Summary
Il succo pancreatico è una preziosa fonte di biomarcatori per il cancro del pancreas umano. Descriviamo qui un metodo per la procedura di raccolta intraoperatoria. Per superare la sfida di adottare questa procedura in modelli murini, suggeriamo un campione alternativo, il liquido interstiziale tumorale, e descriviamo qui due protocolli per il suo isolamento.
Abstract
L'adenocarcinoma pancreatico (PDAC) è la quarta causa di morte correlata al cancro e presto diventerà la seconda. Vi è un urgente bisogno di variabili associate a specifiche patologie pancreatiche per aiutare la diagnosi differenziale preoperatoria e la profilazione del paziente. Il succo pancreatico è un fluido corporeo relativamente inesplorato che, a causa della sua vicinanza al sito tumorale, riflette i cambiamenti nel tessuto circostante. Qui descriviamo in dettaglio la procedura di raccolta intraoperatoria. Sfortunatamente, tradurre la raccolta di succo pancreatico in modelli murini di PDAC, per eseguire studi meccanicistici, è tecnicamente molto impegnativo. Il liquido interstiziale tumorale (TIF) è il fluido extracellulare, al di fuori del sangue e del plasma, che bagna le cellule tumorali e stromali. Analogamente al succo pancreatico, per la sua proprietà di raccogliere e concentrare le molecole che si trovano diluite nel plasma, la TIF può essere sfruttata come indicatore di alterazioni microambientali e come preziosa fonte di biomarcatori associati alla malattia. Poiché la TIF non è facilmente accessibile, sono state proposte varie tecniche per il suo isolamento. Descriviamo qui due metodi semplici e tecnicamente poco impegnativi per il suo isolamento: la centrifugazione tissutale e l'eluizione tissutale.
Introduction
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tumori più aggressivi e presto diventerà la seconda causa di morte 1,2,3. È noto per il suo microambiente immunosoppressivo e per la sua scarsa risposta ai protocolli di immunoterapia4. Attualmente, la resezione chirurgica è ancora l'unica opzione curativa per il PDAC, ma c'è un'alta frequenza di recidive precoci e complicanze postchirurgiche. La mancanza di sintomi specifici fino a uno stadio avanzato non consente una diagnosi precoce, contribuendo alla scadenza della malattia. Inoltre, la sovrapposizione dei sintomi tra PDAC e altre patologie pancreatiche benigne può ostacolare il raggiungimento di una diagnosi tempestiva e affidabile con le attuali strategie diagnostiche. L'identificazione di variabili associate a specifiche patologie pancreatiche potrebbe facilitare il processo decisionale chirurgico e migliorare la profilazione del paziente.
Risultati promettenti nella scoperta di biomarcatori sono stati raggiunti utilizzando fluidi corporei facilmente accessibili, come sangue 5,6,7, urina8, saliva 9 e succo pancreatico10,11,12. Molti studi hanno sfruttato approcci "omici" completi, come tecniche genomiche, proteomiche e metabolomiche, per identificare molecole candidate o firme che potrebbero discriminare tra PDAC e altre afflizioni pancreatiche benigne. Abbiamo recentemente dimostrato che il succo pancreatico, un fluido corporeo relativamente inesplorato, può essere utilizzato per identificare le firme metaboliche di pazienti con profili clinici distinti12. Il succo pancreatico è un fluido ricco di proteine, che accumula il secretoma delle cellule duttali pancreatiche e scorre verso il dotto pancreatico principale e quindi verso il principale dotto biliare comune. A causa della sua vicinanza al pancreas, potrebbe essere fortemente influenzato dalle perturbazioni microambientali indotte dalla massa tumorale (Figura 1), e quindi più informativo del sangue o delle urine o della profilazione basata sui tessuti. Diversi studi hanno esplorato il potenziale del succo pancreatico per identificare nuovi biomarcatori di malattia utilizzando vari approcci, tra cui l'analisi citologica 13, l'analisi proteomica eseguita mediante spettrometria di massa 14,15, la valutazione di marcatori genetici ed epigenetici come K-ras e mutazioni p53 16,17, alterazioni nella metilazione del DNA 18 e miRNA 19 . Tecnicamente, il succo pancreatico può essere raccolto intraoperatoriamente o con procedure minimamente invasive, come l'ecografia endoscopica, la colangio-pancreatografia retrograda o mediante raccolta endoscopica della secrezione di succo duodenale20. Non è ancora chiaro in che misura la composizione del succo pancreatico sia influenzata dalla tecnica di raccolta utilizzata. Descriviamo qui la procedura di raccolta intraoperatoria e mostriamo che il succo pancreatico può rappresentare una fonte preziosa per i biomarcatori PDAC.
Figura 1: Rappresentazione schematica della raccolta del succo pancreatico. (A) Rappresentazione schematica raffigurante la secrezione di succo pancreatico nel dotto pancreatico e la sua raccolta durante l'intervento chirurgico. L'inserto mostra un primo piano del microambiente tumorale: il succo pancreatico raccoglie le molecole rilasciate dalle cellule tumorali e stromali nei dotti pancreatici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La raccolta di succo pancreatico in modelli murini genetici e ortotopici di PDAC sarebbe apprezzata nella prospettiva di sfruttare questo biofluido in studi meccanicistici preclinici; Tuttavia, questa procedura può essere tecnicamente molto impegnativa e non è fattibile per modelli più semplici come i tumori sottocutanei. Per questo motivo, abbiamo identificato il liquido interstiziale tumorale (TIF) come fonte alternativa al succo pancreatico, per la sua caratteristica simile di agire come indicatore delle perturbazioni circostanti. Il liquido interstiziale (IF) è il liquido extracellulare, che si trova al di fuori del sangue e dei vasi linfatici, che bagna le cellule dei tessuti21. La composizione di IF è influenzata sia dalla circolazione sanguigna all'organo che dalla secrezione locale; infatti, le cellule circostanti producono e secernono attivamente proteine nell'IF21. L'interstizio riflette i cambiamenti microambientali dei tessuti circostanti e potrebbe quindi rappresentare una preziosa fonte per la scoperta di biomarcatori in diversi contesti patologici, come i tumori. L'alta concentrazione di proteine localmente secrete in TIF può essere utilizzata per identificare molecole candidate da testare come biomarcatori prognostici o diagnostici nel plasma22,23,24. Diversi studi hanno dimostrato che TIF è un campione adatto per approcci proteomici ad alto rendimento, come le tecniche di spettrometria di massa 23,24,25, così come gli approcci ELISA multiplex 26 e il profilo dei microRNA 27.
Sono stati proposti diversi approcci per l'isolamento dell'IF nei tumori, che possono essere ampiamente classificati come metodi in vivo (ultrafiltrazione capillare 28,29,30,31 e microdialisi 32,33,34,35) ed ex vivo (centrifugazione tissutale 22,36,37,38 e eluizione tissutale 39,40,41,42). Queste tecniche sono state esaminate in dettaglio 43,44. La scelta del metodo appropriato dovrebbe tenere conto di aspetti quali le analisi e le applicazioni a valle e il volume recuperato. Recentemente abbiamo usato questo approccio come prova di principio per dimostrare la diversa attività metabolica dei tumori da due linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico murino12. Sulla base della letteratura24,38, abbiamo scelto di utilizzare il metodo di centrifugazione a bassa velocità per evitare la rottura e la diluizione delle cellule dal contenuto intracellulare. Sia la quantità di glucosio che di lattato in TIF riflettevano le diverse caratteristiche glicolitiche delle due diverse linee cellulari. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo per i due metodi più comunemente usati per l'isolamento della TIF: centrifugazione tissutale ed eluizione tissutale (Figura 2).
Figura 2: Rappresentazione schematica dei metodi di isolamento del liquido interstiziale tumorale. Illustrazione schematica delle tecniche descritte in dettaglio nel protocollo, vale a dire centrifugazione tissutale (A) ed eluizione tissutale (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Protocol
Per tutti i pazienti arruolati, il sangue periferico e il succo pancreatico sono stati raccolti al momento dell'intervento secondo protocolli approvati dal Comitato Etico dell'Istituzione. Tutti i pazienti sono stati arruolati nello studio dopo aver firmato il consenso informato, compresa la raccolta di campioni biologici e dati clinici. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituzione (numero di protocollo ICH-595, approvazione rilasciata nel maggio 2009). Le procedure che coinvolgono i topi e la loro cura sono state conformi alle linee guida dell'UE e istituzionali (protocollo ID 121/2016-PR).
1. Isolamento del succo pancreatico
NOTA: Il prelievo del succo pancreatico viene eseguito nel contesto di una procedura aperta di resezione pancreatica (ad esempio, duodenectomia pancreatica, pancreatectomia totale, pancreatectomia distale) da un'equipe di chirurghi pancreatici esperti.
- Selezione del paziente
- Considerare per la procedura qualsiasi paziente programmato per una resezione pancreatica aperta.
- Confermare l'inclusione se la dimensione del dotto pancreatico principale è ritenuta sufficiente per consentire il recupero del succo pancreatico. Il limite minimo di diametro del dotto pancreatico principale è considerato 2 mm all'imaging TC con mezzo di contrasto.
- Studio pre-operatorio del dotto pancreatico all'imaging TC con mezzo di contrasto per aiutare la pianificazione del recupero del succo pancreatico
- Localizzare tridimensionalmente il dotto pancreatico principale all'interno della ghiandola a livello del collo pancreatico: misurare la distanza del dotto pancreatico principale dal margine pancreatico anteriore, superiore e inferiore su vetrini di sezione trasversale e rendering coronali e sagittali. Una volta in sala operatoria, utilizzare queste misurazioni per approssimare il punto corretto in cui perforare il pancreas per inannulare il dotto di Wirsung e recuperare il succo pancreatico.
- Preparazione del materiale
- Materiale sterile: aprire l'involucro sterile di un ago da 25 G e di una siringa da 3 ml e posizionarli nel campo sterile con la collaborazione dell'infermiera.
- Materiale non sterile: tenere a portata di mano una provetta sottovuoto K2EDTA da 3 mL in sala operatoria per lo stoccaggio del fluido.
- Preparazione del paziente
- Posizionare il paziente sul letto della sala operatoria. Indurre l'anestesia generale mista, utilizzando Remifentanil, Sevorane e Rocuronium, quindi intubare e iniziare a ventilare il paziente. Posizionare il paziente in decubito supino con il braccio destro infilato nel corpo e il braccio sinistro rapito a 90° gradi fissato su una credenza.
- Disinfettare la pelle dell'addome nel sito dell'incisione. Creare e mantenere un campo sterile sull'addome drappeggiando il paziente.
- Procedura chirurgica
- Eseguire un'incisione subcostale e accedere alla cavità addominale. Posizionare una retrazione addominale Rochard per l'esposizione degli organi.
- Esporre e mobilizzare il pancreas attraverso la manovra di Kocher, l'apertura del legamento gastrocolico, l'incisione del tessuto retroperitoneale lungo il bordo superiore e inferiore del pancreas creando un piano di dissezione tra il collo pancreatico e la vena mesenterica superiore situata posteriormente.
- Una volta che il pancreas è mobilizzato ed esposto, procedere al prelievo del succo pancreatico prima del sezionamento del collo pancreatico.
- Identificazione e localizzazione del dotto pancreatico
- Stimare la posizione del dotto pancreatico utilizzando la misurazione effettuata durante l'imaging e quindi palpare la superficie anteriore del pancreas per identificare la sua posizione precisa.
- Raccolta di succo pancreatico
- Tenere la testa pancreatica e il duodeno da sotto ed elevarlo con la mano sinistra, segnando la posizione del dotto pancreatico con il primo dito.
- Afferri con la mano destra della siringa da 3 mL con l'ago da 25 G montato.
- Utilizzare la mano destra per inserire l'ago nel pancreas appena distale al pollice sinistro. Decidere la profondità di penetrazione e il grado di inclinazione dell'ago in base alle misurazioni preoperatorie e alla percezione di aver penetrato la parete del condotto.
- Prelevare il succo con la siringa. Se non è possibile recuperare il succo, spostare l'ago nelle quattro direzioni cercando di cannulare il dotto pancreatico.
- Una volta recuperato il succo pancreatico, spostarlo al di fuori del campo sterile e trasferirlo nella provetta per vuoto K2EDTA da 3 ml. Conservare a 4 °C fino a quando il campione non viene trasferito in laboratorio e procedere all'ulteriore elaborazione il prima possibile.
NOTA: Il volume di succo pancreatico che può essere recuperato con questa procedura varia notevolmente, variando approssimativamente da 0,2 ml a 3 ml nella nostra esperienza. La quantità di succo recuperato dipende fortemente dal paziente: la dimensione del dotto di Wirsung e lo stato funzionale del pancreas (funzionamento rispetto alla ghiandola atrofica). Nella nostra esperienza non esiste alcun espediente che possa essere utilizzato per aumentare la quantità di succo pancreatico recuperato.
2. Lavorazione del succo pancreatico
- Centrifugare il succo pancreatico a 400 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali cellule o detriti.
NOTA: Il succo pancreatico deve essere di colore chiaro e trasparente prima della centrifugazione. La contaminazione del sangue durante l'intervento chirurgico può talvolta verificarsi, rendendo il campione più oscuro e di colore più rosso. Considerare l'esclusione di tali campioni da ulteriori analisi. - Recuperare il surnatante, l'aliquota e conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi.
3. Induzione di tumori sottocutanei
NOTA: Le linee cellulari murine Panc02 e DT6606 sono state ottenute rispettivamente dal Prof. Lorenzo Piemonti (Istituto per il diabete San Raffaele, Milano, Italia) e dal Prof. Francesco Novelli (Centro per la Ricerca Sperimentale e gli Studi Medici, Torino, Italia), come precedentemente descritto12.
- Crescita delle cellule tumorali
- Coltura di cellule Panc02 e DT6606 in terreno di coltura Panc02 e DT6606 in terreno di coltura Memorial Institute (RPMI) 1640 contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2mM di L-glutammina e l'1% di antibiotico penicillina-streptomicina.
- Scongelare le cellule congelate 1-2 settimane prima dell'iniezione del tumore, in base al tasso di crescita della linea cellulare.
- Coltiva cellule a 37 °C con il 5% di CO2 e il 95% di umidità in condizioni sterili.
- Staccare le cellule con una soluzione di tripsina/EDTA allo 0,025% per 5 minuti a 37 °C quando raggiungono l'80% di confluenza ed eliminare la tripsina mediante centrifugazione.
NOTA: DT6606 sono cellule primarie, non immortalate, derivate dal topo LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, e non devono essere fatte passare più di 3 volte prima dell'iniezione in vivo per mantenere le loro caratteristiche originali. Si raccomanda di scongelare le cellule DT6606 7-10 giorni prima dell'iniezione.
- Iniezione di cellule tumorali in vivo
- Tripsinizzare le cellule (vedere punto 3.1.4) e lavarle una volta con soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Eliminare il PBS mediante centrifugazione e risospendere le cellule nel PBS fresco prima del conteggio.
- Contare le cellule e risospenderle in PBS ad una concentrazione di 0,5-1 x 107 cellule/ml in modo da avere una concentrazione finale di 0,5-1 x 106 cellule/100 μL da iniettare in ciascun topo. Preparare le cellule in eccesso. Mantenere le cellule a 4 °C o sul ghiaccio fino alla fine della procedura.
- Raggruppare gli animali (topi femmina C57BL/6J di 8 settimane) in gabbie diverse in base a diverse linee cellulari o trattamenti.
- Trattenere gli animali manualmente e anestetizzarli usando una miscela di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o secondo procedure approvate localmente.
- Rasare il sito di iniezione, di solito un fianco sopra una gamba, con un rasoio elettrico e pulire accuratamente il sito di iniezione con alcool.
- Pipettare su e giù per la sospensione cellulare con una siringa da 1 ml, rimuovendo eventuali bolle d'aria spostando il pistone su e giù. Collegare un ago da 25 G alla siringa e spingere il pistone verso l'alto fino a quando la sospensione cellulare raggiunge l'apertura dell'ago.
- Pizzicare la pelle del fianco con una pinza a punta piatta e inserire con attenzione l'ago alla base della piega cutanea tra le pinze senza perforare la cavità peritoneale o la muscolatura. Per verificare la corretta posizione dell'ago, provare delicatamente a spostare la punta dell'ago lateralmente sotto la pelle. L'ago dovrebbe muoversi liberamente.
- Iniettare lentamente 100 μL di sospensione cellulare (contenente 0,5-1 x 106 cellule), serrare delicatamente il sito di iniezione per alcuni secondi e ritirare lentamente l'ago senza alcun movimento laterale.
- Riportare il mouse nella sua gabbia e monitorare il recupero dall'anestesia.
- Controllare la crescita del tumore usando una pinza per 3-4 settimane. Eutanasia gli animali quando i tumori raggiungono circa 0,5-1 cm3 usando CO2 o secondo procedure approvate localmente.
4. Isolamento del liquido interstiziale tumorale (TIF)
- Asportazione di tumori sottocutanei
- Bloccare gli arti degli animali con nastro di carta e pulire la pelle con alcool. Tagliare la pelle aperta sull'addome per separarla dal peritoneo e proseguire fino agli arti. Eliminare il tumore cresciuto sotto la pelle del fianco con l'aiuto di forbici, morsetti e infine un bisturi.
- Pesare il tumore e tenerlo in un tubo pulito sul ghiaccio fino a dopo l'isolamento del TIF.
- Isolamento della TIF mediante centrifugazione
- Tagliare il tumore a metà, sciacquare rapidamente le due parti in PBS e asciugarle delicatamente su carta da filtro per rimuovere l'eccesso di PBS. Eseguire questi passaggi il più velocemente possibile per evitare l'evaporazione dal tumore.
- Trasferire immediatamente il tumore in un filtro di cellule di nylon da 20 μm fissato in cima a un tubo conico da 50 ml.
- Centrifugare il tubo a 400 x g per 10 minuti a 4 °C.
NOTA: Questa centrifugazione a bassa velocità preserva l'integrità cellulare evitando la contaminazione della TIF da parte del compartimento intracellulare. La perdita di contenuto intracellulare può essere testata nelle applicazioni a valle, ad esempio valutando la presenza di proteine intracellulari di housekeeping, come le proteine ribosomiali25. - Recuperare la TIF dal fondo del tubo, eventualmente aliquotarla e congelarla immediatamente su ghiaccio secco e conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi.
Facoltativo: In base all'analisi proteomica a valle da eseguire, diluire il campione in PBS con un cocktail di inibitori della proteasi per evitare la degradazione di molecole specifiche.
NOTA: A seconda della composizione del tumore, in alcuni casi tumori molto piccoli non producono alcun fluido.
- Isolamento della TIF mediante eluizione
- Tagliare il tumore in piccoli pezzi (≈1-3 mm3) con le forbici o un bisturi e risciacquare accuratamente con PBS freddo.
NOTA: In questo passaggio è molto importante lavorare velocemente ed eseguire la minima manipolazione per evitare danni alle cellule. - Trasferire i pezzi tumorali in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 500 μL di PBS con un cocktail di inibitori della proteasi per evitare la degradazione degli analiti. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% CO2.
- Recuperare il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 ml. Centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali cellule dal campione.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare nuovamente a 2.000 x g per 8 minuti a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare nuovamente a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali detriti. Recupera il surnatante. Immediatamente aliquote e congelare il campione TIF su ghiaccio secco e conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi.
- Tagliare il tumore in piccoli pezzi (≈1-3 mm3) con le forbici o un bisturi e risciacquare accuratamente con PBS freddo.
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Representative Results
Abbiamo seguito la procedura sopra descritta per ottenere succo pancreatico da pazienti con PDAC (n = 31) e altre afflizioni pancreatiche benigne (non-PDAC, n = 9), tra cui pancreatite (n = 2), tumori dell'ampolla papillare (n = 4), tumori neuroendocrini (n = 2), neoplasia mucinosa papillare intraduttale (IPMN; n = 1) 12. I campioni di succo pancreatico sono stati quindi sottoposti ad analisi metabolomica mediante risonanza magnetica nucleare (1H-NMR)12. Filtrando gli ampi segnali NMR delle macromolecole (ad esempio, lipoproteine, lipidi, ecc.) siamo stati in grado di apprezzare in dettaglio piccoli metaboliti di peso molecolare, come mostrato negli spettri 1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) (Figura 3A). L'analisi OPLS-DA supervisionata ha mostrato che il profilo metabolico rilevato nel succo pancreatico era in grado di discriminare tra pazienti PDAC e non PDAC con un'accuratezza dell'82,4% ottenuta mediante convalida incrociata (Figura 3B). È interessante notare che l'analisi metabolomica eseguita su campioni di plasma degli stessi pazienti non ha prodotto lo stesso potere discriminante (accuratezza del 75,2% ottenuta mediante convalida incrociata) (Figura 3C). Questi risultati indicano che il succo pancreatico è un campione ricco di proteine e adatto per analisi "omiche" complete. Inoltre, il potere discriminante superiore del succo pancreatico rispetto al plasma suggerisce che lo spostamento "a monte" verso campioni più prossimali al sito tumorale potrebbe essere una strategia efficace per identificare i biomarcatori che aiutano a individuare il PDAC da altre malattie pancreatiche.
Figura 3: Contenuto metabolomico nel succo e nel plasma pancreatico. (A) 1spettri H-NMR CPMG di campioni PDAC (n=31, blu) e non PDAC (n=9, verde) che mostrano dettagli sui metaboliti di piccolo peso molecolare contenuti nei succhi pancreatici. ppm, parti per milione. (B) Punteggi di analisi OPLS-DA multivariata supervisionata su spettri CPMG da campioni PDAC di succo pancreatico (cerchi blu) e campioni non PDAC (triangoli viola). L'analisi separa i due gruppi (ciascuno delineato da un diagramma a ragno), con un'accuratezza dell'82,4% ottenuta mediante validazione incrociata. (C) Punteggi di analisi OPLS-DA multivariata supervisionata su spettri 1D-NOESY da campioni di plasma PDAC (n = 22, cerchi blu) e campioni non PDAC (n = 7, triangoli viola). Precisione del 75,2% ottenuta mediante convalida incrociata. Questa cifra è stata modificata da Cortese et al.12 con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Per dimostrare che il contenuto di TIF riflette in modo affidabile i cambiamenti nel microambiente tumorale, abbiamo iniettato per via sottocutanea due linee cellulari di cancro del pancreas con tasso glicolitico opposto, Panc02 (altamente glicolitico) e DT6606 (glicolitico basso), seguendo il protocollo sopra descritto. Abbiamo quindi isolato TIF dai tumori asportati utilizzando il metodo di centrifugazione a bassa velocità descritto sopra (vedi paragrafo 4.2). Da tumori di peso compreso tra 0,25-1 g, abbiamo recuperato un range di 5-15 μL di TIF, che è stato poi utilizzato per quantificare la concentrazione di glucosio e lattato. La TIF dei tumori altamente glicolitici conteneva meno glucosio e più lattato rispetto ai tumori glicolitici bassi (Figura 4). Questi dati mostrano che TIF può essere utilizzato come fonte di metaboliti derivati dal tumore e cambiamenti in base al tumore stesso.
Figura 4: Il contenuto di glucosio e lattato nella TIF riflette le caratteristiche intrinseche del tumore. (A) Concentrazione di glucosio e (B) lattato nel liquido interstiziale, isolato utilizzando il metodo di centrifugazione tissutale, da Panc02 (altamente glicolitico, n = 10 in A, n = 9 in B) e DT6606 (glicolitico basso, n = 5 in A, n = 4 in B) tumori impiantati per via sottocutanea. I grafici a scatola danno mediana, quartile inferiore e quartile superiore dalla scatola e minimo e massimo dai baffi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
In questo studio abbiamo descritto la tecnica per raccogliere intraoperatoriamente il succo pancreatico, una biopsia fluida in gran parte inesplorata. Abbiamo recentemente dimostrato che il succo pancreatico può essere sfruttato come fonte di marcatori metabolici della malattia12. L'analisi metabolomica su altre biopsie liquide, come sangue 5,6,7, urina8 e saliva9, ha mostrato risultati promettenti nel discriminare tra PDAC e soggetti sani o pancreatite. Il succo pancreatico, tuttavia, è direttamente secreto dalle cellule duttali pancreatiche e, grazie alla sua vicinanza al sito tumorale, potrebbe essere un indicatore più affidabile dei cambiamenti nel tessuto circostante, anche nelle primissime fasi della malattia. Infatti, mentre i dati spettrali H-NMR del succo pancreatico hanno ottenuto una discriminazione tra i pazienti PDAC e altre malattie pancreatiche benigne, i campioni di plasma non lo hanno fatto. Pertanto, sebbene meno accessibile rispetto ad altre biopsie fluide, il succo pancreatico rappresenta una preziosa fonte di biomarcatori clinici e potrebbe aiutare nell'identificazione di malattie in rapida evoluzione. Abbiamo descritto qui la tecnica intraoperatoria per la raccolta del succo pancreatico; Tuttavia, potrebbe anche essere eseguita durante procedure minimamente invasive, nella prospettiva di identificare preziosi marcatori precoci di malattia. Resta da accertare se le diverse procedure di raccolta influenzino la composizione proteomica del succo pancreatico.
Mentre altre biopsie fluide sono facilmente accessibili nei modelli murini PDAC, la raccolta di succo pancreatico in vivo può essere molto impegnativa se si considerano modelli genetici o ortotopici e non è affatto fattibile nei modelli sottocutanei. Pertanto, in questo articolo abbiamo suggerito l'uso del liquido interstiziale tumorale come alternativa preziosa e ampiamente applicabile. Infatti, la composizione del liquido interstiziale, analogamente al succo pancreatico, è direttamente influenzata dalle alterazioni dell'ambiente locale. I profili proteomici su TIF di diversi tumori, come i carcinomi epatocellulari 45,46, cellule renali 41, ovaie 22,47,48 e mammelle42,49, hanno mostrato risultati incoraggianti nella ricerca di biomarcatori candidati. Tuttavia, vi è poca sovrapposizione nelle proteine candidate identificate, suggerendo che l'approccio utilizzato per isolare la TIF, insieme all'analisi a valle eseguita e alla raccolta dei dati, potrebbe influenzare gli analiti rilevati. Un recente studio sul carcinoma a cellule squamose confrontando i due metodi di isolamento TIF qui descritti, centrifugazione ed eluizione, ha osservato una forte coerenza nella composizione TIF indipendentemente dal metodo utilizzato, sebbene la centrifugazione abbia prodotto un contenuto più elevato di proteine extracellulari25.
Entrambi i metodi qui descritti per l'isolamento di TIF, centrifugazione tissutale ed eluizione tissutale, hanno il vantaggio di essere tecnicamente poco impegnativi, rapidi e richiedono solo attrezzature di laboratorio di base. Rispetto ad altri approcci, come la microdialisi e l'ultrafiltrazione capillare, le tecniche di centrifugazione ed eluizione presentano il limite intrinseco di essere realizzabili solo ex vivo. È importante tenere conto di diversi aspetti quando si sceglie il metodo appropriato, come lo scopo analitico dell'esperimento, il volume recuperato e la rottura delle cellule. Anche la composizione del tumore dovrebbe essere considerata, in quanto può influenzare il volume di TIF recuperato. La centrifugazione tissutale è stata originariamente sviluppata per tessuti poveri di cellule e ricchi di collagene come la cornea38; I tumori, d'altra parte, sono solitamente tessuti caratterizzati da elevata cellularità e ricca vascolarizzazione, entrambe caratteristiche che aumentano la conduttività idraulica, e dovrebbero quindi facilitare l'isolamento della TIF mediante centrifugazione. Tuttavia, alcuni tumori, tra cui il PDAC, presentano un'abbondante componente stromale o fibrotica, ricca di proteine della matrice extracellulare, come i collageni, che tendono a trattenere macromolecole nel tessuto21.
L'eluizione tissutale, d'altra parte, si basa sulla diffusione passiva delle proteine dal tessuto all'eluato, ed è stata sfruttata con successo per un'ampia varietà di tumori43. L'eluizione garantisce il recupero di volumi maggiori, tuttavia le proteine saranno diluite. Per questo motivo, l'eluizione tissutale potrebbe non essere adatta per molecole con abbondanza molto bassa. Inoltre, l'eluizione richiede un maggior grado di manipolazione del tumore, con conseguente perdita di contenuto intracellulare nella TIF. Questo potrebbe essere irrilevante per la scoperta di biomarcatori, ma potrebbe introdurre un pregiudizio se l'obiettivo è determinare la produzione locale di proteine. La quantità di rottura cellulare deve essere testata nelle applicazioni a valle al fine di scegliere il metodo più appropriato in base al tipo di tumore. Questo può essere eseguito in diversi modi, ad esempio testando la presenza di proteine housekeeping, come le proteine ribosomiali, in TIF25. Un altro approccio suggerito è quello di confrontare le concentrazioni di sostanze extracellulari selezionate, come la creatinina o Na+, in TIF e plasma, che dovrebbero essere simili22. Anche la perdita di contenuto intracellulare deve essere presa in considerazione per il metodo di centrifugazione; In realtà, non esiste ancora un consenso generale su ciò che dovrebbe essere considerato "a bassa velocità" al fine di evitare la rottura cellulare, probabilmente a causa delle differenze nella composizione del tumore. Abbiamo scelto di utilizzare una velocità di 400 x g, poiché è stato dimostrato che non si verifica alcuna diluizione dal contenuto intracellulare per le forze g <42438.
Indipendentemente dall'approccio, TIF rappresenta una fonte preziosa e ampiamente applicabile per campionare il microambiente tumorale. Abbiamo dimostrato che ricapitola le caratteristiche intrinseche del tumore e potrebbe essere utile per l'identificazione di biomarcatori di malattia o bersagli terapeutici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Si ringrazia Roberta Migliore per l'assistenza tecnica. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dall'Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) nell'ambito del progetto IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
References
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