Demonstration af heterologe komplekser dannet af Golgi-Resident Type III membranproteiner ved anvendelse af Split Luciferase Complementation Assay

Summary

Protokollen, der præsenteres her, har til formål at påvise forekomsten af heterologe interaktioner mellem Golgi-hjemmehørende type III-membranproteiner med cytoplasmatisk eksponerede N- og/eller C-termini i levende pattedyrceller ved anvendelse af den seneste variant af det splittede luciferasekomplementeringsassay.

Abstract

Målet med denne protokol er at undersøge anvendeligheden af den seneste variant af split luciferase-komplementering til påvisning af heterologe komplekser dannet af nukleotidsukkertransportører (NST’er). Disse ER- og Golgi-residente multitransmembranproteiner bærer de cytoplasmatisk syntetiserede nukleotidsukker over organelmembraner for at levere enzymer, der medierer glykosylering med deres substrater. NST’er findes som dimerer og/eller højere oligomerer. Heterologe interaktioner mellem forskellige NST’er er også blevet rapporteret. For at kontrollere, om teknikken er egnet til at studere fænomenet NST-heteromerisering, testede vi den mod en kombination af de to Golgi-residente NST’er, der tidligere har vist sig at associere på flere andre måder. Luciferase-komplementeringsassayet ser ud til at være særligt velegnet til at studere interaktioner mellem Golgi-residente membranproteiner, da det ikke kræver høje ekspressionsniveauer, hvilket ofte udløser proteinfejllokalisering og øger risikoen for falske positiver.

Introduction

Dette manuskript beskriver en trinvis protokol til kontrol af tilstedeværelsen af heterologe interaktioner mellem Golgi-resident type III-membranproteiner i forbigående transfekterede humane celler ved hjælp af den seneste variant af split luciferase-komplementeringsassayet. Proceduren er blevet grundigst testet mod nukleotidsukkertransportører (NST’er), men vi var også i stand til at opnå positive resultater for andre Golgi-hjemmehørende type III-membranproteiner, hvis N- og / eller C-termini står over for cytoplasmaet.

Vores forskningsgruppe undersøger NST’ernes rolle i glykosylering af makromolekyler. NST’er er Golgi- og/eller ER-resident type III-membranproteiner med N- og C-termini vendt mod den cytoplasmatiske side af den organellare ^membran1. NST’er menes at bære nukleotidaktiverede sukkerarter over organelmembraner for at levere glycosyltransferaser med deres substrater. NST’er danner dimerer og/eller højere oligomerer2,3,4,5,6,7,8,9,10. Desuden er heterologe interaktioner mellem forskellige NST’er også blevet ^{rapporteret6,11}. NST’er blev også påvist at danne komplekser med funktionelt beslægtede glykosyleringsenzymer12,13,14. Vi søgte efter et alternativ til den i øjeblikket anvendte teknik, fluorescens levetidsbilleddannelse (FLIM) -baseret FRET-tilgang, til at studere interaktioner mellem NST’er og funktionelt relaterede Golgi-residente proteiner, så vi besluttede at teste split luciferase-komplementeringsassay. Det gjorde det muligt for os at identificere en ny interaktion mellem en NST og et funktionelt relateret glykosyleringsenzym9.

Den seneste ændring af det opdelte luciferase-komplementeringsassay, NanoBiT, anvendes i den protokol, der præsenteres ^her15. Det er afhængig af rekonstitutionen af luciferaseenzymet (f.eks. NanoLuc) fra de to fragmenter – den store, betegnet som stor BiT eller LgBiT, et 17,6 kDa-protein, og den lille, der kun består af 11 aminosyrer, betegnet som lille BiT eller SmBiT. De to proteiner af interesse smeltes sammen med de komplementære fragmenter og udtrykkes forbigående i en menneskelig cellelinje. Hvis de to fusionsproteiner interagerer, produceres en luminescens in situ ved tilsætning af et cellegennemtrængeligt substrat. Disse to fragmenter er blevet optimeret, så de forbinder med minimal affinitet, medmindre de bringes sammen af en interaktion mellem de proteiner af interesse, de er smeltet sammen med.

Generelt har bioluminescensbaserede metoder nogle fordele i forhold til dem, der er baseret på fluorescens. Bioluminescerende signaler har et højere signal-støj-forhold, fordi baggrundsluminescensen er ubetydelig sammenlignet med det luciferase-afledte ^signal16. I modsætning hertil lider fluorescensbaserede tilgange normalt af en relativt høj baggrund forårsaget af fænomenet autofluorescens. Desuden er bioluminescens mindre skadelig for de analyserede celler end fluorescens, da der i det førstnævnte tilfælde ikke er behov for at ophidse prøven. Af disse grunde udkonkurrerer bioluminescerende tilgange til undersøgelse af PPI in vivo de almindeligt anvendte fluorescerende metoder som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eller Bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC).

Vores protokol er afhængig af henvisende luminescens opnået for proteinkombinationen af interesse for luminescens opnået for kontrolkombinationen. Sidstnævnte omfatter et af de testede proteiner, der er smeltet sammen med et større fragment og et kontrolprotein (f.eks. HaloTag), smeltet sammen med et mindre fragment. Sidstnævnte er et protein af bakteriel oprindelse, der ikke forventes at interagere med nogen af pattedyrproteiner. Brug af dette protein som kontrol udgør begrænsninger for topologien af de Golgi-hjemmehørende par af proteiner, der skal analyseres. Da dette protein i pattedyrceller syntetiseres i cytoplasmaet, bør begge proteiner af interesse have mindst en cytoplasmatisk hale.

Denne tilgang kan være særlig nyttig til indledende screening af PPI. Det kan blive den valgte metode, når fusionsproteinerne af interesse udtrykkes på niveauer, der simpelthen er utilstrækkelige til, at andre tilgange kan anvendes. Tilsvarende kan split luciferase-komplementeringsassay være den bedste løsning, hvis proteinerne af interesse udtrykkes på høje niveauer, men dette påvirker deres subcellulære lokalisering negativt eller er kendt for at tvinge ikke-specifikke interaktioner. Da det mindre fragment kun har 11 aminosyrer, kan det splittede luciferasekomplementeringsassay anvendes, når det er umuligt at bruge større tags. Endelig kan det anvendes til yderligere at bekræfte data opnået ved hjælp af andre teknikker, som i det tilfælde, der præsenteres her.

Protocol

1. Generering af ekspressionsplasmider Undersøg membrantopologi af de proteiner, der er af interesse, ved hjælp af et topologiforudsigelsesværktøj. Design kloningsstrategien, så de større og mindre fragmenter vil vende mod cytoplasmaet, når fusionsproteinerne er blevet indsat i Golgi-membraner. Hvis både N- og C-termini af de proteiner af interesse, som i det tilfælde, der præsenteres her, er cytoplasmatisk orienterede, mærke proteinerne på otte mulige måder (se figur…

Representative Results

For at opnå de mest pålidelige data i denne tilgang bør alle mulige kombinationer testes (jf . figur 1). Parallelt hertil bør positive og negative kontroller medtages. Den positive kontrol skal bestå af de to proteiner, der vides at interagere, hvoraf det ene er smeltet sammen med det større fragment, og det andet er smeltet sammen med det mindre fragment. Den negative kontrol bør ideelt set bestå af de to ikke-interagerende type III-membranproteiner, der er mærket på samme måde. …

Discussion

Her giver vi en detaljeret protokol, der muliggør demonstration af heterologe komplekser dannet mellem Golgi-residente type III-membranproteiner, såsom NST’er, ved hjælp af det delte luciferase-komplementeringsassay. Den foreslåede tilgang til dataanalyse og -fortolkning indebærer at relatere den luminescens, der er opnået for proteinkombinationen af interesse, til den luminescens, der er opnået for den tilsvarende kontrolkombination, som består af et af de proteiner af interesse, der er smeltet sammen med det st…

Materials

0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler