Summary
Le protocole présenté ici vise à démontrer l’apparition d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et les N- et/ou C-termini exposées cytoplasmiquement dans des cellules de mammifères vivants en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée.
Abstract
L’objectif de ce protocole est d’explorer l’applicabilité de la variante la plus récente de la complémentation de la luciférase divisée pour démontrer les complexes hétérologues formés par les transporteurs de sucre nucléotidique (NST). Ces protéines multitransmembranaires résidentes en ER et Golgi transportent les sucres nucléotidiques synthétisés cytoplasmiquement à travers les membranes des organites pour fournir des enzymes qui médient la glycosylation avec leurs substrats. Les NST existent sous forme de dimères et/ou d’oligomères supérieurs. Des interactions hétérologues entre différents NST ont également été rapportées. Pour vérifier si la technique est adaptée à l’étude du phénomène d’hétéromérisation NST, nous l’avons testée par rapport à une combinaison des deux NST résidents de Golgi dont il a été précédemment démontré qu’ils s’associent par plusieurs autres moyens. Le test de complémentation de la luciférase semble particulièrement adapté à l’étude des interactions entre les protéines membranaires résidentes de Golgi, car il ne nécessite pas de niveaux d’expression élevés, ce qui déclenche souvent une mauvaise localisation des protéines et augmente le risque de faux positifs.
Introduction
Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour vérifier la présence d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dans des cellules humaines transfectées transitoirement en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée. La procédure a été le plus largement testée contre les transporteurs de sucre nucléotidique (NST), mais nous avons également pu obtenir des résultats positifs pour d’autres protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dont les N- et / ou C-termini font face au cytoplasme.
Notre groupe de recherche explore le rôle des NST dans la glycosylation des macromolécules. Les NST sont des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et/ou d’ER avec N- et C-termini faisant face au côté cytoplasmique de la membrane organellaire1. On pense que les NST transportent les sucres activés par les nucléotides à travers les membranes des organites pour fournir aux glycosyltransférases leurs substrats. Les NST forment des dimères et/ou des oligomères supérieurs2,3,4,5,6,7,8,9,10. De plus, des interactions hétérologues entre différents NST ont également été rapportées6,11. Il a également été démontré que les NST forment des complexes avec des enzymes de glycosylation fonctionnellement liées12,13,14. Nous avons cherché une alternative à la technique actuellement utilisée, l’approche FRET basée sur l’imagerie par fluorescence de la durée de vie (FLIM), pour étudier les interactions des NST et des protéines résidentes de Golgi fonctionnellement apparentées, nous avons donc décidé de tester le test de complémentation de la luciférase fractionnée. Il nous a permis d’identifier une nouvelle interaction entre un NST et une enzyme de glycosylation fonctionnellement liée9.
La modification la plus récente du test de complémentation de la luciférase fractionnée, NanoBiT, est utilisée dans le protocole présenté ici15. Il repose sur la reconstitution de l’enzyme luciférase (par exemple, NanoLuc) à partir des deux fragments - le grand, appelé grand BiT ou LgBiT, une protéine de 17,6 kDa, et le petit, composé de seulement 11 acides aminés, appelé petit BiT ou SmBiT. Les deux protéines d’intérêt sont fusionnées avec les fragments complémentaires et exprimées transitoirement dans une lignée cellulaire humaine. Si les deux protéines de fusion interagissent, une luminescence est produite in situ lors de l’ajout d’un substrat perméable aux cellules. Ces deux fragments ont été optimisés de manière à ce qu’ils s’associent avec une affinité minimale à moins d’être rapprochés par une interaction entre les protéines d’intérêt auxquelles ils sont fusionnés.
En général, les méthodes basées sur la bioluminescence présentent certains avantages par rapport à celles basées sur la fluorescence. Les signaux bioluminescents ont un rapport signal/bruit plus élevé car la luminescence de fond est négligeable par rapport au signal dérivé de la luciférase16. En revanche, les approches basées sur la fluorescence souffrent généralement d’un fond relativement élevé causé par le phénomène d’autofluorescence. En outre, la bioluminescence est moins préjudiciable aux cellules analysées que la fluorescence, car dans le premier cas, il n’est pas nécessaire d’exciter l’échantillon. Pour ces raisons, les approches bioluminescentes pour étudier les IPP in vivo surpassent les méthodes fluorescentes couramment utilisées comme le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) ou la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC).
Notre protocole repose sur la luminescence de référence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin. Ce dernier comprend l’une des protéines testées qui est fusionnée avec un fragment plus grand et une protéine de contrôle (par exemple, HaloTag), fusionnée avec un fragment plus petit. Cette dernière est une protéine d’origine bactérienne qui ne devrait interagir avec aucune des protéines de mammifères. L’utilisation de cette protéine comme témoin pose des limites à la topologie des paires de protéines résidentes de Golgi à analyser. Étant donné que dans les cellules de mammifères, cette protéine est synthétisée dans le cytoplasme, les deux protéines d’intérêt doivent avoir au moins une queue cytoplasmique.
Cette approche peut être particulièrement utile pour le dépistage initial des IPP. Elle peut devenir la méthode de choix lorsque les protéines de fusion d’intérêt sont exprimées à des niveaux tout simplement insuffisants pour que d’autres approches puissent être appliquées. De même, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être la meilleure option si les protéines d’intérêt sont exprimées à des niveaux élevés, mais cela affecte négativement leur localisation subcellulaire ou est connu pour forcer des interactions non spécifiques. Étant donné que le plus petit fragment ne contient que 11 acides aminés, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être appliqué lorsque l’utilisation de marqueurs plus grands est impossible. Enfin, il peut être utilisé pour confirmer davantage les données obtenues à l’aide d’autres techniques, comme dans le cas présenté ici.
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Protocol
1. Génération de plasmides d’expression
- Examiner la topologie membranaire des protéines d’intérêt à l’aide d’un outil de prédiction de topologie.
- Concevoir la stratégie de clonage de manière à ce que les fragments les plus grands et les plus petits fassent face au cytoplasme une fois que les protéines de fusion ont été insérées dans les membranes de Golgi. Si, comme dans le cas présenté ici, les N- et C-termini des protéines d’intérêt sont orientées cytoplasmiquement, marquez les protéines de huit manières possibles (voir Figure 1B). Si N- ou C-terminus d’une ou des deux protéines d’intérêt est luminally orienté, excluez-le du marquage.
- Subcinez les gènes d’intérêt en vecteurs d’expression appropriés (voir Tableau des matériaux) en suivant des protocoles de clonage standard.
Remarque : Il est recommandé de tester toutes les orientations possibles, car certaines options de balisage peuvent ne pas fonctionner en raison d’une proximité insuffisante, d’une orientation sous-optimale ou de contraintes spatiales.
2. Transfection transitoire des plasmides d’expression dans les cellules
- Récoltez la culture cellulaire adhérente HEK293T par trypsinisation et ressuspendez les cellules dans un milieu de croissance complet dédié. Plaquez les cellules (2 x 104/100 μL/puits) sur une plaque de 96 puits à fond clair, côté blanc. Ajuster le nombre total de puits pour tenir compte de toutes les combinaisons et de tous les contrôles testés, y compris les répétitions.
REMARQUE: Essayez d’utiliser uniquement les 60 puits intérieurs de la plaque pour minimiser les changements thermiques et éviter l’évaporation pendant la nuit. L’utilisation de plaques revêtues de poly-D-lysine est fortement recommandée, telles que celles indiquées dans le tableau des matériaux, sinon les cellules peuvent se détacher lors des étapes de lavage suivantes. - Cultiver les cellules pendant la nuit dans des conditions normales (37 °C, 5 % de CO2).
- Le lendemain, transfecter les cellules avec les combinaisons souhaitées de plasmides d’expression obtenus au point 1.1.
- Diluer les plasmides d’expression dans un milieu sans sérum (voir tableau des matériaux) à 6,25 ng/μL pour chaque construction.
- Ajouter le réactif de transfection à base de lipides à un rapport lipide/ADN approprié et incuber selon les instructions du fabricant.
- Ajouter 8 μL de mélange lipide/ADN aux puits désignés. Mélanger le contenu de la plaque par rotation douce. Il en résulte une transfection des deux constructions d’expression à 50 ng/puits.
- Cultiver les cellules pendant 20-24 h dans des conditions standard (37 °C, 5% de CO2).
REMARQUE: La culture des cellules pendant une période plus longue peut entraîner des niveaux plus élevés d’expression de la protéine de fusion, ce qui peut favoriser une association non spécifique entre les fragments.
3. Échange moyen
- Le lendemain, remplacez le milieu conditionné par 100 μL d’un milieu sans sérum dans chaque puits. Assurez-vous que les cellules ne se sont pas détachées lors d’un échange moyen.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée 2-3 h avant l’ajout de la solution de travail furimazine. Le sevrage sérique minimise le fond causé par l’autoluminescence de la furimazine.
4. Préparation de la solution de travail furimazine
- Juste avant la mesure, mélanger 1 volume de furimazine avec 19 volumes d’un tampon de dilution (une dilution de 20 fois).
REMARQUE: Le volume total de la solution de travail de furimazine à préparer dépend du nombre de puits individuels à analyser (la solution de travail de la furimazine est ajoutée au milieu de culture cellulaire dans un rapport de 1:5, par conséquent, à chaque puits préalablement rempli de 100 μL d’un milieu sans sérum, 25 μL de la solution de travail de furimazine doivent être ajoutés). - Ajouter la solution de travail de furimazine aux puits désignés (25 μL/puits). Mélangez doucement la plaque à la main ou à l’aide d’un agitateur orbital (par exemple, 15 s à 300-500 tr/min).
5. Mesure de la luminescence
- Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques de luminescence.
- Pour les expériences à réaliser à 37 °C, équilibrez la plaque pendant 10 à 15 min à la température indiquée.
- Sélectionnez les puits à analyser.
- Luminescence de lecture avec un temps d’intégration de 0,3 s. Continuez à surveiller la luminescence jusqu’à 2 h au besoin.
6. Analyse des données
- Calculer les valeurs moyennes et les écarts-types pour toutes les combinaisons testées et de contrôle.
- Analysez les données à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle avec plusieurs comparaisons.
- Calculer les valeurs de changement de pli en divisant une luminescence moyenne obtenue pour les combinaisons d’intérêts par une luminescence moyenne obtenue pour les commandes négatives correspondantes. Évaluez les résultats.
NOTE: L’approche de l’analyse des données proposée ici suppose que l’interaction peut être revendiquée si la luminescence obtenue pour la combinaison testée est statistiquement significativement supérieure à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin correspondante et, en même temps, le rapport de ces deux valeurs dépasse 10.
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Representative Results
Pour obtenir les données les plus fiables dans cette approche, toutes les combinaisons possibles doivent être testées (voir figure 1). En parallèle, des contrôles positifs et négatifs devraient être inclus. Le témoin positif doit être constitué des deux protéines connues pour interagir, dont l’une est fusionnée avec le plus grand fragment et l’autre est fusionnée avec le plus petit fragment. Le témoin négatif devrait idéalement être constitué des deux protéines membranaires de type III non interagissant marquées de la même manière. Cependant, l’établissement d’un tel contrôle peut être difficile, car le manque d’interaction des deux protéines témoins doit être confirmé en profondeur à l’aide de plusieurs approches alternatives. Par conséquent, on pourrait utiliser une protéine cytosolique d’origine non humaine qui ne devrait interagir avec aucune protéine humaine (par exemple, HaloTag) comme témoin négatif, si N- et/ou C-termini des protéines, dont l’interaction doit être déterminée, sont exposées cytoplasmiquement comme dans le cas présenté ici. Nous recommandons fortement une vérification supplémentaire des résultats obtenus à l’aide de ce type de contrôle par co-expression des variantes non marquées de l’une ou l’autre des protéines d’intérêt combinée au titrage des plasmides correspondants. Si les deux protéines interagissent spécifiquement, une copie supplémentaire de l’une ou l’autre d’entre elles dépourvue du fragment de luciférase devrait entraîner une diminution spécifique de la luminescence.
Les valeurs des unités de luminescence relative (RLU) typiques des combinaisons positives et négatives sont énumérées dans le tableau 1. Les résultats ont été obtenus pour les deux NST, SLC35A2 et SLC35A3, dont il a été démontré qu’ils s’associaient par co-immunoprécipitation et FLIM-FRET6 ainsi que par ligature de proximité in situ11. SLC35A2 et SLC35A3 sont des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi avec N- et C-termini face au cytoplasme (Figure 1A). Par conséquent, il existe huit options de marquage possibles et les protéines de fusion résultantes peuvent également être assemblées de huit manières possibles (Figure 1B). Les valeurs moyennes de RLU correspondant à toutes les combinaisons testées et témoins sont représentées à la figure 2A. Le contrôle positif est également inclus. Une exigence initiale pour qu’un résultat sélectionné soit considéré comme indicatif d’une interaction est que la valeur RLU obtenue pour la combinaison d’intérêts soit statistiquement significativement plus élevée que la valeur RLU obtenue pour la combinaison témoin correspondante. Dans la figure 2A, trois combinaisons de ce type sont observées (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 et SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). L’étape suivante de l’analyse des résultats consiste à obtenir des valeurs de ratio pour les combinaisons d’intérêt en divisant les valeurs RLU correspondantes par les valeurs RLU obtenues pour les contrôles respectifs. Les résultats de cette analyse sont présentés à la figure 2B. Selon les suggestions du fabricant, les rapports entre 10 et 1000 sont très révélateurs d’interactions spécifiques. Il existe deux combinaisons qui répondent à ces critères (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 et SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) et soutiennent l’idée que SLC35A2 et SLC35A3 interagissent. Cependant, le fait que les six autres combinaisons soient négatives ne signifie pas qu’il n’y a aucune interaction entre les protéines de fusion respectives, mais suggère plutôt que la stratégie de marquage n’était pas optimale dans ces cas. Cet exemple montre à quel point il est important de tester toutes les combinaisons possibles.
Les données présentées à la figure 2 ont également été confirmées par la coexpression de SLC35A2 ou SLC35A3 marqués HA avec la combinaison qui a entraîné la luminescence relative la plus élevée, à savoir SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Des quantités variables de plasmides codant pour les variantes de NST marquées HA ont été utilisées pour la co-transfection. Il en a résulté une diminution statistiquement significative et dose-dépendante des valeurs de RLU (Figure 3). Le tableau 2 montre une perturbation spécifique et dose-dépendante de l’interaction entre SLC35A2-LgBiT et SmBiT-SLC35A3 par la coexpression simultanée de variantes de NST marquées HA.
Le problème le plus courant associé à la méthode présentée ici est la faible efficacité de la transfection. Pour vérifier si c’est la cause de résultats sous-optimaux, incluez un contrôle positif dans toutes les expériences. Le témoin positif que nous avons utilisé pour obtenir les données présentées ici se compose des deux protéines de fusion en interaction : la sous-unité catalytique alpha (PRKACA) de la protéine kinase dépendante du cAPM fusionnée avec le plus petit fragment et la sous-unité régulatrice de la protéine kinase dépendante du cAPM de type II-alpha (PRKAR2A) fusionnée avec le plus grand fragment. Dans nos mains, la valeur RLU correspondante a atteint ~ 6 x 105. Une baisse significative (2-3 ordres de grandeur) de ce nombre pourrait indiquer l’efficacité sous-optimale de la transfection effectuée. Dans un tel cas, nous recommandons de vérifier le bien-être des cellules cultivées et de s’assurer que le nombre approprié de cellules est plaqué pour la transfection.
Figure 1 : Schémas de la topologie et du balisage de la membrane. (A) Topologie membranaire des protéines SLC35A2 et SLC35A3. (B) Possibilités de marquage des protéines SLC35A2 et SLC35A3 avec les fragments de dosage de complémentation de la luciférase fractionnée et de combiner les protéines de fusion résultantes pour le test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats du test de complémentation de la luciférase fractionnée effectué dans les cellules HEK293T pour les combinaisons de protéines sélectionnées et les témoins négatifs correspondants (données traitées). (A) Valeurs RLU obtenues pour les combinaisons de protéines sélectionnées et les témoins négatifs correspondants. Négatif, HaloTag étiqueté avec SmBiT; PRKAR2A, sous-unité régulatrice de la protéine kinase de type II-alpha dépendante du cAPM; PRKACA, sous-unité catalytique alpha de la protéine kinase dépendante du cAPM. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle avec de multiples comparaisons et sont présentées comme une moyenne ±'écart-type (ET) de trois répétitions techniques. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Changements de pli calculés en divisant une luminescence moyenne obtenue pour la combinaison testée (RLU SAMPLE) par une luminescence moyenne obtenue pour la commande négative correspondante (RLU CONTROL). La valeur seuil considérée comme indicative d’une interaction a été fixée à 10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Perturbation spécifique et dose-dépendante de l’interaction entre SLC35A2-LgBiT et SmBiT-SLC35A3 par coexpression simultanée de variantes de NST marquées HA. Les cellules HEK293T ont été transfectées avec des plasmides codant pour SLC35A2-LgBiT et SmBiT-SLC35A3 et, en outre, soit avec un plasmide pSelect vide (simulacre), soit avec des quantités croissantes de plasmides pSelect codant pour SLC35A2 marqué HA (panneau de gauche) et SLC35A3 (panneau de droite). Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle avec de multiples comparaisons et sont présentées comme une moyenne ±'écart-type (ET) de trois répétitions techniques. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Résultats du test effectué dans les cellules HEK293T pour les combinaisons de protéines sélectionnées et les témoins négatifs correspondants (données brutes). Les valeurs RLU non traitées obtenues pour les combinaisons de protéines sélectionnées et les témoins négatifs correspondants sont affichées. Négatif, HaloTag étiqueté avec SmBiT; PRKAR2A, sous-unité régulatrice de la protéine kinase de type II-alpha dépendante du cAPM; PRKACA, sous-unité catalytique alpha de la protéine kinase dépendante du cAPM, TR, réplique technique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Perturbation spécifique et dose-dépendante de l’interaction entre SLC35A2-LgBiT et SmBiT-SLC35A3 par coexpression simultanée de variantes de la NST marquées ha(données brutes). Les valeurs RLU non traitées obtenues pour les combinaisons de protéines sélectionnées sont affichées. Mock, cellules exprimant SLC35A2-LgBiT et SmBiT-SLC35A3 co-transfectées avec un vecteur pSelect vide; HA-SLC35A2, cellules exprimant SLC35A2-LgBiT et SmBiT-SLC35A3 co-transfectées avec les quantités indiquées d’un plasmide pSelect codant pour SLC35A2 marqué avec l’épitope HA à l’extrémité N; HA-SLC35A3, cellules exprimant SLC35A2-LgBiT et SmBiT-SLC35A3 co-transfectées avec les quantités indiquées d’un plasmide pSelect codant pour SLC35A3 marqué avec l’épitope HA au N-terminus; TR, réplique technique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Nous fournissons ici un protocole détaillé permettant la démonstration de complexes hétérologues formés entre des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi, telles que les NST, en utilisant le test de complémentation de la luciférase divisée. L’approche proposée pour l’analyse et l’interprétation des données consiste à relier la luminescence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin correspondante, qui est composée de l’une des protéines d’intérêt fusionnées avec le plus grand fragment et de la protéine témoin d’origine bactérienne fusionnée avec le plus petit fragment. Ce dernier est exprimé dans le cytoplasme des cellules de mammifères; par conséquent, son utilisation comme référence nécessite que N- et/ou C-termini des protéines, dont l’interaction doit être analysée, se trouvent du côté cytoplasmique de la membrane de Golgi.
Les étapes critiques du protocole sont la conception du plasmide, le placage des cellules à transfecter, la transfection elle-même, l’échange de milieu, la préparation de la solution de travail de la furimazine et son ajout aux cellules. La conception du plasmide doit être faite de manière à ce que les deux fragments de luciférase soient face au cytoplasme, sinon les combinaisons de contrôle ne fonctionneront pas et les valeurs RLU de référence seront manquantes. Les cellules à transfecter doivent être plaquées comme spécifié dans le protocole, sinon l’efficacité de la transfection pourrait être sous-optimale. Nous recommandons d’utiliser des plaques multipuits avec la surface revêtue de poly-L-lysine pour soutenir la fixation des cellules pendant l’échange du fluide. Enfin, la solution de travail de la furimazine doit être fraîchement préparée et immédiatement ajoutée aux cellules. Une fois qu’il est ajouté, la lecture doit être effectuée dès que possible.
Pour éviter des résultats non concluants, des contrôles positifs et négatifs doivent toujours être inclus. Le témoin positif doit toujours être utilisé de manière à ce que l’efficacité de la transfection soit surveillée. Il est très important que toutes les protéines de fusion possibles qui sont topologiquement compatibles entre elles ainsi qu’avec le contrôle négatif basé sur HaloTag soient générées et combinées. Si possible, le témoin négatif comprenant une protéine membranaire n’interagissant avec aucune des protéines d’intérêt doit être utilisé. Ici, nous n’avons pas utilisé un tel contrôle, car son développement est encore en cours. Au lieu de cela, nous avons forcé un désassemblage spécifique des complexes d’intérêt en co-exprimant une copie supplémentaire non étiquetée de l’une des protéines analysées. Les vecteurs d’expression que nous avons utilisés portent le promoteur relativement faible du virus de l’herpès simplex-thymidine kinase (HSV-TK), qui garantit de faibles niveaux d’expression optimaux pour obtenir des résultats spécifiques. Cependant, dans le cas de résultats sous-optimaux, il pourrait être bénéfique d’utiliser les vecteurs à base de CMV ou, alternativement, d’optimiser la quantité de plasmides utilisés pour la transfection.
La méthode présentée, bien que puissante et pratique, présente certaines limites. Premièrement, cette méthode ne permet pas de déterminer si les complexes identifiés correspondent à des dimères ou à des oligomères d’ordre supérieur. En outre, la localisation subcellulaire des protéines en interaction ne peut pas être surveillée. Cela est toutefois possible avec l’extension du protocole de base avec l’imagerie bioluminescente, bien que la résolution spatiale de ces images soit significativement plus faible par rapport aux approches basées sur la fluorescence.
La méthode présentée est très rapide et efficace (la mesure prend jusqu’à plusieurs minutes et les données sont obtenues à partir de milliers de cellules). Le traitement et l’interprétation des données sont également relativement simples. Peu ou pas d’optimisation du protocole de base est nécessaire. Le seul équipement spécifique requis est un luminomètre. Le test de complémentation de la luciférase fractionnée et le BiFC travaillent sur le même principe essentiel, c’est-à-dire la reconstitution d’une protéine fonctionnelle à partir de ses fragments non fonctionnels. Les avantages généraux des approches basées sur la bioluminescence par rapport à celles basées sur la fluorescence étaient déjà énumérés dans l’introduction. Un avantage spécifique du test de complémentation de la luciférase fractionnée par rapport au BiFC est que le premier est entièrement réversible15. Dans BiFC, une fois qu’une protéine fluorescente est reconstituée, elle ne se dissocie pas en fragments non fluorescents correspondants17. En revanche, l’assemblage des sous-unités NanoLuc est réversible, ce qui crée une occasion unique d’étudier la dynamique des IPP. Enfin, la sensibilité exceptionnelle de la méthode présentée permet de supposer que cette approche devrait fonctionner même avec les lignées cellulaires difficiles à transfecter.
Le protocole présenté ici permet de déterminer si les deux protéines membranaires de type III résidentes de Golgi interagissent. Comme déjà mentionné, la configuration de base de la méthode peut être couplée à l’imagerie par bioluminescence pour confirmer la localisation subcellulaire de l’IPP d’intérêt. La réversibilité de ce test de complémentation de la luciférase fractionnée permet d’étudier la dynamique des IPP en temps réel. Le signal luminescent dérivé de la furimazine est maintenu pendant environ 2 heures. Cependant, des substrats pour le test de complémentation de la luciférase divisée assurant une durée nettement plus longue (heures à jours) du signal résultant sont également disponibles. Cette méthode permet d’identifier les facteurs qui déclenchent ou empêchent l’IPP d’intérêt. Parmi les exemples les plus récents de son application, citons des études sur les interactions entre les protéines G et les récepteurs couplés aux protéines G18, les changements conformationnels des protéines19, l’ubiquitination des protéines20, l’internalisation des récepteurs de surface cellulaire21 et l’identification des facteurs qui modulent les IPP22,23. Par conséquent, cette méthode semble être un outil polyvalent avec un fort potentiel pour atteindre des objectifs expérimentaux même très difficiles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention n° 2016/23/D/NZ3/01314 du Centre national des sciences (NCN), Cracovie, Pologne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al.
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
