Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Aislamiento de líquidos proximales para investigar el microambiente tumoral del adenocarcinoma pancreático

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61687
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,3, 4,5,6, 1,3, 2,7, 2
1Section of Pancreatic Surgery, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 2Department of Immunology and Inflammation, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 3Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, 4Giotto Biotech S.R.L., 5Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, 6National Phenome Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Imperial College London, 7Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan
* These authors contributed equally

Summary

El jugo pancreático es una fuente preciosa de biomarcadores para el cáncer de páncreas humano. Describimos aquí un método para el procedimiento de recolección intraoperatoria. Para superar el desafío de adoptar este procedimiento en modelos murinos, sugerimos una muestra alternativa, el líquido intersticial tumoral, y describimos aquí dos protocolos para su aislamiento.

Abstract

El adenocarcinoma pancreático (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer, y pronto se convertirá en la segunda. Existe una necesidad urgente de variables asociadas a patologías pancreáticas específicas para ayudar al diagnóstico diferencial preoperatorio y al perfil del paciente. El jugo pancreático es un fluido corporal relativamente inexplorado que, debido a su proximidad al sitio del tumor, refleja cambios en el tejido circundante. Aquí describimos en detalle el procedimiento de recolección intraoperatoria. Desafortunadamente, traducir la recolección de jugo pancreático a modelos murinos de PDAC, para realizar estudios mecanicistas, es técnicamente muy desafiante. El líquido intersticial tumoral (TIF) es el líquido extracelular, fuera de la sangre y el plasma, que baña las células tumorales y del estroma. Al igual que el jugo pancreático, por su propiedad de recolectar y concentrar moléculas que se encuentran diluidas en plasma, TIF puede ser explotado como un indicador de alteraciones microambientales y como una valiosa fuente de biomarcadores asociados a enfermedades. Dado que TIF no es fácilmente accesible, se han propuesto varias técnicas para su aislamiento. Describimos aquí dos métodos simples y técnicamente poco exigentes para su aislamiento: centrifugación tisular y elución tisular.

Introduction

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es uno de los tumores más agresivos y pronto se convertirá en la segunda causa de muerte 1,2,3. Es bien conocido por su microambiente inmunosupresor y por su falta de respuesta a los protocolos de inmunoterapia4. Actualmente, la resección quirúrgica sigue siendo la única opción curativa para el PDAC, sin embargo, hay una alta frecuencia de recaídas tempranas y complicaciones posquirúrgicas. La falta de síntomas específicos hasta una etapa avanzada no permite un diagnóstico precoz, contribuyendo a la caducidad de la enfermedad. Además, la superposición de síntomas entre PDAC y otras patologías pancreáticas benignas puede dificultar el logro de un diagnóstico rápido y confiable con las estrategias diagnósticas actuales. La identificación de variables asociadas a patologías pancreáticas específicas podría facilitar la toma de decisiones quirúrgicas y mejorar el perfil del paciente.

Se han logrado resultados prometedores en el descubrimiento de biomarcadores utilizando fluidos corporales de fácil acceso, como sangre 5,6,7, orina8, saliva 9 y jugo pancreático10,11,12. Muchos estudios han explotado enfoques integrales de "ómicas", como técnicas genómicas, proteómicas y metabolómicas, para identificar moléculas candidatas o firmas que podrían discriminar entre PDAC y otras afecciones pancreáticas benignas. Recientemente demostramos que el jugo pancreático, un fluido corporal relativamente inexplorado, puede ser utilizado para identificar firmas metabólicas de pacientes con perfiles clínicos distintos12. El jugo pancreático es un líquido rico en proteínas, que acumula el secretoma de las células ductales pancreáticas y fluye hacia el conducto pancreático principal, y luego hacia el conducto biliar común principal. Debido a su proximidad al páncreas, podría verse fuertemente afectado por perturbaciones microambientales inducidas por la masa tumoral (Figura 1) y, por lo tanto, más informativo que la sangre o la orina, o el perfil basado en tejidos. Varios estudios han explorado el potencial del jugo pancreático para identificar nuevos biomarcadores de enfermedad utilizando diversos enfoques, incluyendo el análisis citológico 13, el análisis proteómico realizado por espectrometría de masas 14,15, la evaluación de marcadores genéticos y epigenéticos como las mutaciones K-ras y p53 16,17, alteraciones en la metilación del ADN 18 y miRNAs 19 . Técnicamente, el jugo pancreático puede ser recolectado intraoperatoriamente o con procedimientos mínimamente invasivos, como ultrasonido endoscópico, colangiopancreatografía retrógrada o por recolección endoscópica de secreción de jugo duodenal20. Todavía no está claro en qué medida la composición del jugo pancreático se ve afectada por la técnica de recolección utilizada. Describimos aquí el procedimiento de recolección intraoperatoria y mostramos que el jugo pancreático puede representar una fuente valiosa de biomarcadores PDAC.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática de la recolección de jugo pancreático. (A) Representación esquemática que representa la secreción de jugo pancreático en el conducto pancreático y su recolección durante la cirugía. El recuadro muestra un primer plano del microambiente tumoral: el jugo pancreático recoge moléculas liberadas por las células tumorales y estromales en los conductos pancreáticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La recolección de jugo pancreático en modelos genéticos y ortotópicos de ratón de PDAC sería apreciada en la perspectiva de explotar este biofluido en estudios mecanicistas preclínicos; Sin embargo, este procedimiento puede ser técnicamente muy desafiante y no es factible para modelos más simples, como los tumores subcutáneos. Por esta razón, identificamos el líquido intersticial tumoral (TIF) como una fuente alternativa al jugo pancreático, por su característica similar de actuar como un indicador de perturbaciones circundantes. El líquido intersticial (IF) es el líquido extracelular, que se encuentra fuera de los vasos sanguíneos y linfáticos, que baña las células tisulares21. La composición del FI se ve afectada tanto por la circulación sanguínea al órgano como por la secreción local; de hecho, las células circundantes producen y secretan activamente proteínas en el IF21. El intersticio refleja los cambios microambientales de los tejidos circundantes y, por lo tanto, podría representar una fuente valiosa para el descubrimiento de biomarcadores en varios contextos patológicos, como los tumores. La alta concentración de proteínas secretadas localmente en TIF puede ser utilizada para identificar moléculas candidatas para ser probadas como biomarcadores pronósticos o diagnósticos en plasma22,23,24. Varios estudios han demostrado que TIF es una muestra adecuada para enfoques proteómicos de alto rendimiento, como las técnicas de espectrometría de masas 23,24,25, así como los enfoques ELISA multiplex 26 y el perfil de microARN 27.

Se han propuesto varios enfoques para el aislamiento del AI en tumores, que pueden clasificarse ampliamente como in vivo (ultrafiltración capilar 28,29,30,31 y microdiálisis 32,33,34,35) y métodos ex vivo (centrifugación tisular 22,36,37,38 y elución tisular 39,40,41,42). Estas técnicas han sido revisadas con gran detalle43,44. La elección del método adecuado debe tener en cuenta cuestiones como los análisis y aplicaciones posteriores y el volumen recuperado. Recientemente utilizamos este enfoque como prueba de principio para demostrar la diferente actividad metabólica de los tumores de dos líneas celulares murinas de adenocarcinoma pancreático12. Con base en la literatura24,38, optamos por utilizar el método de centrifugación de baja velocidad para evitar la rotura celular y la dilución del contenido intracelular. Tanto la cantidad de glucosa como de lactato en TIF reflejaban las diferentes características glucolíticas de las dos líneas celulares diferentes. Aquí describimos en detalle el protocolo para los dos métodos más utilizados para el aislamiento de TIF: centrifugación tisular y elución tisular (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática de los métodos de aislamiento del líquido intersticial tumoral. Ilustración esquemática de las técnicas descritas en detalle en el protocolo, a saber, centrifugación tisular (A) y elución tisular (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Para todos los pacientes inscritos, se recolectó sangre periférica y jugo pancreático en el momento de la cirugía de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Institución. Todos los pacientes se inscribieron en el estudio después de firmar el consentimiento informado, incluida la recolección de muestras biológicas y datos clínicos. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Institución (protocolo número ICH-595, aprobación emitida en mayo de 2009). Los procedimientos con ratones y su cuidado se ajustaron a las Directrices institucionales y de la UE (protocolo ID 121/2016-PR).

1. Aislamiento del jugo pancreático

NOTA: La extracción de jugo pancreático se ejecuta en el contexto de un procedimiento abierto de resección pancreática (por ejemplo, pancreaticoduodenectomía, pancreatectomía total, pancreatectomía distal) por un equipo de cirujanos pancreáticos expertos.

  1. Selección de pacientes
    1. Considere para el procedimiento a cualquier paciente programado para una resección pancreática abierta.
    2. Confirme la inclusión si el tamaño del conducto pancreático principal se considera suficiente para permitir la recuperación del jugo pancreático. El límite mínimo en el diámetro del conducto pancreático principal se considera 2 mm en la tomografía computarizada con contraste.
  2. Estudio preoperatorio del conducto pancreático en imágenes por TC con contraste para ayudar a la planificación de la recuperación del jugo pancreático
    1. Localiza tridimensionalmente el conducto pancreático principal dentro de la glándula a nivel del cuello pancreático: mide la distancia del conducto pancreático principal desde el margen pancreático anterior, superior e inferior en portaobjetos transversales y representaciones coronales y sagitales. Una vez en el quirófano, utilice estas medidas para aproximarse al lugar correcto donde perforar el páncreas para canular el conducto de Wirsung y recuperar el jugo pancreático.
  3. Preparación del material
    1. Material estéril: Abra el sobre estéril de una aguja de 25 g y una jeringa de 3 ml, y colóquelos en el campo estéril con la cooperación de la enfermera de limpieza.
    2. Material no estéril: Mantenga un tubo de ensayo de vacío K2EDTA de 3 ml listo a mano en el quirófano para el almacenamiento del líquido.
  4. Preparación del paciente
    1. Coloque al paciente en la cama del quirófano. Inducir anestesia general mixta, usando Remifentanilo, Sevorane y Rocuronium, luego intubar y comenzar a ventilar al paciente. Coloque al paciente en decúbito supino con el brazo derecho pegado al cuerpo y el brazo izquierdo abducido a 90° grados asegurado en un zócalo.
    2. Desinfecte la piel del abdomen en el sitio de la incisión. Crear y mantener un campo estéril en el abdomen que cubre al paciente.
  5. Procedimiento quirúrgico
    1. Realice una incisión subcostal y obtenga acceso a la cavidad abdominal. Coloque una retracción abdominal de Rochard para la exposición de órganos.
    2. Exponer y movilizar el páncreas a través de la maniobra de Kocher, apertura del ligamento gastrocólico, incisión del tejido retroperitoneal a lo largo del borde superior e inferior del páncreas creando un plano de disección entre el cuello pancreático y la vena mesentérica superior ubicada posteriormente.
    3. Una vez que el páncreas está movilizado y expuesto, proceda a la retirada del jugo pancreático antes de seccionar el cuello pancreático.
  6. Identificación y localización del conducto pancreático
    1. Estimar la ubicación del conducto pancreático utilizando la medición tomada en la imagen y luego palpar la superficie anterior del páncreas para identificar su ubicación precisa.
  7. Recolección de jugo pancreático
    1. Sostenga la cabeza pancreática y el duodeno desde abajo y levántelo con la mano izquierda, marcando la ubicación del conducto pancreático con el primer dígito.
    2. Sujetar con la mano derecha la jeringa de 3 ml con la aguja de 25 G montada.
    3. Use la mano derecha para insertar la aguja en el páncreas justo distal al pulgar izquierdo. Decidir la profundidad de penetración y el grado de inclinación de la aguja en función de las mediciones preoperatorias y de la percepción de haber penetrado la pared del conducto.
    4. Retire el jugo con la jeringa. Si no es posible recuperar el jugo, reubique la aguja en las cuatro direcciones tratando de canular el conducto pancreático.
    5. Una vez que se recupere el jugo pancreático, muévalo fuera del campo estéril y transfiéralo al tubo de ensayo de vacío K2EDTA de 3 ml. Conservar a 4 °C hasta que la muestra se transfiera al laboratorio y proceder a su posterior procesamiento lo antes posible.
      NOTA: El volumen de jugo pancreático que se puede recuperar con este procedimiento varía mucho, oscilando aproximadamente de 0.2 ml a 3 ml en nuestra experiencia. La cantidad de jugo recuperado depende en gran medida del paciente: la dimensión del conducto de Wirsung y el estado funcional del páncreas (funcionamiento versus glándula atrófica). En nuestra experiencia, no hay ningún recurso que pueda usarse para aumentar la cantidad de jugo pancreático recuperado.

2. Procesamiento del jugo pancreático

  1. Centrifugar el jugo pancreático a 400 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar cualquier célula o residuo.
    NOTA: El jugo pancreático debe ser de color claro y transparente antes de la centrifugación. La contaminación de la sangre durante la cirugía a veces puede ocurrir, haciendo que la muestra parezca más turbia y de color más rojo. Considere excluir tales muestras de análisis adicionales.
  2. Recuperar el sobrenadante, la alícuota y almacenar a -80 °C hasta nuevos análisis.

3. Inducción de tumores subcutáneos

NOTA: Las líneas celulares murinas Panc02 y DT6606 se obtuvieron del Prof. Lorenzo Piemonti (Instituto de Diabetes San Raffaele, Milán, Italia) y del Prof. Francesco Novelli (Centro de Investigación Experimental y Estudios Médicos, Turín, Italia) respectivamente, como se describió anteriormente12.

  1. Crecimiento de células tumorales
    1. Cultivo de células Panc02 y DT6606 en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 2mM L-glutamina y 1% de antibiótico penicilina-estreptomicina.
    2. Descongelar las células congeladas 1-2 semanas antes de la inyección del tumor, de acuerdo con la tasa de crecimiento de la línea celular.
    3. Cultivar células a 37 °C con 5% deCO2 y 95% de humedad en condiciones estériles.
    4. Separar las células con solución de tripsina/EDTA al 0,025% durante 5 min a 37 °C cuando alcancen el 80% de confluencia y eliminar la tripsina por centrifugación.
      NOTA: DT6606 son células primarias, no inmortalizadas, derivadas del ratón LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, y no deben pasarse más de 3 veces antes de la inyección in vivo para mantener sus características originales. Se recomienda descongelar las células DT6606 7-10 días antes de la inyección.
  2. Inyección de células tumorales in vivo
    1. Tripsinizar las células (ver paso 3.1.4) y lavarlas una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Elimine el PBS por centrifugación y resuspenda las células en PBS fresco antes de contar.
    2. Contar las células y resuspenderlas en PBS a una concentración de 0.5-1 x 107 células/mL para tener una concentración final de 0.5-1 x 106 células/100 μL para inyectar en cada ratón. Preparar las células en exceso. Mantener las celdas a 4 °C o en hielo hasta el final del procedimiento.
    3. Agrupar los animales (ratones hembra C57BL/6J de 8 semanas de edad) en diferentes jaulas según diferentes líneas celulares o tratamientos.
    4. Sujetar a los animales manualmente y anestesiarlos usando una mezcla de ketamina (80 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) o de acuerdo con procedimientos aprobados localmente.
    5. Afeite el sitio de inyección, generalmente un flanco por encima de una pierna, con una afeitadora eléctrica y limpie cuidadosamente el sitio de inyección con alcohol.
    6. Pipetear hacia arriba y hacia abajo la suspensión celular con una jeringa de 1 ml, eliminando cualquier burbuja de aire moviendo el pistón hacia arriba y hacia abajo. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa y empuje el pistón hacia arriba hasta que la suspensión celular llegue a la abertura de la aguja.
    7. Pellizque la piel del flanco con pinzas de punta plana e inserte cuidadosamente la aguja en la base del pliegue de la piel entre las pinzas sin perforar la cavidad peritoneal o la musculatura. Para verificar la posición correcta de la aguja, intente mover suavemente la punta de la aguja hacia los lados debajo de la piel. La aguja debe moverse libremente.
    8. Inyecte lentamente 100 μL de suspensión celular (que contenga 0,5-1 x 106 células), sujete suavemente el lugar de inyección durante unos segundos y retire lentamente la aguja sin ningún movimiento lateral.
    9. Devuelva el ratón a su jaula y controle la recuperación de la anestesia.
    10. Controlar el crecimiento del tumor con un calibrador durante 3-4 semanas. Eutanasia a los animales cuando los tumores alcanzan aproximadamente 0,5-1cm3 utilizandoCO2 o de acuerdo con procedimientos aprobados localmente.

4. Aislamiento del líquido intersticial tumoral (TIF)

  1. Extirpación de tumores subcutáneos
    1. Bloquee las extremidades de los animales con cinta adhesiva de papel y limpie la piel con alcohol. Cortar la piel abierta en el abdomen con el fin de separarlo del peritoneo y continuar hasta las extremidades. Extirpe el tumor que crece debajo de la piel del flanco con la ayuda de tijeras, pinzas y, finalmente, un bisturí.
    2. Pesar el tumor y mantenerlo en un tubo limpio sobre hielo hasta después del aislamiento de TIF.
  2. Aislamiento de TIF por centrifugación
    1. Corte el tumor por la mitad, enjuague las dos partes rápidamente en PBS y séquelas suavemente en papel de filtro para eliminar el exceso de PBS. Lleve a cabo estos pasos lo más rápido posible para evitar la evaporación del tumor.
    2. Transfiera inmediatamente el tumor a un filtro de células de nylon de 20 μm colocado sobre un tubo cónico de 50 ml.
    3. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Esta centrifugación de baja velocidad preserva la integridad celular evitando la contaminación de TIF por compartimento intracelular. La fuga de contenido intracelular puede probarse en aplicaciones posteriores, por ejemplo, evaluando la presencia de proteínas de mantenimiento intracelular, como las proteínas ribosómicas25.
    4. Recuperar el TIF del fondo del tubo, finalmente alícuota e inmediatamente congelarlo en hielo seco y almacenar a -80 °C hasta su posterior análisis.
      Opcional: Basado en el análisis proteómico posterior que se realizará, diluya la muestra en PBS con un cóctel de inhibidores de proteasa para evitar la degradación de moléculas específicas.
      NOTA: Dependiendo de la composición del tumor, en algunos casos los tumores muy pequeños no producen ningún líquido.
  3. Aislamiento de TIF por elución
    1. Corte el tumor en trozos pequeños (≈1-3 mm3) con tijeras o un bisturí y enjuague cuidadosamente con PBS frío.
      NOTA: En este paso es muy importante trabajar rápido y realizar una manipulación mínima para evitar daños celulares.
    2. Transfiera las piezas tumorales a un tubo de 1,5 ml y agregue 500 μL de PBS con un cóctel inhibidor de la proteasa para evitar la degradación de los analitos. Incubar durante 1 hora a 37 °C y 5% deCO2.
    3. Recupere el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar las células de la muestra.
    4. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugar de nuevo a 2.000 x g durante 8 min a 4 °C.
    5. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugar de nuevo a 20.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para eliminar cualquier residuo. Recupere el sobrenadante. Alícuota inmediatamente y congelar la muestra TIF en hielo seco y almacenar a -80 °C hasta su posterior análisis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se siguió el procedimiento descrito anteriormente para obtener jugo pancreático de pacientes con PDAC (n=31) y otras afecciones pancreáticas benignas (no PDAC, n=9), incluyendo pancreatitis (n=2), tumores papilar-ampolla (n=4), tumores neuroendocrinos (n=2), neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN; n=1)12. Las muestras de jugo pancreático fueron sometidas a análisis metabolómico mediante resonancia magnética nuclear (1R-H)12. Al filtrar las señales amplias de RMN de macromoléculas (por ejemplo, lipoproteínas, lípidos, etc.) pudimos apreciar en detalle metabolitos de pequeño peso molecular, como se muestra en los espectros 1D de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) (Figura 3A). El análisis supervisado de OPLS-DA mostró que el perfil metabólico detectado en el jugo pancreático fue capaz de discriminar entre pacientes con PDAC y no PDAC con una precisión del 82,4% obtenida por validación cruzada (Figura 3B). Curiosamente, el análisis metabolómico realizado en muestras de plasma de los mismos pacientes no arrojó el mismo poder discriminativo (precisión del 75,2% obtenida por validación cruzada) (Figura 3C). Estos resultados indican que el jugo pancreático es una muestra rica en proteínas y adecuada para análisis "ómicos" exhaustivos. Además, el poder discriminativo superior del jugo pancreático en comparación con el plasma sugiere que moverse "aguas arriba" a muestras más proximales al sitio del tumor podría ser una estrategia exitosa para identificar biomarcadores que ayuden a distinguir el PDAC de otras enfermedades pancreáticas.

Figure 3
Figura 3: Contenido metabolómico en jugo pancreático y plasma. (A) 1espectro de CPMG de H-NMR de muestras PDAC (n = 31, azul) y no PDAC (n = 9, verde) que muestran detalles sobre los metabolitos de peso molecular pequeños contenidos en los jugos pancreáticos. ppm, partes por millón. (B) Puntuaciones del análisis multivariado supervisado de OPLS-DA en espectros de CPMG de muestras de PDAC de jugo pancreático (círculos azules) y muestras no PDAC (triángulos púrpura). El análisis segrega los dos grupos (cada uno delineado por un diagrama de araña), con una precisión del 82,4% obtenida por validación cruzada. (C) Puntuaciones de análisis OPLS-DA multivariante supervisado en espectros 1D-NOESY de muestras plasmáticas de PDAC (n = 22, círculos azules) y muestras no PDAC (n = 7, triángulos púrpuras). Precisión del 75,2% obtenida por validación cruzada. Esta cifra ha sido modificada de Cortese et al.12 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para demostrar que el contenido de TIF refleja de manera confiable los cambios en el microambiente tumoral, inyectamos por vía subcutánea dos líneas celulares de cáncer de páncreas con tasa glucolítica opuesta, Panc02 (altamente glucolítico) y DT6606 (glucolítico bajo), siguiendo el protocolo descrito anteriormente. A continuación, se aislaron TIF de los tumores extirpados utilizando el método de centrifugación de baja velocidad descrito anteriormente (véase el punto 4.2). A partir de tumores de peso entre 0,25-1 g, recuperamos un rango de 5-15 μL de TIF, que luego se utilizó para cuantificar la concentración de glucosa y lactato. Los TIF de tumores altamente glucolíticos contenían menos glucosa y más lactato en comparación con los tumores glucolíticos bajos (Figura 4). Estos datos muestran que TIF se puede utilizar como fuente de metabolitos derivados del tumor y cambios de acuerdo con el tumor en sí.

Figure 4
Figura 4: El contenido de glucosa y lactato en TIF refleja las características intrínsecas del tumor. (A) Concentración de glucosa y (B) lactato en líquido intersticial, aislados mediante el método de centrifugación tisular, de tumores implantados por vía subcutánea Panc02 (altamente glucolítico, n=10 en A, n=9 en B) y DT6606 (glucolítico bajo, n=5 en A, n=4 en B). Los diagramas de caja dan la mediana, el cuartil inferior y el cuartil superior por caja, y mínimo y máximo por los bigotes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En este estudio hemos descrito la técnica para recolectar intraoperatoriamente jugo pancreático, una biopsia de líquido en gran parte inexplorada. Recientemente hemos demostrado que el jugo pancreático puede ser explotado como fuente de marcadores metabólicos de la enfermedad12. El análisis metabolómico en otras biopsias líquidas, como sangre 5,6,7, orina8 y saliva9, ha mostrado resultados prometedores en la discriminación entre PDAC y sujetos sanos o pancreatitis. El jugo pancreático, sin embargo, es secretado directamente por las células ductales pancreáticas, y debido a su proximidad al sitio del tumor, podría ser un indicador más confiable de los cambios en el tejido circundante, incluso en las primeras etapas de la enfermedad. De hecho, mientras que los datos espectrales de H-RMN del jugo pancreático lograron una discriminación entre los pacientes con PDAC y otras enfermedades pancreáticas benignas, las muestras de plasma no lo hicieron. Por lo tanto, aunque menos accesible que otras biopsias líquidas, el jugo pancreático representa una fuente preciosa de biomarcadores clínicos y podría ayudar en la identificación de enfermedades de rápida evolución. Hemos descrito aquí la técnica intraoperatoria para la recolección de jugo pancreático; Sin embargo, también podría realizarse durante procedimientos mínimamente invasivos, en la perspectiva de identificar valiosos marcadores tempranos de enfermedad. Queda por determinar si los diferentes procedimientos de recolección afectan la composición proteómica del jugo pancreático.

Mientras que otras biopsias líquidas son fácilmente accesibles en modelos murinos PDAC, la recolección de jugo pancreático in vivo puede ser muy difícil si se consideran modelos genéticos u ortotópicos, y no es factible en absoluto en modelos subcutáneos. Por lo tanto, en este trabajo hemos sugerido el uso de líquido intersticial tumoral como una alternativa valiosa y ampliamente aplicable. De hecho, la composición del líquido intersticial, de manera similar al jugo pancreático, se ve directamente afectada por alteraciones en el medio local. El perfil proteómico en TIF de diferentes tumores, como hepatocelular 45,46, células renales 41, ovario 22,47,48 y carcinomas de mama 42,49, han mostrado resultados alentadores en la investigación de biomarcadores candidatos. Sin embargo, hay poca superposición en las proteínas candidatas identificadas, lo que sugiere que el enfoque utilizado para aislar TIF, junto con el análisis posterior realizado y la recopilación de datos, podría afectar a los analitos detectados. Un estudio reciente sobre carcinoma de células escamosas que comparó los dos métodos de aislamiento TIF descritos aquí, centrifugación y elución, observó una fuerte consistencia en la composición TIF independientemente del método utilizado, aunque la centrifugación produjo un mayor contenido de proteínas extracelulares25.

Ambos métodos descritos aquí para el aislamiento de TIF, centrifugación tisular y elución tisular, tienen la ventaja de ser técnicamente poco exigentes, rápidos y solo requieren equipo básico de laboratorio. En comparación con otros enfoques, como la microdiálisis y la ultrafiltración capilar, las técnicas de centrifugación y elución presentan la limitación intrínseca de ser solo factibles ex vivo. Es importante tener en cuenta varias cuestiones a la hora de elegir el método adecuado, como el propósito analítico del experimento, el volumen recuperado y la rotura celular. También se debe considerar la composición del tumor, ya que puede influir en el volumen de TIF recuperado. La centrifugación tisular se desarrolló originalmente para tejidos pobres en células y ricos en colágeno, como la córnea38; Los tumores, por otro lado, suelen ser tejidos caracterizados por una alta celularidad y una rica vascularización, ambas características que aumentan la conductividad hidráulica y, por lo tanto, deben facilitar el aislamiento de TIF por centrifugación. Sin embargo, algunos tumores, incluyendo PDAC, presentan un abundante componente estromal o fibrótico, rico en proteínas de la matriz extracelular, como los colágenos, que tienden a retener macromoléculas en el tejido21.

La elución tisular, por otro lado, se basa en la difusión pasiva de proteínas del tejido al eluido, y ha sido explotada con éxito para una amplia variedad de tumores43. La elución otorga la recuperación de mayores volúmenes, sin embargo, las proteínas se diluirán. Por esta razón, la elución tisular podría no ser adecuada para moléculas con muy baja abundancia. Además, la elución requiere un mayor grado de manipulación del tumor, lo que posiblemente resulte en una fuga de contenido intracelular en TIF. Esto podría ser irrelevante para el descubrimiento de biomarcadores, pero podría introducir un sesgo si el objetivo es determinar la producción local de proteínas. La cantidad de rotura celular debe probarse en aplicaciones posteriores para elegir el método más apropiado según el tipo de tumor. Esto se puede realizar de varias maneras, por ejemplo, probando la presencia de proteínas de mantenimiento, como las proteínas ribosómicas, en TIF25. Otro enfoque sugerido es el de comparar las concentraciones de sustancias extracelulares seleccionadas, como creatinina o Na+, en TIF y plasma, que deben ser similares22. La fuga de contenido intracelular también debe considerarse para el método de centrifugación; De hecho, todavía no existe un consenso general sobre lo que debe considerarse "baja velocidad" para evitar la rotura celular, posiblemente debido a las diferencias en la composición tumoral. Elegimos utilizar una velocidad de 400 x g, ya que se ha demostrado que no se produce dilución del contenido intracelular para las fuerzas g <42438.

Independientemente del enfoque, TIF representa una fuente valiosa y ampliamente aplicable para muestrear el microambiente tumoral. Hemos demostrado que recapitula las características intrínsecas del tumor y podría ser útil para la identificación de biomarcadores de enfermedad u objetivos terapéuticos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Roberta Migliore por su asistencia técnica. La investigación que condujo a estos resultados ha recibido financiación de la Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) bajo el proyecto IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD Biosciences 309659
1.5 mL Eppendorf tube Greiner BioOne GR616201
20 µm nylon cell strainer pluriSelect 43-50020-03
25G needle BD Biosciences 305122
3 mL K2EDTA vacutainer BD Biosciences 366473
3 mL syringe BD Biosciences 309656
50 mL Falcon tube Corning 352098
Clamps Medicon 06.20.12
Disposable scalpel Medicom 9000-10
Fetal bovine serum Microtech MG10432
Flat-tipped forceps Medicon 06.00.10
Penicillin-Streptomycin Lonza ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Protease inhibitor cocktail Roche 34044100
RPMI medium Euroclone ECB9006L
Scissors Medicon 02.04.09
Trypsin/EDTA 1x Lonza BE17-161F
Ultraglutamine 100x Lonza BE17-605E/U1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
  3. Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
  4. Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
  5. Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
  6. Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
  7. Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
  8. Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
  9. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
  10. Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
  11. Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
  12. Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
  13. Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
  14. Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
  15. Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
  16. Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
  17. Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
  18. Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
  19. Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
  20. Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
  21. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  22. Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
  23. Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
  24. Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
  25. Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
  26. Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
  27. Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
  28. Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
  29. Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
  30. Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
  31. Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
  32. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
  33. Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
  34. Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
  35. Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
  36. Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
  37. Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
  38. Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
  39. Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
  40. Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
  41. Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
  42. Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
  43. Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
  44. Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
  45. Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
  46. Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
  47. Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
  48. Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
  49. Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).

Tags

Investigación del cáncer Número 165 adenocarcinoma pancreático jugo pancreático líquido intersticial tumoral líquido proximal biopsia líquida biomarcadores proteómica
Aislamiento de líquidos proximales para investigar el microambiente tumoral del adenocarcinoma pancreático
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donisi, G., Barbagallo, M.,… More

Donisi, G., Barbagallo, M., Capretti, G., Nappo, G., Takis, P. G., Zerbi, A., Marchesi, F., Cortese, N. Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (165), e61687, doi:10.3791/61687 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter