Summary
췌장액은 인간 췌장암에 대한 바이오마커의 귀중한 공급원입니다. 여기서는 수술 중 수집 절차 방법을 설명합니다. 쥐 모델에서 이 절차를 채택하는 문제를 극복하기 위해 대체 샘플인 종양 간질액을 제안하고 여기에서 분리를 위한 두 가지 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
췌장 선암종 (PDAC)은 암 관련 사망의 네 번째 주요 원인이며 곧 두 번째가 될 것입니다. 수술 전 감별 진단 및 환자 프로파일 링을 돕기 위해 특정 췌장 병리와 관련된 변수가 시급히 필요합니다. 췌장액은 상대적으로 탐험되지 않은 체액으로, 종양 부위와 가깝기 때문에 주변 조직의 변화를 반영합니다. 여기에서는 수술 중 수집 절차에 대해 자세히 설명합니다. 불행히도 췌장액 수집을 PDAC의 쥐 모델로 번역하여 기계 론적 연구를 수행하는 것은 기술적으로 매우 어렵습니다. 종양 간질 액 (TIF)은 종양 및 기질 세포를 목욕시키는 혈액 및 혈장 외부의 세포 외액입니다. 췌장액과 유사하게, 혈장에서 희석된 것으로 밝혀진 분자를 수집하고 농축하는 특성 때문에 TIF는 미세환경 변화의 지표 및 질병 관련 바이오마커의 귀중한 공급원으로 활용될 수 있습니다. TIF는 쉽게 접근할 수 없기 때문에, 그 분리를 위해 다양한 기술이 제안되었다. 여기서는 분리를 위한 간단하고 기술적으로 까다로운 두 가지 방법인 조직 원심분리와 조직 용출에 대해 설명합니다.
Introduction
췌장 관 선암 (PDAC)은 가장 공격적인 종양 중 하나이며 곧 두 번째 주요 사망 원인이 될 것입니다 1,2,3. 면역 억제 미세 환경과 면역 요법 프로토콜4에 대한 무반응으로 잘 알려져 있습니다. 현재 외과적 절제술은 여전히 PDAC의 유일한 치료 옵션이지만 조기 재발 및 수술 후 합병증의 빈도가 높습니다. 고급 단계까지 특정 증상이 없으면 조기 진단이 불가능하여 질병의 종말에 기여합니다. 또한, PDAC와 다른 양성 췌장 병리 사이의 증상의 중복은 현재의 진단 전략으로 신속하고 신뢰할 수있는 진단의 달성을 방해 할 수 있습니다. 특정 췌장 병리와 관련된 변수의 식별은 수술 의사 결정 과정을 용이하게하고 환자 프로파일 링을 개선 할 수 있습니다.
바이오마커 발견에서 유망한 결과는 혈액 5,6,7, 소변8, 타액 9 및 췌장액10,11,12와 같이 쉽게 접근할 수 있는 체액을 사용하여 달성되었습니다. 많은 연구에서 PDAC와 다른 양성 췌장 질환을 구별할 수 있는 후보 분자 또는 시그니처를 식별하기 위해 게놈, 단백질체학 및 대사체학 기술과 같은 포괄적인 "오믹스" 접근 방식을 활용했습니다. 우리는 최근에 상대적으로 탐험되지 않은 체액인 췌장액을 사용하여 뚜렷한 임상 프로필을 가진 환자의 대사 시그니처를 식별할 수 있음을 입증했습니다12. 췌장액은 단백질이 풍부한 액체로 췌장 덕트 세포의 분비물을 축적하여 주 췌장 덕트로 흐른 다음 주 담관으로 흐릅니다. 췌장과의 근접성으로 인해 종양 덩어리에 의해 유도 된 미세 환경 섭동 (그림 1)에 크게 영향을받을 수 있으므로 혈액이나 소변 또는 조직 기반 프로파일 링보다 더 유익합니다. 여러 연구에서 세포학적 분석13, 질량분석법14,15에 의해 수행된 단백질체학적 분석, K-ras 및 p53 돌연변이와 같은 유전적 및 후성유전학적 마커의 평가16,17, DNA 메틸화18 및 miRNA의 변화19를 포함한 다양한 접근 방식을 사용하여 질병의 새로운 바이오마커를 식별하는 췌장액의 잠재력을 탐구했습니다. . 기술적으로, 췌장액은 수술 중 또는 내시경 초음파, 역행 담관 - 췌장 조영술과 같은 최소 침습적 절차 또는 십이지장 주스 분비물20의 내시경 수집에 의해 수집 될 수있다. 췌장액 성분이 사용 된 수집 기술에 의해 어느 정도 영향을 받는지는 아직 명확하지 않습니다. 우리는 여기에서 수술 중 수집 절차를 설명하고 췌장액이 PDAC 바이오마커의 귀중한 공급원이 될 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: 췌장액 수집의 개략적 표현. (A) 췌장액이 췌관으로 분비되고 수술 중 수집되는 것을 묘사하는 개략적 표현. 삽입물은 종양 미세 환경의 클로즈업을 보여줍니다 : 췌장액은 췌장 덕트의 종양 및 기질 세포에 의해 방출되는 분자를 수집합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PDAC의 유전 및 동종 마우스 모델에서 췌장액 수집은 전임상 기계 론적 연구에서이 생체 유체를 활용하는 관점에서 높이 평가 될 것이다. 그러나이 절차는 기술적으로 매우 어려울 수 있으며 피하 종양과 같은 단순한 모델에는 적합하지 않습니다. 이러한 이유로 우리는 종양 간질 액 (TIF)을 췌장액의 대체 공급원으로 확인했는데, 이는 주변 섭동의 지표 역할을하는 유사한 특성 때문입니다. 간질 액 (IF)은 혈액 및 림프관 외부에서 발견되는 세포 외 액체이며, 조직 세포(21)를 목욕시킵니다. IF 조성물은 장기로의 혈액 순환과 국소 분비 모두에 의해 영향을받습니다. 사실, 주변 세포는 IF21에서 단백질을 적극적으로 생산하고 분비합니다. 간질은 주변 조직의 미세 환경 변화를 반영하므로 종양과 같은 여러 병리학 적 맥락에서 바이오 마커 발견을위한 귀중한 원천이 될 수 있습니다. TIF에서 국소 분비된 단백질의 고농도는 혈장22,23,24에서 예후 또는 진단적 바이오마커로서 시험될 후보 분자를 확인하는데 사용될 수 있다. 여러 연구에서 TIF가 질량 분석 기술23,24,25, 다중 ELISA 접근법26 및 microRNA 프로파일링 27과 같은 고처리량 단백질체학 접근법에 적합한 샘플임이 입증되었습니다.
종양에서 IF의 분리를 위해 몇 가지 접근법이 제안되었으며, 이는 생체 내 (모세관 한외 여과 28,29,30,31 및 미세 투석 32,33,34,35) 및 생체 외 방법 (조직 원심 분리22,36,37,38 및 조직 용출 39,40,41,42). 이러한 기술은43,44에서 광범위하게 검토되었습니다. 적절한 방법을 선택할 때는 다운스트림 분석 및 애플리케이션과 복구된 볼륨과 같은 문제를 고려해야 합니다. 우리는 최근에 두 개의 쥐 췌장 선암 세포주12에서 종양의 다른 대사 활성을 입증하기 위한 원리 증명으로 이 접근법을 사용했습니다. 문헌24,38에 기초하여, 우리는 세포 내 내용물로 인한 세포 파손 및 희석을 피하기 위해 저속 원심 분리 방법을 사용하기로 결정했습니다. TIF에서 포도당과 락테이트의 양은 모두 두 개의 상이한 세포주의 상이한 해당 특성을 반영하였다. 여기에서는 TIF 분리에 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 방법인 조직 원심분리와 조직 용리에 대한 프로토콜을 자세히 설명합니다(그림 2).
그림 2: 종양 간질액 분리 방법의 개략적 표현. 프로토콜에 상세히 기술된 기술, 즉 조직 원심분리(A) 및 조직 용출(B)의 개략도를 도시한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
등록 된 모든 환자에 대해 말초 혈액과 췌장액은 기관의 윤리위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수술시 수집되었습니다. 모든 환자는 생물학적 표본 및 임상 데이터 수집을 포함하여 사전 동의서에 서명 한 후 연구에 등록되었습니다. 이 연구는 기관의 윤리위원회 (프로토콜 번호 ICH-595, 2009 년 5 월 승인 발행)의 승인을 받았습니다. 마우스와 그 관리와 관련된 절차는 EU 및 기관 지침 (프로토콜 ID 121 / 2016-PR)을 준수했습니다.
1. 췌장액의 분리
참고: 췌장액의 회수는 전문 췌장 외과 의사에 의한 췌장 절제술(예: 췌장 십이지장 절제술, 전체 췌장 절제술, 원위 췌장 절제술)의 공개 절차의 맥락에서 실행됩니다.
- 환자 선택
- 개방 췌장 절제술로 예정된 환자를 절차를 고려하십시오.
- 주 췌관 크기가 췌장액 회수를 허용하기에 충분하다고 판단되는 경우 포함을 확인하십시오. 주 췌관 직경의 최소 한계는 조영제 강화 CT 영상에서 2mm로 간주됩니다.
- 췌장액 검색 계획에 도움이 되는 조영제 CT 영상에서 췌관의 수술 전 연구
- 췌장 목 수준에서 글 랜드 내의 주 췌장 덕트를 3 차원 적으로 국소화하십시오 : 단면 슬라이드의 전방, 상부 및 하부 췌장 마진, 관상 및 시상 렌더링에서 주 췌장 덕트의 거리를 측정합니다. 수술실에 도착하면이 측정 값을 사용하여 Wirsung 덕트를 캐뉼레이션하고 췌장액을 회수하기 위해 췌장을 뚫을 정확한 위치를 근사화하십시오.
- 재료 준비
- 멸균 물질: 25G 바늘 1개와 3mL 주사기 1개의 멸균 봉투를 열고 스크럽 간호사의 협조를 받아 멸균 필드에 배치합니다.
- 멸균되지 않은 물질: 유체 보관을 위해 수술실에 3mL K2EDTA 진공 시험관을 준비하십시오.
- 환자의 준비
- 환자를 수술실 침대에 놓습니다. 레미 펜타닐, 세보 란 및 로쿠로 늄을 사용하여 혼합 전신 마취를 유도 한 다음 삽관하고 환자 환기를 시작하십시오. 환자를 앙와위 욕창에 놓고 오른팔을 몸에 집어넣고 왼팔을 90°까지 납치하여 암보드에 고정합니다.
- 절개 부위에서 복부의 피부를 소독하십시오. 환자를 드레이핑하는 복부에 멸균 장을 만들고 유지하십시오.
- 수술
- 늑골 하 절개를 수행하고 복강에 접근하십시오. 장기 노출을 위해 Rochard 복부 수축을 배치합니다.
- Kocher 기동, 위 인대 개방, 췌장의 상하 경계를 따라 후 복막 조직을 절개하여 췌장 목과 후방에 위치한 상 장간막 정맥 사이에 해부 평면을 만드는 췌장을 노출하고 동원합니다.
- 췌장이 동원되고 노출되면 췌장 목을 절개하기 전에 췌장액 금단을 진행하십시오.
- 췌장 덕트의 식별 및 위치 파악
- 영상에서 측정한 값을 사용하여 췌관의 위치를 추정한 다음 췌장의 앞쪽 표면을 촉지하여 정확한 위치를 식별합니다.
- 췌장액 수집
- 췌장 머리와 십이지장을 아래에서 잡고 왼손으로 들어 올려 췌관의 위치를 첫 번째 숫자로 표시하십시오.
- 3G 바늘이 장착된 상태에서 25mL 주사기의 오른손으로 잡습니다.
- 오른손을 사용하여 왼쪽 엄지 손가락 바로 말단의 췌장에 바늘을 삽입하십시오. 수술 전 측정과 덕트 벽을 관통했다는 인식을 기반으로 바늘의 침투 깊이와 경사도를 결정하십시오.
- 주사기로 주스를 빼냅니다. 주스를 회수 할 수없는 경우 췌관을 캐뉼레이션하기 위해 바늘을 네 방향으로 재배치하십시오.
- 췌장액이 회수되면 멸균 필드 외부로 옮겨 3mL K2EDTA 진공 시험관으로 옮깁니다. 샘플이 실험실로 옮겨질 때까지 4°C를 유지하고 가능한 한 빨리 추가 처리를 진행합니다.
알림: 이 절차로 회수할 수 있는 췌장액의 양은 경험상 약 0.2mL에서 3mL까지 매우 다양합니다. 회수되는 주스의 양은 환자에 따라 크게 달라집니다 : Wirsung 덕트의 크기와 췌장의 기능 상태 (기능 대 위축선). 우리의 경험상 검색되는 췌장액의 양을 늘리는 데 사용할 수있는 편의는 없습니다.
2. 췌장액 가공
- 췌장액을 400 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포나 파편을 제거합니다.
알림: 췌장액은 원심 분리 전에 투명하고 투명해야합니다. 수술 중 혈액 오염이 때때로 발생하여 샘플이 더 어둡고 붉게 보일 수 있습니다. 이러한 샘플을 추가 분석에서 제외하는 것이 좋습니다. - 상청액을 회수하고, 분취량을 추가 분석할 때까지 -80°C에서 저장한다.
3. 피하 종양의 유도
참고: 뮤린 Panc02 및 DT6606 세포주는앞서 설명한 바와 같이 각각 로렌조 피에몬티 교수(이탈리아 밀라노 산 라파엘레 당뇨병 연구소) 및 프란체스코 노벨리 교수(이탈리아 토리노의 실험 연구 및 의학 연구 센터)로부터 수득하였다.
- 종양 세포의 성장
- 10% 태아 소 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제를 포함하는 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지에서 Panc02 및 DT6606 세포를 배양합니다.
- 종양 주입 1-2주 전에 동결된 세포를 해동하고, 세포주의 성장 속도에 따라.
- 멸균 조건에서 5%CO2 및 95% 습도로 37°C에서 세포를 성장시킨다.
- 0.025% 트립신/EDTA 용액으로 세포를 분리하여 80% 컨플루언시에 도달하면 37°C에서 5분 동안 분리하고 원심분리로 트립신을 제거합니다.
참고: DT6606은 LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre 마우스에서 파생된 불멸화되지 않은 기본 세포이며 원래 특성을 유지하기 위해 생체 내 주사 전에 3회 이상 계대배양해서는 안 됩니다. 주사 7-10 일 전에 DT6606 세포를 해동하는 것이 좋습니다.
- 생체 내 종양 세포 주입
- 세포를 트립신 화하고 (3.1.4 단계 참조) 인산염 완충 식염수 (PBS)로 한 번 세척하십시오. 원심분리로 PBS를 제거하고 계수하기 전에 새로운 PBS에 세포를 재현탁합니다.
- 세포를 세고 0.5-1 x 10 6cells/100 μL의 최종 농도가 되도록 PBS에 0.5-1 x 107 cells/mL의 농도로 재현탁시켜 각 마우스에 주입합니다. 세포를 과도하게 준비하십시오. 절차가 끝날 때까지 세포를 4 ° C 또는 얼음 위에 보관하십시오.
- 동물(8주령 암컷 C57BL/6J 마우스)을 다른 세포주 또는 처리에 따라 다른 케이지에 그룹화합니다.
- 동물을 수동으로 제지하고 케타민 (80 mg / kg)과 자일 라진 (10 mg / kg)의 혼합물을 사용하거나 현지에서 승인 된 절차에 따라 마취하십시오.
- 전기 면도기로 주사 부위 (일반적으로 다리 위의 측면)를 면도하고 알코올로 주사 부위를 조심스럽게 청소하십시오.
- 1mL 주사기로 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하고 피스톤을 위아래로 움직여 기포를 제거합니다. 25G 바늘을 주사기에 부착하고 세포 현탁액이 바늘 구멍에 도달할 때까지 피스톤을 위쪽으로 밉니다.
- 평평한 끝 집게로 옆구리의 피부를 꼬집고 복강이나 근육계에 구멍을 뚫지 않고 집게 사이의 피부 주름 바닥에 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 바늘의 올바른 위치를 확인하려면 바늘 끝을 피부 아래로 옆으로 부드럽게 움직여보십시오. 바늘은 자유롭게 움직여야합니다.
- 100μL의 세포 현탁액 (0.5-1 x 106 세포 포함)을 천천히 주입하고 주사 부위를 몇 초 동안 부드럽게 고정하고 옆으로 움직이지 않고 바늘을 천천히 빼냅니다.
- 마우스를 케이지로 되돌리고 마취 후 회복을 모니터링하십시오.
- 3-4 주 동안 캘리퍼스를 사용하여 종양 성장을 확인하십시오. 종양이CO2를 사용하여 또는 국부적으로 승인된 절차에 따라 대략 0.5-1cm3에 도달할 때 동물을 안락사시킨다.
4. 종양 간질 액 (TIF)의 분리
- 피하 종양의 절제
- 종이 테이프로 동물의 팔다리를 막고 알코올로 피부를 닦으십시오. 복막에서 피부를 분리하고 팔다리까지 가기 위해 복부에서 피부를 잘라냅니다. 가위, 클램프 및 결국 메스의 도움으로 옆구리의 피부 아래에서 자란 종양을 절제하십시오.
- 종양의 무게를 측정하고 TIF가 분리 될 때까지 얼음 위의 깨끗한 튜브에 보관하십시오.
- 원심분리에 의한 TIF의 분리
- 종양을 반으로 자르고 PBS로 두 부분을 빠르게 헹구고 여과지로 부드럽게 닦아 과도한 PBS를 제거합니다. 종양에서 증발을 피하기 위해 가능한 한 빨리이 단계를 수행하십시오.
- 종양을 50mL 원추형 튜브 위에 부착된 20μm 나일론 세포 여과기로 즉시 옮깁니다.
- 튜브를 400 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
참고: 이 저속 원심분리는 세포 내 구획에 의한 TIF의 오염을 방지하는 세포 무결성을 보존합니다. 세포내 함량 누출은 예를 들어 리보솜 단백질25와 같은 세포내 하우스키핑 단백질의 존재를 평가함으로써 다운스트림 용도에서 시험될 수 있다. - 튜브 바닥에서 TIF를 회수하고, 최종적으로 분취하고, 즉시 드라이 아이스에서 동결시키고 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 보관합니다.
선택 사항: 수행할 다운스트림 단백질체학 분석에 기초하여, 특정 분자의 분해를 피하기 위해 프로테아제 억제제 칵테일로 PBS에서 샘플을 희석한다.
참고: 종양의 구성에 따라 어떤 경우에는 매우 작은 종양이 체액을 생성하지 않습니다.
- 용리에 의한 TIF의 분리
- 가위 또는 메스로 종양을 작은 조각 (≈1-3 mm3)으로 자르고 차가운 PBS로 조심스럽게 헹굽니다.
알림: 이 단계에서는 셀 손상을 방지하기 위해 빠르게 작업하고 최소한의 조작을 수행하는 것이 매우 중요합니다. - 종양 조각을 1.5mL 튜브로 옮기고 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 500μL의 PBS를 추가하여 분석물의 분해를 방지합니다. 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 상청액을 회수하여 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 5분 동안 1,000 x g 로 원심분리하여 샘플에서 세포를 제거합니다.
- 상청액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 8분 동안 2,000 x g 에서 다시 원심분리합니다.
- 상청액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 로 다시 원심분리하여 이물질을 제거합니다. 상청액을 회수하십시오. TIF 샘플을 즉시 분취하고, 드라이아이스 상에서 동결시키고, 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 저장한다.
- 가위 또는 메스로 종양을 작은 조각 (≈1-3 mm3)으로 자르고 차가운 PBS로 조심스럽게 헹굽니다.
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Representative Results
우리는 췌장염 (n = 2), 유두-팽대 종양 (n = 4), 신경 내분비 종양 (n = 2), 관 내 유두 점액 성 신 생물 (IPMN; n = 1) 12를 포함한 PDAC (n = 31) 및 기타 양성 췌장 질환 (비 PDAC, n = 9) 환자로부터 췌장액을 얻기 위해 위에서 설명한 절차를 따랐다. 그런 다음 췌장액 샘플을 핵자기 공명(1H-NMR)12을 사용하여 대사체 분석을 수행했습니다. 거대분자(예: 지단백질, 지질 등)의 광범위한 NMR 신호를 필터링하여 1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG) 스펙트럼(그림 3A)에서 볼 수 있듯이 작은 분자량 대사산물을 자세히 이해할 수 있었습니다. 감독 OPLS-DA 분석은 췌장액에서 검출 된 대사 프로파일이 교차 검증에 의해 얻어진 82.4 %의 정확도로 PDAC와 비 PDAC 환자를 구별 할 수 있음을 보여 주었다 (그림 3B). 흥미롭게도 동일한 환자의 혈장 샘플에 대해 수행된 대사체학 분석은 동일한 판별력(교차 검증으로 얻은 정확도 75.2%)을 산출하지 못했습니다(그림 3C). 이러한 결과는 췌장액이 단백질이 풍부한 샘플이며 포괄적인 "오믹스" 분석에 적합하다는 것을 나타냅니다. 또한, 혈장에 비해 췌장액의 우수한 판별력은 종양 부위에 더 가까운 샘플로 "업스트림"을 이동하는 것이 다른 췌장 질환에서 PDAC를 선별하는 데 도움이 되는 바이오마커를 식별하는 성공적인 전략이 될 수 있음을 시사합니다.
그림 3: 췌장액과 혈장의 대사체 함량. (A) 췌장액에 포함된 소분자량 대사산물에 대한 세부 정보를 보여주는 PDAC(n=31, 파란색) 및 비-PDAC 샘플(n=9, 녹색)의 1H-NMR CPMG 스펙트럼. ppm, 백만분율. (B) 췌장액 PDAC 샘플 (파란색 원) 및 비 PDAC 샘플 (보라색 삼각형)의 CPMG 스펙트럼에 대한 감독 된 다변량 OPLS-DA 분석 점수. 이 분석은 두 그룹(각각 스파이더 플롯으로 윤곽이 그려진 그룹)을 분리하며, 교차 검증을 통해 얻은 정확도는 82.4%입니다. (C) 혈장 PDAC 샘플 (n = 22, 파란색 원) 및 비 PDAC 샘플 (n = 7, 보라색 삼각형)의 1D-NOESY 스펙트럼에 대한 감독 된 다변량 OPLS-DA 분석 점수. 교차 검증으로 얻은 75.2%의 정확도. 이 수치는 Cortese et al.12에서 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
TIF 함량이 종양 미세 환경의 변화를 안정적으로 반영한다는 것을 입증하기 위해 위에서 설명한 프로토콜에 따라 반대 당분해 속도인 Panc02(고도 해당 작용) 및 DT6606(낮은 해당 작용)을 가진 두 개의 췌장암 세포주를 피하 주사했습니다. 그런 다음 위에서 설명한 저속 원심분리 방법을 사용하여 절제된 종양에서 TIF를 분리했습니다(단락 4.2 참조). 0.25-1 g 사이의 체중의 종양에서 5-15 μL의 TIF를 회수 한 다음 포도당과 젖산염의 농도를 정량화하는 데 사용했습니다. 고도로 당질성 종양의 TIF는 낮은 당분해성 종양에 비해 포도당이 적고 젖산염이 더 많았습니다(그림 4). 이 데이터는 TIF가 종양 유래 대사 산물의 공급원으로 사용될 수 있으며 종양 자체에 따라 변화한다는 것을 보여줍니다.
그림 4: TIF의 포도당 및 젖산 함량은 내인성 종양 특징을 반영합니다. (A) Panc02 (고도의 해당 작용, A에서 n = 10, B에서 n = 9) 및 DT6606 (낮은 해당 작용, A에서 n = 5, B에서 n = 4)에서 조직 원심 분리 방법을 사용하여 분리 된 간질 액의 포도당 및 (B) 젖산 농도) 피하 이식 된 종양. 상자 그림은 상자에 의해 중앙값, 하위 사분위수 및 상위 사분위수를 제공하고 수염에 의해 최소값과 최대값을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리는 대부분 탐험되지 않은 유체 생검 인 췌장액을 수술 중 수집하는 기술을 설명했습니다. 우리는 최근에 췌장액이 질병12의 대사 마커의 원천으로 이용 될 수 있음을 보여주었습니다. 혈액 5,6,7, 소변8 및 타액9와 같은 다른 액체 생검에 대한 대사체 분석은 PDAC와 건강한 피험자 또는 췌장염을 구별하는 데 유망한 결과를 보여주었습니다. 그러나 췌장액은 췌장 유관 세포에 의해 직접 분비되며 종양 부위와 가깝기 때문에 질병의 초기 단계에서도 주변 조직의 변화에 대한보다 신뢰할 수있는 지표가 될 수 있습니다. 사실, 췌장액의 H-NMR 스펙트럼 데이터는 PDAC 환자와 다른 양성 췌장 질환 사이의 차별을 달성한 반면, 혈장 샘플은 그렇지 않았습니다. 따라서 다른 체액 생검보다 접근하기 어렵지만 췌장액은 임상 바이오마커의 귀중한 공급원이며 빠르게 진화하는 질병을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 여기에서 췌장액 수집을위한 수술 중 기술을 설명했습니다. 그러나 질병의 귀중한 초기 마커를 식별하는 관점에서 최소 침습적 절차 중에 수행 될 수도 있습니다. 다른 수집 절차가 췌장액의 단백질체 구성에 영향을 미치는지 여부는 확인되어야합니다.
다른 유체 생검은 PDAC 뮤린 모델에서 쉽게 접근 할 수있는 반면, 생체 내 췌장액 수집은 유전 적 또는 동종 모델을 고려하면 매우 어려울 수 있으며 피하 모델에서는 전혀 불가능합니다. 따라서이 논문에서 우리는 가치 있고 널리 적용 가능한 대안으로 종양 간질 액의 사용을 제안했습니다. 사실, 간질 액 구성은 췌장액과 유사하게 국소 환경의 변화에 직접적인 영향을받습니다. 간세포 45,46, 신장 세포 41, 난소 22,47,48 및 유방42,49 암종과 같은 다양한 종양의 TIF에 대한 단백질체 프로파일링은 후보 바이오마커에 대한 연구에서 고무적인 결과를 보여주었습니다. 그러나 식별된 후보 단백질에는 거의 중복이 없으며, 이는 수행된 다운스트림 분석 및 데이터 수집과 함께 TIF를 분리하는 데 사용되는 접근 방식이 검출된 분석물에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 여기에 기술된 두 가지 TIF 분리 방법인 원심분리 및 용리를 비교하는 편평 세포 암종에 대한 최근 연구에서는 원심분리가 더 높은 함량의 세포외 단백질을 생성했지만 사용된 방법과 독립적으로 TIF 조성의 강한 일관성이 관찰되었습니다25.
TIF의 분리, 조직 원심분리 및 조직 용리를 위해 여기에 설명된 두 가지 방법 모두 기술적으로 까다롭지 않고 빠르며 기본적인 실험실 장비만 필요하다는 장점이 있습니다. 미세 투석 및 모세관 한외여과와 같은 다른 접근 방식과 비교할 때, 원심분리 및 용리 기술은 생체 외에서만 실현 가능하다는 본질적인 한계를 가지고 있습니다. 실험의 분석 목적, 부피 회복 및 세포 파손과 같은 적절한 방법을 선택할 때 몇 가지 문제를 고려하는 것이 중요합니다. 종양의 조성은 회복 된 TIF의 부피에 영향을 줄 수 있으므로 고려해야합니다. 조직 원심 분리는 원래 각막38과 같은 세포가 부족하고 콜라겐이 풍부한 조직을 위해 개발되었습니다. 반면에 종양은 일반적으로 높은 세포성과 풍부한 혈관 형성을 특징으로하는 조직이며, 두 가지 특징 모두 수력 전도도를 증가시켜 원심 분리에 의한 TIF의 분리를 용이하게해야합니다. 그러나, PDAC를 포함하는 일부 종양은 조직 내에 거대분자를 보유하는 경향이 있는 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질이 풍부한 풍부한 기질 또는 섬유성 성분을 함유한다(21).
한편, 조직 용출은 조직으로부터 용출액으로의 단백질의 수동적 확산에 기초하여, 매우 다양한 종양에 대해 성공적으로 이용되어 왔다(43). 용출은 더 큰 부피의 회수를 허용하지만 단백질은 희석됩니다. 이러한 이유로 조직 용출은 매우 낮은 존재비를 가진 분자에 적합하지 않을 수 있습니다. 더욱이, 용출은 종양의 더 큰 정도의 조작을 필요로하며, 아마도 TIF에서 세포 내 내용물 누출을 초래할 수있다. 이것은 바이오마커 발견과 관련이 없을 수 있지만 목표가 단백질의 국소 생산을 결정하는 것이라면 편향을 유발할 수 있습니다. 세포 파괴의 양은 종양 유형에 따라 가장 적절한 방법을 선택하기 위해 다운스트림 응용 분야에서 테스트해야 합니다. 이는 예를 들어 TIF25에서 리보솜 단백질과 같은 하우스키핑 단백질의 존재를 테스트하여 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 또 다른 제안 된 접근법은 TIF 및 혈장에서 크레아티닌 또는 Na와 같은 선택된 세포 외 물질의 농도를 비교하는 것입니다22. 원심 분리 방법에 대해서도 세포 내 내용물 누출을 고려해야합니다. 사실, 종양 구성의 차이로 인해 세포 파괴를 피하기 위해 "저속"으로 간주되어야하는 것에 대한 일반적인 합의는 아직 없습니다. 우리는 g 힘 <42438에 대해 세포 내 내용물로부터의 희석이 발생하지 않는 것으로 나타 났기 때문에 400 x g 속도를 사용하기로 결정했습니다.
접근 방식에 관계없이 TIF는 종양 미세 환경을 샘플링하는 데 유용하고 널리 적용 가능한 공급원입니다. 우리는 그것이 종양 내재적 특징을 요약하고 질병 또는 치료 표적의 바이오마커를 식별하는 데 유용할 수 있음을 보여주었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
기술 지원에 대해 Roberta Migliore에게 감사드립니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 IG2016-ID.18443 프로젝트 – P.I. Marchesi Federica에 따라 Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC)로부터 자금을 지원 받았습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
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