जाता है।

चित्रा 7 में Solute छवियों या तो एचआर-MBG या एचआर-सीबीजी बाध्यकारी जैल का उपयोग कर तीन अलग-अलग अध्ययनों में उत्पन्न किए गए थे। रासायनिक छवियों एक्स-अक्ष के साथ 82-120 माइक्रोन और वाई-एक्सिस के साथ 300-400 माइक्रोन के स्थानिक संकल्प पर 2डी सॉल्यूट फ्लक्स वितरण दिखाते हैं, जो ला-आईसीपी-एमएस मापदंडों पर निर्भर करता है। चूंकि इमेज कैलिब्रेशन और आकार घटाने के दौरान कोई इंटरपोलेशन लागू नहीं किया गया था, इसलिए सिंगल पिक्सल मापा गया डेटापॉइंट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। आरओआई की फोटोग्राफिक छवि के साथ सोल्यूट छवियों के संरेखण से पता चलता है कि मिट्टी की संरचना और जड़ आकृति विज्ञान के अनुसार विभिन्न तत्वों का उप-मिमी, 2डी सॉल्यूट फ्लक्स वितरण अत्यधिक परिवर्तनशील है। यह मिट्टी-राइजोस्फेयर-प्लांट सिस्टम में तत्वों के अंतर बायोजियोकेमिकल व्यवहार और मिट्टी मैट्रिक्स और पौधे की जड़ों के साथ उनकी बातचीत के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

चित्रा 7A लैबिल अकार्बनिक एमजी, अल, पी, एमएन और फे सोल्यूट फ्लक्स में राष्ट्रीय राजमार्ग4नंबर3के साथ निषेचित कार्बोनेट-मुक्त मिट्टी में उगाए गए एक युवा एफ एस्क्यूलेंटम रूट के आसपास कल्पना की गई थी। उप-मिमी सोल्यूट वितरण ने रूट तेज के कारण पुराने रूट वर्गों के साथ कम अल, पी और फे फ्लक्स के क्षेत्रों को दिखाया, और एफ एस्क्यूरेंटम रूट की स्थानीयकृत पी जुड़ाव प्रक्रियाओं के कारण मूल शीर्ष पर एमजी, अल, पी, एमन और फे फ्लक्स में अत्यधिक वृद्धि हुई। ध्यान दें कि मूल टिप मिट्टी की सतह के पीछे कुछ हद तक स्थित है और इसलिए फोटो ग्राफिक छवि में शायद ही दिखाई दे। चित्रा 7B एमएनएन, फे, जेडएन, सीडी और पीबी सहित प्रयोगशाला ट्रेस धातुओं के वितरण को धातु-सहिष्णु एस स्मिथियाना की जड़ के चारों ओर दिखाता है जो जेडएन, सीडी और पीबी के साथ मामूली रूप से दूषित मिट्टी में उगाया जाता है। सोल्यूट छवियों ने विशेष रूप से तत्काल जड़ स्थिति में जेडएन, सीडी और पीबी की अलग-अलग कमी की कल्पना की, जिसमें यह दर्शाया गया है कि एस स्मिथियाना जड़ें दूषित मिट्टी में प्रयोगशाला ट्रेस धातुओं के लिए एक स्थानीयकृत सिंक के रूप में कार्य करती हैं। इसके अलावा, स्थानीयकृत जेडएन, सीडी और पीबी फ्लक्स वृद्धि देखी जा सकती है, जो तत्काल मिट्टी-रूट इंटरफेस पर इन ट्रेस धातुओं के संचय का संकेत देती है।

बहु-मौलिक सोल्यूट इमेजिंग के अलावा, प्रस्तुत विधि को पूरक प्रसार-आधारित इमेजिंग तकनीकों जैसे प्लानरऑप्टोड्स 34के साथ भी जोड़ा जा सकता है। यह चित्रा 7Cमें प्रदर्शित किया जाता है, जहां एस स्मिथियाना के राइजोसिफैयर में लैबिल ट्रेस धातुओं का वितरण संयुक्त, एकल परत प्लानर ऑप्टोड-डीजीटी ईन बाइंडिंग जेल33का उपयोग करके पीएच के वितरण के साथ सह-स्थानीयकृत किया गया था। मिट्टी सब्सट्रेट को (एनएच4) 2एसओ4के साथ निषेचित किया गया था, जिससे थोक मिट्टी की तुलना में जड़ कुल्हाड़ियों के साथ पीएच में ~ 1 इकाई की कमी आई थी। पीएच घटने से एमएन, फे, कंपनी, नी, सीयू और पीबी के बढ़ते घुलनशील प्रवाह के साथ सह-स्थानीयकृत किया गया, जो पीएच-प्रेरित धातु घुलनशीलता का सुझाव देता है।

इसके अलावा, इन उदाहरण परिणामों में कुछ संभावित इमेजिंग कलाकृतियां दिखाई देती हैं जिन्हें प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, संरचनात्मक मिट्टी की इनोमोजेनिटीज, उदाहरण के लिए, चित्रा 7 एकी आरओआई छवि के निचले तीसरे हिस्से में एक क्षैतिज रेखा के रूप में मनाया जाता है, मिट्टी-जेल संपर्क विच्छेदन का कारण बन सकता है जिसके परिणामस्वरूप इस स्थान पर बाध्यकारी जेल में सीमित प्रसार होता है। इसके विपरीत, राइजोट्रॉन में अत्यधिक मिट्टी के कॉम्पैक्टेशन से खराब पोरोसिटी हो सकती है जिसके परिणामस्वरूप एनोक्सिया की ओर मिट्टी रेडॉक्स स्थिति का कृत्रिम बदलाव हो सकता है। यह चित्रा 7Bमें दर्शाया गया है, जहां सोल्यूट छवियों में अत्यधिक ऊंचा एमएन और फे फ्लक्स के व्यापक क्षेत्रों में आरओआई छवि में मिट्टी की एक घनी परत के साथ मिलान किया जाता है। यह उच्च मृदा कॉम्पैक्टेशन के कारण मिट्टी की रेडॉक्स क्षमता में कमी का सुझाव देता है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक रेडॉक्स-संवेदनशील तत्वों का अपचय विघटन और घुलनशीलता होती है। इसलिए भरने के बाद सीधे मिट्टी की सतह के सावधानीपूर्वक राइजोट्रॉन भरने और दृश्य निरीक्षण की सिफारिश की जाती है।

Figure 7
चित्रा 7: विभिन्न मिट्टी-रूट इंटरफेस में लैबिल पोषक तत्वों और संदूषक सोल्यूट प्रजातियों का उप-मिमी 2डी वितरण। (A)एक युवा एफ एस्क्यूलेंटम रूट के चारों ओर एनियोनिक पी और cationic एमजी, अल, एमएन और फे सोल्यूट्स का वितरण । एनियोनिक और cationic solutes के सह-स्थानीयकृत नमूने ~75% WHC के मिट्टी के पानी संतृप्ति पर 24 घंटे के लिए एचआर-एमबीजी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। अल, पी और एमएन छवियों को अंशांकित एफडीजीटी मूल्यों (पीजी सेमी-2 एस -1) के रूप में प्रदर्शित कियाजाताहै, जबकि एमजी और एफई छवियां 13सी-सामान्यीकृत तीव्रता दिखाती हैं। स्केल बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा रेफरी48से अनुकूलित है। (ख)एमएनएन, एफ, जेडएन, सीडी और पीबी के आसपास एमएनएन, जेडएन, सीडी और पीबी के साथ दूषित मिट्टी में उगाई जाने वाली एस स्मिथियाना रूट के वितरण । Cationic ट्रेस धातु solutes ~८०% WHC के एक मिट्टी के पानी संतृप्ति पर 20 घंटे के लिए एचआर-सीबीजी का उपयोग कर नमूना थे । सभी छवियों को कैलिब्रेटेड एफडीजीटी मान (पीजी सेमी-2 एस -1) के रूप में प्रदर्शित कियाजाता है। स्केल बार 0.5 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा रेफरी3से अनुकूलित है । (ग)एस स्मिथियाना जड़ों के आसपास पीएच और कई cationic solutes का वितरण सीडी और सोल्यूट गतिशीलता के साथ नुकीला मिट्टी में उगाया गया मानव संसाधन-एमबीजी प्रोटोकॉल के संशोधन का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जिससे एक साथ सोल्यूट सैंपलिंग और प्लानर ऑप्टोड इमेजिंग33की अनुमति मिली। एमएन, सीयू, जेडएन और सीडी छवियों को अंशांकित एफडीजीटी मूल्यों (पीजी सेमी-2 एस -1) के रूप में प्रदर्शित कियाजाताहै, जबकि एफ, सीओ, नी और पीबी छवियां 13सी-सामान्यीकृत तीव्रता दिखाती हैं। स्केल बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा रेफरी33से अनुकूलित है। प्रस्तुत आंकड़े सीसी द्वारा के तहत लाइसेंस प्राप्त उद्धृत अनुच्छेद3,33,48 से पुन: पेश किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल 1. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां प्रस्तुत सोल्यूट इमेजिंग प्रोटोकॉल मिट्टी-पौधों के वातावरण में 2डी पोषक तत्वों और संदूषक प्रवाह की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक बहुमुखी विधि है। यह मिट्टी-रूट इंटरफेस पर लैबाइल सोल्यूट प्रजातियों की उप-मिमी स्केल बहु-तत्व छवियों को उत्पन्न करने की अपनी क्षमता में अद्वितीय है, जो राइजोस्पेयर में सोल्यूट ग्रेडिएंट्स को मापने के लिए वैकल्पिक तरीकों के प्राप्त स्थानिक संकल्प से अधिकहै। डीजीटी के सीटू नमूना दृष्टिकोण में लक्षित, ला-आईसीपी-एमएस जैसे अत्यधिक संवेदनशील रासायनिक विश्लेषण विधि के संयोजन में, मिट्टी या इसी तरह के सब्सट्रेट्स में उगाए जाने वाले व्यक्तिगत पौधों की जड़ों के आसपास घुलनशील गतिशीलता की विस्तृत जांच की सुविधा प्रदान करता है। सिंक-आधारित नमूना प्रक्रिया के कारण, प्राप्त छवियां कल्पना वाले सॉल्यूट्स की क्षमता को दर्शाती हैं, और इसलिए उनके पौधे की उपलब्धता10का अनुमान है। यद्यपि सोल्यूट फ्लक्स की विधि-अंतर्निहित माप में पौधे-उपलब्ध पोषक तत्वों के अंशों के रूप में व्याख्याशीलता जैसे काफी फायदे होते हैं, प्रवाह माप पोरवॉटर एकाग्रता माप की तुलना में समझने के लिए बहुत कम सीधे-आगे होते हैं। थोक मिट्टी अनुप्रयोगों में मानक डीजीटी नमूना ज्यामिति (विशेष रूप से उस सेटअप में उपयोग किए जाने वाले 0.8 मिमी-मोटी प्रसार जैल) वास्तविक पोरवॉटर एकाग्रता, सीसोलनऔर एक बल्क डीजीटी माप, सीडीजीटीद्वारा एक समय-औसत पोरवॉटर एकाग्रता अनुमान की तुलना करने के लिए अनुमति देता है, और एक सोल्यूट प्रजातियों की पुनर्आपूर्ति गतिशीलता के बारे में इन मापदंडों की व्याख्या के लिए। हालांकि, इस तरह की तुलना इमेजिंग डीजीटी आवेदन के आधार पर बहुत पतली प्रसार परतों के साथ नहीं की जा सकती है, क्योंकि व्युत्पन्न सीडीजीटी मूल्य अवास्तविक रूप से छोटेहैं। डीजीटी इमेजिंग परिणाम इसलिए हमेशा सरल और व्याख्या करने के लिए जल्दी नहीं होते हैं और अक्सर अधिक पारंपरिक पोरजल एकाग्रता मापों के सीधे तुलनीय नहीं होते हैं।

विधि लागू करते समय, कुछ महत्वपूर्ण चरणों पर सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है, मुख्य रूप से राइजोट्रॉन विकास कंटेनरों को भरने और पानी देने से संबंधित। मिट्टी को राइजोट्रॉन में भरने के दौरान, मिट्टी को बहुत अधिक कॉम्पैक्ट करने से बचना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि पौधे की जड़ें दृढ़ता से संकुचित मिट्टी में प्रवेश नहीं कर सकती हैं और जड़ विकास बाधित होगा। हमने जड़ों को दृढ़ता से संकुचित मिट्टी से बचने और राइजोट्रॉन विकास कंटेनर के भीतरी किनारों के साथ बढ़ते देखा है, जहां मिट्टी आमतौर पर कम संकुचित होती है। इस मामले में, राइजोट्रॉन के केंद्र में स्थित व्यक्तिगत जड़ें, जहां डीजीटी जैल को आसानी से लागू किया जा सकता है, सफल जेल आवेदन को प्रभावी ढंग से बाधित करते हुए विकसित नहीं हो सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, अनुभव से पता चला है कि 1.0-1.4 ग्रामसेमी-3 की सूखी मिट्टी थोक घनत्व बेरोक-टोक जड़ विकास की अनुमति देता है। इसके अलावा, अत्यधिक मृदा कॉम्पैक्टेशन रेडॉक्स-संवेदनशील तत्वों और बायोजियोकेमिक रूप से संबंधित प्रजातियों की घुलनशीलता के बारे में कलाकृतियों का एक संभावित स्रोत भी है। चूंकि कुल पोर की मात्रा कम हो जाती है और पोर व्यास वितरण अत्यधिक संकुचित मिट्टी में कम व्यास की ओर स्थानांतरित हो जाता है, कम हवा से भरे बड़े व्यास पोर की मात्रा उपलब्ध है, जिससे स्थानीय स्तर पर अपचय की स्थिति पैदा हो सकती है। नतीजतन, एमएनIII/IV-औरFeIII-ऑक्साइडको कम किया जा सकता है, जिससे एमएन2 + और Fe2 + फ्लक्स में वृद्धि हुई है । फे-ऑक्साइड का विघटन, जो फॉस्फेट और सूक्ष्म पोषक तत्वों के लिए महत्वपूर्ण सोरपशन साइटें हैं, सोछत और/या सह-उपजी प्रजातियों को मुक्त कर सकते हैं और इस तरह बायोजियोकेमिक रूप से संबद्ध प्रजातियों के कृत्रिम रूप से ऊंचा प्रवाह का कारण बन सकते हैं । अगर ग्रोथ कंटेनरों को बहुत ज्यादा पानी पिलाया जाए तो इसी तरह का मुद्दा उठ सकता है । विकास कंटेनर के शीर्ष पर छोटी मिट्टी की सतह क्षेत्र के माध्यम से वाष्पीकरण कम है और मिट्टी रोपण के बाद कई हफ्तों तक पानी संतृप्त रह सकती है, जिससे रेडॉक्स कलाकृतियां भी हो सकती हैं।

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार गढ़े गए एचआर-डीजीटी बाइंडिंग जेल की रासायनिक कार्यक्षमता है। प्रोटोकॉल का पालन करके, बाध्यकारी चरणों के सजातीय वितरण के साथ पतले जैल प्राप्त किए जाते हैं। यदि जैल में अहोमेनेसीय सामग्री वितरण के क्षेत्र हैं (उदाहरण के लिए, जेल में छेद या बाध्यकारी चरणों के समुच्चय) इन क्षेत्रों को हटाने की आवश्यकता है या, यदि बहुत व्यापक है, तो जेल निर्माण प्रोटोकॉल को दोहराया जाना चाहिए। यदि सही ढंग से तैयार किया जाता है, तो जेल को लक्ष्य सोल्यूट प्रजातियों को बांधने में सक्षम होना चाहिए जो तुरंत जेल में फैलते हैं और मात्रात्मक रूप से27,जो विश्लेषण-विशिष्ट जेल बाध्यकारी क्षमता द्वारा निर्धारित किया जाता है। जबकि जेल की क्षमता से अधिक अदूषित मिट्टी में कम समस्याग्रस्त है, इसे धातु-दूषित मिट्टी और खारी मिट्टी के वातावरण में माना जाना चाहिए। जेल बाध्यकारी चरणों का संतृप्ति न केवल मात्रात्मक सॉल्यूट नमूने को ख़राब करेगा, बल्कि जेल में बाध्यकारी चरणों के बीच सोल्यूट्स का पार्श्व प्रसार भी होगा, जिससे छोटे पैमाने पर सॉल्यूट फ्लक्स सुविधाओं का अनिश्चितकालीन स्थानीयकरण होगा। इस प्रकार, यदि लक्षित मृदा वातावरण में बहुत अधिक मात्रा में लैबिल पोषक तत्व/संदूषक प्रजातियों की अपेक्षा की जाती है, तो प्रारंभिक परीक्षण किए जाने चाहिए । अपेक्षित डीजीटी लोडिंग का आकलन करने के लिए, थोक मिट्टी डीजीटी पिस्टन नमूने जिसके बाद जेल एल्यूशन और गीले-रासायनिक विश्लेषण15,49लागू किए जा सकते हैं। यदि आवश्यक हो, तो जेल संपर्क समय को कम करने के लिए डीजीटी तैनाती समय को समायोजित किया जा सकता है और इस प्रकार क्षमता थ्रेसहोल्ड से ऊपर जेल संतृप्ति से बचें। इसके विपरीत, प्रारंभिक परीक्षण भी आवश्यक जेल संपर्क समय और/या ला-आईसीपी-एमएस संवेदनशीलता की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है अगर बहुत कम solute loadings की उंमीद कर रहे हैं, जो प्राकृतिक मिट्टी की पृष्ठभूमि के स्तर पर ट्रेस तत्व solutes मानचित्रण के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है15। इसके अलावा, डीजीटी ला-आईसीपी-एमएस अंशांकन मानकों को तैयार करने में जैल की नियंत्रित लोडिंग के माध्यम से अपने प्रायोगिक आवेदन से पहले सही डीजीटी जेल कार्यप्रणाली का सत्यापन किया जाना चाहिए। जेल मानक एक मैट्रिक्स-मिलान संदर्भ जेल एनालिट लोडिंग प्रदान करता है जिसका उपयोग यह आकलन करने के लिए किया जा सकता है कि ला-आईसीपी-एमएस द्वारा निर्धारित नमूना जेल लोडिंग अपेक्षित सीमा के भीतर है या नहीं। यदि एक संकेत प्राप्त करने में असमर्थ है जो गैस और विधि खाली पृष्ठभूमि शोर से अलग है, ऑपरेटर को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ट्रेस तत्व विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को लागू किया गया था और सभी प्रोटोकॉल कदम सही ढंग से किए गए थे । कभी-कभी, डीजीटी जेल को गलती से मिट्टी के उजागर, लेजर बीम के बजाय ग्लास प्लेट की ओर सामना करने वाले पक्ष के साथ सॉल्यूट सैंपलिंग के बाद फ़्लिप किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कम सिग्नल तीव्रता होती है और अंतिम सॉल्यूट फ्लक्स छवियों में गलती से फ़्लिप की गई विशेषताएं होती हैं।

ला-आईसीपी-एमएस विश्लेषण के दौरान बड़ी मात्रा में डेटा तैयार किया जाता है, जिसका मूल्यांकन करने में काफी समय लगता है । हमारी प्रयोगशाला में, हम मानक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अपने लक्षित डेटा आउटपुट प्रारूप के अनुरूप इन-हाउस डेटा मूल्यांकन लिपियों का उपयोग करते हैं। अर्ध-स्वचालित छंटाई और अंशांकन के बाद, ओपन सोर्स, ओपन एक्सेस इमेज एनालिसिस टूल्स (इमेजजे, फिजी50)का उपयोग करके इमेज प्लॉटिंग का आयोजन किया जाता है। यह दृष्टिकोण डेटा छंटाई, मूल्यांकन और प्रस्तुति पर पूर्ण नियंत्रण की अनुमति देता है, जो आवश्यक है क्योंकि एकत्र किए गए डेटा आयताकार के अनुरूप हैं, न कि क्वाड्रेटिक पिक्सेल, जिन्हें उत्पन्न सॉल्यूट मानचित्रों में ठीक से प्रदर्शित करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, डेटा प्रोसेसिंग के दौरान, किसी भी पिक्सेल इंटरपोलेशन को सावधानीपूर्वक टाला जाना चाहिए। पिक्सेल इंटरपोलेशन रासायनिक छवियों में चिकनी ढाल की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप नरम, अक्सर परिपत्र तत्व वितरण विशेषताएं होती हैं और इसलिए मूल डेटा का अवांछनीय परिवर्तन होता है। पिक्सेल इंटरपोलेशन कई इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर उत्पादों में री-स्केलिंग और री-फॉर्मेटिंग ऑपरेशंस में एक मानक प्रक्रिया है, लेकिन आमतौर पर अचयनित किया जा सकता है।

अंत में, वर्णित विधि प्राकृतिक मिट्टी-राइजोस्फीयर-प्लांट सिस्टम में पोषक तत्वों और संदूषक गतिशीलता को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उन्नति है। डीजीटी-केवल अनुप्रयोगों के अलावा, विधि को अन्य, प्रसार आधारित इमेजिंग तकनीकों जैसे प्लानर ऑप्टोड्स3, 33,42,43,48,51और ज़ाइमोग्राफी20,21, 22,23,24के साथ जोड़ा जा सकता है, और अतिरिक्त तत्वों और मिट्टी के मापदंडों को शामिल करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) द्वारा सह-वित्त पोषित किया गया था: P30085-N28 (थॉमस प्रोहास्का) और ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) और फेडरल स्टेट ऑफ लोअर ऑस्ट्रिया: P27571-बीबीएल (जैकब सैंटनर)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) VWR 21300.260 ≥98.0%, analytical reagent
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M8250-100G ≥99.5%
Acrylamide solution Sigma-Aldrich A4058-100ML 40%, for electrophoresis
Analyte salts n/a n/a Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher
Buechner funnel VWR 511-0065 13 cm plate diameter
Chemical equilibrium modelling software KTH Sweden n/a Visual MINTEQ
Clamp Local warehouse n/a
Desktop publishing software Adobe Inc. n/a InDesign CS6
DGT cross-linker DGT Research Ltd n/a 2%, agarose derivative
DGT piston sampler DGT Research Ltd n/a 2 cm diameter exposure window
Digital single-lens reflex (DSLR) camera Canon Inc. n/a Canon EOS 1000D
Dispersion device IKA 3737000 Ultra-Turrax T10 Basic
Double-sided adhesive tape Tesa 56171
Ethanol Sigma-Aldrich 34923 Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
Gel blotting paper Whatman 10426981 Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness
Gel drier UniEquip n/a UNIGELDRYER 3545
High-pressure microwave system Anton Paar n/a Multiwave 3000
HNO3 VWR 1.00456.2500P 65%, ISO for analysis
Horizontal shaker GFL 305
HydroMed D4 AdvanSource Biomaterials Corp. n/a Ether-based hydrophilic urethane
ICP-MS software Perkin Elmer n/a Syngistix
Image analysis software National Institutes of Health (NIH) n/a ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/
Knife-coating device BYK 5561 Single Bar 6″, 0.5 mils
LA software Elemental Scientific Lasers n/a ActiveView
LA system Elemental Scientific Lasers n/a NWR193
Laminar flow bench Telstar Laboratory Equipment B.V. n/a Class II biological safety cabinet
Magnetic stirrer IKA 0003582400 C-MAG MS 7
Moisture-retaining film Bemis Company, Inc. PM999 Parafilm M, 4" x 250'
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-50ML BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99%
NaNO3 Sigma-Aldrich 229938-10G 99.995% trace metals basis
NaOH Sigma-Aldrich 1064980500 Pellets for analysis
Overhead shaker GFL 3040
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials Savillex 200-015-20 15 mL Standard Vial, Rounded Interior
pH meter Thermo Scientific 13-644-928 Orion 3-Star Benchtop pH Meter
pH probe Thermo Scientific 8157BNUMD Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutter DGT Research Ltd n/a Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd
Plastic tweezers Semadeni 602
Plasticine Local stationary shop n/a non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents
Polycarbonate membrane discs Whatman 110606 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polycarbonate membrane sheet Whatman 113506 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polyethersulfone membrane discs Pall Corporation 60172 Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
Polyethersulfone membrane sheet Pall Corporation 60179 Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
PTFE foil Haberkorn n/a 50 µm thickness
PTFE spacer Haberkorn n/a Variable thicknesses available
PTFE-coated razor blades Personna GEM 62-0178 Stainless steel single edge blades (coated)
PTFE-coated Tygon tubing S-prep GmbH SP8180 0.32 cm inner diameter
Quadrupole ICP-MS Perkin Elmer N8150044 NexION 2000B
Quantitative filter paper, 454 VWR 516-0854 Particle retention 12-15 µm
Spreadsheet software Microsoft Corporation n/a Microsoft Excel 2016 (v16.0)
Stainless-steel cutter Local locksmithery n/a 2.5 cm diameter
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) Teledyne CETAC Technologies n/a 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension
Transistor-transistor logic (TTL) cable n/a n/a Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument
Two-volume cell Elemental Scientific Lasers n/a Two-volume cell 1
Vinyl electrical tape 3M n/a Scotch Super 33+
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References

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Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska, T., Santner, J. Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil. J. Vis. Exp. (163), e61661, doi:10.3791/61661 (2020).

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