Summary
פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה עבור הדמיה דו-ממדית תת-מ"מ של מינים מרובים של חומרים מזינים אנאורגניים מזהמים ומינים מזהמים באמצעות מעברי צבע דיפוזיביים בסרטים דקים (DGT) בשילוב עם הדמיית ספקטרומטריית מסה. דגימה מסיסת וניתוח כימי ברזולוציה גבוהה מתוארים בפירוט למיפוי כמותי של מסיסים בריזוספרה של צמחים יבשתיים.
Abstract
אנו מתארים שיטה להדמיה דו-ממדית (דו-ממדית) וכימות של התפלגות labile (כלומר, סופח באופן הפיך) מזן מסיס (למשל, P, Fe, Mn) ומזהם (למשל, As, Cd, Pb) מינים מסיסים באדמה הסמוכה לשורשי הצמח ("rhizosphere") ברזולוציה מרחבית תת-מילימטר (~ 100 מיקרומטר). השיטה משלבת דגימה מסיסת מבוססת כיור על ידי מעברי צבע מפוזרים בטכניקת סרטים דקים (DGT) עם ניתוח כימי שנפתר באופן מעוגל על ידי אבלציה בלייזר בשילוב ספקטרומטריית מסת פלזמה (LA-ICP-MS). טכניקת DGT מבוססת על הידרוג'לים דקים עם שלבי כריכה אנתלט סלקטיביים מופצים הומוגנית. מגוון שלבי הכריכה הזמינים מאפשר הכנת סוגים שונים של ג'ל DGT בעקבות הליכי ייצור ג'ל פשוטים. עבור פריסת ג'ל DGT בריזוספרה, צמחים גדלים במיכלי צמיחה שטוחים ושקופים (rhizotrons), המאפשרים גישה פולשנית מינימלית למערכת שורשים הגדלה באדמה. לאחר תקופה שלפני הצמיחה, ג'לים DGT מוחלים על אזורים נבחרים של עניין עבור דגימה solute situ בריזוזפירה. לאחר מכן, ג'לים DGT מאוחזרים ומוכנים לניתוח כימי עוקב של מסיסים מאוגדים באמצעות LA-ICP-MS קו סריקה הדמיה. יישום של נורמליזציה פנימית באמצעות 13C וכיול חיצוני באמצעות תקני ג'ל תואמי מטריצה מאפשר עוד יותר כימות של שטף 2D solute. שיטה זו ייחודית ביכולתה לייצר תמונות דו-ממד כמותיות בקנה מידה תת-מ"מ של שטף מסיס מרובה אלמנטים בסביבות של צמחי קרקע, החורגות מהרזולוציה המרחבית ברת השגה של שיטות אחרות למדידת מעברי צבע מסיסים בריזוספירה באופן משמעותי. אנו מציגים את היישום וההערכה של השיטה להדמיית מינים מסיסים קטיוניים ואניוניים מרובים בריזוספרה של צמחים יבשתיים ומדגישים את האפשרות לשלב שיטה זו עם טכניקות הדמיה משלימות.
Introduction
רכישת חומרים מזינים על ידי צמחי יבול היא גורם מפתח בקביעת פרודוקטיביות היבול. התהליכים השולטים בספיגה יעילה של חומרים מזינים על ידי יבולים נחקרו באופן אינטנסיבי, במיוחד המנגנונים השולטים בזמינות התזונתיים והפנמה תזונתית על ידי שורשי הצמח בממשק שורש הקרקע, הריזוספירה, מוכרים על תפקידם ברכישת חומרי הזנה של יבולים. תהליכים חשובים עבור ספיגת התזונתי הצמח כוללים: הובלת מים מזינים לכיוון השורש; שיווי משקל דינמי של סופציה בין מינים המומסים בנקבוביות הקרקע לבין מינים הקשורים למשטחי אדמה מוצקים; תחרות מיקרוביאלית על חומרים מזינים; מינרליזציה מיקרוביאלית של חומרים מזינים הכלולים בחומר אורגני באדמה; והפנמה תזונתית לתוך סימפלסמה השורש. ספיגת מזהמי מתכת קורט אנאורגניים נשלטת במידה רבה על ידי אותם מנגנונים.
בהתאם לזמינות התזונתי והמזהם, הביקוש לצמחים וההתפזרות באדמה, ניתן לראות דפוסי תזונה דיפרנציאליים בריזוספרה. עבור אלמנטים סוררים מאוד עם שיעורי הפנמה גבוהים יחסית (למשל, P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), דלדול של labile (כלומר, ספיחה הפוכה) שבר אלמנט לעומת הקרקע בתפזורת נמצא, עם רוחב אזור דלדול לעתים קרובות להיות ≤1 מ"מ, ואילו עבור חומרים מזינים ניידים יותר כגון NO3-, אזורי דלדול יכול להאריך עד כמה סנטימטרים1. יתר על כן, הצטברות של אלמנטים כגון Al ו Cd נצפתה כאשר הזמינות עולה על שיעורי ספיגת הצמח2,3.
בהתחשב בחשיבות של תהליכי ריזוספירה ברכיבה על אופניים מזינים ומזהמיים, פותחו מספר טכניקות למדידת שבר היסוד הזמין לצמח ברזולוציה מרחבית גבוהה4,5. עם זאת, מדידת הפצות מסיסות labile בקנה מידה קטן הוכיחה להיות מאתגר מכמה סיבות. קושי גדול הוא לטעום נפחים קטנים מאוד (טווח μL נמוך) של אדמה ו / או מי נקבוביות בתנוחות מוגדרות הסמוכות לשורשי הצמח החי כדי לפתור את שיפוע התזונתי התלול בריזוספירה. גישה אחת כדי לטפל בבעיה זו היא להשתמש כוסות יניקה מיקרו להפקת דגימות נקבוביות6. בשיטה זו, א. גטלין, א. היים ו- E. Matzner7 מדדו ריכוזים תזונתיים של נקבוביות קרקע בקרבת שורשי Quercus robur L. ברזולוציה מרחבית של ~ 1 ס"מ. קושי בניתוח כמויות μL של תמיסת קרקע או אדמה הוא, כי אלה נפחי מדגם קטנים, בשילוב עם ריכוזים נמוכים של כל פרט למינים התזונתיים העיקריים, דורשים טכניקות ניתוח כימי רגיש מאוד.
מערכת חלופית, המסוגלת לפתור שיפוע מ תזונה ברזולוציה של ~ 0.5 מ"מ, היא לגדל מחצלת שורש על פני השטח של בלוק אדמה, עם שכבת קרום הידרופילית דקה המפרידה בין אדמה לשורשים8,9. בתצורה זו, מסיסים יכולים לעבור דרך הממברנה והשורשים יכולים לקחת חומרים מזינים ומזהמים מהאדמה בעוד הפרשות שורש יכול להתפזר לתוך האדמה. לאחר הקמת שכבת שורש צפופה, ניתן לדגום את גוש הקרקע ולחתוך אותו לדגימות קרקע שהושגו לצורך מיצוי של שברי יסוד. בדרך זו, חומרים מזינים חד מימדיים, הדרגתי מזהמים, בממוצע על פני שטח גדול יחסית (~ 100 ס"מ2) ניתן לנתח.
אתגר נוסף הוא להשיג דגימות של חלק היסוד labile, הזמין לצמחים, שכן רוב טכניקות מיצוי הקרקע הכימית פועלות באופן שונה מאוד בהשוואה למנגנונים שבאמצעותם צמחים תופסים חומרים מזינים ומזהמים. בפרוטוקולים רבים של מיצוי קרקע, אדמה מעורבבת עם פתרון תמציתי במטרה ליצור שיווי משקל (מדומה-) בין שבר יסוד מומס וסורב. עם זאת, צמחים מפנימים ללא הרף חומרים מזינים, ולכן, לעתים קרובות בהדרגה לרוקן את אדמת rhizosphere. למרות פרוטוקולי מיצוי שיווי משקל אומצו באופן נרחב כמו בדיקות קרקע כפי שהם קלים ליישום, החלק התזונתי שחולצו לעתים קרובות אינו מייצג את החלק התזונתי הזמין לצמח היטב10,11,12,13. שיטות כיור אשר ברציפות לרוקן את הקרקע שנדגמו עבור חומרים מזינים הוצעו כשיטות יתרון ועשויים להידמות טוב יותר מנגנון ספיגת התזונה הבסיסית על ידי חיקוי תהליכי ספיגת השורש10,11,14,15.
בנוסף לשיטות שתוארו לעיל, יישומי הדמיה מקוריים, המסוגלים למדוד מפות פרמטרים רציפות עם רזולוציות ≤100 מיקרומטר על פני שדות ראייה של מספר ס"מ2 פותחו עבור אלמנטים ספציפיים ואדמה (ביו)פרמטרים כימיים5. ניתן להשתמש באוטורדיוגרפיה כדי לדמות את התפלגות האלמנטים ברייזוספירה בתנאי שניתן יהיה להשיג רדיואיזוטופים מתאימים16. optodes מישורי לאפשר הדמיה של פרמטרים כימיים חשובים הקרקע כגון pH ו pO217,18,19, ופעילות אנזים או הפצות חלבון הכולל ניתן למפות באמצעות טכניקות הדמיה אינדיקטור פלורסנט כגון זימוגרפיה הקרקע20,21,22,23 ו / או שורש blotting שיטות24. בעוד שזימוגרפיה ואוטורדיוגרפיה מוגבלות למדידת פרמטר יחיד בכל פעם, הדמיית pH ו- pO2 באמצעות אופטודות מישוריות יכולה להיעשות בו זמנית. טכניקות מחצלת השורש המסורתיות יותר מספקות מידע 1D בלבד, בעוד כוסות יניקה מיקרו מספקות מדידות נקודה או מידע דו-ממדי ברזולוציה נמוכה, אולם שתי הגישות מאפשרות ניתוח מרובה רכיבים. לאחרונה, P. D. Ilhardt, ואח'25 הציג גישה חדשנית באמצעות ספקטרוסקופיית פירוק הנגרמת על ידי לייזר (LIBS) כדי למפות 2D הכולל הפצות מרובות אלמנטים ברזולוציה של ~ 100 מיקרומטר בדגימות ליבה שורש הקרקע שבו התפלגות היסוד הטבעי נשמר על ידי הכנת מדגם זהיר.
הטכניקה היחידה המסוגלת לדגום 2D ממוקד של מסיסים תזונתיים ומזהמים מרובים ברזולוציה מרחבית גבוהה היא הדרגתיים מפוזרים בטכניקת סרטים דקים (DGT), שיטת דגימה מבוססת כיור שמשתקת מינים של מתכות עקיבה במקום על חומר מחייב המוטמע בשכבת הידרוג'ל26,27. DGT הוצגה כטכניקת דגימה כימית למדידת מסיסות labile במשקעים ובמים, ועד מהרה אומצה לשימושה בקרקעות28. הוא מאפשר הדמיה מרובת אלמנטים בקנה מידה תת-מ"מ, אשר הודגם בתחילה במשקע נהר29, ופותח עוד יותר עבור היישום שלה ריזוספרות צמחים30,31,32,33.
עבור דגימת DGT, גיליון ג'ל בגודל של כ 3 ס"מ x 5 ס"מ מוחל על שורש צמח יחיד שגדל בשכבת פני השטח של בלוק אדמה, עם קרום הידרופילי המפריד בין הג'ל לאדמה. במהלך זמן המגע, חומרים מזינים labile ו / או מזהמים להתפזר לכיוון הג'ל והם קשורים מיד על ידי חומר הכריכה שולבו בג'ל. בדרך זו, שיפוע ריכוז, ובכך שטף נטו מתמשך לכיוון הג'ל נקבע וגבר במהלך זמן הדגימה. לאחר הדגימה, ניתן להסיר ולנתח את ההידרוגל באמצעות טכניקה כימית אנליטית המאפשרת ניתוח שנפתר באופן מקיף. טכניקה מיוחדת מאוד בשימוש לעתים קרובות למטרה זו היא אבלציה לייזר בשילוב ספקטרומטריית מסת פלזמה אינדוקטיבית (LA-ICP-MS). במחקרים מוקדמים מסוימים, פליטת רנטגן המושרה חלקיקים מיקרו (PIXE) שימש גם29. דגימת DGT בשילוב עם ניתוח LA-ICP-MS מאפשרת הדמיה כימית מרובת אלמנטים ברזולוציה מרחבית של ~ 100 מיקרומטר. אם נעשה שימוש בטכניקות רגישות ביותר של ICP-MS (למשל, שדה סקטור ICP-MS), ניתן להשיג מגבלות זיהוי נמוכות במיוחד. במחקר על ההשפעה של liming על ספיגת Zn ו Cd על ידי תירס15, הצלחנו למפות תקליטור labile בריזוזפירה תירס באדמה מזוהמת עם מגבלה של גילוי של 38 ס"מ-2 ס"מ של תקליטור לכל אזור ג'ל. DGT, אופודות מישוריות, ו zymography להסתמך על דיפוזיה של אלמנט היעד מאדמה לשכבת ג'ל, אשר ניתן לנצל ליישום משולב של שיטות אלה על מנת בו זמנית, או ברציפות, תמונה מספר רב של פרמטרים רלוונטיים עבור מיזינים צמחיים ספיגת מזהמים. מידע מפורט על היבטים כימיים אנליטיים של הדמיית DGT, על הפוטנציאל של שילוב DGT ושיטות הדמיה אחרות, ועל היישומים שלה נבדק באופן מקיף ב ref.34,35.
במאמר זה אנו מתארים כיצד לבצע ניסוי הדמיה מסיס באמצעות טכניקת DGT על שורשים של צמחים יבשתיים בסביבת אדמה בלתי רוויה, כולל גידול צמחים, ייצור ג'ל, יישום ג'ל, ניתוח ג'ל ויצירת תמונה. כל השלבים מפורטים בפירוט, כולל הערות על צעדים קריטיים וחלופות ניסיוניות.
Protocol
1. ייצור ג'לים DGT
הערה: מספר סוגי ג'ל DGT זמינים עבור הדמיה דו-ממדית של מינים מסיסים labile ברזולוציה מרחבית גבוהה (תת מ"מ)35. כאן, הייצור של שלושה ג'לים מחייבים ברזולוציה גבוהה (HR)-DGT המאופיינים היטב המשמשים ביישומי הדמיה מסיסים מסוכמים בקצרה. נהלי מעבדה לניתוח יסודות קורט, כמו גם הליכי ייצור מפורטים של כל ג'לים HR-DGT המוצגים מתוארים בסעיפי מידע תומך (SI) S1 ו- S2.
- ג'ל מחייב אנטיון וקיון מעורב מבוסס פוליאוריתן (HR-MBG; SI S2.1)31
- הכן השעיית ג'ל פוליאוריתן עם זרמי זירקוניום (IV) מפוזרים הומוגנית (IV) הידרוקסיד ו iminodiacetate (IDA).
- מצפים את מתלה הג'ל בסרט דק על צלחת זכוכית וליזום היווצרות ג'ל על ידי אידוי ממס כדי להשיג 0.1 מ"מ דק, דמעה הוכחה תערובת אניון וג'ל קשירת קטיון (HR-MBG).
- ג'ל מחייב אניון פוליאקרילמיד-זירקוניה (HR-ABG; SI S2.2)36
- פברק ג'ל פוליאקרילאמיד (APA) בעובי 0.4 מ"מ בעקבות הליכי יציקת ג'ל37 (ראה SI S2.4 לקבלת פרוטוקול מפורט של ייצור APA).
- זירקוניום מזרז (IV) שלבי הידרוקסיד לתוך ג'ל APA precast כדי לקבל ג'ל מחייב אניון 0.4 מ"מ דק (HR-ABG).
- ג'ל קשירת קטיון פוליאקרילמיד-אימינודיאצטט (HR-CBG; SI S2.3)38
- הכן השעיית ג'ל פוליאקרילמיד עם שלבי IDA מפוזרים הומוגנית.
- השליכו את הג'ל בין שתי צלחות זכוכית ויזמו את תגובת הפולמליזציה כדי להשיג ג'ל קשירה בעובי 0.4 מ"מ (HR-CBG) שבו שלבי ה- IDA מיושבים בצד אחד של הג'ל.
2. גידול צמחים
הערה: המערכת הניסיונית משתמשת בריזוטרונים4 (איור 1) כדי לגדל צמחים באדמה בלתי רוויה להדמיה מסיסת. ראשית, מילוי קרקע rhizotron והשקיה מתוארים, ולאחר מכן פרטים על צמיחת הצמח הניסיוני ניתנים. פרטים על עיצוב rhizotron והכנת מצע הקרקע לפני מילוי לתוך rhizotron מוצגים בסעיף SI S3.
איור 1: עיצוב ריזוטרון (לא לשנות קנה מידה). (A)תצוגה מופרדת של מיכל צמיחה של ריזוטרון. (B)הרכיבה ריזוטרון במהלך צמיחת הצמח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- מילוי אדמה של ריזוטרון
- לפני מילוי הריזוטרון באדמה לחה מראש (תכולת מים
כבידתית, ידוע; ראה SI S3.2), סגור את בורות ההשקיה בחלק האחורי של הריזוטרון באמצעות סרט דבק והסר את הלוח הקדמי ואת מסילות הקיבעון והברגים שלו. - שוקלים את הריזוטרון הריק (למעט הלוח הקדמי, המסילות והברגים), שמונה לוחות אקריליים בגודל 5 ס"מ על 11 ס"מ ו-16מלחציים (לוח חומרים)ומתעדים את סכום המשקולות.
- חברו צלחת אקרילית אחת קטנה בתחתית הריזוטרון באמצעות שני מלחציים מכל צד, כאשר לחץ המהדקים מכוון למסגרת הריזוטרון, כך שהצלחת אינה מתכופפת פנימה ועוצמת הקול קבועה.
- שיפוע את הריזוטרון מעט לכיוון צלחת הפלסטיק הקטנה וממלאים באדמה לחה מראש עד לגובה של ~ 4 ס"מ(איור 2A). פזרו את האדמה בתוך הריזוטרון על ידי תסיסה קלה של הריזוטרון ודחסו בעדינות את האדמה בכמה מ"מ (בהתאם למאפייני הקרקע הספציפיים) בעזרת כלי דחיסה(איור 2B).
- חזור על הפעולה 2.1.3 - 2.1.4 עד שהריזוטרון יתמלא באדמה (איור 2C). השאירו פער של ~ 3 ס"מ בחלק העליון לשתילה הבאה של שתילים לתוך rhizotron.
- שוקלים את הריזוטרון המלא באדמה (כולל 8 צלחות קטנות ו-16 מלחציים) ומתעדים את המשקל. מתוך זה, לחסר את משקל rhizotron הריק המתקבל 2.1.2 ולתעד את הפרש המשקל, כלומר, המסה של אדמה
לחה, (g), בריזוטרון. - לחשב את המסה של אדמה יבשה בריזוטרון,
(ז), על פי Eq. 1, ולאחר מכן לחשב את צפיפות הקרקע היבשה בתפזורת, 
(g ס"מ-3), בריזוטרון על פי Eq. 2.
כאן,
(ס"מ3)הוא הנפח הפנימי הכולל של הריזוטרון.
הערה: ערכים אופייניים בריזוטרון הם בין 1.0-1.4 גרםס"מ -3. אין לחרוג מ- 1.5 גרםס"מ -3 מכיוון שצמיחת השורש עלולה להיפגע מעל ערך זה. - מניחים את הריזוטרון המלא באדמה על קופסת תמיכה ומסירים את כל המהדקים והצלחות הקטנות מהריזוטרון(איור 2D). לנקות בזהירות את מסגרת rhizotron (כלומר, קצוות) באמצעות נייר טישו, כמו חלקיקי הקרקע הנותרים על המסגרת יכול לגרום לדליפות.
הערה: משטח הקרקע החשוף חייב להיות הומוגני ומפולס עם מסגרת הריזוטרון ללא סדקים או פערים. אם לא, רוקן את הריזוטרון וחזור על 2.1.2 - 2.1.8. - חותכים שתי חתיכות של polytetrafluoroethylene (PTFE)(שולחן החומרים)רדיד ל 22 ס"מ x 13 ס"מ כל אחד. בנוסף, חותכים חתיכת נייר פלסטיק ל 46 ס"מ x 15 ס"מ. רשום את סכום משקלי נייר הפלסטיק וה-PTFE. מניחים את החלק הראשון של רדיד PTFE על החצי העליון של משטח הקרקע החשופה בריזוטרון, המשתרע ~ 1 ס"מ מעל פני הקרקע בחלק העליון של rhizotron.
- תקן בזהירות את רדיד ה-PTFE למסגרת הריזוטרון באמצעות סרטהדבקה (איור 2E). התחל על ידי תיקון פינה אחת בחלק העליון של rhizotron הראשון, ואחריו הפינה הנגדית שלה ולבסוף שתי הפינות בהמשך rhizotron. החל מתח בעת תיקון הפינות 2-4 כדי להבטיח משטח רדיד שטוח. אם קפלים מגיחים, לפתוח ולתקן מחדש את הקלטת בפינות בודדות (לא בבת אחת) עד שכל הקפלים מוסרים ואת רדיד PTFE הוא שטוח ורציף עם פני הקרקע.
- מניחים את החלק השני של רדיד PTFE בקצה התחתון של rhizotron, חופף את חתיכת רדיד PTFE העליון על ידי ~ 1 ס"מ. חזור 2.1.10 לתיקון רדיד PTFE השני לריזוטרון.
- מניחים את רדיד הפלסטיק (46 ס"מ x 15 ס"מ) על רדידים PTFE. לתקן את רדיד הפלסטיק באמצעות הליך הקיבעון כמפורט ב 2.1.10.
- מניחים צלחת קדמית על הריזוטרון המלא באדמה ומכסה רדיד אלומיניום. מניחים מסילה אחת סביב כל צד של הריזוטרון ומהדקים את הברגים ביד כדי לתקן את המסילות ובכך את הצלחת הקדמית לריזוטרון. הברגים ממוקמים לכיוון הצד הסגור של הריזוטרון, כלומר הצד עם בורות השקיה(איור 1A).
- לפני מילוי הריזוטרון באדמה לחה מראש (תכולת מים
כבידתית, ידוע; ראה SI S3.2), סגור את בורות ההשקיה בחלק האחורי של הריזוטרון באמצעות סרט דבק והסר את הלוח הקדמי ואת מסילות הקיבעון והברגים שלו.
לחה, (g), בריזוטרון.
(ז), על פי Eq. 1, ולאחר מכן לחשב את צפיפות הקרקע היבשה בתפזורת, 
(g ס"מ-3), בריזוטרון על פי Eq. 2.
(ס"מ3)הוא הנפח הפנימי הכולל של הריזוטרון.
איור 2: הרכבה ומילוי של ריזוטרון לגידול צמחים באדמה להדמיה מסיסת בריזוספרה. (A)מילוי אדמה לתוך הריזוטרון. (B) דחיסה של האדמה המלאה באמצעות כלי דחיסה. (C)ריזוטרון מלא אדמה עם לוחות אקריליק קטנים ומהדקים. (D)ריזוטרון מלא אדמה עם משטח אדמה חשוף. (ה)ריזוטרון מלא אדמה מכוסה בחלקו בנייר כסף מגן PTFE. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טיפול בריזוטרון ויישום ג'ל DGT. (A)השקיית אדמה באמצעות 10 טיפים פיפטה מ"ל בחורי השקיה בחלק האחורי של rhizotron. (B)שתילת שתילים (המצוין כתמים ירוקים) לתוך ריזוטרון מלא אדמה וסגור. (C)ריזוטרון ניטע עם גזרי סמיתיאנה סליקס והסיר צלחת קדמית וכיסוי נייר כסף מפלסטיק. (D)בזהירות קילוף את כיסוי רדיד PTFE לפני יישום ג'ל DGT. (ה)תמונה ברזולוציה גבוהה של ההחזר על ההשקעה בממשק שורש הקרקע. (ו)יישום של הצלחת הקדמית מצויד ג'ל DGT על rhizotron. (G)תמונה של ההחזר על ההשקעה עם ג'ל DGT מיושם במהלך דגימה מסיסת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- השקיית האדמה
- לקבוע את קיבולת החזקת המים (WHC) של הקרקע הניסיונית בריזוטרון. למטרה זו, לייצר שני rhizotrons עם תחתית פתוחה ולמלא אותם באדמה כפי שצוין בסעיף 2.1. לרוויה מלאה אלה פתוח, אדמה מלא rhizotrons על ידי טבילה במיכל מים במשך 16 שעות ולנקז את rhizotrons במשך 8 שעות.
- קח דגימת אדמה מרוכבת של ~ 50 גרם ממיקומים אקראיים בריזוטרונים הפתוחים התחתון ולייבש את המדגם ב 105 °C (70 °F) כדי לקבוע על פי Eq. S1. הנקבע מתאים WHC של הקרקע, ולכן, מבוטא כמו
(gg-1). - הגדר את המטרה בריזוטרון הניסיוני. במהלך שלב הצמיחה, להגדיר 60 % של WHC (כלומר, גורם WHC,
) כדי לספק לצמחים כמות מספקת של מים תוך הימנעות תנאים אנוקסי בריזוטרון. - לחשב את המסה הכוללת של מים להוסיף,
(ז), כדי להשקות את הקרקע בריזוטרון ביעד על פי Eq. 3. חשבון המסה של מים נוכח באדמה בריזוטרון, 
(ז).
- מחלקים במספר חורי השקיית הריזוטרון (כאן 14) כדי להשיג את מסת המים שיש להוסיף בכל בור השקיה. הוסיפו מים על ידי דחיפת 10 טיפים פיפטה מ"ל לתוך בורות השקיה ולתת למים לזרום לתוך האדמה בכוחהכבידה (איור 3A).
- גידול צמחים
- זרעים טרום נביטה של הצמח הניסיוני (למשל, על נייר סינון רטוב) על פי דרישות נביטת הזרעים הספציפיות עד שהרדיקל עולה (באורך של עד 1 ס"מ).
- שתלו עד שני שתילים לתוך הריזוטרון כפי שצוין באיור 3B. בשתילה, להוסיף ~ 5 מ"ל של מים ישירות לשתילים כדי לתמוך בצמיחה שלהם. מכסים את הפתח העליון של הריזוטרון במשך ~ יומיים הראשונים לאחר השתילה עם סרט שקוף, שומר לחות(שולחן החומרים). לעטוף את rhizotron בנייר אלומיניום כדי למנוע צמיחה מיקרופיטית.
הערה: מלבד שתילים, ניתן גם לעבד גזרי צמחים בריזוטרונים. - מעבירים את הריזוטרון הנטוע לחדר צמיחה, כאשר התנאים הסביבתיים (כלומר טמפרטורה, לחות, עוצמת אור) מוגדרים לדרישות הצמח הספציפיות. שיפוע קנה השורש ב 25°-35° כדי להבטיח פיתוח השורש לצד הצלחת הקדמית באמצעות gravitropism.
- במהלך צמיחת הצמח, באופן כבידתי לשמור על תכולת המים היעד בריזוטרון על ידי השקיה תקופתית כל 2-4 ימים באמצעות חורי השקיה rhizotron כמפורט ב 2.2.5. שמור על משטח הקרקע בפתח העליון לח על ידי תוספות קבועות של ~ 5 מ"ל מים.
הערה: אם צמחים גדלים לתקופות ממושכות ואת ביומסה הצמח צפוי להפחית באופן משמעותי את כמות המים שנוספו rhizotron על ידי השיטה המוצעת, להסביר את המשקל של ביומסה הצמח על ידי גידול צמחים ריזוטרון נפרד משכפל קציר ושקילת רקמות הצמח במרווחים מוגדרים. - ברגע שהשורשים מגיעים למיקום מתאים לאורך הצלחת הקדמית, עדיף במרכז הריזוטרון, יש למרוח ג'ל DGT לדגום את ההתפלגות המסיסת של ריזוספרה.
(gg-1).
) כדי לספק לצמחים כמות מספקת של מים תוך הימנעות תנאים אנוקסי בריזוטרון.
(ז), כדי להשקות את הקרקע בריזוטרון ביעד 
(ז).
3. דגימת ההתפלגות המסיסה
- יישום ג'ל
- עלייה בריזוטרון מ 60 % ל 80 % 24 שעות לפני יישום ג'ל כמפורט ב 2.2.4.-2.2.5. זה מבטיח מגע טוב עם ג'ל קרקע ומאפשר דיפוזיה מסיסת לתוך הג'ל תוך הימנעות מתנאי אדמה אנוקסיים במהלך דגימה מסיסת.
- קח צלחת קדמית חדשה, מנקה חומצה, ליישר אותו על rhizotron המשמש לדגימה, ולסמן את האזורים של עניין (ROIs) על הצלחת. מעבירים את הצלחת לספסל זרימה למינארי או לכל סביבה אחרת נטולת אבק ומתכת, צד לא מסומן הפונה כלפי מעלה.
- חותכים את ג'ל כריכת DGT על תמיכה אקרילית לגודל המלבני הנדרש המתאים להחזר על ההשקעה, בדרך כלל סביב 3 ס"מ × 5 ס"מ, באמצעות סכיני גילוח מצופים PTFE. חותכים את הג'ל על ידי לחיצה במקום להחליק את סכין הגילוח כדי להבטיח חתך ברור. מניחים את חתיכת הג'ל המלבני על הצד הלא מסומן של הצלחת במיקום המסומן של ההחזר על ההשקעה.
הערה: אם נעשה שימוש ב- HR-MBG, ניתן להוסיף מתחת לג'ל רדיד מרווח בעובי 100 מיקרומטר כדי להבטיח שהג'ל נמצא במגע טוב עם מערכת שורשי הקרקע. - חותכים קרום פוליקרבונט 10 מיקרומטר דק (0.2 מיקרומטר נקבובית גודל; טבלת חומרים) לגודל המרחיב את גודל הג'ל על ידי ≥1 ס"מ בכל צד ומניחים את הממברנה על הג'ל. החל קצת מים כדי להסיר בועות אוויר מהערימה.
- לתקן את הממברנה לאורך כל ארבעת הקצוות באמצעות סרט ויניל חשמלי(שולחן החומרים). בתהליך, להסיר בזהירות בועות אוויר לכודים בין הג'ל לבין הממברנה באמצעות פינצטה מפלסטיק. הקלטת חייבת רק ליצור קשר עם הממברנה ולא עם הג'ל.
הערה: אם הקלטת באה במגע עם הג'ל, בועות אוויר לכודות בין הג'ל לקרום, או משטח הממברנה הסופי מראה קפלים, יש להרכיב מחדש את ערימת הג'ל/ממברנה כאשר השטף המפוזר של מסיסים לתוך הג'ל יכול להיפגע35 (חזור על 3.1.3 - 3.1.5). - הניחו את הריזוטרון על דוכן, הסירו את המסילות והרימו בזהירות את הלוח הקדמי(איור 3C). מוציאים את רדיד הפלסטיק, חותכים את רדיד ה-PTFE בשולי הריזוטרון ומקלפים לאט את רדיד ה-PTFE כדי למנוע הפרעה למערכת שורשי הקרקע(איור 3D).
- צלם תמונה אורתוגונלית של ההחזר על ההשקעה באמצעות מצלמת רפלקס חד-עדשה דיגיטלית (DSLR)(טבלת חומרים)כדי להקל על הפרשנות וההצגה של ההפצה המסיסה המבוססת על מבנה הקרקע ומורפולוגיה שורש (איור 3E). השתמש מעמד מצלמה, ואם זמין, עדשת מאקרו. יישר את המצלמה כך שמרכז התמונה יתאים למרכז ההחזר על ההשקעה, ומישור המיקוד של המצלמה יהיה מקביל לפני הקרקע. כלול סרגל קנה מידה (למשל סרגל) בתמונה.
- חברו את הצלחת המצוידת בערימת הג'ל/ממברנה לריזוטרון הפתוח(איור 3F). לכן, ליישר קצה אחד של הצלחת עם קצה של rhizotron בעדינות "לכופף" את הצלחת לכיוון האדמה. מצב זה של יישום מסייע למנוע בועות אוויר בין מחסנית ג'ל / ממברנה ומערכת שורש הקרקע. תקן את הלוח הקדמי באמצעות המסילות והברגים.
הערה: שלב זה הוא קריטי ויש לבצעו בקפידה. לא ניתן להזיז את הצלחת לאחר יצירת מגע בין ערימת הג'ל/ממברנה לבין מערכת שורשי הקרקע מבלי לעקור אדמה ושורשים. - רשום את שעת ההתחלה המדויקת של פריסת הג'ל וצלם את הג'ל שנפרס בהו"ר כפי שניתן ב- 3.1.7 (איור 3G). עוטפים את הריזוטרון בנייר אלומיניום ומעבירים לחדר הגידול עד סוף תקופת הדגימה המסיסה (לעתים קרובות 24 שעות).
- עלייה
- אחזור ג'ל
- מניחים את הריזוטרון על תיבת תמיכה, מרימים בזהירות את הלוח הקדמי ושוטפים את ערימת הג'ל/ממברנה על הצלחת במים כדי לשטוף חלקיקים דבקים(איור 4A). רשום את שעת הסיום המדויקת של פריסת הג'ל. קרקע מדגם מן ההחזר על ההשקעה כדי לקבוע אתהקרקע wבפועל בריזוטרון על פי Eq. S1.
- מעבירים את הצלחת הקדמית לספסל הזרימה הלמינארית, ערימת ג'ל/ממברנה הפונה כלפי מעלה. אחזרו את הג'ל מהצלחת הקדמית על ידי הסרה קפדנית של הקלטת לאורך כל ארבעת הקצוות ולאחר מכן את קרום הפוליקרבונט המכסה את הג'ל(איור 4B). החל מים כדי לעזור ג'ל לצוף בחופשיות על סרט דק של מים על הצלחת עם צד מגע הקרקע פונה כלפי מעלה.
הערה: זה קריטי כדי לעקוב אחר כיוון הג'ל. צד הג'ל החשוף לאדמה ולשורשים חייב תמיד עם הפנים כלפי מעלה (כלפי המשתמש).
- ייבוש ג'ל
- חותכים חתיכה מלבנית של נייר סופג ג'ל(שולחן החומרים) ומניחיםחתיכה קטנה מעט יותר של קרום polyethersulfone (0.45 מיקרומטר נקבובית גודל; טבלת חומרים) למעלה.
- מעבירים את הג'ל מהצלחת לערימת הנייר/ממברנה של ג'ל באמצעות פינצטה מפלסטיק, צד מגע אדמה הפונה כלפי מעלה. הג'ל חייב להיות רגוע (כלומר, לא מתוח) ושטוח לחלוטין, ללא בועות אוויר בין ג'ל לקרום. החל קצת מים על ג'ל סופג נייר / מחסנית קרום כדי להקל על העברת ג'ל ומיקום.
- מכסים את ג'ל סופג נייר / ממברנה / ערימת ג'ל לחלוטין עם חתיכת נייר פלסטיק לסמן את דגימת הג'ל ואת הכיוון שלה על נייר פלסטיק(איור 4C). מניחים את נייר סופג הג'ל / קרום / ג'ל / ערימת נייר כסף פלסטיק במייבש ג'ל ואקום(שולחן החומרים)ויבש עד הערימה מיובשת לחלוטין (בדרך כלל 48-72 שעות). עבור HR-MBG, הגדר את הטמפרטורה ל-50-55 מעלות צלזיוס, עבור HR-ABG ו- HR-CBG היבשים הטובים ביותר בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את נייר סופג הג'ל מהערימה המיובשת ומעבירים את הג'ל, שכעת מתמזג באופן בלתי נפרד עם קרום הפוליאתרסולפונה, לשקית רוכסן. כיסוי רדיד הפלסטיק נשאר על הג'ל עד זמן קצר לפני ניתוח LA-ICP-MS.
- כלול חתיכת ג'ל מגיליון הג'ל המקורי כשיטה ריקה, שאינה נחשפת לאדמה. מעבדים את הג'ל הריק בשיטה הזהה לג'ל לדוגמה לאחר 3.3.2 - 3.3.4.
איור 4: אחזור ג'ל DGT והכנה לייבוש על דגימה מסיסת. (A)צלחת עם ג'ל DGT וריזוטרון מיד לאחר דגימה מסיסת. (B)אחזור של ג'ל DGT מהצלחת בספסל זרימה למינארי. (ג)ערימה של נייר סופג ג'ל / קרום פוליאתרסולפונה / ג'ל DGT / כיסוי נייר פלסטיק לייבוש ג'ל. שימו לב שהג'ל צבוע מעט לאחר פריסתו על אדמת הריזוספרה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
4. ניתוח כימי של ג'ל מחייב DGT
הערה: בפרוטוקול זה, ניתוח של התפלגות מסיס על ג'ל מחייב DGT מושגת על ידי LA-ICP-MS באמצעות nanosecond 193 ננומטר ArF excimer LA מערכת מצויד תא אבלציה שני כרכים יחד עם ICP-MS quadrupole (איור 5). כל המכשירים רשומים בטבלת החומרים. לחלופין, nanosecond 213 ננומטר או 266 ננומטר מערכות לוס אנג'לס מצב מוצק ניתן ליישם36,39,40,41,42,43. אם נדרשת רגישות משופרת או רזולוציה המונית, שדה סקטור ICP-MS הוא חלופה מרובע ICP-MS15,44. פרטים על הכנת תקני ג'ל DGT לכיול חיצוני וצימוד של מערכת לוס אנג'לס ל- ICP-MS מרובע מוצגים בסעיפי SI S4 ו- S5.
איור 5: הגדרת LA-ICP-MS לניתוח ג'ל DGT. (A)Nanosecond 193 ננומטר ArF excimer LA מערכת מרובע ICP-MS. (B)ג'לים מיובשים המותקנים על לוחות זכוכית ומתוקנים על שלב הדגימה בלוס אנג'לס מוכנים להכנסת תא אבלציה. (C)גז נבולייזר (Ar) מ- ICP-MS וגז נושאת אירוסול (הוא או Ar) מתא אבלציה המחובר ל- ICP באמצעות מפצל Y דו-כיווני ומתאם לפיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- הכנה לדוגמה עבור LA-ICP-MS
- מעבירים את דגימות הג'ל המיובשות, הסטנדרטים ושיטת הריקים (הממוזגים עם התמיכה בקרום פוליאתרסולפונה) לחתיכות בודדות של סרט דבק דו-צדדי(שולחן החומרים),צד הג'ל הפונה כלפי מעלה. חתוך חלקי קלטת עודפים כדי לחסוך מקום בתא אבלציה.
- הר את הג'לים המיובשים על צלחות זכוכית. השתמש בצלחות זכוכית בודדות עבור כל דגימת ג'ל, סדרה סטנדרטית או שיטה ריקה כדי לאפשר סידור גמיש בשלב הדגימה של לוס אנג'לס (גודל אופייני של 10 ס"מ × 10 ס"מ). השתמש glasscutter כדי להתאים את גודל צלחת הזכוכית לפי הצורך. תקן את לוחות הזכוכית עם הג'לים בשלב הדגימה של לוס אנג'לס (איור 5B) באמצעות פלסטלינה(שולחן החומרים). מיישרים את משטח הג'ל על ידי התאמת רצפת הבמה ונועלים את שלב הדגימה לתוך תא אבלציה.
- ניתוח סריקת קו LA-ICP-MS
- צמד את מערכת לוס אנג'לס ל- ICP-MS כפי שצוין בסעיף SI S5. בתוכנת לוס אנג'לס(טבלה של חומרים),להגדיר את הגדרות אור המצלמה (כלומר, 'טבעת', 'קואקס' ו 'משודר') כדי להאיר את משטח הג'ל בתא אבלציה ולהתמקד על משטח הג'ל על ידי התאמת מרחק ציר z. עבור למיקומים אקראיים ברחבי התא כדי להבטיח כי כל משטחי הג'ל נמצאים בפוקוס.
- הגדר את הפרמטרים של לוס אנג'לס בחלון 'הגדרת לייזר' של תוכנת לוס אנג'לס. הגדרות אופייניות המשמשות בניתוח סריקת קו LA-ICP-MS של ג'לים DGT הן: מצב רציף; תפוקת אנרגיה 20-30%; קצב חזרות 10-20 הרץ; קוטר ספוט 100-200 מיקרומטר; מהירות סריקה 150-250 מיקרומטר s-1.
הערה: יש למטב את הפרמטרים עבור סוג הג'ל המשמש ועשוי להשתנות. ניתן לשפר פרמטרים גם להגברת יחס האות לרעש, לרזולוציה המרחבית או להפחתת זמני הרכישה בהתאם להתקנה הניסיונית והאינסטרומנטלית. השתמש בתפוקת אנרגיה נמוכה יחסית (≤40 %) וקצב החזרה (≤25 הרץ) כדי למנוע חדירה דרך הג'לים לתוך חומרי הגיבוי39. ודא כי מהירות סריקת הלייזר היא ≤ קוטר הספוט מחולק על ידי משך מחזור הסריקה הכולל ICP-MS (ראה 4.2.6) כדי למנוע דחיסה של נקודות הנתונים ובכך אובדן רזולוציה בכיוון הסריקה45. לדוגמה, בעת הגדרת קוטר נקודה של 200 מיקרומטר ומשך מחזור סריקה כולל של ICP-MS של 0.25 s, מהירות הסריקה צריכה להיות ≤800 מיקרומטר s-1. - בחר את כלי הקו וצייר תבנית קו אחת באורך ~ 1 מ"מ על-פני תקן ג'ל. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תבנית הקו בחלון 'סריקת תבניות' וודא שהפרמטרים של לוס אנג'לס מוגדרים ב- 4.2.3. אומצו. השתמש בכלי 'סריקות כפולות'כדי לשכפל קו זה ארבע פעמים, עם מרחק בין קווים (מרחק בין מרכז הקו) הגדול מקוטר הספוט (איור 6). גישה זו מציעה בסך הכל חמישה קווים מקבילים לכל תקן ג'ל(n = 5). חזור על שלב זה עבור כל תקן ג'ל, כיול ריק ושיטה ריקה.
- לעבור לדגימת הג'ל ולצייר קו אחד לאורך הקצה העליון של האזור המלבני שיש לנתח. שכפל את הקו כדי ליצור קווים מקבילים עבור אזור הדגימה כולו כפי שצוין ב- 4.2.3. השתמש במרחק בין קו של 300-400 מיקרומטר. ודא שהמוקד (מרחק ציר z) מוגדר כראוי עבור כל נקודת התחלה וסיום של כל שורה.
הערה: הרזולוציה המרחבית של הניתוח גבוהה יותר לאורך כיוון הסריקה בהשוואה למרחק הבין-קווי. לכן, נקודות התחלה וסיום של הקווים עשויות לעקוב בצורה הטובה ביותר אחר הכיוון של מעברי הצבע של ניתוח. עבור מעברי צבע של ריזוספרה, זה בדרך כלל בניצב לציר השורש (איור 6). - בתוכנת ICP-MS(טבלת החומרים),הגדר שיטת 'נתונים בלבד' שנפתרה בזמן במסך 'שיטה', בחר איזוטופ מתאים אחד או יותר עבור כל ניתוח וכלול 13C כתקן נורמליזציה פנימי31,36,40,41,42. ודא שזיהוי האיזוטופים אינו נפגע על-ידי הפרעות46.
- הגדר את משך מחזור הסריקה הכולל של פעולת השירות ICP-MS ('Est. זמן קריאה') ≤0.5 שניות עם זמני השתהות מתאימים לכל איזוטופ (בדרך כלל בין 10-50 אלפיות השנייה). הגדר את הערך 'קריאות' ICP-MS ' ל- 1 ושנה את הערך 'קריאות /שכפל' כדי להגדיר את זמן המדידה הכולל לכל מדגם (' זמןדגימה'), כלומר, לכל שורת אבלציה בודדת. הדבר תלוי בפרמטרים הספציפיים של לוס אנג'לס ובמרחקי הקווים המוגדרים ב- 4.2.2 - 4.2.4.
- עבור דיווח נתונים, השתמש במצב עוצמה לעומת מצב איסוף נתוני זמן והגדר את 'אפשרות כתיבת קובץ' כ ' כ ' חדש לכלדוגמה' כדי ליצור קובץ נתונים בודד (כאן .xl) עבור כל שורת אבלציה.
- הגדר רצף לדוגמה 'אצווה' במסך 'דוגמה' ICP-MS, כאשר כל ערך לדוגמה מתאים לקו אבלציה בודד המוגדר ב- 4.2.3 - 4.2.4.
- לחץ על 'נתח אצווה' כדי ליזום את רצף הדגימה ב- ICP-MS, אשר ימתין עם רכישת נתונים עד שיופעל על-ידי פעימת הלייזר הראשונה (ראה SI S5 לקבלת פרטים על תצורת הגורם המפעיל).
- בתוכנת לוס אנג'לס, בחר את כל השורות שיש לנתח וודא ששיטת ICP-MS ('Est. Sampling Time', ראה 4.2.6.) תואמת את משך ההבלים של הקו הבודד, שהוא בדרך כלל שונה עבור דגימות ג'ל, תקנים ושיטות ריקות. חזור על 4.2.6. כדי להתאים את שיטת ICP-MS במידת הצורך.
- לחץ על 'פליטה' בחלון 'אנרגיית לייזר' כדי לטעון את ראש הלייזר ולאחר מכן לחץ על 'הפעל' כדי לפתוח את החלון 'הפעל ניסוי'. כאן, בחר באפשרות 'תבניות נבחרות בלבד', הגדר את 'השהיית שטיפת 'ל- 20-30 שניות, סמן את התיבה ' הפעל לייזרבמהלך סריקות' והגדר את 'זמן חימום לייזר' ל- 10 שניות.
- לחץ על 'הפעל' בחלון 'הפעל ניסוי' כדי להתחיל את ניתוח סריקת הקו ולנטר את עוצמת האות הגולמי בספירות לשניה (cps) עבור כל איזוטופ ב- ICP-MS בזמן אמת. כל שורה צריכה להתחיל ('זמן חימום לייזר', 10 s) ולסיים ('השהיית סחף', 20-30 s) עם גז ריק.
- לפקח על שטף הלייזר (J cm-2) במהלך הניתוח כדי להעריך את יציבות הלייזר. אם התנודות משתנות במידה רבה, בטלו את הניתוח וודאו שמקור הלייזר ו/או מערכת המראה שלו מתפקדים באופן מלא.
- לאחר הניתוח, לעצור את הפלזמה ICP-MS ולהגדיר את קצב זרימת הגז המוביל על מערכת לוס אנג'לס ל 0 מ"ל מינימום-1. מוציאים את הג'לים מתא אבלציה ומאחסנים בשקיות רוכסן לשימוש נוסף.
איור 6: סכמטי של העיצוב הניסיוני DGT LA-ICP-MS (לא לשנות קנה מידה). האיור מתאר את הדגימה המבוססת על DGT בדגימה מסיסת באתרו בריזוספרה ואת מיפוי LA-ICP-MS של ההתפלגות המסיסה על משטח הג'ל, כולל תקריב המציג מידות ופרמטרים של סריקת קו למופת. שים לב כי ג'ל DGT הוא התהפך אופקית כאשר מועבר מאדמת rhizosphere על צלחת הזכוכית, כפי שצוין על ידי המיקום של המלבן בפינה התחתונה של ג'ל DGT. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- עיבוד וכיול נתונים
- יבא את קובץ הנתונים הגולמיים ( .xl) עבור כל שורה מסולפת בתוכנת גיליון אלקטרוני (טבלת חומרים). טבלת הנתונים הגולמיים מציגה את קריאות ICP-MS (נקודות נתונים) עבור כל איזוטופ ב- cps ואת נקודות הזמן המתאימות ב- s. פרט את כל השורות זו לצד זו בעמודות שונות.
- הערך את נתוני סריקת הקו לקבלת יציבות האות של התקן הפנימי (13C) ותקופות שטיפה נאותות.
- חשב כמות גז ממוצעת ריקה עבור כל איזוטופ מכל הערכים הריקים של הגז שנרשמו לפני אבלציות הקו (כלומר, במהלך זמן החימום של הלייזר) והפחית את כמות הגז הממוצעת הריקה מהעוצמות הגולמיות המתאימות עבור כל איזוטופ לתיקון עבור אות הרקע.
- החל נורמליזציה פנימית על-ידי חלוקת עוצמת האות של כל איזוטופ (cps) בעוצמת האות של התקן הפנימי (cps) עבור כל נקודת נתונים כדי לתקן עבור וריאציות בכמות החומר ablated ו אינסטרומנטלי להיסחף.
- חתוך נתונים לפני ההתחלה ואחרי הסוף של כל קו ablated כדי להסיר את אות הרקע. בצע חילוף של טבלת הנתונים כדי להשיג מטריצת רשת שבה כל שורה תואמת לקו מנופח ולכל עמודה לערך עוצמת איזוטופ מנורמל. הפרד את המטריצות עבור כל איזוטופ לגליונות עבודה בודדים.
- חשב את יחס עוצמת האות המנורמל הממוצע לכל איזוטופ עבור תקני הכיול וכיול ריקים וחישב את פונקציית הכיול (y = ax + b)באמצעות מודל רגרסיה ליניארית עם טעינות אנלייט סטנדרטיות של ג'ל (μg cm-2; ראה SI S4) כ- x-values. להעריך את פונקציית הכיול של כל איזוטופ עבור ליניאריות47.
- החל את פונקציית הכיול על מטריצת הנתונים לדוגמה. המר את יחסי עוצמת האות מנורמל,
, כדי ג'ל analyte טעינות, 
(מיקרוגרם-2), ולאחר מכן כדי שטף סולמוס ממוצע זמן, 
(pg cm-2 s-1), עבור כל איזוטופ ונקודת נתונים על פי Eq. 4 ו Eq. 5:
כאן, a הוא השיפוע של קו הכיול, b הוא יירוט של קו הכיול, ו t (s) הוא זמן פריסת הג'ל במהלך דגימה מסיסת. - שמור את מטריצת הנתונים לדוגמה המכוילת עבור כל ניתוח כקובץ txt.
- יצירת תמונה
הערה: הקפד להימנע מכל פעולת אינטרפולציה פיקסלים במהלך כל השלבים של יצירת תמונה, כמו זה עלול להוביל הדרגתיים שטף solute החלקה מלאכותית בתמונות וכתוצאה מכך.- יבא את מטריצת הנתונים לדוגמה המכוילת (.txt) כתמונת טקסט בתוכנת ניתוח התמונה (טבלה של חומרים).
- חשב את המרחק לפיקסל בכיוון x (כלומר, רזולוציה לרוחב) על-ידי הכפלת מהירות סריקת הלייזר עם משך מחזור הסריקה הכולל של ICP-MS (למשל, בהנחה שמהירות סריקה של 200 מיקרומטרs-1 ומשך מחזור סריקה כולל של 0.25 שניות, הרזולוציה לרוחב שווה ל- 50 מיקרומטר). המרחק לפיקסל בכיוון y משתווה למרחק הבין-קווי (איור 6).
- חשב את פקטור תיקון יחס הגובה-רוחב של התמונה. לכן, חלק את המרחק לפיקסל בכיוון y (למשל, 300 מיקרומטר) במרחק לפיקסל בכיוון x (למשל, 50 מיקרומטר). החל את פקטור התיקון המתקבל של y/x (בדוגמה זו 6) תחת 'קנה מידה'. החל את המרחק לפיקסל (ב- μm או מ"מ) בכיוון x כקנה מידה תחת 'קבע קנה מידה'.
- החל 'חיפוש טבלה' כלומר, סולם צבע מדומה לקבלת תצוגה חזותית טובה יותר של מעברי צבע כימיים בתמונה solute ולהתאים את התמונה 'איזון צבע' כדי לשלוט בגבולות התחתונים / העליונים של טווח התצוגה. הוסף 'סרגל כיול' ושמור את התמונה המסיסה כקובץ tiff.
- העתק את התמונה המסיסה באמצעות הפקודה 'העתק למערכת' בתוכנת ניתוח התמונה והדבק לתוכנת הוצאה לאור שולחנית ( טבלהשל חומרים). התאם קנה מידה, ישר והלחין את התמונה המסיסה עם התמונה של ההחזר על ההשקעה שהושגה ב- 3.1.7.
הערה: לפני ההעתקה, שנה את גודל התמונה המסיסה ב- למשל, פקטור 10 באמצעות החלת 'X Scale' של 10 ו 'סולם Y' של 10 תחת 'קבע קנה מידה' כדי להבטיח פיקסלים מספיקים לפרסום ברזולוציה גבוהה.
, כדי ג'ל analyte טעינות, 
(מיקרוגרם-2), ולאחר מכן כדי שטף סולמוס ממוצע זמן, 
(pg cm-2 s-1), עבור כל איזוטופ ונקודת נתונים על פי Eq. 4 ו Eq. 5:
| ייצור ג'ל DGT | גידול צמחים | בדגימה מסיסת באתרו | מיפוי שטף מסיס LA-ICP-MS |
| משאבי אנוש-MBG שבוע אחד |
הכנת קרקע שבוע אחד |
יישום ג'ל שעה אחת לכל ג'ל |
הכנה לדוגמה שעה אחת לכל ג'ל |
| משאבי אנוש-ABG 3 ימים |
הרכבה של ריזוטרון שעתיים לכל שכפול |
תקופת דגימה מסיסת משתנה, בדרך כלל 24 שעות |
ניתוח LA-ICP-MS יום אחד לכל ג'ל |
| משאבי אנוש-CBG 3 ימים |
גידול צמחים תלוי בלימודים |
אחזור ג'ל שעה אחת לכל ג'ל |
עיבוד נתונים 4 שעות לכל ג'ל |
| ייבוש ג'ל 2-3 ימים |
יצירת תמונה 10 דקות לתמונה |
טבלה 1: זמנים משוערים עבור שלבים כלליים של טכניקת DGT LA-ICP-MS.
Representative Results
כדי להדגים את היכולת ופרטי הנתונים של שיטת ההדמיה DGT, ריכזנו עבורכם את התת-מ"מ, התפלגות השטף הדו-ממדית של מינים מרובים של חומרים מזינים ומסיסים מזהמים באדמה הסמוכה לשורשים של אסקולנטום פגופירום וסמית'יאנה סליקס (איור 7). זמנים משוערים עבור שלבים פרוצדורליים כלליים של הפרוטוקול מוצגים בטבלה 1.
תמונות Solute באיור 7 נוצרו בשלושה מחקרים שונים באמצעות ג'לים מחייבים HR-MBG או HR-CBG. התמונות הכימיות מראות את התפלגות השטף הדו-ממדי ברזולוציה מרחבית של 82-120 מיקרומטר לאורך ציר ה- x ו- 300-400 מיקרומטר לאורך ציר ה- y, בהתאם לפרמטרים של LA-ICP-MS בהם נעשה שימוש. מכיוון שלא הוחלה אינטרפולציה במהלך כיול וגודל תמונה, פיקסלים בודדים מייצגים נקודות נתונים נמדדות. יישור של תמונות solute עם תמונה מצולמת של ההחזר על ההשקעה מגלה כי תת מ"מ, 2D התפלגות שטף מסיס של אלמנטים שונים משתנה מאוד על פי מבנה הקרקע מורפולוגיה השורש. ניתן לייחס זאת להתנהגות הביו-גיאוכימית הדיפרנציאלית של היסודות במערכת הקרקע-ריזוספרה-צמח, ולאינטראקציה שלהם עם מטריצת הקרקע ושורשי הצמח.
באיור 7A labile inorganic Mg, Al, P, Mn ו-Fe solute Fluxes הוצגו סביב שורש F. esculentum צעיר שגדל באדמה נטולת קרבונט מופרית עם NH4NO3. התפלגות מסיסות תת-מ"מ הראתה אזורים של שטפי אל, P ו-Fe מופחתים לצד מקטעי שורש ישנים יותר עקב ספיגת שורשים, ותנודות גבוהות מאוד של Mg, Al, P, Mn ו- Fe בשיא השורש עקב תהליכי גיוס P מקומיים של שורש ה- F. esculentum. שימו לב שקצה השורש ממוקם מעט מאחורי משטח הקרקע ולכן כמעט ולא נראה בתמונה הצילומית. איור 7B מציג את ההתפלגות של מתכות מעקב labile, כולל Mn, Fe, Zn, Cd ו- Pb סביב שורש של מתכת סובלנית S. smithiana גדל באדמה מזוהמת בינונית עם Zn, Cd ו Pb. התמונות המסיסות דמיינו דלדול מובהק במיוחד של Zn, Cd ו- Pb בעמדת השורש המיידית, מראה כי שורשי S. smithiana לשמש כיור מקומי עבור מתכות עקבות labile באדמה מזוהמת. חוץ מזה, Zn מקומי, תקליטור ו Pb שטף עליות ניתן לראות, המציין הצטברות של מתכות קורט אלה בממשק שורש הקרקע המיידי.
בנוסף להדמיה מרובת אלמנטים, ניתן לשלב את השיטה המוצגת גם עם טכניקות הדמיה משלימות מבוססות דיפוזיה כגון optodesמישורי 34. הדבר בא לידי ביטוי באיור 7C, שם התפלגות מתכות עקבות הלבילים בריזוספרה של ס. סמית'יאנה הייתה משותפת עם התפלגות ה-pH באמצעות ג'ל מחייב משולב של מישור יחיד optode-DGT . מצע הקרקע הופרה עם (NH4)2SO4, המוביל לירידה ב- pH לאורך צירי השורש על ידי ~ 1 יחידה לעומת אדמה בתפזורת. ירידות ה-pH היו במשותף עם שטף מסיס מוגבר של Mn, פה, Co, Ni, Cu ו Pb, מה שמרמז על סולביליזציה מתכת הנגרמת על ידי pH.
יתר על כן, תוצאות דוגמה אלה מראות כמה חפצי הדמיה פוטנציאליים שניתן להשיג. לדוגמה, אי-התבוננות בקרקע מבנית, למשל, שנצפתה כקו אופקי בשליש התחתון של תמונת ההחזר על ההשקעה באיור 7A, עלולה לגרום לאי-רציפויות מגע של ג'ל קרקע וכתוצאה מכך דיפוזיה מוגבלת במיקום זה לתוך ג'ל הכריכה. לעומת זאת, דחיסת קרקע מוגזמת בריזוטרון יכולה להוביל לנקבוביות ירודה וכתוצאה מכך לשינוי מלאכותי של מצב redox הקרקע כלפי אנוקסיה. הדבר מודגם באיור 7B, שבו אזורים נרחבים של שטפי Mn ו-Fe מוגבהים מאוד בתמונות המסיסות תואמים באופן חזותי לשכבת אדמה צפופה בתמונת ההחזר על ההשקעה. זה מרמז על ירידה בפוטנציאל redox הקרקע עקב דחיסת קרקע גבוהה, וכתוצאה מכך פירוק צמצום ו solubilization של אלמנטים רגישים מאוד redox. לכן מומלץ להקפיד על מילוי ריזוטרון ובדיקה ויזואלית של משטח הקרקע מיד לאחר המילוי.
איור 7: התפלגות דו-מימדית תת-מ"מ של מינים מזינים ומסיסים מזהמים על פני ממשקי שורש קרקע שונים. (A)הפצה של P אניוני ו- cationic Mg, Al, Mn ו- Fe מתבודד סביב שורש F. esculentum צעיר. דגימה מקומית משותפת של מסיסים אניוניים וקטיונים הושגה באמצעות HR-MBG במשך 24 שעות ברוויית מי קרקע של ~ 75% WHC. התמונות Al, P ו- Mn מוצגות כערכי fDGT מכוילים (pg cm-2 s-1),ואילו התמונות Mg ו- Fe מציגות 13 עוצמותמנורמלות C. סרגל קנה המידה מייצג 1 ס"מ. נתון זה מותאם משופט48. (B)הפצה של Mn, Fe, Zn, Cd ו- Pb סביב שורש S. smithiana גדל באדמה מזוהמים בינוני עם Zn, Cd ו Pb. עקבות קטיוניים מתכת solutes נדגמו באמצעות HR-CBG עבור 20 שעות ברוויה מי קרקע של ~ 80 % WHC. כל התמונות מוצגות כערכיDGT מכוילים(pg cm-2 s-1). סרגל קנה המידה מייצג 0.5 ס"מ. נתון זה מותאם משופט3. (ג)הפצה של pH ומסיסים קטיוניים מרובים סביב שורשי S. smithiana גדל באדמה זינק עם Cd. לוקליזציה משותפת של pH ודינמיקה solute הושגה באמצעות שינוי של פרוטוקול HR-MBG, המאפשר דגימה מסיסים בו זמנית הדמיה optode מישורי33. התמונות Mn, Cu, Zn ו- Cd מוצגות כערכיDGT מכוילים(pg cm-2 s-1), ואילו תמונות Fe, Co, Ni ו- Pb מציגות 13 עוצמותמנורמלות C. סרגל קנה המידה מייצג 1 ס"מ. נתון זה מותאם משופט33. הנתונים המוצגים משוחזרים ממאמרים מצוטטים3,33,48 מורשים תחת CC BY. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
פרוטוקול ההדמיה המסיס המוצג כאן הוא שיטה רב-תכליתית לדמיין ולכמת שטף דו-מימדי ומזהם בסביבות של צמחי קרקע. הוא ייחודי ביכולתו ליצור תמונות מרובות אלמנטים בקנה מידה תת-מ"מ של מינים מסיסים של labile בממשק שורש הקרקע, העולה על הרזולוציה המרחבית ברת השגה של שיטות חלופיות למדידת מעברי צבע מסיסים בריזוספירה באופן משמעותי4. המטרה בגישת דגימת situ של DGT, בשילוב עם שיטת ניתוח כימי רגיש מאוד כגון LA-ICP-MS, מקלה על חקירה מפורטת של דינמיקת שטף מסיס סביב שורשי צמחים בודדים הגדלים באדמה או מצעים דומים. בשל תהליך הדגימה מבוסס הכיור, התמונות שהתקבלו משקפות את הכדאיות של המסכים החזותיים, ולכן הן הערכה של זמינות הצמח שלהם10. למרות המדידה הטבועה בשיטה של שטף מסיס נושאת יתרונות ניכרים כמו הפרשנות כמו שברים תזונתיים זמינים לצמחים, מדידות שטף הם הרבה פחות ישר קדימה כדי להבין מאשר מדידות ריכוז נקבוביות. הגיאומטריה הסטנדרטית של דגימת DGT ביישומי קרקע בתפזורת (במיוחד ג'ל דיפוזיה בעובי 0.8 מ"מ המשמש בהגדרה זו) מאפשרת להשוות את ריכוז הנקבוביות בפועל, csoln, ואת הערכת ריכוז הנקבוביות הממוצעת בזמן על ידי מדידת DGT בתפזורת, cDGT, ולפרשנות של פרמטרים אלה לגבי דינמיקת האספקה של מין מסיס. עם זאת, השוואה כזו לא יכולה להיעשות בהתבסס על יישום DGT הדמיה עם שכבות דיפוזיה דקות מאוד, כמו ערכיdGT cנגזר הם קטנים באופן לא מציאותי34. תוצאות הדמיית DGT ולכן אינן תמיד פשוטות ומהירות לפרש ולעתים קרובות אינן דומות ישירות למדידות ריכוז פורווטר קונבנציונליות יותר.
בעת יישום השיטה, יש לשקול בזהירות כמה צעדים קריטיים, הקשורים בעיקר למילוי והשקה של מיכלי הצמיחה של ריזוטרון. במהלך מילוי האדמה לתוך rhizotron, חשוב מאוד להימנע דוחס את הקרקע יותר מדי, כמו שורשי הצמח לא יכול לחדור אדמה דחוסה מאוד צמיחת השורש יהיה מעוכב. ראינו שורשים הימנעות אדמה דחוסה מאוד וגדל לאורך הקצוות הפנימיים של מיכל הצמיחה rhizotron, שם הקרקע היא בדרך כלל פחות דחוסה. במקרה זה, שורשים בודדים הממוקמים במרכז rhizotrons, שבו ג'לים DGT ניתן ליישם בנוחות, לא יכול להתפתח בכלל, ביעילות מעכב יישום ג'ל מוצלח. במעבדה שלנו, הניסיון הראה כי צפיפות קרקע יבשה בתפזורת של 1.0-1.4 ס"מ-3 לאפשר פיתוח שורש ללא הפרעה. יתר על כן, דחיסת קרקע מוגזמת היא גם מקור פוטנציאלי של חפצים לגבי המסיסות של אלמנטים רגישים לארוקס ומינים הקשורים ביו-גיאוכימיה. ככל שנפח הנקבוביות הכולל מצטמצם וחלוקת קוטר הנקבוביות מועברת לכיוון קטרים נמוכים יותר באדמה דחוסה מאוד, נפח נקבוביות קטן יותר בקוטר גדול יותר זמין, מה שעלול להוביל לתנאים מצמצמים באופן מקומי. כתוצאה מכך, MnIII/IV- ותחמוצות FeIIIעשויות להיות מופחתות, מה שמוביל לתנודותMn+ ו-Fe 2+ מוגברות. התפרקותם של תחמוצות פה, שהן אתרי סופציה חשובים למשל, עבור פוספט ומיקרו-נוטריאנטים, עשויה לשחרר מינים סורבים ו/או חד-מזרזים ובכך לגרום לשטף גבוה באופן מלאכותי של המינים הקשורים לביו-גיאוכימיה. בעיה דומה עלולה להתעורר אם מיכלי הצמיחה מושקים יותר מדי. אידוי דרך שטח הקרקע הקטן בחלק העליון של מיכל הצמיחה הוא נמוך הקרקע עשויה להישאר רוויה במים עד מספר שבועות לאחר השתילה, אשר עלול גם לגרום חפצי redox.
שיקול חשוב נוסף הוא הפונקציונליות הכימית של ג'ל מחייב HR-DGT מפוברק. על ידי ביצוע הפרוטוקול, ג'לים דקים עם התפלגות הומוגנית של שלבי קשירה מתקבלים. אם הג'לים יש אזורים של הפצת חומר inhomogeneous (למשל, חורים בג'ל או אגרגטים של שלבי קשירה) אזורים אלה צריכים להיות מוסרים או, אם נרחב מדי, פרוטוקול ייצור הג'ל צריך לחזור על עצמו. אם מכינים נכון, הג'ל חייב להיות מסוגל לקשור את המינים מסיסים היעד כי להתפזר לתוך הג'ל מיד כמותית27, אשר נקבע על ידי יכולת מחייב ג'ל ספציפי לניתוח. בעוד חריגה מקיבולת הג'ל בעייתית פחות בקרקעות לא מזוהמות, יש לשקול אותה בקרקעות מזוהמות מתכת ובסביבות קרקע מלוחות. רוויה של שלבי קשירה ג'ל לא רק לפגוע דגימה כמותית, אלא גם לגרום דיפוזיה לרוחב של מסיסות בין שלבי קשירה בג'ל, המוביל לוקליזציה בלתי מוגבלת של תכונות שטף solute בקנה מידה קטן. לכן, אם כמויות גבוהות מאוד של מינים מזינים /מזהמים labile צפויים בסביבת הקרקע היעד, בדיקות ראשוניות צריך להתבצע. להערכת הטענות DGT הצפויות, דגימת בוכנה DGT קרקע בתפזורת ואחריו elution ג'ל וניתוח כימי רטוב ניתן ליישם15,49. במידת הצורך, ניתן להתאים את זמני הפריסה של DGT כדי לקצר את זמן המגע עם הג'ל ובכך למנוע רוויית ג'ל מעל סף הקיבולת. לעומת זאת, בדיקות ראשוניות יכולות גם להיות מועילות כדי לזהות את זמני המגע הנדרשים ג'ל ו / או LA-ICP-MS רגישויות אם צפויים עומסים מסיסים נמוכים מאוד, אשר עשוי להיות חשוב למיפוי יסודות קורט solutes ברמות רקע קרקע טבעית15. חוץ מזה, יש לאמת את תפקוד ג'ל DGT הנכון לפני היישום הניסיוני שלו באמצעות טעינה מבוקרת של ג'לים בהכנת תקני כיול DGT LA-ICP-MS. תקן הג'ל מספק טעינת ג'ל עזר תואמת מטריצה שניתן להשתמש בה כדי להעריך אם טעינת הג'ל לדוגמה שנקבעה על ידי LA-ICP-MS נמצאת בטווח הצפוי. אם אין אפשרות להשיג אות השונה מרעש הרקע הריק של הגז והשיטה, על המפעיל לוודא כי נהלי מעבדה לניתוח רכיבי מעקב יושמו וכל שלבי הפרוטוקול בוצעו כראוי. לפעמים, ג'ל DGT הוא התהפך בטעות לאחר דגימה מסיסת עם הקרקע חשוף, צד טעון פונה לכיוון צלחת הזכוכית ולא קרן הלייזר, וכתוצאה מכך עוצמות אות נמוכות תכונות הפוכות בטעות בתמונות שטף מסיס הסופי.
במהלך ניתוח LA-ICP-MS, נוצרת כמות גדולה של נתונים, אשר לוקח זמן רב כדי להעריך. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בסקריפטים פנימיים להערכת נתונים המותאמים לפורמט פלט נתוני היעד שלנו באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני סטנדרטית. לאחר מיון וכיול חצי אוטומטיים, התוויית תמונה מתבצעת באמצעות קוד פתוח, כלי ניתוח תמונה בגישה פתוחה (ImageJ, Fiji50). גישה זו מאפשרת שליטה מלאה על מיון נתונים, הערכה והצגה, דבר חיוני מכיוון שהנתונים שנאספו תואמים לפיקסלים מלבניים ולא ריבועית, שיש להציגם כראוי במפות המסתפרות שנוצרו. יתר על כן, במהלך עיבוד נתונים, כל אינטרפולציה פיקסל יש להימנע בזהירות. האינטרפולציה של הפיקסלים מובילה למדרגיות מוחלקות בתמונות הכימיות, וכתוצאה מכך תכונות מרוככות ולעתים קרובות מעגליות להפצת אלמנטים ולכן היא שינוי לא רצוי של הנתונים המקוריים. אינטרפולציה של פיקסלים היא הליך סטנדרטי בפעולות שינוי קנה מידה ועיצוב מחדש במוצרי תוכנה רבים לעיבוד תמונה, אך ניתן לבטל את הבחירה בה בדרך כלל.
לסיכום, השיטה המתוארת היא התקדמות משמעותית להבנת הדינמיקה התזונתית והמזהמת במערכות טבעיות של צמחי קרקע-ריזוספרה. בנוסף ליישומים DGT בלבד, השיטה יכולה להיות משולבת עם אחרים, דיפוזיה מבוססי טכניקות הדמיה כמו optodesמישורי 3,33,42,43,48,51 ו zymography20,21,22,23,24, וניתן לפתח עוד יותר עבור הכללת אלמנטים נוספים ופרמטרים הקרקע.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן במשותף על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF): P30085-N28 (תומאס פרוהסקה) וקרן המדע האוסטרית (FWF) והמדינה הפדרלית של אוסטריה התחתונה: P27571-BBL (יעקב סנטנר).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
| Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
| Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
| Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
| Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
| Clamp | Local warehouse | n/a | |
| Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
| DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
| DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
| Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
| Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
| Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
| Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
| Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
| High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
| HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
| Horizontal shaker | GFL | 305 | |
| HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
| ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
| Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
| Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
| LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
| LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
| Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
| Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
| Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
| Overhead shaker | GFL | 3040 | |
| Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
| pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
| pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
| Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
| Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
| Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
| Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
| PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
| PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
| PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
| Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
| Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
| Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
| Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
| Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
| Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
| Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
| Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
| Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
| ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |
References
- Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
- Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
- Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
- Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
- Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
- Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
- Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
- Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
- Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
- Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
- Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
- Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
- Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
- Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
- Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
- Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
- Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
- Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
- Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
- Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
- Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
- Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
- Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
- Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
- Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
- Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
- Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
- Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
- Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
- Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
- Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
- Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
- Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
- May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
- Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
- Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
- Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).
