Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Tvådimensionell visualisering och kvantifiering av labila, oorganiska växtnäringsämnen och föroreningar i jord

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61661
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

Summary

Detta protokoll presenterar ett arbetsflöde för sub mm 2D-visualisering av flera labila oorganiska näringsämnen och förorenande solute arter med diffusiva gradienter i tunna filmer (DGT) kombinerat med masspektrometri imaging. Solute provtagning och högupplöst kemisk analys beskrivs i detalj för kvantitativ kartläggning av solutes i rhizosfären av terrestra växter.

Abstract

Vi beskriver en metod för tvådimensionell (2D) visualisering och kvantifiering av fördelningen av labil (dvs. reversibelt adsorberat) oorganiskt näringsämne (t.ex. P, Fe, Mn) och föroreningar (t.ex. As, Cd, Pb) solute arter i jorden intill växtrötter (rhizosfären) vid sub millimeter (~ 100 μm) rumslig upplösning. Metoden kombinerar sink-baserad solute provtagning av diffusiva gradienter i tunna filmer (DGT) teknik med rumsligt löst kemisk analys genom laser ablation induktivt kopplade plasma massa spektrometri (LA-ICP-MS). DGT-tekniken är baserad på tunna hydrogeler med homogent fördelade analytselektiva bindningsfaser. Mångfalden av tillgängliga bindningsfaser möjliggör beredning av olika DGT-geltyper efter enkla geltillverkningsförfaranden. För utbyggnad av DGT-gel i rhizosfären odlas växter i platta, transparenta tillväxtbehållare (rhizotroner), vilket möjliggör minimal invasiv tillgång till ett jordodlat rotsystem. Efter en pre-growth period tillämpas DGT geler på utvalda regioner av intresse för in situ solute provtagning i rhizosfären. Därefter hämtas och bereds DGT-geler för efterföljande kemisk analys av de bundna solutformningarna med la-ICP-MS-linjeskanning. Tillämpning av intern normalisering med hjälp av 13C och extern kalibrering med hjälp av matrismatchade gelstandarder möjliggör ytterligare kvantifiering av 2D-soluteflödena. Denna metod är unik i sin förmåga att generera kvantitativa 2D-bilder av 2D-bilder av 2D-bilder med flera element i jord-växtmiljöer, vilket överträffar den uppnåeliga rumsliga upplösningen av andra metoder för att mäta lydiga lutningar i rhizosfären avsevärt. Vi presenterar tillämpningen och utvärderingen av metoden för avbildning flera katjoniska och anjoniska solute arter i rhizosfären av terrestra växter och belyser möjligheten att kombinera denna metod med kompletterande solute imaging tekniker.

Introduction

Näringsförvärv av växtväxter är en nyckelfaktor för att bestämma grödans produktivitet. De processer som styr grödornas effektiva upptag av näringsämnen har studerats intensivt, särskilt de mekanismer som styr näringstillgången till och näringsin internalisering av växtrötter vid jordrotsgränssnittet, rhizosfären, är erkända för sin roll i växtnäringsförvärv. Viktiga processer för växtnäringsupptag inkluderar: näringstransport mot roten; Dynamisk sorptionsjämvikt mellan arter som löses upp i markens porvatten och arter som är bundna till fasta markytor. Mikrobiell konkurrens om näringsämnen. Mikrobiell mineralisering av näringsämnen som ingår i organiskt material i marken. och närings internalisering i rot symplasma. Upptaget av oorganiska spårmetaller (oid) föroreningar styrs till stor del av samma mekanismer.

Beroende på tillgången på näringsämnen och föroreningar, växtbehov och diffusivitet i jord kan differentierade näringsmönster i rhizosfären observeras. För starkt ssorberande element med jämförelsevis höga internaliseringshastigheter (t.ex. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), finns utarmning av labilen (dvs. reversibelt adsorberad) elementfraktion jämfört med bulkjorden, med utarmningszonbredder som ofta är ≤1 mm, medan för mer mobila näringsämnen som NR3-kan utarmningszoner sträcka sig upp till flera centimeter1. Dessutom har ackumulering av element som Al och Cd observerats när tillgängligheten överstiger upptaget av anläggningar2,3.

Med tanke på rhizosfärprocessernas betydelse för närings- och föroreningscykling har flera tekniker för att mäta den växt-tillgängliga elementfraktionen med hög rumslig upplösning utvecklats4,5. Att mäta småskaliga labila solutefördelningar har dock visat sig vara utmanande av flera skäl. En stor svårighet är att provta mycket små (lågt μL-intervall) volymer jord och/eller porvatten på definierade positioner intill levande växtrötter för att lösa de branta näringsgradienterna i rhizosfären. Ett tillvägagångssätt för att ta itu med detta problem är att använda mikrosugkoppar för utvinning av porvattenprover6. Med denna metod mätte A. Göttlein, A. Heim och E. Matzner7 jordporvatten näringskoncentrationer i närheten av Quercus robur L. rötter med en rumslig upplösning på ~ 1 cm. En svårighet att analysera μL-volymer jord- eller jordlösning är att dessa små provvolymer, i kombination med de låga koncentrationerna av alla utom de stora näringsarterna, kräver mycket känsliga kemiska analystekniker.

Ett alternativt system, som kan lösa näringsgradienter med en upplösning ner till ~ 0,5 mm, är att växa en rotmatta på ytan av ett jordblock, med ett tunt hydrofilt membranskikt som skiljer jord frånrötterna 8,9. I denna konfiguration kan solutes passera genom membranet och rötter kan ta upp näringsämnen och föroreningar från jorden medan rotutsöndrar kan sprida sig i jorden. Efter inrättandet av ett tätt rotskikt kan jordblocket provtas och skivas för att erhålla jordprover för efterföljande extraktion av elementfraktioner. På detta sätt kan endimensionella näringsämnen och förorenande gradienter, i genomsnitt över ett relativt stort område (~ 100 cm2) analyseras.

En annan utmaning är att få prover av labila, växt-tillgängliga elementfraktion, eftersom de flesta kemiska jordutvinningstekniker fungerar mycket annorlunda jämfört med de mekanismer genom vilka växter tar upp näringsämnen och föroreningar. I många jordutvinningsprotokoll blandas jord med en extraktiv lösning i syfte att fastställa en (pseudo-)jämvikt mellan upplöst och sorbat elementfraktion. Växter internaliserar dock kontinuerligt näringsämnen och utarmar därför ofta gradvis rhizosfärjorden. Även om jämviktsextraktionsprotokoll har antagits allmänt som marktester eftersom de är lätta att genomföra, representerar den extraherade näringsfraktionen ofta inte den växt tillgängliga näringsfraktionenväl 10,11,12,13. Sink metoder som kontinuerligt utarmar den provsmakade jorden för näringsämnen har föreslagits som fördelaktiga metoder och kan bättre likna den underliggande näringsupptagsmekanismen genom att efterlikna rotupptagsprocesserna10,11,14,15.

Utöver de metoder som beskrivs ovan har äkta bildåtergivningstillämpningar, som kan mäta kontinuerliga parameterkartor med upplösningar ≤100 μm över flera cm2, utvecklats för specifika element och jord (bio)kemiska parametrar5. Autoradiografi kan användas för att avbilda elementfördelningen i rhizosfären förutsatt att lämpliga radioisotoper finnstillgängliga 16. Planar optodes möjliggör visualisering av viktiga jordkemiska parametrar som pH och pO217,18,19, och enzymaktivitet eller totala proteinfördelningar kan kartläggas med fluorescerande indikatoravbildningstekniker som jord zymografi20,21,22,23 och/eller root blotting metoder24. Medan zymografi och autoradiografi är begränsade till mätning av en enda parameter i taget, kan pH och pO2 imaging med planar optodes göras samtidigt. De mer traditionella rotmattateknikerna ger endast 1D-information, medan mikrosugkoppar ger punktmätningar eller 2D-information med låg upplösning, men båda metoderna möjliggör flerelementsanalys. Mer nyligen presenterade P. D. Ilhardt , et al.25 ett nytt tillvägagångssätt med laserinducerad nedbrytningsspektroskopi (LIBS) för att kartlägga 2D totala multielementfördelningar med en upplösning på ~ 100 μm i jordrotskärnprover där den naturliga elementfördelningen bevarades genom noggrann provberedning.

Den enda teknik som kan rikta in sig på 2D-provtagning av flera närings- och föroreningssoluter med hög rumslig upplösning är diffusiva lutningar i tunnfilmsteknik (DGT), en diskbänksbaserad provtagningsmetod som immobiliserar labila spårmetallarter (loid) på plats på ett bindande material inbäddat i etthydrogelskikt 26,27. DGT introducerades som en kemisk speciationsteknik för att mäta labila solutes i sediment och vatten, och antogs snart för dess användning ijordar 28. Det möjliggör sub mm skala flera element solute imaging, som ursprungligen demonstrerades i en flod sediment29, och har utvecklats ytterligare för dess tillämpning i växt rhizosfärer30,31,32,33.

För DGT-provtagning appliceras ett gelark av en storlek på cirka 3 cm x 5 cm på en enda växtrot som växer i ytskiktet i ett jordblock, med ett hydrofilt membran som skiljer gelén från jorden. Under kontakttiden sprids labila näringsämnen och/eller föroreningar mot gelén och binds omedelbart av det bindningsmaterial som ingår i gelén. På detta sätt etableras ett koncentrationsgradient och därmed ett kontinuerligt nettoflöde mot gelén och råder under provtagningstiden. Efter provtagning kan hydrogelen avlägsnas och analyseras med hjälp av en analytisk kemisk teknik som möjliggör rumsligt löst analys. En högspecialiserad och ofta använd teknik för detta ändamål är laserablation induktivt kopplade plasma masspektrometri (LA-ICP-MS). I vissa tidiga studier användes också mikropartikelinducerade röntgenutsläpp (PIXE)29. DGT-provtagning i kombination med LA-ICP-MS-analys möjliggör kemisk avbildning med flera element med en rumslig upplösning på ~ 100 μm. Om mycket känsliga ICP-MS-tekniker (t.ex. sektorsområde ICP-MS) används kan exceptionellt låga detektionsgränser uppnås. I en studie om effekten av kalkning på Zn och Cd-upptag med majs15kunde vi kartlägga labila Cd i majs rhizosfären i oförorenad jord med en detektionsgräns på 38 pg cm-2 cd per gelområde. DGT, planar optodes och zymografi förlitar sig på diffusion av målelementet från jord till ett gelskikt, som kan utnyttjas för kombinerad tillämpning av dessa metoder för att samtidigt, eller i följd, avbilda ett stort antal parametrar som är relevanta för växtnäringsämne och förorenande upptag. Detaljerad information om analytiska kemiska aspekter av DGT-avbildning, om potentialen att kombinera DGT och andra bildframställningsmetoder och om dess tillämpningar granskas utförligt i ref.34,35.

I den här artikeln beskriver vi hur man utför ett solute imaging experiment med hjälp av DGT-tekniken på rötter av markbundna växter i en omättad markmiljö, inklusive växtodling, geltillverkning, gelapplikation, gelanalys och bildgenerering. Alla steg utarbetas i detalj, inklusive anteckningar om kritiska steg och experimentella alternativ.

Protocol

1. Tillverkning av DGT-geler

OBS: Flera DGT geltyper finns tillgängliga för 2D-avbildning av labila solute arter med hög (sub mm) rumslig upplösning35. Här sammanfattas tillverkningen av tre väl karakteriserade högupplösta (HR)-DGT-bindningsgeler som används i solute imaging applikationer kort. Laboratorieförfaranden för analys av spårämnen samt detaljerade tillverkningsförfaranden för alla presenterade HR-DGT-geler beskrivs i avsnitten S1 och S2 (Supporting Information) (SI).

  1. Polyuretanbaserad blandad anjon- och katjonbindningsgel (HR-MBG; SI S2.1)31
    1. Förbered en polyuretangelupphängning med homogent spridda zirkonium (IV) hydroxid- och iminodiacetatfaser (IDA).
    2. Täck gelupphängningen i en tunn film på en glasplatta och initiera gelbildning genom lösningsmedelsavdunstning för att få en 0,1 mm tunn, rivsäker blandad anjon- och katjonbindningsgel (HR-MBG).
  2. Polyakrylamid-zirconia anjonbindande gel (HR-ABG; SI S2.2)36
    1. Tillverka en 0,4 mm tunn agarosakorslänkad polyakrylamidgel (APA) enligt etableradegelgjutningsprocedurer 37 (se SI S2.4 för ett detaljerat protokoll för APA-tillverkningen).
    2. Fäll ut zirkonium (IV) hydroxidfaser i den prefabricerade APA-gelén för att erhålla en 0,4 mm tunn anjonbindningsgel (HR-ABG).
  3. Polyakrylamid-iminodiacetate cation bindande gel (HR-CBG; SI S2.3)38
    1. Förbered en polyakrylamidgelupphängning med homogent spridda IDA-faser.
    2. Gjut gelen mellan två glasplattor och initiera polymerisationsreaktionen för att erhålla en 0,4 mm tunn katjonbindningsgel (HR-CBG) där IDA-faserna sätts på ena sidan av gelén.

2. Växtodling

OBS: Det experimentella systemet använder rhizotroner4 (Figur 1) för att odla växter i omättad jord för solute imaging. Först beskrivs rhizotronjordfyllning och vattning, sedan ges detaljer om den experimentella växttillväxten. Detaljer om rhizotrondesign och jordsubstratpreparat innan de fylls i rhizotronen presenteras i SI-sektionen S3.

Figure 1
Figur 1: Rhizotrondesign (ej skala). (A) Exploderad vy över en rhizotron tillväxtbehållare. B)Monterad rhizotron under växttillväxt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. Rhizotron jordfyllning
    1. Innan du fyller rhizotronen med förfuktad jord (gravimetriskt vatteninnehåll, Equation 6 är känt; se SI S3.2), stäng vattningshålen på baksidan av rhizotronen med tejp och ta bort frontplattan och dess fixeringsskenor och skruvar.
    2. Väg den tomma rhizotronen (utom framplattan, skenorna och skruvarna), åtta 5 cm x 11 cm akrylplattor och 16 klämmor(materialförteckningen)och registrera summan av vikterna.
    3. Fäst en liten akrylplatta längst ner på rhizotronen med två klämmor på varje sida, med trycket från klämmorna riktade mot rhizotronramen, så att plattan inte böjer sig inåt och volymen är konstant.
    4. Luta rhizotronen något mot den lilla plastplattan och fyll med förfuktad jord upp till en höjd av ~ 4 cm (Figur 2A). Fördela jorden inuti rhizotronen genom att omröra rhizotronen något och komprimera försiktigt jorden med några mm (beroende på de specifika markegenskaperna) med ett komprimeringsverktyg (Figur 2B).
    5. Upprepa 2.1.3 - 2.1.4 tills rhizotronen är fylld med jord (figur 2C). Lämna ett mellanrum på ~ 3 cm på toppen för efterföljande plantering av plantor i rhizotronen.
    6. Väg den jordfyllda rhizotronen (inklusive 8 små plattor och 16 klämmor) och registrera vikten. Subtrahera från detta den tomma rhizotronvikten som erhålls i 2.1.2 och registrera viktskillnaden, Equation 7 dvs.
    7. Beräkna massan av torr jord i rhizotronen, Equation 8 (g), enligt Eq. 1, och beräkna sedan den torra jordens bulktäthet, Equation 9 (g cm-3), i rhizotronen enligt Eq. 2.
      Equation 1
      Equation 2
      Här är Equation 10 (cm3) rhizotronens totala inre volym.
      OBS: Typiska Equation 9 värden i rhizotronen är mellan 1,0-1,4 g cm-3. Överskrid inte 1,5 g cm-3 eftersom rottillväxten kan hindras över detta värde.
    8. Placera den jordfyllda rhizotronen på en stödlåda och ta bort alla klämmor och små plattor från rhizotronen (Figur 2D). Rengör försiktigt rhizotronramen (dvs. kanterna) med vävnadspapper, eftersom återstående jordpartiklar på ramen kan orsaka läckage.
      OBS: Den exponerade markytan måste vara homogen och utjämnad med rhizotronramen utan sprickor eller luckor. Om inte, töm rhizotronen och upprepa 2.1.2 - 2.1.8.
    9. Skär två bitar polytetrafluoreten (PTFE)(Table of Materials)folie till 22 cm x 13 cm vardera. Skär dessutom en bit plastfolie till 46 cm x 15 cm. Registrera summan av PTFE- och plastfolievikter. Placera den första biten PTFE-folie på den övre halvan av den exponerade markytan i rhizotronen och sträck ~ 1 cm över marknivån högst upp på rhizotronen.
    10. Fäst försiktigt PTFE-folien på rhizotronramen med tejp (Figur 2E). Börja med att fixa ett hörn högst upp på rhizotronen först, följt av dess motsatta hörn och slutligen de två hörnen längre ner i rhizotronen. Applicera spänningen när du fixar hörnen 2-4 för att säkerställa en plan folieyta. Om veck dyker upp, öppna och fixera tejpen igen i enskilda hörn (inte alla på en gång) tills alla veck tas bort och PTFE-folien är platt och sammanhängande med markytan.
    11. Placera den andra biten PTFE-folie på rhizotronens nedre ände och överlappa den övre PTFE-foliebiten med ~ 1 cm. Upprepa 2.1.10 för att fästa den andra PTFE-folien på rhizotronen.
    12. Placera plastfolien (46 cm x 15 cm) på PTFE-folierna. Fixera plastfolien med fixeringsproceduren enligt 2.1.10.
    13. Placera en framplatta på den jordfyllda och folietäckta rhizotronen. Placera en skena runt varje sida av rhizotronen och dra åt skruvarna för hand för att fixa skenorna och därmed den främre plattan till rhizotronen. Skruvarna är placerade mot rhizotronens slutna sida,dvs.

Figure 2
Figur 2: Rhizotronmontering och fyllning för att odla växter i jord för solute imaging i rhizosfären. A)Jordfyllning i rhizotronen. B)Komprimering av den fyllda jorden med hjälp av ett komprimeringsverktyg. C)Jordfylld rhizotron med små akrylplattor och klämmor. D)Jordfylld rhizotron med exponerad markyta. e)Jordfylld rhizotron delvis täckt med en skyddande PTFE-folie. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Rhizotronhantering och DGT-gelapplikation. A)Jordvattning med 10 ml pipettspetsar i vattenhålen på baksidan av rhizotronen. B)Plantering av plantor (anges som gröna fläckar) i den jordfyllda och slutna rhizotronen. C)Rhizotron planterad med Salix smithiana-sticklingar och borttagen framplatta och plastfolieskydd. (D) Skala försiktigt av PTFE-foliekåpan före DGT-gelapplikationen. (E) Högupplöst bild av jordrotsgränssnittet ROI. F)Applicering av frontplattan utrustad med DGT-gelen på rhizotronen. g)Foto av avkastningen på sysselsatt prov med DGT-gelen applicerad under soluteprovtagning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. Vattna jorden
    1. Bestäm den experimentella markens vattenhållande kapacitet (WHC) i rhizotronen. Tillverka därför två rhizotroner med öppen botten och fyll dem med jord enligt avsnitt 2.1. Mätta dessa öppna, jordfyllda rhizotroner helt genom nedsänkning i en vattenbehållare i 16 timmar och dränera rhizotronerna i 8 timmar.
    2. Ta ett sammansatt jordprov på ~50 g från slumpmässiga platser i rhizotronerna med öppen botten och torka provet vid 105 °C för att bestämma Equation 6 enligt Eq. S1. Den Equation 6 fastställda motsvarar jordens WHC och uttrycks därför som Equation 11 (g g-1).
    3. Definiera målet i Equation 6 den experimentella rhizotronen. Under tillväxtfasen, ställ Equation 6 in 60 % av WHC (dvs. WHC-faktorn) för att förse anläggningar med Equation 12 en tillräcklig mängd vatten samtidigt som anoxiska förhållanden i rhizotronen undviks.
    4. Beräkna den totala massan vatten som ska Equation 13 tillsättas, (g), för att bevattna jorden i rhizotronen vid målet Equation 6 enligt Eq. 3. Redogöra för den mängd vatten som finns i jorden i rhizotronen, Equation 14 g.
      Equation 3
    5. Dividera Equation 13 med antalet rhizotronvattenhål (här 14) för att få den massa vatten som ska tillsättas i varje vattenhål. Tillsätt vatten genom att trycka in 10 ml pipettspetsar i vattenhålen och låta vattnet rinna ut i jorden genom gravitation (Figur 3A).
  2. Växttillväxt
    1. Pre-groddar frön av den experimentella växten (t.ex. på våtfilterpapper) enligt de specifika kraven på fröspiration tills radikeln dyker upp (upp till 1 cm lång).
    2. Plantera upp till två plantor i rhizotronen enligt figur 3B. Vid plantering, tillsätt ~ 5 ml vatten direkt till plantorna för att stödja deras tillväxt. Täck rhizotronens övre öppning under de första ~ två dagarna efter plantering med en transparent, fuktbehållande film (Table of Materials). Linda rhizotronen i aluminiumfolie för att förhindra mikrofytisk tillväxt.
      OBS: Förutom plantor kan växtskär också odlas i rhizotroner.
    3. Överför den planterade rhizotronen till ett tillväxtrum, med miljöförhållanden (dvs. temperatur, fuktighet, ljusintensitet) inställda på de specifika växtkraven. Luta rhizotronen vid 25°-35° för att säkerställa rotutveckling längs frontplattan via gravitropism.
    4. Under växttillväxten upprätthåller gravimetriskt målvattenhalten i rhizotronen genom periodisk vattning var 2-4: e dag med rhizotronvattenhålen enligt 2.2.5. Håll markytan på toppöppningen fuktig genom regelbundna tillsats av ~5 ml vatten.
      OBS: Om växter odlas under längre perioder och växtbiomassan förväntas minska den mängd vatten som tillsätts rhizotronen avsevärt med den föreslagna metoden, ska hänsyn tas till växtbiomassans vikt genom att odla växter i separata rhizotronreliker och skörda och väga växtvävnaderna med bestämda intervall.
    5. När rötterna når en lämplig plats längs den främre plattan, företrädesvis i mitten av rhizotronen, applicera DGT-geler för provtagning av den rhizosfäriska solutefördelningen.

3. Provtagning av den soluta fördelningen

  1. Gel ansökan
    1. Ökning Equation 6 av rhizotronen från 60 % Equation 11 till 80 % Equation 11 24 timmar före gelansökning enligt 2.2.4.-2.2.5. Detta säkerställer god jordgelkontakt och möjliggör enkel diffusion i gelén samtidigt som anoxiska markförhållanden undviks vid soluteprovtagning.
    2. Ta en ny, syrarengjord frontplatta, rikta den mot rhizotronen som används för provtagning och markera de områden som är av intresse (ROIs) på plattan. Överför plattan till en laminär flödesbänk eller någon annan damm- och metallfri miljö, omarkerad sida vänd uppåt.
    3. Skär DGT-bindningsgelen på ett akrylstöd till önskad rektangulär storlek som motsvarar ROI, vanligtvis cirka 3 cm × 5 cm, med PTFE-belagda rakblad. Skär gelén genom att trycka i stället för att skjuta rakbladet för att säkerställa ett tydligt snitt. Placera den rektangulära gelbiten på den omärkta sidan av plattan på den markerade platsen för ROI.
      OBS: Om HR-MBG används kan en 100 μm tunn distansfolie tillsättas under gelén för att säkerställa att gelén är i god kontakt med jordrotssystemet.
    4. Kapa ett 10 μm tunt polykarbonatmembran (0,2 μm porstorlek; Tabell över material) till en storlek som förlänger gelstorleken med ≥1 cm vid varje sida och placera membranet på gelén. Applicera lite vatten för att ta bort luftbubblor från stacken.
    5. Fixera membranet längs alla fyra kanterna med hjälp av vinyl eltejp( Table of Materials). Ta försiktigt bort luftbubblor som fastnat mellan gelén och membranet med hjälp av plasttweezers. Tejpen får endast komma i kontakt med membranet och inte med gelén.
      OBS: Om tejpen kommer i kontakt med gelén fastnar luftbubblor mellan gelén och membranet, eller om den slutliga membranytan visar veck, måste gel/membranstacken monteras på igen eftersom det diffusiva flödet av soluts i gelén kan försämras35 (upprepa 3.1.3 - 3.1.5).
    6. Placera rhizotronen på ett stativ, ta bort skenorna och lyft försiktigt av frontplattan(bild 3C). Ta bort plastfolien, skär av PTFE-folien i kanterna på rhizotronen och skala långsamt av PTFE-folien för att undvika störningar i jordrotssystemet (Figur 3D).
    7. Ta ett ortogonfoto av ROI med hjälp av en digital DSLR-kamera (Tableof Materials)för att underlätta tolkningen och presentationen av den soluta fördelningen baserat på markstrukturen och rotmorfologin (figur 3E). Använd ett kamerastativ och, om tillgängligt, ett makroobjektiv. Rikta in kameran så att fotots mitt motsvarar ROI:s mitt, och kamerans fokusplan är parallellt med markytan. Inkludera en skalbar (t.ex. en linjal) på bilden.
    8. Fäst plattan utrustad med gel/membranstacken på den öppna rhizotronen (Figur 3F). Rikta därför in en kant på plattan med en kant av rhizotronen och "böj försiktigt" plattan mot jorden. Detta användningssätt hjälper till att undvika luftbubblor mellan gel/membranstacken och jordrotssystemet. Fäst frontplattan med skenor och skruvar.
      OBS: Detta steg är kritiskt och måste utföras noggrant. Plattan kan inte flyttas efter att ha etablerat kontakt mellan gel/membranstacken och jordrotssystemet utan att jord och rötter förskjuts.
    9. Registrera den exakta starttiden för gelutplacering och ta ett foto av den utplacerade gelén vid AVKASTNINGEN enligt 3.1.7 (Figur 3G). Linda rhizotronen i aluminiumfolie och överför till tillväxtrummet till slutet av den soluta provtagningsperioden (ofta 24 h).
  2. Hämtning av gel
    1. Placera rhizotronen på en stödlåda, lyft försiktigt av framplattan och skölj gelen/membranstacken på plattan med vatten för att tvätta bort vidhäftande partiklar (Figur 4A). Registrera den exakta sluttiden för gelutplacering. Provjord från ROI för att bestämma den faktiskaw-jorden i rhizotronen enligt Eq. S1.
    2. Överför framplattan till laminarflödesbänken, gel/membranstacken uppåt. Hämta gelén från framplattan genom att försiktigt ta bort tejpen längs alla fyra kanterna och sedan polykarbonatmembranet som täcker gelén (Figur 4B). Applicera vatten för att hjälpa gelén att flyta fritt på en tunn vattenfilm på plattan med jordkontaktsidan vänd uppåt.
      OBS: Det är viktigt att hålla reda på gelorienteringen. Gelsidan som utsätts för jorden och rötterna måste alltid vändas uppåt (mot användaren).
  3. Torkning av gel
    1. Skär ett rektangulärt gelblottingpapper(Materialförteckning)och placera en något mindre bit av ett polyeterulfonmembran (0,45 μm porstorlek; Tabell över material) överst.
    2. Överför gelén från plattan till gelens blottingpapper/membranstapel med hjälp av plasttweezers, jordkontaktssidan uppåt. Gelén måste vara avslappnad (dvs. inte sträckt) och helt platt, utan luftbubblor mellan gel och membran. Applicera lite vatten på gelblottningspapperet/membranstacken för att underlätta gelöverföring och placering.
    3. Täck gelens blottingpapper/membran/gelstapel helt med en bit plastfolie och märk på gelprovet och dess orientering på plastfolien(figur 4C). Placera gelen blotting paper/membrane/gel/plastic foil stack i en vakuumgeltork(Table of Materials)och torka tills stacken är helt uttorkad (vanligtvis 48-72 h). För HR-MBG, ställ in temperaturen på 50-55 °C, för HR-ABG och HR-CBG bäst torr vid rumstemperatur.
    4. Ta bort gelen blotting papper från den torkade stacken och överför gelén, som nu oskiljaktigt slås samman med polyetersulfonmembranet, i en zip-påse. Plastfoliekåpan stannar på gelén tills strax före LA-ICP-MS-analysen.
    5. Inkludera en gelbit från det ursprungliga gelbladet som en metod tom, som inte utsätts för jord. Bearbeta metodens blankgel identisk med provgelen enligt 3.3.2 - 3.3.4.

Figure 4
Figur 4: Hämtning av DGT-gel och förberedelse för torkning vid soluteprovtagning. A)Platta med DGT-gel och rhizotron direkt efter soluteprovtagning. B)Hämtning av DGT-gelen från plattan i en laminär flödesbänk. c)Stack av gelblotting papper/polyetersulfonmembran/DGT gel/plastfolieskydd för geltorkning. Observera att gelén är något färgad efter utplaceringen på rhizosfärens jord. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

4. Kemisk analys av DGT-bindningsgelen

OBS: I detta protokoll utförs analysen av den lösa fördelningen på DGT-bindningsgelen av LA-ICP-MS med hjälp av ett nanosekunds 193 nm ArF excimer LA-system utrustat med en tvåvolymsblationcell i kombination med en fyrdubbel ICP-MS (figur 5). Alla instrument är listade i materialförteckningen. Alternativt kan nanosekund 213 nm eller 266 nm solid state LA-system appliceras36,39,40,41,42,43. Om ökad känslighet eller massupplösning krävs är sektorsfält ICP-MS ett alternativ till fyrdubbel ICP-MS15,44. Närmare uppgifter om beredningen av DGT-gelstandarder för extern kalibrering och koppling av LA-systemet till fyrdubbel ICP-MS presenteras i SI-avsnitten S4 och S5.

Figure 5
Figur 5: LA-ICP-MS-installation för DGT-gelanalys. A)Nanosekund 193 nm ArF excimer LA-system och fyrdubbel ICP-MS. B)Torkade geler monterade på glasplattor och fastsatta på LA-provstadiet redo att föras in i ablationscellen. C)Nebulisatorgas (Ar) från ICP-MS och aerosolbärgas (He eller Ar) från ablationscell som är ansluten till ICP via en tvåvägs Y-splitter- och brännaradapterkoppling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. Provberedning för LA-ICP-MS
    1. Överför de torkade gelproverna, standarderna och metodämnena (som slås samman med polyetersulfonmembranstödet) till enskilda bitar av dubbelhäftande tejp (Table of Materials), gelsidan vänd uppåt. Beskär överflödiga banddelar för att spara utrymme i ablationscellen.
    2. Montera de torkade gelerna på glasplattor. Använd enskilda glasplattor för varje gelprov, standardserie eller metod tom för att möjliggöra flexibelt arrangemang på LA-provstadiet (typisk storlek 10 cm × 10 cm). Använd en glaskräm för att justera glasplattans storlek efter behov. Fixera glasplattorna med gelerna på LA-provstadiet(figur 5B)med hjälp av plastin(materialförteckning). Jämna ut gelytan genom att justera scengolvet och låsa provsteget i ablationscellen.
  2. LA-ICP-MS-analys av linjeskanning
    1. Koppla LA-systemet till ICP-MS enligt si-avsnitt S5. I LA-programvaran(Table of Materials)ställer du in kameraljusinställningarna (dvs. 'Ring', 'Coax' och 'Transmitted') för att belysa gelytan i ablationscellen och fokusera på gelytan genom att justera z-axelavståndet. Flytta till slumpmässiga platser över hela cellen för att säkerställa att alla gelytor är i fokus.
    2. Ställ in LA-parametrarna i fönstretLaser setupi LA-programvaran. Typiska inställningar som används i LA-ICP-MS line-scan analys av DGT geler är: läge kontinuerlig; Energiproduktion 20-30%.energy output 20-30%; repetitionshastighet 10-20 Hz; Punktdiameter 100-200 μm. skanningshastighet 150-250 μm s-1.
      OBS: Parametrarna måste optimeras för vilken typ av gel som används och kan variera. Parametrar kan också förbättras för att öka förhållandet mellan signal och brus, rumslig upplösning eller minska förvärvstiderna beroende på den experimentella och instrumentella inställningen. Använd en relativt låg energiproduktion (≤40 %) och repetitionshastighet (≤25 Hz) för att undvika att penetrera genom gelerna i underlagsmaterialen39. Se till att laserskanningshastigheten är ≤ spotdiametern dividerad med den totala ICP-MS-skanningscykeln (se 4.2.6) för att undvika komprimering av datapunkterna och därmed en förlust av upplösning i skanningsriktning45. När du till exempel ställer in en punktdiameter på 200 μm och en total ICP-MS-skanningscykeltid på 0,25 s, bör skanningshastigheten vara ≤800 μms -1.
    3. Välj linjeverktyget och rita ett enda, ~1 mm långt linjemönster över en gelstandard. Högerklicka på linjemönstret i fönstret "Skanningsmönster" och kontrollera att LA-parametrarna i 4.2.3. har antagits. Använd verktygetDuplicerade skanningarför att duplicera den här linjen fyra gånger, med ett interlineavstånd (avståndet mellan linjecentrum) större än dekordiametern (figur 6). Detta tillvägagångssätt erbjuder totalt fem parallella linjer per gelstandard (n = 5). Upprepa detta steg för varje gelstandard, kalibreringslös och metod tom.
    4. Flytta till gelprovet och rita en enda linje längs den övre kanten av det rektangulära området som ska analyseras. Duplicera raden om du vill skapa parallella linjer för hela exempelområdet enligt 4.2.3. Använd ett interlineavstånd på 300-400 μm. Kontrollera att fokus (z-axelavstånd) är korrekt inställt för varje start- och slutpunkt på varje rad.
      OBS: Analysens rumsliga upplösning är högre längs skanningsriktningen jämfört med det interline avståndet. Därför kan linjernas start- och slutpunkter bäst följa riktningen för analytgradienterna. För rhizosfärgradienter är detta vanligtvis vinkelrätt mot rotaxeln (figur 6).
    5. I ICP-MS-programvaran(Table of Materials), ställ in en tidsupplöst" Data Only" -metod på skärmen "Metod' väljer du en eller flera lämpliga isotoper för varje analyt och inkluderar 13C som intern normaliseringsstandard31,36,40,41,42. Kontrollera att detektion av isotoper inte försämras av störningar46.
    6. Ställ in den totala genomsökningscykeltiden för ICP-MS-metoden(Est. Reading Time)till ≤0,5 s med lämpliga uppehållstider per isotop (vanligtvis mellan 10-50 ms). Ställ in ICP-MS 'Avläsningar' till 1 och ändra värdet "Avläsningar / Replikera" för att ställa in den totala mättiden per prov ("Est. Samplingstid),dvs. per enskild ablationslinje. Detta beror på de specifika LA-parametrar och linjeavstånd som anges i 4.2.2 - 4.2.4.
    7. För datarapportering använd ett datainsamlingsläge mellan intensitet och tid och ställ infilskrivningsalternativetpå "Nytt per prov" för att skapa en enskild datafil (här .xl) för varje ablationsrad.
    8. Ställ in en" batch" provsekvens på skärmen ICP-MS 'Sample' med varje provpost som motsvarar en enskild ablationslinje i 4.2.3 -4.2.4.
    9. Klicka på' Analysera batch' för att initiera exempelsekvensen på ICP-MS, som väntar med datainsamling tills den utlöses av den första laserpulsen (se SI S5 för information om utlösarkonfigurationen).
    10. I LA-programvaran väljer du alla linjer som ska analyseras och kontrollerar att ICP-MS-metoden(" Est. Sampling Time", se 4.2.6.) matchar varaktigheten för de enskilda radablationerna, som vanligtvis skiljer sig åt för gelprover, standarder och metodämnen. Upprepa 4.2.6. för att vid behov justera ICP-MS-metoden.
    11. Klicka på" Emission" i fönstret" Laserenergi" för att ladda laserhuvudet och klicka sedan på "Kör" för att öppna fönstretKörexperiment. Här väljer du 'Endast valda mönster', ställer in 'Washout Delay' på 20-30 s, markerar rutan ' Aktivera laser underskanningar' och ställer in 'Laser Warmup Time' på 10 s.
    12. Klicka påKöri fönstret Körexperimentför att starta linjeskanningsanalysen och övervaka den råa signalintensiteten i antal per sekund (cps) för varje isotop på ICP-MS i realtid. Varje linje ska starta ('Laser Warmup Time', 10 s) och end ('Washout Delay', 20-30 s) med en gas tom.
    13. Övervaka laserfluensen (J cm-2)under analysen för att bedöma laserstabiliteten. Om fluensen varierar till stor del, avbryt analysen och kontrollera att laserkällan och/eller dess spegelsystem är fullt fungerande.
    14. Efter analysen stoppar du ICP-MS-plasman och ställer in bärgasflödet på LA-systemet till 0 mL min-1. Ta bort gelerna från ablationscellen och förvara i zip-påsar för vidare användning.

Figure 6
Figur 6: Schematisk för DGT LA-ICP-MS experimentell design (ej skala). Illustrationen visar DGT-baserade in situ solute provtagning i rhizosfären och LA-ICP-MS mappning av den solute fördelningen på gel ytan, inklusive en närbild visar exemplariska line-scan dimensioner och parametrar. Observera att DGT-gelén vänds horisontellt när den överförs från rhizosfärjorden till glasplattan, vilket indikeras av rektangelns läge i DGT-gelens nedre hörn. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. Databehandling och kalibrering
    1. Importera rådatafilen (.xl) för varje ablated rad i kalkylbladsprogram (Materialförteckning). Rådatatabellen visar ICP-MS-avläsningarna (datapunkter) för varje isotop i cps och motsvarande tidpunkter i s. Lista alla rader bredvid varandra i olika kolumner.
    2. Utvärdera linjeskanningsdata för signalstabilitet för den interna standarden(13C) och tillräckliga washout-tider.
    3. Beräkna en genomsnittlig gasfri för varje isotop från alla gasfria värden som registrerats före linjens ablationer (dvs. under laservärmningstiden) och subtrahera den genomsnittliga gasen från motsvarande råa intensiteter för varje isotop för att korrigera för bakgrundssignalen.
    4. Tillämpa intern normalisering genom att dividera signalintensiteten för varje isotop (cps) med signalintensiteten hos den interna standarden (cps) för varje datapunkt för att korrigera för variationer i mängden material som ablated och instrumental drift.
    5. Beskär data före start och efter slutet av varje ablated rad för att ta bort bakgrundssignalen. Transponera datatabellen för att få en rutnätsmatris där varje rad motsvarar en ablated linje och varje kolumn till ett normaliserat isotopintensitetsvärde. Separera matriserna för varje isotop i enskilda kalkylblad.
    6. Beräkna det genomsnittliga normaliserade signalintensitetsförhållandet per isotop för kalibreringsstandarderna och kalibreringstomen och beräkna kalibreringsfunktionen (y = ax + b) med hjälp av en linjär regressionsmodell med gelstandarden analytbelastningar (μg cm-2; se SI S4) som x-värden. Utvärdera kalibreringsfunktionen för varje isotop för linjäritet47.
    7. Applicera kalibreringsfunktionen på exempeldatamatrisen. Konvertera de normaliserade Equation 15 signalintensitetsförhållandena , till gelanalytbelastningar, Equation 15 (μg cm-2), och därefter till tidsgenomsnittliga solutflöde ( Equation 17 pg cm-2 s-1), för varje isotop och datapunkt enligt Eq. 4 och Eq. 5:
      Equation 4
      Equation 05
      Här är a kalibreringslinjens lutning, b är kalibreringsledningens avlyssningslinje, och t (s) är gelutplaceringstiden under soluteprovtagning.
    8. Spara den kalibrerade exempeldatamatrisen för varje analyt som txt-fil.
  2. Bildgenerering
    OBS: Se till att undvika pixelinterpolering under alla steg i bildgenereringen, eftersom detta kan leda till artificiellt utjämnade soluteflödesgradienter i de resulterande bilderna.
    1. Importera den kalibrerade exempeldatamatrisen (.txt) som textbild i bildanalysprogramvaran (Table of Materials).
    2. Beräkna avståndet per pixel i x-riktning (dvs. sidoupplösning) genom att multiplicera laserskanningshastigheten med den totala ICP-MS-skanningscykelns varaktighet (t.ex. förutsatt en skanningshastighet på 200 μms -1 och en total skanningscykeltid på 0,25 s motsvarar sidoupplösningen 50 μm). Avståndet per pixel i y-riktning motsvarar det interline-avståndet (bild 6).
    3. Beräkna bildens korrigeringsfaktor för bildförhållandet. Dividera därför avståndet per pixel i y-riktning (t.ex. 300 μm) med avståndet per pixel i x-riktning (t.ex. 50 μm). Applicera den erhållna y/x-korrigeringsfaktorn (i det här exemplet 6) underSkala. Applicera avståndet per pixel (i μm eller mm) i x-riktning som skalning under "Set scale".
    4. Använd en "Uppseendetabell", dvs. pseudofärgskala för bättre visualisering av kemiska gradienter i den soluterade bilden och justera bildens "färgbalans" för att styra de nedre/övre gränserna för visningsområdet. Lägg till ettkalibreringsfältoch spara den solute bilden som tiff-fil.
    5. Kopiera den soluterade bilden med kommandot 'Kopiera till system' i bildanalysprogramvaran och klistra in i programvara för skrivbordspublicering ( Table ofMaterials). Skala, justera och komponera den soluterade bilden med bilden av roi som erhålls i 3.1.7.
      OBS: Innan du kopierar, ändra storlek på den soluta bilden med t.ex. faktor 10 genom att använda enX-skalapå 10 och en" Y-skala" på 10 under ' Ställ inskala' för att säkerställa tillräckligt med pixlar för högupplöst publicering.
DGT gel tillverkning Växtodling In situ solute provtagning LA-ICP-MS solute flödesmappning
HR-MBG
1 vecka 		Jordberedning
1 vecka 		Gel ansökan
1 timme per gel 		Provberedning
1 timme per gel
HR-ABG
3 dagar 		Rhizotron montering
2 timmar per replikat 		Solute provtagningsperiod
variabel, vanligtvis 24 timmar 		LA-ICP-MS-analys
1 dag per gel
HR-CBG
3 dagar 		Växttillväxt
beroende av studier 		Hämtning av gel
1 timme per gel 		Databehandling
4 timmar per gel
Torkning av gel
2-3 dagar 		Bildgenerering
10 min per bild

Tabell 1: Ungefärliga tider för allmänna steg i DGT LA-ICP-MS-tekniken.

Representative Results

För att demonstrera förmågan och datadetaljerna i DGT-avbildningsmetoden sammanställde vi sub mm, 2D-flödesfördelningen av flera labila näringsämnen och förorenande solutearter i jord intill rötterna fagopyrum esculentum och Salix smithiana (Figur 7). Ungefärliga tider för protokollets allmänna förfarandesteg presenteras i tabell 1.

Solutebilder i figur 7 genererades i tre olika studier med antingen HR-MBG- eller HR-CBG-bindningsgeler. De kemiska bilderna visar 2D-soluteflödesfördelningen med en rumslig upplösning på 82-120 μm längs x-axeln och 300-400 μm längs y-axeln, beroende på de LA-ICP-MS-parametrar som används. Eftersom ingen interpolation tillämpades under bildkalibrering och storleksändring representerar enstaka pixlar uppmätta datapunkter. Justeringen av de soluterade bilderna med en fotografisk bild av ROI visar att sub mm, 2D-solutflödesfördelningen av olika element är mycket varierande beroende på markstruktur och rotmorfologi. Detta kan hänföras till det differentiella biogeokemiska beteendet hos elementen i jord-rhizosfär-växtsystemet och deras interaktion med jordmatrisen och växtrötterna.

I figur 7A labila oorganiska Mg, Al, P, Mn och Fe solute fluxes visualiserades runt en ung F. esculentum rot odlas i karbonatfri jord befruktad med NH4NO3. Sub-mm solute fördelningen visade zoner av minskade Al, P och Fe flödet tillsammans med äldre rot sektioner på grund av att rot upptag, och mycket ökad Mg, Al, P, Mn och Fe flödet vid roten apex på grund av att lokaliserade P mobilisering processer av F. esculentum rot. Observera att rotspetsen ligger något bakom markytan och därför knappt synlig i den fotografiska bilden. Figur 7B visar fördelningen av labila spårmetaller, inklusive Mn, Fe, Zn, Cd och Pb runt en rot av metalltolerant S. smithiana som odlas i en jord som är måttligt förorenad med Zn, Cd och Pb. De soluterade bilderna visualiserade distinkt utarmning särskilt av Zn, Cd och Pb vid den omedelbara rotpositionen, vilket visar att S. smithiana rötter fungerar som en lokaliserad diskbänk för labila spårmetaller i förorenad jord. Dessutom kan lokaliserade Zn-, Cd- och Pb-flödesökningar observeras, vilket indikerar ackumulering av dessa spårmetaller vid det omedelbara jordrotsgränssnittet.

Förutom multielements solute imaging kan den presenterade metoden också kombineras med kompletterande diffusionsbaserade bildtekniker som planaroptoder 34. Detta visas i figur 7C, där fördelningen av labila spårmetaller i rhizosfären av S. smithiana var samlokalisering med fördelningen av pH med hjälp av en kombinerad, enskiktsplanar optod-DGT katjonbindning gel33. Jordsubstratet befruktades med (NH4)2SO4, vilket ledde till en pH-minskning längs rotaxlar med ~ 1 enhet jämfört med bulkjord. PH-minskningarna var samlokalisering med ökade solute flödet av Mn, Fe, Co, Ni, Cu och Pb, vilket tyder pH-inducerad metall löslighet.

Dessutom visar dessa exempel resultat några av de potentiella bild avbildning artefakter som kan erhållas. Till exempel kan strukturella jordinhomogeniteter, t.ex. observerade som en horisontell linje i den nedre tredjedelen av ROI-bilden av figur 7A, orsaka jord-gelkontaktavgångar som resulterar i begränsad diffusion på denna plats i bindningsgelen. Omvänt kan överdriven jordkomprimering i rhizotronen leda till dålig porositet vilket resulterar i en konstgjord förskjutning av jordens redoxstatus mot anoxi. Detta illustreras i figur 7B, där omfattande områden med högt förhöjda Mn- och Fe-flödet i de soluterade bilderna visuellt matchas med ett tätt jordlager i ROI-bilden. Detta tyder på en minskad jord redox potential på grund av hög jord komprimering, vilket resulterar i reduktiv upplösning och löslighet av de mycket redox-känsliga elementen. Noggrann rhizotronfyllning och visuell inspektion av markytan direkt efter fyllning rekommenderas därför.

Figure 7
Figur 7: Sub mm 2D-fördelning av labila näringsämnen och förorenande solutearter över olika jordrotsgränssnitt. A)Fördelningen av anjonisk P och katjonisk mg, al, mn och fe ligger runt en ung F. esculentumrot. Samlokalisering av anjoniska och katjoniska solutes uppnåddes med HR-MBG för 24 h vid en jordvattenmättnad på ~ 75% WHC. Al-, P- och Mn-bilderna visas som kalibrerade fDGT-värden (pg cm-2 s-1), medan Mg- och Fe-bilder visar 13C-normaliserade intensiteter. Skalstrecket representerar 1 cm. Denna siffra är anpassad från ref.48. B)Distribution av Mn, Fe, Zn, Cd och Pb runt en S. smithiana-rot som odlats i jord som är måttligt förorenad med Zn, Cd och Pb. Katjoniska spårmetallsoluter provtogs med HR-CBG i 20 timmar vid en jordvattenmättnad på ~80 % WHC. Alla bilder visas som kalibrerade fDGT-värden (pg cm-2 s-1). Skalstången representerar 0,5 cm. Denna siffra är anpassad från ref.3. C)Distribution av pH och flera katjoniska soluts runt S. smithiana rötter odlade i jord spetsad med Cd. Samlokalisering av pH och solute dynamik uppnåddes med hjälp av en ändring av HR-MBG protokollet, möjliggör samtidig solute provtagning och planar optode imaging33. Bilderna Mn, Cu, Zn och Cd visas som kalibrerade fDGT-värden (pg cm-2 s-1), medan Fe-, Co-, Ni- och Pb-bilder visar 13C-normaliserade intensiteter. Skalstrecket representerar 1 cm. Denna siffra är anpassad från ref.33. De presenterade siffrorna återges från de citerade artiklarna3,33,48 licensierade enligt CC BY. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Det solutbildande protokoll som presenteras här är en mångsidig metod för att visualisera och kvantifiera 2D-närings- och föroreningsflöde i jordväxtmiljöer. Det är unikt i sin förmåga att generera under mm skala flerelementsbilder av labila solute arter vid jord-rot gränssnittet, överstiger den uppnåeliga rumsliga upplösningen av alternativa metoder för att mäta solute gradienter i rhizosfären väsentligen4. DGT:s riktade in situ-provtagningsmetod, i kombination med en mycket känslig kemisk analysmetod såsom LA-ICP-MS, underlättar en detaljerad undersökning av den soluta flödesdynamiken kring enskilda växtrötter som odlas i jord eller liknande substrat. På grund av den sink-baserade provtagningsprocessen återspeglar de erhållna bilderna de visualiserade solutens lability och är därför en uppskattning av deras anläggningstillgänglighet10. Även om den metod-inneboende mätningen av solute fluxes har betydande fördelar som tolkningen som växt-tillgängliga näringsfraktioner, är flödesmätningar mycket mindre raka för att förstå än porvattenkoncentrationsmätningar. Standardprovtagningsgeometrin för DGT i bulkjordtillämpningar (särskilt de 0,8 mm tjocka diffusionsgeler som används i den inställningen) gör det möjligt att jämföra den faktiska porvattenkoncentrationen, csoln, och en tidsgenomsnittlig uppskattning av porvattenkoncentrationen genom en DGT-mätning i bulk, cDGT,och för tolkning av dessa parametrar avseende den återanskaffningsdynamiken hos en soluteart. En sådan jämförelse kan dock inte göras baserat på avbildning av DGT-applikation med mycket tunna diffusionsskikt, eftersom de härledda cDGT-värdena är orealistiskt små34. DGT-bildresultat är därför inte alltid enkla och snabba att tolka och är ofta inte direkt jämförbara med mer konventionella porvattenkoncentrationsmätningar.

Vid tillämpning av metoden måste några kritiska steg noggrant övervägas, främst relaterade till fyllning och vattning av rhizotrontillväxtbehållare. När du fyller jorden i rhizotronen är det mycket viktigt att undvika att komprimera jorden för mycket, eftersom växtrötterna inte kan tränga in i starkt komprimerad jord och rottillväxten kommer att hämmas. Vi har observerat rötter som undviker starkt komprimerad jord och växer längs rhizotrontillväxtbehållarens inre kanter, där jorden vanligtvis är mindre komprimerad. I det här fallet kan enskilda rötter som ligger i mitten av rhizotronerna, där DGT-geler kan appliceras bekvämt, inte utvecklas alls, vilket effektivt hämmar framgångsrik gelapplikation. I vårt laboratorium visade erfarenhet att torr jord bulk densiteter på 1,0-1,4 g cm-3 tillåter obehindrat rot utveckling. Dessutom är överdriven markkomprimering också en potentiell källa till artefakter när det gäller lösligheten hos redoxkänsliga element och biogeokemiskt associerade arter. Eftersom den totala porvolymen minskar och pordiameterfördelningen flyttas mot lägre diametrar i högkomprimerad jord, finns mindre luftfylld porvolym med större diameter tillgänglig, vilket kan leda till reduktiva förhållanden lokalt. Följaktligen kan MnIII/IV- och FeIII- oxider minskas, vilket leder till ökade Mn2 + och Fe2 + flödet. Upplösningen av Fe-oxider, som är viktiga sorptionsplatser, t.ex. för fosfat och mikronäringsämnen, kan frigöra sorkade och/eller samfällda arter och därmed orsaka artificiellt förhöjda flödet av den biogeokemiskt associerade arten. En liknande fråga kan uppstå om tillväxtbehållarna vattnas för mycket. Avdunstning via den lilla markytan högst upp i tillväxtbehållaren är låg och jorden kan förbli vattenmättad i upp till flera veckor efter plantering, vilket också kan orsaka redox artefakter.

En annan viktig faktor är den kemiska funktionaliteten hos den tillverkade HR-DGT-bindningsgelen. Genom att följa protokollet erhålls tunna geler med en homogen fördelning av bindningsfaser. Om gelerna har områden med inhomogen materialfördelning (t.ex. hål i gelen eller aggregat av bindningsfaser) måste dessa områden avlägsnas eller, om det är för omfattande, geltillverkningsprotokollet upprepas. Om gelen bereds korrekt måste den kunna binda målsoluta arter som sprider sig till gelén omedelbartoch kvantitativt 27, vilket bestäms av den analytspecifika gelbindningskapaciteten. Även om det är mindre problematiskt att överskrida gelkapaciteten i oförorenade jordar, bör den övervägas i metallförorenade jordar och saltlösningsjordmiljöer. Mättnad av gelbindningsfaserna kommer inte bara att försämra kvantitativ soluteprovtagning, men resulterar också i lateral diffusion av solutes mellan bindningsfaser i gelén, vilket leder till en obestämd lokalisering av småskaliga soluteflödesfunktioner. Om mycket stora mängder labila näringsämnen/främmande arter förväntas i måljordmiljön bör därför preliminära tester utföras. För uppskattning av förväntade DGT-belastningar kan DGT-kolvprovtagning i bulkjord följt av gelelutspädning och våtkemisk analys tillämpas15,49. Vid behov kan DGT-driftsättningstiderna justeras för att minska gelkontakttiden och därmed undvika gelmättnad över kapacitetströsklar. Omvänt kan preliminära tester också vara till hjälp för att identifiera erforderliga gelkontakttider och/eller LA-ICP-MS-känsligheter om mycket låga solutebelastningar förväntas, vilket kan vara viktigt för kartläggning av spårämnen på naturliga jordbakgrundsnivåer15. Dessutom bör korrekt DGT-gelfunktion kontrolleras före dess experimentella applicering genom kontrollerad lastning av geler vid beredning av DGT LA-ICP-MS kalibreringsstandarder. Gelstandarden ger en matrismatchad referensgelanalytbelastning som kan användas för att bedöma om provgelbelastningen som bestäms av LA-ICP-MS ligger inom det förväntade intervallet. Om det inte går att få fram en signal som skiljer sig från det tomma bakgrundsljudet från gasen och metoden, skall verksamhetsutövaren se till att laboratorieförfaranden för analys av spårämnen har genomförts och att alla protokollsteg har utförts korrekt. Ibland vänds DGT-gelén av misstag efter soluteprovtagning med den jordexponerade, laddade sidan vänd mot glasplattan snarare än laserstrålen, vilket resulterar i låga signalintensiteter och felaktigt vända funktioner i de slutliga solutflödesbilderna.

Under LA-ICP-MS-analysen genereras en stor mängd data, vilket tar lång tid att utvärdera. I vårt labb använder vi interna datautvärderingsskript som är skräddarsydda för vårt måldatautmatningsformat med hjälp av standardprogram för kalkylblad. Efter halvautomatisk sortering och kalibrering utförs bildritning med öppen källkod, open access-bildanalysverktyg (ImageJ, Fiji50). Den här metoden ger full kontroll över data sortering, utvärdering och presentation, vilket är viktigt eftersom de insamlade data motsvarar rektangulära och inte kvadratiska pixlar, som måste visas korrekt i de genererade solute kartorna. Under databehandlingen bör dessutom alla pixelinterpolationer undvikas noggrant. Pixelinterpolering leder till utjämnade gradienter i de kemiska bilderna, vilket resulterar i mjukade, ofta cirkulära elementfördelningsfunktioner och är därför en oönskad ändring av originaldata. Pixelinterpolering är en standardprocedur för omskalning och omformatering av åtgärder i många bildbehandlingsprogramprodukter men kan avmarkeras vanligtvis.

Sammanfattningsvis är den beskrivna metoden ett betydande framsteg för att förstå närings- och föroreningsdynamiken i naturliga jord-rhizosfär-växtsystem. Förutom DGT-endast applikationer kan metoden kombineras med andra diffusionsbaserade bildtekniker som planar optodes3,33,42,43,48,51 ochzymography20 , 21,22,23,24, och kan utvecklas ytterligare för att inkludera ytterligare element och markparametrar.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie samfinansierades av Den österrikiska vetenskapsfonden (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) och Österrikiska vetenskapsfonden (FWF) och den federala staten Nedre Österrike: P27571-BBL (Jakob Santner).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) VWR 21300.260 ≥98.0%, analytical reagent
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M8250-100G ≥99.5%
Acrylamide solution Sigma-Aldrich A4058-100ML 40%, for electrophoresis
Analyte salts n/a n/a Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher
Buechner funnel VWR 511-0065 13 cm plate diameter
Chemical equilibrium modelling software KTH Sweden n/a Visual MINTEQ
Clamp Local warehouse n/a
Desktop publishing software Adobe Inc. n/a InDesign CS6
DGT cross-linker DGT Research Ltd n/a 2%, agarose derivative
DGT piston sampler DGT Research Ltd n/a 2 cm diameter exposure window
Digital single-lens reflex (DSLR) camera Canon Inc. n/a Canon EOS 1000D
Dispersion device IKA 3737000 Ultra-Turrax T10 Basic
Double-sided adhesive tape Tesa 56171
Ethanol Sigma-Aldrich 34923 Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
Gel blotting paper Whatman 10426981 Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness
Gel drier UniEquip n/a UNIGELDRYER 3545
High-pressure microwave system Anton Paar n/a Multiwave 3000
HNO3 VWR 1.00456.2500P 65%, ISO for analysis
Horizontal shaker GFL 305
HydroMed D4 AdvanSource Biomaterials Corp. n/a Ether-based hydrophilic urethane
ICP-MS software Perkin Elmer n/a Syngistix
Image analysis software National Institutes of Health (NIH) n/a ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/
Knife-coating device BYK 5561 Single Bar 6″, 0.5 mils
LA software Elemental Scientific Lasers n/a ActiveView
LA system Elemental Scientific Lasers n/a NWR193
Laminar flow bench Telstar Laboratory Equipment B.V. n/a Class II biological safety cabinet
Magnetic stirrer IKA 0003582400 C-MAG MS 7
Moisture-retaining film Bemis Company, Inc. PM999 Parafilm M, 4" x 250'
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-50ML BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99%
NaNO3 Sigma-Aldrich 229938-10G 99.995% trace metals basis
NaOH Sigma-Aldrich 1064980500 Pellets for analysis
Overhead shaker GFL 3040
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials Savillex 200-015-20 15 mL Standard Vial, Rounded Interior
pH meter Thermo Scientific 13-644-928 Orion 3-Star Benchtop pH Meter
pH probe Thermo Scientific 8157BNUMD Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutter DGT Research Ltd n/a Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd
Plastic tweezers Semadeni 602
Plasticine Local stationary shop n/a non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents
Polycarbonate membrane discs Whatman 110606 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polycarbonate membrane sheet Whatman 113506 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polyethersulfone membrane discs Pall Corporation 60172 Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
Polyethersulfone membrane sheet Pall Corporation 60179 Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
PTFE foil Haberkorn n/a 50 µm thickness
PTFE spacer Haberkorn n/a Variable thicknesses available
PTFE-coated razor blades Personna GEM 62-0178 Stainless steel single edge blades (coated)
PTFE-coated Tygon tubing S-prep GmbH SP8180 0.32 cm inner diameter
Quadrupole ICP-MS Perkin Elmer N8150044 NexION 2000B
Quantitative filter paper, 454 VWR 516-0854 Particle retention 12-15 µm
Spreadsheet software Microsoft Corporation n/a Microsoft Excel 2016 (v16.0)
Stainless-steel cutter Local locksmithery n/a 2.5 cm diameter
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) Teledyne CETAC Technologies n/a 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension
Transistor-transistor logic (TTL) cable n/a n/a Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument
Two-volume cell Elemental Scientific Lasers n/a Two-volume cell 1
Vinyl electrical tape 3M n/a Scotch Super 33+
Water purification system Termo Electron LED GmbH n/a TKA-GenPure
ZrOCl2 × 8H2O Alfa Aesar 86108.30 99.9 %, metals basis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
  2. Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
  3. Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
  4. Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
  5. Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
  6. Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
  7. Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
  8. Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
  9. Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  10. Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
  11. Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
  12. Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
  13. Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
  14. Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
  15. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
  16. Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
  17. Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  18. Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
  19. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  20. Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  21. Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
  22. Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
  23. Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
  24. Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
  25. Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
  26. Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
  27. Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
  28. Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
  29. Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
  30. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  31. Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
  32. Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
  33. Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
  34. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
  35. Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
  36. Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
  37. Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
  38. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
  39. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
  40. Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
  41. Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
  42. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  43. Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
  44. Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
  45. Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
  46. May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
  47. Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
  48. Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
  49. Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
  50. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  51. Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).

Tags

Miljövetenskap utgåva 163 kemisk avbildning rhizosfär diffusiva gradienter i tunna filmer laserablation induktivt kopplade plasmamasspektrometri spårämne växtnäring
Tvådimensionell visualisering och kvantifiering av labila, oorganiska växtnäringsämnen och föroreningar i jord
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska,… More

Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska, T., Santner, J. Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil. J. Vis. Exp. (163), e61661, doi:10.3791/61661 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter