Isolering av proksimale væsker for å undersøke tumormikromiljøet i bukspyttkjerteladenokarsinom

Summary

Bukspyttkjerteljuice er en verdifull kilde til biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen. Vi beskriver her en metode for intraoperativ innsamlingsprosedyre. For å overvinne utfordringen med å vedta denne prosedyren i murine modeller, foreslår vi en alternativ prøve, tumor interstitiell væske, og beskriver her to protokoller for isolasjon.

Abstract

Pankreas adenokarsinom (PDAC) er den fjerde ledende årsaken til kreftrelatert død, og snart å bli den andre. Det er et presserende behov for variabler knyttet til spesifikke pankreaspatologier for å hjelpe preoperativ differensialdiagnose og pasientprofilering. Bukspyttkjerteljuice er en relativt uutforsket kroppsvæske, som på grunn av sin nærhet til tumorstedet reflekterer endringer i det omkringliggende vevet. Her beskriver vi i detalj den intraoperative innsamlingsprosedyren. Dessverre er det teknisk svært utfordrende å oversette bukspyttkjerteljuiceinnsamling til murine-modeller av PDAC, for å utføre mekanistiske studier. Tumor interstitiell væske (TIF) er den ekstracellulære væsken, utenfor blod og plasma, som bader tumor og stromale celler. På samme måte som bukspyttkjerteljuice, for sin egenskap å samle og konsentrere molekyler som finnes fortynnet i plasma, kan TIF utnyttes som en indikator på mikromiljøendringer og som en verdifull kilde til sykdomsassosierte biomarkører. Siden TIF ikke er lett tilgjengelig, har ulike teknikker blitt foreslått for isolasjon. Vi beskriver her to enkle og teknisk lite krevende metoder for isolering: vevsentrifugering og vevseluering.

Introduction

Pankreas ductal adenokarsinom (PDAC) er en av de mest aggressive svulstene, og snart å bli den nest største dødsårsaken ^1,2,3. Det er kjent for sitt immunosuppressive mikromiljø og for sin manglende respons på immunterapiprotokoller⁴. For tiden er kirurgisk reseksjon fortsatt det eneste kurative alternativet for PDAC, men det er en høy frekvens av tidlige tilbakefall og postkirurgiske komplikasjoner. Mangelen på spesifikke symptomer til et avansert stadium tillater ikke en tidlig diagnose, noe som bidrar til sykdommens tidsfrister. Videre kan overlappingen av symptomer mellom PDAC og andre godartede pankreaspatologier hindre oppnåelsen av en rask og pålitelig diagnose med dagens diagnostiske strategier. Identifisering av variabler knyttet til spesifikke pankreaspatologier kan lette den kirurgiske beslutningsprosessen og forbedre pasientprofilering.

Lovende resultater i biomarkøroppdagelse er oppnådd ved bruk av lett tilgjengelige kroppsvæsker, som blod ^5,6,7, urin⁸, spytt 9 og bukspyttkjerteljuice^10,11,12. Mange studier har utnyttet omfattende “omics” tilnærminger, for eksempel genomiske, proteomiske og metabolomiske teknikker, for å identifisere kandidatmolekyler eller signaturer som kan diskriminere mellom PDAC og andre godartede pankreasforstyrrelser. Vi har nylig vist at bukspyttkjerteljuice, en relativt uutforsket kroppsvæske, kan brukes til å identifisere metabolske signaturer hos pasienter med forskjellige kliniske profiler¹². Bukspyttkjerteljuice er en proteinrik væske som akkumulerer sekretomet av bukspyttkjertelen og strømmer til hovedpankreaskanalen, og deretter til den viktigste vanlige gallekanalen. På grunn av nærheten til bukspyttkjertelen kan den bli sterkt påvirket av mikromiljøforstyrrelser indusert av tumormassen (figur 1), og derfor mer informativ enn blod eller urin eller vevsbasert profilering. Flere studier har undersøkt potensialet for bukspyttkjerteljuice for å identifisere nye biomarkører av sykdom ved hjelp av ulike tilnærminger, inkludert cytologisk analyse 13, proteomisk analyse utført ved massespektrometri 14,15, vurdering av genetiske og epigenetiske markører som K-ras og p53 mutasjoner 16,17^, endringer i DNA-metylering¹⁸ og miRNA ¹⁹ . Teknisk sett kan bukspyttkjerteljuice samles intraoperativt eller med minimalt invasive prosedyrer, for eksempel endoskopisk ultralyd, retrograd kolangio-pankreatografi, eller ved endoskopisk samling av duodenal juice sekresjon²⁰. Det er ennå ikke klart i hvilken grad sammensetningen av bukspyttkjerteljuice påvirkes av innsamlingsteknikken som brukes. Vi beskriver her den intraoperative innsamlingsprosedyren og viser at bukspyttkjerteljuice kan representere en verdifull kilde for PDAC-biomarkører.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av bukspyttkjerteljuicesamling. (A) Skjematisk fremstilling som viser sekresjonen av bukspyttkjerteljuice i bukspyttkjertelen og dens samling under operasjonen. Innfellingen viser et nærbilde av svulstens mikromiljø: bukspyttkjerteljuice samler molekyler frigjort av tumor- og stromale celler i bukspyttkjertelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Samlingen av bukspyttkjerteljuice i genetiske og ortotopiske musemodeller av PDAC vil bli verdsatt i perspektivet for å utnytte denne biofluiden i prekliniske mekanistiske studier; Imidlertid kan denne prosedyren være teknisk svært utfordrende og er ikke mulig for enklere modeller som subkutane svulster. Av denne grunn identifiserte vi tumor interstitiell væske (TIF) som en alternativ kilde til bukspyttkjerteljuice, for sin lignende egenskap for å fungere som en indikator på omgivende forstyrrelser. Interstitiell væske (IF) er den ekstracellulære væsken, funnet utenfor blod og lymfekar, som bader vevsceller²¹. IF-sammensetningen påvirkes av både blodsirkulasjon til orgelet og lokal sekresjon; Faktisk produserer og utskiller omkringliggende celler aktivt proteiner i IF²¹. Interstitium reflekterer mikromiljøendringer i omkringliggende vev og kan derfor representere en verdifull kilde for biomarkøroppdagelse i flere patologiske sammenhenger, for eksempel svulster. Den høye konsentrasjonen av lokalt utskilte proteiner i TIF kan brukes til å identifisere kandidatmolekyler som skal testes som prognostiske eller diagnostiske biomarkører i plasma^22,23,24. Flere studier har vist at TIF er en egnet prøve for proteomiske tilnærminger med høy gjennomstrømning, for eksempel massespektrometriteknikker 23,24,25^, samt multiplex ELISA-tilnærminger 26 og mikroRNA-profilering ²⁷.

Flere tilnærminger har blitt foreslått for isolering av IF i svulster, som i stor grad kan kategoriseres som in vivo (kapillær ultrafiltrering 28,29,30,31 og mikrodialyse 32,33,34,35) og ex vivo metoder (vevsentrifugering ^22,36,37,38 og vev eluering 39,40,41,42). Disse teknikkene har blitt gjennomgått i omfattende detalj^43,44. Valg av egnet metode bør ta hensyn til blant annet nedstrømsanalyser og anvendelser og gjenværende volum. Vi har nylig brukt denne tilnærmingen som et prinsippbevis for å demonstrere den forskjellige metabolske aktiviteten til svulster fra to murine pankreas adenokarsinomcellelinjer¹². Basert på litteratur ^24,38 valgte vi å bruke lavhastighets sentrifugeringsmetoden for å unngå cellebrudd og fortynning fra intracellulært innhold. Både mengden glukose og laktat i TIF reflekterte de forskjellige glykolytiske egenskapene til de to forskjellige cellelinjene. Her beskriver vi i detalj protokollen for de to mest brukte metodene for isolering av TIF: vevsentrifugering og vevseluering (figur 2).

Figur 2: Skjematisk fremstilling av interstitiell væskeisolasjonsmetode i tumor. Skjematisk illustrasjon av teknikkene beskrevet i detalj i protokollen, nemlig vevsentrifugering (A) og vevseluering (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

For alle pasienter som ble registrert, ble perifert blod og bukspyttkjerteljuice samlet på operasjonstidspunktet i henhold til protokoller godkjent av institusjonens etiske komité. Alle pasientene ble inkludert i studien etter signert informert samtykke, inkludert innsamling av biologiske prøver og kliniske data. Studien ble godkjent av institusjonens etiske komité (protokollnummer ICH-595, godkjenning utstedt i mai 2009). Prosedyrer som involverer mus og deres omsorg ble overholdt EUs og institusjonens retningslinje…

Representative Results

Vi fulgte prosedyren beskrevet ovenfor for å få pancreasjuice fra pasienter med PDAC (n = 31) og andre godartede pankreasplager (ikke-PDAC, n = 9), inkludert pankreatitt (n = 2), papillære ampullatumorer (n = 4), nevroendokrine svulster (n = 2), intraduklær papillær mucinøs neoplasi (IPMN; n = 1) 12. Bukspyttkjerteljuiceprøvene ble deretter utsatt for metabolomisk analyse ved hjelp av kjernemagnetisk resonans (1H-NMR)12. Ved å filtrere de bre…

Discussion

I denne studien har vi beskrevet teknikken for intraoperativt oppsamling av bukspyttkjerteljuice, en stort sett uutforsket væskebiopsi. Vi har nylig vist at bukspyttkjerteljuice kan utnyttes som en kilde til metabolske markører av sykdom¹². Metabolomisk analyse på andre flytende biopsier, som blod ^5,6,7, urin⁸ og spytt^9, har vist lovende resultater i å d…

Materials

1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1