Summary
该协议提出了一个新型的，强大的，可重复的文化系统，以产生和生长三维球体从Caco2结肠腺癌细胞。研究结果为研究癌症干细胞生物学（包括化疗反应）的方法的恰当性提供了第一个概念证明。
Abstract
结肠直肠癌的特点是异质性和分层组织，由负责肿瘤开发、维持和抗药性的癌症干细胞（CSC）群体组成。因此，更好地了解CSC特性对于其特定目标来说是有效治疗的先决条件。然而，缺乏适合深入调查的可适用的前科模型。虽然体外二维（2D）癌细胞系为肿瘤生物学提供了有价值的见解，但它们不会复制表型和遗传肿瘤异质性。相比之下，三维（3D）模型处理和再现近生理癌症的复杂性和细胞异质性。这项工作的目的是设计一个强大和可重复的3D培养系统来研究CSC生物学。目前的方法描述了从Caco2结肠腺癌细胞中产生3D球体的条件的发展和优化，这种模型可用于长期培养。重要的是，在球体中，围绕流明状结构组织的细胞的特点是微分细胞增殖模式，以及CSC的存在，这些细胞表示一组标记物。这些结果为研究细胞异质性和CSC生物学（包括对化疗的反应）的这种3D方法的恰当性提供了第一个概念证明。
Introduction
结肠直肠癌（CRC）仍然是世界第二大癌症相关死亡原因。CRC的发展是基因突变和/或表观遗传改变2，3逐步获取和积累的结果，包括肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因3，4的灭活。此外，非遗传因素（如微环境）可以促进和促进原基因转化，从而参与CRC5的演变。重要的是，CRC由不同的细胞群组成，包括未分化的CSC和显示一些分化特征的散装肿瘤细胞，它们构成了一个层次结构，让人联想到正常结肠密码6、7中的上皮组织。
CSC被认为是负责肿瘤外观8，其维持和生长，转移能力，和耐常规疗法6，7。在肿瘤中，癌细胞，包括CSC，在它们独特的突变和表观遗传特征、形态和表型差异、基因表达、新陈代谢、增殖率和转移潜力方面表现出高度的异质性和复杂性。因此，为了更好地了解癌症生物学，肿瘤进展，并获得抗药性治疗及其转化为有效的治疗，人类前科模型捕捉这种癌症的异质性和层次性是重要的10，11。
体外2D癌细胞系已被长期使用，为肿瘤的发展和治疗分子疗效的机制提供了宝贵的见解。然而，由于原始肿瘤中缺乏表型和遗传异质性，它们的限制现在已得到广泛认可。此外，营养物质、氧气、pH梯度和肿瘤微环境不复发生，微环境对于维持包括CSC11、12在内的不同细胞类型的特别重要。为了克服这些主要缺点，已经开发了几种3D模型，以实验性地解决和再现癌症的复杂性和异质性。实际上，这些模型可回顾肿瘤细胞异质性、细胞相互作用和空间结构，类似于体内12、13、14中观察到的模型。从新鲜肿瘤以及细胞线衍生球体中建立的原发性肿瘤器官主要采用15、16。
球体可以以无脚手架或脚手架的方式培养，以迫使细胞形成细胞并在细胞聚合体中生长。无脚手架的方法基于非粘附条件下的细胞培养（例如，悬垂法或超低附着板），而基于脚手架的模型则依赖于自然、合成或混合生物材料来培养细胞12、13、14。基于脚手架的球体呈现不同的缺点，因为最终的球体形成将取决于所用（生物）材料的性质和组成。虽然脚手架无球体方法，到目前为止不依赖于基板的性质，他们产生球体，在结构和大小17，18变化。
这项工作旨在设计一个强大和可重复的球体3D培养系统，其大小是同质的，由Caco2结肠腺癌细胞组成，以研究CSC生物学。Caco2细胞特别感兴趣，因为它们能够随着时间的推移分化19，20，强烈地暗示了干细胞般的潜力。因此，球体的长期培养揭示了不同CSC人群对化疗有不同的反应。
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Protocol
注：所有试剂和材料的详细信息都列在 材料表中。
1. 球形形成
- 球形文化媒体
- 准备基础介质，包括杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM）， 辅以 4 mM L-阿拉尼尔- L - 谷氨酰二肽.
- 从步骤 1.1.1 开始，在基础介质中准备包含 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素链霉素 （笔/链球菌） 的 DMEM 完整介质。
- 从步骤 1.1.1 开始，在基础介质中准备包含 2.5% 的基层膜基质、10% FBS 和 1% 笔/链球菌的 DMEM/地下室膜基质介质。
- 球形形成板的准备
- 温暖的基底和DMEM/地下室膜基质介质在室温（RT）约20分钟。
- 通过在每口井中添加 500μL 的防粘性冲洗溶液，预处理专用于球形形成的 24 井板的井。
注：在这些板块中，每口井由1，200个微井组成。 - 在摆动桶转子中以 1，200 × g 的速度将板分流 5 分钟，并配有板材适配器。
注意：如果只使用一个盘子，请准备一个装满水的额外标准板，以平衡重量。 - 用2mL的暖基底介质冲洗每口井，并从井中吸气介质。
- 观察显微镜下的板，以确保气泡已完全从微井中去除。如果气泡仍然被困住，离心机在1，200× 克 时再停留5分钟，以消除气泡。
- 重复冲洗步骤 1.2.4-1.2.5。
- 在每个井中加入 1 mL 的暖 DMEM/地下室膜基质介质。
- 球体的生成
- 在含有 5%CO 2 的潮湿大气中，在 DMEM 介质中的 2D 单层中生长 Caco2 细胞，辅以 10% FBS 和 1% 笔/链球，温度为 37 °C（以下简称 37 °C/5% CO2）。
注：要使用的细胞通道的最大数量为 80。 - 当达到80%的共生性时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）1x（10厘米菜5毫升）清洗细胞，加入三聚氰胺四乙酸（EDTA）（10厘米菜2毫克），在37°C/5%CO2孵育2-5分钟。
- 检查显微镜下的细胞分离，并通过每10厘米盘中加入4毫升的DMEM完整介质来中和三氯丁香。
- 使用血细胞计计算细胞以确定细胞总数。
- 将细胞悬架在 1，200 × g 下，悬架 5 分钟。丢弃超母体，并以适当的DMEM/基础膜基质介质体体恢复颗粒。
- 参考 表1， 以确定每口井所需的细胞数量，以达到每个微井所需的细胞数量。或者，考虑到每口井包含 1，200 个微井，请计算使用以下公式进行 24 井板的细胞数量
每口井所需的细胞数量 = 每个微井所需的细胞数量× 1，200 个 - 将细胞悬架的所需体积添加到每个井中，以达到最终 1 mL 的所需的细胞数。
- 向每口油井添加 1 mL 的 DMEM/地下室膜基质介质，以达到每口井 2 mL 的最终体积（另请参阅步骤 1.2.7）。
注意：小心不要将气泡引入微井。 - 立即以1，200× 克 的速度将盘子离心5分钟，以捕获微井中的细胞。如有必要，用装满水的标准板平衡离心机。
- 观察显微镜下的板，以验证细胞均匀地分布在微井中。
- 在不干扰板的情况下，以 37 °C/5% CO2 48 h 孵化板。
注：根据最初的协议21，虽然许多细胞系可以在24小时内形成球体，但有些细胞线需要更长的潜伏时间。在此协议中，48 h 足以形成球形。
- 在含有 5%CO 2 的潮湿大气中，在 DMEM 介质中的 2D 单层中生长 Caco2 细胞，辅以 10% FBS 和 1% 笔/链球，温度为 37 °C（以下简称 37 °C/5% CO2）。
- 从微井中采集球体
- 在 RT 加热基底和 DMEM/地下室膜基质介质约 20 分钟。
- 使用血清学移液器，从每口井中取出一半的培养介质（1 mL）。
- 将介质重新添加到井面，将球体从微井中分离。
注意：不要触摸或修剪球形。 - 将 37μm 可逆滤应变器（或 40μm 标准滤应变器）放在 15 mL 锥形管的顶部以收集球形。
注意：如果使用 40μm 标准滤网，请将其倒置。 - 轻轻地吸气脱落的球体（从步骤1.4.3），并通过过滤器通过球形悬架。
注意：球体将保留在过滤器上：单个细胞将流过与介质。 - 使用血清学移液器，在整个井面上分配1mL的温暖基底介质，以去除了任何剩余的球体，并在过滤器上恢复它们。
- 重复此洗涤步骤 1.4.6 两次。
- 观察显微镜下的板，以确保从微井中去除所有球体。如有必要，重复洗涤（步骤 1.4.6-1.4.7）。
- 倒置滤网，并将其放置在新的15mL圆锥管上。通过用DMEM/地下室膜基质介质清洗滤网收集球体。
注：收集的球体已准备好用于下游应用和分析。
- 球体的长期文化
- 在基础介质中准备 1.5% 的 agarose 溶液，并通过自杀灭（标准循环）消毒。
- 虽然蔗糖溶液是温暖和静止的液体，涂上标准培养板或菜肴的井，如 表2所述。
注意：加热烤箱中的盘子/盘子将促进涂层步骤。涂层的盘子/盘子可以在RT的无菌环境中最多留10天，并免受光线的伤害。 - 在糖衣板中播种收获的球体（从步骤 1.4.9 开始），并添加 DMEM/地下室膜基质介质，根据板的大小实现最终体积。
注意：为了避免球形聚合物，以22球形/cm2的最佳密度播种它们。观察涂层并非完全平坦，它向边缘上升，在板的中心产生光凹。如果球体的数量过高，它们更有可能相互粘附。 - 在37°C/5%CO2 中孵化板，直到球体恢复以进行特定分析。
- 用化疗药物治疗球形
- 板球体从步骤1.5.4，并增长他们2天。从第3天（D3）开始，用福尔菲里（5-氟酸，50微克/升） 治疗：伊里诺特坎， 100μg/mL;卢科沃林，25微克/升）或与福尔福克斯（5-氟酸，50微克/升;氧化铂，10微克/升;Leucovorin， 25 μg/mL） 化疗方案组合通常用于治疗CRC患者22，23，24，25，或保持他们在（控制）未治疗（NT）状态。
- 经过3天的治疗后，使用尖端切断的移液器（1，000μL尖端）收集球体，确保每个情况至少由三个复制品表示。以1，000× 克 的速度将它们离心3分钟，然后取出超自然。
- 修复颗粒在2%的副甲醛（PFA）组织学分析（见第3节），或使用颗粒进行RNA提取（见第4节）。
- 为了分析细胞死亡，在DMEM/地下室膜基质介质中从步骤1.6.1中孵育球体30分钟，核酸污渍（1：5000稀释）不会渗透活细胞，而是穿透死细胞26的受损膜。用微板读卡器测量荧光的积累。
2. 监测球形生长
- 使用倒显微镜，获取不同条件下在不同条件下保持的球体的代表性图像。
- 使用适当的软件测量每个球形的三个不同代表性直径来分析图像。
- 使用以下公式获取估计的球体体积。
注：术语，d1，d2和d3，是球体的三个直径。
3. 免疫荧光（IF）和组织染色
- 固定和石蜡嵌入
- 使用移液器在选定的时间点收集球体，并按步骤 1.6.2 将尖端切断，并在 RT 以 2% PFA 固定 30 分钟。
注：或者，在此步骤中将样品存储在 4 °C，直到进一步使用。 - 对于石蜡嵌入，用PBS 1x清洗球体3倍，并以70%乙醇重新填充。石蜡内含和分割后，进行血氧林和异丙辛 （H&E） 染色，用于组织学分析。
- 使用移液器在选定的时间点收集球体，并按步骤 1.6.2 将尖端切断，并在 RT 以 2% PFA 固定 30 分钟。
- 石蜡部分的免疫带
注：使用5微米厚的部分进行间接免疫染色。- 在 60 °C 下孵化滑梯，持续 2 小时，以熔化蜡并改善去帕芬化。
- 用甲基环丙烷清洗两次幻灯片3分钟。
- 在 1：1 甲基环丙烷：100% 乙醇中清洗幻灯片 3 分钟。
- 在100%乙醇中清洗幻灯片两次，3分钟。
注意：执行所有操作步骤 3.2.2 到步骤 3.2.4 在化学罩。 - 在90%乙醇中清洗幻灯片3分钟。
- 在 75% 乙醇中清洗幻灯片 3 分钟。
- 在50%乙醇中清洗幻灯片3分钟。
- 在自来水下清洗滑梯。
- 在蒸馏水中补充滑梯水分5分钟。
- 准备700mL的0.01 M柠檬酸盐缓冲器，pH 6.0，并将其添加到一个合适的容器（宽度：11.5厘米，长度：17厘米，高度：7厘米）：淹没在它的幻灯片。在 700 W 时在微波炉中加热容器 9-10 分钟，当沸腾开始时，将功率降低到 400-450 W. 孵化再加热 10 分钟。
- 让幻灯片在缓冲区冷却到RT约30-40分钟。
- 在 PBS 中清洗幻灯片两次，5 分钟。
- 用记号笔在各部分周围画一个圆圈，为应用于各部分的液体设置屏障。
- 在 RT 中用 50 μL 的阻塞缓冲区（10% 普通山羊血清、1% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.02% Triton X-100 在 PBS 中孵化每个部分，至少 30 分钟。
- 取出阻塞缓冲，并在孵化缓冲区中稀释 50μL 的主要抗体（1% 普通山羊血清、0.1% BSA 和 0.02% Triton X-100 在 PBS 中）。在RT孵化2小时或在4°C过夜。
- 取出主要抗体，在PBS中清洗幻灯片3次5分钟。
- 在 RT 的孵化缓冲区中用 50μL 的荧光二次抗体稀释 1 小时，孵化幻灯片。
- 去除辅助抗体，在PBS中清洗幻灯片3次5分钟。
- 在每个部分添加 50μL 的安装介质，并加入 4+，6-2-苯绒，并在该部分放置玻璃盖片。
4. RNA提取、反向转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和定量RT-PCR（qRT-PCR）
- 在不同的时间点收集球体，每个点由至少三个复制品表示。以1，000× 克 的速度将它们离心3分钟，然后取出超自然。
注：颗粒可直接用于RNA提取或存储在-20°C，直到进一步使用。 - 根据制造商的说明，使用商用 RNA 隔离套件分离总 RNA。
- 根据制造商的说明，将每个RNA样本中的500 ng反向转录为补充DNA（cDNA），并使用商业套件。
- 反向转录后，对 cDNA 的 1 μL 进行 PCR 分析，以放大位于不同外位的引物的内务基因。
注：此步骤可验证RNA制剂中没有任何基因组DNA污染。对于此协议，使用多肽异丙酶 B（PPIB） 引因。 - 使用特定于感兴趣基因的引物，对先前稀释的 cDNA 的 4μL（无 RNAse 双蒸馏水中的 1：10）进行 qPCR 放大。在每个样本中，使用与家政基因水平正常化的ΔΔCt方法和值来量化特定的 mRNA 表达。
注：对于此协议，选择了β行为（ACTB）。 本协议中使用的引金列在 表 3 中。
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Representative Results
由于球体大小缺乏同质性是目前可用的3D球形培养系统13的主要缺点之一，这项工作的目的是建立一个可靠和可重复的协议，以获得同质球体。首先，为了建立理想的工作条件，使用专用板（表1）测试了不同数量的Caco2细胞，每个微孔/球体的细胞从50到2000个不等。实际上，这些板块中的每口井都含有1，200个微孔，使每口井形成相同数量的球形，更重要的是，形成一个球形的外周微井21。经过两天的培养，含有2000个细胞的球形外孔井成长为单层，50个细胞外球体产生小而非同质的球体（图1A）。因此，这两个条件被排除在进一步分析之外。为了建立长期文化，球体从微井中收获，并在新准备的糖衣板中非粘附条件下播种。然后，通过测量体积的变化，在整个实验时间过程中监测球状体的生长。考虑到非球形形状，测量了每个球体的三个不同直径，并应用了体积公式27（图1B）。在整个实验过程中，来自100个和200个细胞产生的球体保持了初始大小，而那些含有1000个细胞的球体由于体积大而在收获过程中解体，因此在体积上表现出更多的变异性。因此，由于500个细胞产生的球体在实验过程中显示出最均匀的体积增加，因此这一细胞数量被用于球体形成。
其次，除了500个细胞外，还研究了300到800个细胞的额外细胞数量。此外，为了改善不粘附的条件，修改了原来的协议，预先处理了两次井，而不是只应用一次洗涤。随着这些变化（图2A），球体均匀性和压实性得到了改善。每个条件下的球体大小在收获时测量（图2B），它们的长期生长在加糖涂层菜肴（图2C）中监测了整个天的文化。根据结果，500和600个细胞/球体被确认为最佳条件，产生良好的生长和低变异性。由于在整个实验过程中的生长特征更加均匀，并且形成了紧凑的结构，因此选择600个球体外球细胞作为细胞编号供后续实验使用。最后，为了进一步完善协议，DMEM完整的介质补充了2.5%的基层膜基质，其中包含额外的生长因子和大量的细胞外基质蛋白28。事实上，球体的多球形可能是由于缺乏来自微环境的信号，这可能影响细胞偏振29，30。地下室膜基质的加入增强了球体生长，改善了其同质性（图2D）。这种改进的一个例子可以看到500个细胞外球体。在没有地下室膜基质（图1B）的情况下，球体的大小更加异质，从D3翻倍到D7，然后到达高原。然而，在地下膜基质（图2C）的存在下，每个时间点的球体大小更加均匀，随着时间的推移呈成比例增长。
为了分析球体的长期特征，在涂有糖衣的盘子中培养后，在不同的时间点恢复它们，以便对石蜡部分进行详细的组学和IF分析。H&E染色表明，球体内的细胞随着时间推长，其组织和形状会发生变化。事实上，细胞在D3的多层中密集排列，而单层排列的扁平细胞在D10中清晰可见。有趣的是，正如图像中的黑色虚线所示，从D5开始，球体中出现了一个流明（图3）。同时，IF使用增殖标记、增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞死亡标记（活性催化壳酶3）对细胞增殖和凋亡进行了分析。PCNA的标签显示，增殖细胞经常存在于球体的外表面，有时在隐秘状或芽状结构中，让人联想到器官培养15。此外，观察到D5和D7的PCNA阳性细胞明显增加，下降D10（图4，左面板）。令人惊讶的是，在D3和D5（图4，左面板）和较长时间（未显示的数据）的球体中很少的细胞中观察到活性壳酶3。石蜡部分还评估了β-卡泰宁的表达模式。有趣的是，在每个时间点都观察到高浓度的β-卡泰宁表达，具有清晰的膜绑定和细胞质染色（图4，右面板）。值得注意的是，膜绑定β-卡特宁通过与E-卡德林31结合参与细胞粘附。在各时点的细胞群中都注意到了高水平的卡泰宁标签。在某些情况下，细胞还显示明确的核 +卡泰宁本地化（图 4，右面板）。众所周知，Caco2细胞在2D中分化体外细胞主要分为19、32等肠道细胞。然而，IF（未显示的数据）在这些球体中检测不到分化标记的表达，如染色素A（肠内分泌细胞）、溶酶（胰腺细胞）或粘液2（MUC 2，杯状细胞）。然而，由于球体表示ALPI（碱性磷酸酶）和溶解载体家族2，成绩单变种2（SLC2A5）/葡萄糖运输机5（GLUT5）mRNA（图5），分化成肠细胞的可能性得到了证实。这些 mRNA 水平在 D5 和 D7 中增加，但与 D3 级别相比，差异不是显著（ALPI），就是只有轻微显著（SLC2A5）。
为了确定基于这种新方法生成和培养的球体是否是研究 CSC 的可靠工具，IF 和 qRT-PCR 分析了 CSC 标记的表达。CD133和CD44是癌细胞种群的特点，包括CS7、33、34，并且由普通肠和结肠33、34、35的SCs表示。CD133正向细胞的簇主要在每个时间点（图6A，左面板）的球体外部表面进行局部化。CD44阳性细胞较少，但总是与CD133阳性细胞（图6A，右面板）相关联，表明存在CD133/CD44双阳性CSC样细胞群，而种群只表示CD133。嗅觉素 4 （OLFM4） 和武藏 1 （MSI1） 被检查为 SC/CSC 标记：这些标记在结肠密码36，37和在不同的细胞种群35，38以非常有限的方式表达。每个时间点只观察到几个 MSI1 阳性细胞（图 7），而 OLFM4 仍无法检测（未显示数据）。然而，正如CD44和CD133观察到的，MSI1标记的细胞位于球体的外部表面，具有类似加密或芽状结构。在涂有糖衣的菜肴中，在培养后，在 mRNA 级别同时分析相同的标记。醛脱氢酶1（ALDH1a1）也包含在研究中（图8）中，该标记是CSC39，40的特征良好的标记。对蛋白-1（CD133的PROM1编码）和CD44 mRNA的分析证实了在所分析的所有时间点，两个标记在球体中的表达。但值得注意的是，虽然PROM1 mRNA水平在文化中与一段时间相当相似，但CD44水平从D3开始下降。然而，在比较D10和D3的mRNA水平时，差异只是略显显著。
MSI1 mRNA的分析证实了它在每个时间点的球体表达，与D7或D10（图8）相比，D3和D5的表达水平要高得多，而OLFM4 mRNA则无法检测（未显示）。最后，ALDH1a1 mRNA在每个时间点都以球形表示，并显示在D10时下降的表达特征，与D3（图8）相比，水平仅略显显著。为了验证研究癌细胞生物学的新模型的恰当性，在用FOLFOX或FOLFIRI治疗的球形中分析了化疗的反应，并定期给CRC患者22、23、24、25进行联合疗法。首先，通过用荧光核酸污渍孵育球体来检查诱导细胞死亡的治疗效果，该污渍专门进入死细胞26。与控制NT条件相比，每种药物的治疗均以荧光的积累（图9A）来测量显著细胞死亡。这一观察也通过活显微镜在形态学水平上得到证实，这表明治疗对球体的大小和外观有强烈影响（图9B）。最后，在相同条件下（图9C）中，qRT-PCR对SC/CSC标记的表达进行了分析。有趣的是，与对照水平相比，FOLFOX 和 FOLFIRI 条件下的PROM1 mRNA 水平显著下降，而MSI1水平不受治疗的影响。此外，与对照剂相比，FOLFOX 对ALDH1a1 mRNA 表达没有影响，但与 FOLFIRI 一起治疗显著提高了其水平。未检测到OLFM4 mRNA，CD44 mRNA 水平极低（未显示数据）。
图1：球形文化的设置。 （A） 从Caco2细胞的指示浓度开始的球 状形成。顶板展示了两天文化后整个文化板块的代表形象。底部面板显示每个条件所选微井的图像。图像的放大倍数为4倍（微井大小：400微米）。比例杆：低放大倍率，100μm;高放大倍数，30μm。（B） 每个微孔中不同数量的细胞产生的球体的生长特征，并在不同的时间点进行分析。请注意，指示的日子包括微井中前两天的培养和随后在糖衣板中收获的球体的文化。直方图显示平均±标准偏差，n = 4=6。黑圆显示单个球体的值。估计体积的公式显示在面板的上部，其中 d1、d2 和 d3 表示每个球体测量的三个直径。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：优化球体形成和文化的条件。 （A） 具有代表性的球形图像在D7后，他们从微井恢复（2天）和文化在糖衣菜（5天），使用新的井准备和文化介质条件。比例杆：30微米。（B） 微井中细胞培养开始两天后新收获的球体的估计体积。直方图显示平均±标准偏差 （SD），n = 4=6。黑圆表示单个球体的大小。（C） 根据新选择的条件，估计长期文化中球体的数量。图显示了球体中不同数量的细胞产生的球体的生长特征，并在收获后的不同时间点进行分析，如所示。直方图显示平均± SD，n = 6=10。黑圆表示单个球体的大小。（D） 在实验时间过程（右面板）和微孔（左面板）内选择的600个细胞的代表性图像。图像的放大倍数是4倍。比例杆：低放大倍率，100μm;高放大倍数，30μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：球体的系统特征。 组织造血素和石蜡部分的黄素 （H&E） 染色。如所示，在收获后指示的时间点对球体的代表性图像。每个高放大插图中的黑色虚线划定球体内的流明。比例杆：低放大倍率，30μm;高放大倍数，10μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：通过免疫球状的可可2球体特征。 在指示时间对球体进行免疫染色，用于增殖细胞核抗原（PCNA、红色）和细胞死亡标记物，激活壳酶 3（绿色）（左面板）和β-卡泰宁（红色）（右面板）。图像显示合并标记的PCNA（红色），激活的木膏3（绿色），和核（蓝色）或β-卡泰宁（红色）和核（蓝色）。白箭指向细胞或细胞组，表达高水平的β-卡泰宁。图像拍摄的目标是20倍。比例杆：5微米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：按qRT-PCR分析肠细胞分化标记。分析ALPI和SLC2A5编码碱性磷酸酶和GLUT5蛋白质，分别。直方图显示平均±标准偏差，n = 3，在对ACTB正常化后。与正常结肠粘膜（红线 =1）相比，数据表示为折叠变化。NS：不重要：MS：通过未修复的学生测试与D3相比，意义不大。缩写：qRT-PCR =定量反转录-聚合酶链反应;胶质5=葡萄糖运输机5：SLC2A5=溶解载体系列2，成绩单变体2：ACTB=β行为。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：球体中干细胞标记、CD44和CD133的异质表达。 在指示时间对干细胞标记物 CD133 和 CD44 进行免疫染色。左面板中的图像显示 CD133（绿色）和核（蓝色） 的合并标记：右面板中的相同图像显示 CD44（红色）和核（蓝色）的合并标记。左面板中的绿色箭头指向 CD133 表达单元，两个面板中的白色箭头指向表示 CD44 和 CD133 的单元或细胞组。图像是以20倍的目标获得的。比例杆：5微米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：干细胞标记的异质表达，MSI1，在球体中。 在指示时间对干细胞标记 MSI1 （红色） 进行免疫染色。图像显示 MSI1（红色）和核（蓝色）的合并标记。白色虚线突出了一些类似加密的结构，其中细胞对 MSI1 免疫带呈阳性。图像的放大倍数是20倍。比例杆：5微米。缩写=MSI1=武藏1。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：qRT-PCR对干细胞标记物的分析。在指示时间对球体中的 mRNA 进行PROM1、CD44、MSI1和ALDH1a1级别的量化。 直方图显示平均±标准偏差，n = 3，在对ACTB正常化后。与正常结肠粘膜（红线 =1）相比，数据表示为折叠变化。NS：不重要：MS：与D3相比，使用未修好的学生t测试略显显著。*：P <与D3或D5相比为0.05，使用未修复的学生t-测试。缩写：qRT-PCR =定量反转录-聚合酶链反应;PROM1=蛋白-1：MSI1 = 武藏 1;ALDH1+1 = 醛脱氢酶 1 阿尔法;ACTB=β行为。请单击此处查看此图的较大版本。
图9：化疗对球体的影响。从微井中收获后，球体在高糖涂层板中培养，用FOLFOX或FOLFIRI治疗3天，或保持（控制）非处理（NT）状态。（A） 对死细胞中核酸标签造成的荧光分析。直方图显示平均±标准偏差 （SD），n = 4。（B） 在不同的文化条件下保持球体的形态特征。图像的拍摄目标是4倍。比例杆：400微米。（C） 通过 qRT-PCR 对PROM1、MSI1和ALDH1a1 mRNA 进行量化。 直方图显示平均± SD， n = 4， 在对ACTB正常化后。*：NS：不重要：P < 0.05;**： P < 0.01;：P < 0.001 与控制 （NT） 条件相比， 使用未修复的学生t 测试。缩写：福尔福克斯 = 5-氟酸，50微克/升;氧化铂，10微克/升;卢科沃林， 25 微克/升;福尔菲里 = 5-氟酸，50微克/升;伊里诺特坎， 100μg/mL;卢科沃林， 25 微克/升;qRT-PCR =定量反转录-聚合酶链反应;PROM1=蛋白-1：MSI1 = 武藏 1;ALDH1+1 = 醛脱氢酶 1 阿尔法;ACTB=β行为。请单击此处查看此图的较大版本。
| 球形外细胞的所需数量 | 每口井所需的细胞数量 |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1.2 x 105 |
| 200 | 2.4 x 105 |
| 300 | 3.6 x 105 |
| 400 | 4.8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7.2 x 105 |
| 700 | 8.4 x 105 |
| 800 | 9.6 x 105 |
| 1000 | 1.2 x 106 |
| 2000 | 2.4 x 106 |
表1： 球形形成和细胞播种的摘要。
| 10 毫米菜肴 | 6 井板 | 12 井板 | 24井板 | 96 井板 | |
| 涂层体积 | 4升 | 300μL | 250μL | 150μL | 50 微升（向下和向上） |
表2： 用于涂覆不同盘子/盘子的大量高糖溶液。
| 基因 | 引 | 序列 | 产品长度 | |
| 分化标记 | 阿尔皮 | 向前 | CTG GTA反恐委员会特加特克特加卡 | 81 |
| 反向 | 阿特格·塔格·加格·阿格·阿格特加·特加·格特 | |||
| SLC2A5 | 向前 | 塔克· 卡塔克 · 塔格 · 阿格 · 加特 · 加 | 94 | |
| 反向 | 阿卡阿格阿加加加特加股份公司 | |||
| 干细胞标记 | 阿尔德1a1 | 向前 | 海合会贸易委员会ACA加特卡阿卡加格 | 147 |
| 反向 | 贸易和贸易委员会AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | 向前 | 阿格特TGG卡格行动交流卡格GA | 131 | |
| 反向 | TG TCC在一个GTG交流 | |||
| 促销1 | 向前 | 格塔阿加ACC阿格阿格 | 131 | |
| 反向 | 海合会TTG TCC TTG格塔格特克 | |||
| CD44 | 向前 | TGC CT塔格特·阿塔克 | 160 | |
| 反向 | TGA AGT广义广义通信技术贸易委员会 | |||
| 奥夫姆 4 | 向前 | TCTGTG TCC卡格特克特克 | 118 | |
| 反向 | 阿泰卡阿格特卡反恐委员会 | |||
| 家政基因 | 行动 | 向前 | 仙人掌猫T卡卡塔加GCG GTT C | 134 |
| 反向 | 阿格·特克·克·阿特克·特克·阿克特 | |||
| PPIB | 向前 | ATG ATC卡格格格加加克TT | 100 | |
| 反向 | 海合会CGT阿格特克特卡特克特特克特 |
表3： 用于定量反转录-聚合酶链反应的引物。
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Discussion
体外3D模型克服了2D癌细胞培养的主要实验缺陷，因为它们在回顾典型的肿瘤特征（包括微环境和细胞异质性）方面似乎更可靠。常用的球体 3D 模型是无脚手架（在低附件条件下培养）或基于脚手架（使用生物材料培养细胞）。这些方法由于取决于使用的脚手架的性质或产生结构和大小变化的球体而呈现不同的缺点。
本协议报告了使用无脚手架方法从结肠腺癌细胞系 Caco2 中产生同质球体的优化条件。球体很容易收获，与先前报道的研究相反，它们生长成功，在文化时期它们的生长特征也可以分析。此外，使用这种新方法，球体（a） 积极增殖，（b） 细胞死亡率很低，（c） 组织在球体内形成流明，（d） 表现出组分细胞的分化能力。鉴于新方法的最终目的是将其用于CSC生物学研究，分析了CSC不同标记的表达。有趣的是，标记根据时间点和定义不同的 CSC 群呈现动态表达模式。
最重要的是，通过本协议产生的球形可用于分析与临床应用相关的药物，如化疗方案、FOLFOX 和 FOLFIRI。研究结果还强调细胞对药物的异质反应取决于所分析的CSC标记。这一观察与目前的观点一致，即肿瘤内的异质和多个类似CSC的细胞群表现出不同的化疗敏感性/化学耐受性特性42，43。这一发现有力地证明了这种大规模筛查新方法的适用性。除了本研究中报告的应用外，新协议还可用于更广泛的分析（例如RNA和/或DNA提取和大规模分析、西式印迹和免疫荧光）。事实上，球体的体积和生长特性可以通过应用球体体积公式来轻松确定，如果必要的话，该公式还考虑到不同的直径来平衡与完美球形的偏差。但是，应根据细胞类型（细胞系或新鲜初级培养物）和复制时间等生长能力优化特定参数。然而，协议指出了可以轻松调整的关键步骤。
在执行本文中描述的球形生成时，需要考虑一些关注点。首先，应使用防粘性冲洗解决方案执行几个洗涤步骤，以促进球体的均匀性和压实性。在这种情况下，需要洗两次。其次，必须从微井中去除气泡，因为这样会干扰球体的正确形成。第三，一旦离心步骤后细胞在每个微井中播种，板必须保持两天不受干扰。在研究球形形成的早期步骤时，可能需要对协议进行其他考虑和更改，可能包括自动可视化和成像系统。第四，在不干扰球体的情况下改变媒介，鉴于它们处于悬浮状态，可能具有挑战性。因此，建议每次只更改一半的音量。第五，在收获球体时，重要的是要保持其结构。因此，建议在含血清介质或 PBS 中冲洗后，使用带有尖端的血清移液器或微皮带，以防止球体粘附在提示上。
使用此协议时也可能遇到一些限制。首先，并非所有的细胞系或细胞类型都有相同的培养参数：在某些情况下，细胞异质性和细胞的通过/老化数量也可能影响形成球体的能力。其次，与有机体相反，在文化中长期维持球体可能很困难。此外，它们不能通过微皮尖15的简单碎片复制。第三，此协议不能适应单球体分析，因为一个接一个地手动恢复球体可能比较棘手。该技术更适合同时获得大量同质球体。最后，对于研究来自其他细胞类型的生长因子的影响或分析微环境的重要性的研究，丰富模型和进行共同培养实验非常重要。
最后，目前的方法描述了一个新的协议，有效地生成和培养球体从Caco2细胞。结果表明，该方法可应用于肿瘤异质性研究及CSC分析。该方法还可用于高通量药物筛选和癌症和非癌细胞干细胞生物学研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
我们确认成像和阿尼帕德重新切切组织学平台 （CRCL， CLB）.我们感谢里昂·贝拉德中心（CLB）医院的药房，感谢福尔福克斯和福尔菲里赠送的实物礼物。我们还感谢布里吉特·曼希普对手稿的批判性阅读。这项工作得到了FRM（2018年FRM，DEQ20181039598）和印加（PLBIO19-289）的支持。MVG 和 LC 得到了 FRM 的支持，CF 得到了 ARC 基金会和莱昂·贝拉德中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
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