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Immunology and Infection

एक समकालीन वार्मिंग/एक Murine कवक सेप्सिस मॉडल में कुशल पूंछ नस इंजेक्शन के लिए निरोधक उपकरण

Published: November 6, 2020 doi: 10.3791/61961
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Center for Oral and Craniofacial Biology, Louisiana State University Health-School of Dentistry, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

Summary

यहां, हम एक विशिष्ट डिजाइन वार्मिंग/निरोधक डिवाइस का उपयोग कर कृंतक पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एक प्रभावी और कुशल विधि पेश करते हैं । वासोडिलेशन और निरोधक प्रक्रियाओं की शुरुआत को व्यवस्थित करके, यह प्रोटोकॉल कम से कम संकट वाले जानवरों के बड़े समूहों के सटीक और समय पर नसों के इंजेक्शन की अनुमति देता है।

Abstract

कृंतक मॉडल में, पूंछ नस इंजेक्शन प्रयोगात्मक एजेंटों के नसों में प्रशासन के लिए महत्वपूर्ण तरीके हैं। पूंछ नस इंजेक्शन आम तौर पर पशु के वार्मिंग शामिल करने के लिए vasodilation को बढ़ावा देने, जो रक्त वाहिकाओं की पहचान और पोत lumen में सुई की स्थिति दोनों में एड्स जबकि सुरक्षित रूप से जानवर निरोधक । हालांकि पूंछ नस इंजेक्शन कई प्रोटोकॉल में आम प्रक्रियाएं हैं और यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है तो अत्यधिक तकनीकी नहीं माना जाता है, सटीक और लगातार इंजेक्शन प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने और परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। पूंछ नस इंजेक्शन से पहले वासोडिलेशन को प्रेरित करने के लिए पारंपरिक तरीके आम तौर पर गर्मी के स्रोत जैसे गर्मी दीपक, इलेक्ट्रिकल/रिचार्जेबल हीट पैड, या 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म पानी के उपयोग पर निर्भर करते हैं। एक मानक प्रयोगशाला की स्थापना में आसानी से सुलभ होने के बावजूद, इन उपकरणों जाहिर है गरीब/सीमित थर्मो नियामक क्षमता से पीड़ित हैं । इसी तरह, हालांकि निरोधक उपकरणों के विभिन्न रूपों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, वे ध्यान से इस्तेमाल किया जाना चाहिए जानवरों के लिए आघात से बचने के लिए । वर्तमान विधियों की ये सीमाएं प्रयोगों में अनावश्यक चर बनाती हैं या परिणामस्वरूप प्रयोगों और/या प्रयोगशालाओं के बीच अलग-अलग परिणाम होते हैं ।

इस लेख में, हम एक अभिनव डिवाइस का उपयोग करके एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं जो कुशल सुव्यवस्थित पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एक प्रणाली में समायोज्य निरोधक इकाई के साथ एक स्वतंत्र, थर्मलली विनियमित, वार्मिंग डिवाइस को जोड़ती है। उदाहरण हम उपयोग फंगल रक्तप्रवाह संक्रमण का एक नसों में मॉडल है कि सेप्सिस में परिणाम है । वार्मिंग उपकरण एक गर्मी चिंतनशील ऐक्रेलिक बॉक्स एक समायोज्य स्वचालित थर्मोस्टेट के साथ स्थापित करने के लिए एक पूर्व निर्धारित सीमा पर आंतरिक तापमान बनाए रखने के होते हैं । इसी तरह, शंकु निरोधक तंत्र की चौड़ाई और ऊंचाई को विभिन्न कृंतक आकारों को सुरक्षित रूप से समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। डिवाइस की उन्नत और बहुमुखी विशेषताओं के साथ, यहां दिखाई गई तकनीक कृंतक मॉडलों को शामिल करते हुए अनुसंधान क्षेत्रों की एक श्रृंखला में एक उपयोगी उपकरण बन सकती है जो पूंछ नस इंजेक्शन को नियोजित करती है।

Introduction

कृंतक से जुड़े पशु मॉडल का उपयोग जैव चिकित्सा अनुसंधान का एक प्रधान रहा है। कई inbred और outbred उपभेदों, साथ ही आनुवंशिक रूप से संशोधित लाइनों, उपलब्ध है और नियमित रूप से दुनिया भर में प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल कर रहे हैं । पूंछ नस इंजेक्शन कृंतक मॉडल में आवश्यक तरीकों में से एक है जिसमें प्रयोगात्मक एजेंटों के नसों (i.v.) प्रशासन की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, जीवी इंजेक्शन के प्रशासन के अन्य मार्गों जैसे स्थानीय ऊतकों और पाचन तंत्र को दरकिनार करके उच्च अवशोषण दर और सांद्रता या गैर-शारीरिकपीएच1, 2,3,4के समाधानों के लिए उच्च सहिष्णुता जैसे प्रमुख फायदे होते हैं। अन्य व्यवहार्य इव मार्गों (उदाहरण के लिए, सैफेनस नसें, रेट्रो-ऑर्बिटल वेनस साइनस), पूंछ की नसें कृंतक2,3,5,6में सबसे सुरक्षित और सबसे आसानी से सुलभ रक्त वाहिका मानी जाती हैं। इसलिए, संक्रामक रोग मॉडल 7 , 8 ,9,जैविक सामग्री का प्रत्यारोपण10,11,प्रीक्लिनिकल चिकित्सा विज्ञान 12,13और विषविज्ञान विश्लेषण14,15सहित कृंतक मॉडलों की एक सरणी में पूंछ नस इंजेक्शन को व्यापक रूप सेनियोजितकिया गया है।

स्थिरता और डोजिंग की सटीकता सफल पूंछ नस इंजेक्शन में एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। हैरानी की बात यह है कि साहित्य में पूंछ के नस के इंजेक्शन का मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन अक्सर गलत इंजेक्शन16,17को फंसाता है । एक अध्ययन में बताया गया है कि प्रशिक्षित इंजेक्टरों द्वारा किए गए तीस इंजेक्शनों में से बारह ने18पूंछ के भीतर इंजेक्शन की 10% से अधिक मात्रा में छोड़ दिया । इसके अलावा, प्रक्रिया के दौरान पूंछ नस इंजेक्शन प्राप्त करने वाले जानवर की सुरक्षा और आराम एक प्राथमिक चिंता का विषय होना चाहिए। अनुचित संयम चोटों और तनाव से संबंधित विकृतियों (जैसे, वजन घटाने, बिगड़ा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं) की एक श्रृंखला है कि नमूना गुणवत्ता19,20में पर्याप्त चर शुरू कर सकता है के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इन त्रुटियों से डेटा में परिवर्तनशीलता और खराब प्रजनन क्षमता हो सकती है, इस प्रकार अध्ययन परिणामों को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया जा सकता है।

पोत के छोटे व्यास के कारण पूंछ नस इंजेक्शन का प्रदर्शन करते समय जानवर में संवहनी फैलाव का प्रेरण अक्सर आवश्यक होता है, चूहों में 300 माइक्रोन होने का अनुमानहै 21। वासोडिलेशन वेनस ल्यूमेन के भीतर इष्टतम सुई-नस संरेखण प्राप्त करने में पूंछ की नसों और एड्स की दृश्यता को बढ़ाता है। प्रयोगशालाओं द्वारा विभिन्न प्रकार के तरीकों की सूचना दी गई है जैसे कि पूंछ को गर्म पानी में डुबोना22,गर्म कपड़े, दीपक, या हेयर ड्रायर23, 24का उपयोग करके पूंछ पर गर्मी लगाना, या जानवर को गर्म वातावरण में रखना, एक हीटिंग पैड, इनक्यूबेटर, या बॉक्स का उपयोग करके इन गर्मी स्रोतों में से एक के साथ संयुक्त25। उपकरणों को या तो विशिष्ट उद्देश्यों के लिए स्वयं बनाया जा सकता है या वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से उपलब्ध हो सकता है। हालांकि, कई थर्मोरेगुलेटरी क्षमताओं की कमी है और यदि कोई हो, तो डिवाइस का तापमान खराब रखा जाता है और अक्सर कमरे के तापमान में भिन्नता के अधीन होता है। इसी प्रकार, पूंछ की नस के इंजेक्शन के लिए निरोधक उपकरण का उपयोग आवश्यक है क्योंकि संज्ञाहरण के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है26,27. प्रयोगशाला-विशिष्ट या वाणिज्यिक निरोधक उपकरणों के कई प्रकार विकसित किए गए हैं। आमतौर पर, जानवर को डिस्पोजेबल 50 मिलीलीटर शंकु नली4,स्लॉटेड प्लेक्सीग्लास दीवारों, एक सुरंग, या शंकु28में रखा जाता है, जिनमें से सभी जानवर के आंदोलनों को प्रतिबंधित करते हुए पूंछ के पर्याप्त जोखिम की अनुमति देते हैं। हालांकि, अधिकांश निरोधक सामग्रियों की कठोरता के कारण आकार सीमाएं होती हैं। इसके अलावा, व्यावहारिक और परिष्कृत डिजाइनों के बावजूद आधुनिक उच्च जटिलता उपकरण, जानवरों के बड़े समूहों से जुड़े इंजेक्शन के लिए व्यवहार्य प्रतीत नहीं होतेहैं 22।

रक्तधारा संक्रमण और संबद्ध सेप्सिस के माउस मॉडल इस तकनीक के उपयोग की आवश्यकता स्थितियों का एक प्रमुख उदाहरण हैं। गंभीर नैदानिक सेप्सिस के सभी माइक्रोबियल एटियोलॉजी में, फंगल सेप्सिस अक्सर एंटीफंगल थेरेपी29के बावजूद >40% की मृत्यु दर के साथ एक घातक स्थिति होती है। वास्तव में, कैंडिडा एल्बिकान द्वारा संक्रमण को अस्पताल द्वारा अधिग्रहीत रक्तप्रवाह संक्रमण (कैंडिडेमिया)30, 31का चौथा प्रमुख कारण बताया गया है। इंट्रा-पेट कैंडिडियासिस में, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में सूक्ष्मजीव रक्त के माध्यम से प्रसारित हो सकते हैं और पॉलीमाइक्रोबियल सेप्सिस का कारण बन सकते हैं और इससे भी अधिक मृत्यु दर32,33,34। चूंकि अधिकांश नोसोकोमियल कैंडिमिया के मामले दूषित केंद्रीय रेखा कैथेटर या इंडवेलिंग मेडिकल डिवाइस35,36से निकलते हैं , यानी पूंछ के नस के इंजेक्शन से सी एल्बिकान के साथ टीका लगाने से मानव सेप्सिस विकास को बारीकी से प्रतिबिंबित किया जा सकता है और हेमेटोजेनस द्वारा प्रसारित कैंडिडियासिस 37,38के माउस मॉडल में एक मुख्य विधि रही है। इस मॉडल में, दिनों में होने वाली मृत्यु दरको सी एल्बिकान यानी40,41को समायोजित करके बढ़ाया या छोटा किया जा सकता है।

हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला ने एक सुविधाजनक प्रणाली में एक समायोज्य निरोधक इकाई के साथ जोड़ा गया थर्मोरेथुलेटेड वार्मिंग इकाई से लैस एक अभिनव उपकरण का उपयोग करके एक इष्टतम सुव्यवस्थित पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एक अभिनव प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को सटीक और समय पर तरीके से पूंछ नस इंजेक्शन करने की अनुमति देता है, जबकि जानवरों को न्यूनतम संकट के साथ प्रक्रिया के लिए सुरक्षित रूप से वातानुकूलित और संयमित किया जा सकता है। उन्नत वार्मिंग और निरोधक उपकरण के उपयोग के साथ यहां प्रदर्शित तकनीकें, कृंतक मॉडलों को नियोजित करने वाले विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम कर सकती हैं।

Protocol

पूंछ नस इंजेक्शन और वार्मिंग/निरोधक उपकरण के उपयोग से जुड़े सभी पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. तैयारी

  1. कम से कम 1 सप्ताह के लिए आवास वातावरण में जानवरों को अनुकूलित करें, और भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम की अनुमति दें।
    नोट: इस इंजेक्शन तकनीक के अधिकांश नए उपयोगकर्ताओं के लिए, सफेद या हल्के रंग के फर के साथ पशु उपभेदों बेहतर हो सकता है क्योंकि पूंछ की नसें त्वचा के माध्यम से आसानी से दिखाई देती हैं। चूहों के काले रंग के उपभेदों (जैसे, C57BL/6) या चूहों (जैसे, ब्राउन नॉर्वे) में गहराई से वर्णक पूंछ होती है, जिसके परिणामस्वरूप नस के खिलाफ एक कमजोर रंग विपरीत होता है। यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि नए उपयोगकर्ताओं को प्रवीणता प्राप्त होने तक पर्याप्त प्रशिक्षण प्राप्त हो।
  2. पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एजेंट
    1. सभी परीक्षण एजेंटों और समाधानों को उपयुक्त रूप से तैयार करें। जीवों या सेलुलर सामग्रियों का प्रशासन करते समय, पायरोजन-मुक्त स्थितियों को बनाए रखने के लिए प्रसंस्करण के सभी चरणों के दौरान सावधानी बरतें।
    2. पूंछ नस इंजेक्शन के लिए वाहनों के रूप में केवल सामान्य नमकीन (0.9% डब्ल्यू/वी सोडियम क्लोराइड) या फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) जैसे संतुलित नमक समाधानों का उपयोग करें।
      सावधानी: संवहनी क्षति के संभावित जोखिम के कारण पानी, तेल या चिपचिपा समाधान का उपयोग कभी न करें। कृंतक में रक्त और तेज रक्त प्रवाह दरों के बफरिंग प्रभाव के कारण पीएच (4.5-8.0) की एक विस्तृत श्रृंखला सहनीय है। हालांकि, अत्यधिक अम्लीय या क्षारीय समाधान इंजेक्शन साइट पर अनावश्यक ऊतक क्षति में परिणाम कर सकते हैं और इससे बचा जाना चाहिए।
    3. इंजेक्शन की मात्रा और आवृत्ति को न्यूनतम तक सीमित करें। जानवर 3 को तनाव को कम करने के लिए इंजेक्शन से पहले शरीर के तापमान पर चूहों और चूहों (≤200 माइक्रोन और ≤500 माइक्रोन, क्रमशः) के लिएअनुशंसितमात्रा का उपयोग करें।
    4. सुनिश्चित करें कि सिरिंज और सुई की प्रत्येक तैयारी समाधान में हवा के बुलबुले से मुक्त है; यदि बुलबुले मौजूद हैं, तो एम्बोलिज्म के जोखिम को रोकने के लिए उन्हें पूरी तरह से शुद्ध करें।
      नोट: आमतौर पर, 27 जी, 1/2-इन सुइयों के साथ 1 मिली सीरिंज सबसे पूंछ नस इंजेक्शन के लिए पर्याप्त हैं ।
    5. डिस्पोजेबल या समर्पित गाउन और लेटेक्स या नाइट्राइल दस्ताने के न्यूनतम के साथ स्थानीय IACUC द्वारा आवश्यक उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें। पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करते समय सुरक्षा चश्मे का उपयोग अत्यधिक अनुशंसित है।
  3. वार्मिंग और संयम डिवाइस
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग से पहले सभी घटकों का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें कि डिवाइस किसी भी दोष(चित्रा 1) सेमुक्त है।
    2. वार्मिंग डिवाइस आरंभीकरण(चित्रा 2A)
      1. एक साफ फ्लैट बेंचटॉप पर वार्मिंग इकाई रखें, और डिवाइस पर बिजली । सुनिश्चित करें कि थर्मोस्टेट पावर इंडिकेटर लैंप हरे रंग से जलाया जाता है। क्षेत्र को सूखा रखने और गर्मी बनाए रखने के लिए वार्मिंग कक्ष के अंदर बिस्तर सामग्री रखें।
    3. संयम डिवाइस सेटअप(चित्रा 2B)
      1. वार्मिंग इकाई के साथ संयम इकाई रखें, और जानवर के लिए उपयुक्त शंकु आकार निर्धारित करें। यदि आवश्यक हो, तो जानवर के लिए पर्याप्त संयम प्रदान करने के लिए लचीला एल्यूमीनियम शंकु की आधार चौड़ाई को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। वैकल्पिक रूप से, शंकु को अलग-अलग शरीर के आकार के चूहों या चूहों को समायोजित करने के लिए कस्टम-फिट मॉडल के साथ बदलें।

2. पूंछ नस इंजेक्शन

  1. उपकरण समायोजन
    1. आंतरिक तापमान की स्थापना
      1. नियंत्रण डायल का उपयोग करके, वांछित तापमान पर थर्मोस्टेट सेट करें। सुनिश्चित करें कि हीटर संकेतक लाल जलाया जाता है, और प्रकाश बल्ब रोशन करता है। बल्ब प्रकाशित (हीटिंग) करते समय आंतरिक तापमान प्रदर्शन को ध्यान से मॉनिटर करें। एक बार लक्ष्य तापमान पहुंच जाने के बाद थर्मोस्टेट बल्ब को स्वचालित रूप से निष्क्रिय कर देता है, लगभग 10-15 मिनट में।
        नोट: परिवेश के तापमान से अधिक तापमान निर्धारित करना हीटर को सक्रिय करता है। सामान्य तौर पर, मानक विवारियम स्थितियों में अनुशंसित आवास तापमान 20 से 26 डिग्री सेल्सियस तक भिन्न होता है, जबकि प्रयोगशाला चूहों के लिए तटस्थ (यानी आरामदायक) तापमान 30 और 32 डिग्री सेल्सियस42के बीच माना जाता है। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि वार्मिंग कक्ष का आंतरिक तापमान थर्मोन्यूट्रालिटी की तुलना में थोड़ा अधिक ऊंचा हो, लगभग 32-36 डिग्री सेल्सियस पर। कभी भी थर्मोस्टेट को शरीर के तापमान से ऊपर सेट न करें।
    2. संयम मंच की स्थिति
      1. ऊंचाई समायोजन घुंडी का उपयोग करना, उपयोगकर्ता के लिए इष्टतम स्तर पर शंकु ऊंचाई को समायोजित करें।
  2. हीट उपचार(चित्रा 3A)
    1. एक बार जब लक्ष्य तापमान (32-36 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंच गया है, तो धीरे-धीरे जानवरों को आवास पिंजरे से वार्मिंग कक्ष में स्थानांतरित करें।
      नोट: 5-10 मिनट के लिए हीट उपचार वासोडिलेशन को प्रेरित करने और पूंछ नसों की दृश्यता को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, प्रक्रिया की अवधि के लिए थर्मोरेग में जानवरों को सुरक्षित रूप से आयोजित किया जा सकता है (आमतौर पर हाइपरथर्मिया का कोई संकेत नहीं है) 20-30 मिनट।) । वार्मिंग कक्ष में सुरक्षित रूप से 4-6 चूहे या एक चूहा हो सकता है।
    2. तीव्र गर्मी तनाव के किसी भी संकेत के लिए जानवर की निगरानी करें (उदाहरण के लिए, तेजी से श्वसन, सुस्ती, कूदकर भागने का व्यवहार)।
      सावधानी: हाइपरथर्मिया के लक्षण प्रदर्शित जानवरों को उनके पिंजरे में वापस कर दिया जाना चाहिए और निगरानी की जानी चाहिए जब तक कि वे पुन: उपयोग करने से पहले सामान्य गतिविधि फिर से शुरू नहीं करते। यदि यह इष्टतम सीमा से अधिक आंतरिक तापमान के कारण है, तो सुनिश्चित करें कि वार्मिंग डिवाइस बंद हो गया है।
  3. इंजेक्शन कदम
    1. पूंछ के आधार से जानवर को उठाएं, और इसे वार्मिंग कक्ष से हटा दें। निरोधक इकाई के शंकु खोलने पर जानवर का परिचय दें।
      सावधानी: पूंछ के अंत से चूहों को कभी न उठाएं; इसके परिणामस्वरूप गंभीर चोटें आ सकती हैं। हैंडलिंग के वैकल्पिक तरीकों का उपयोग मोटापे से ग्रस्त या गर्भवती चूहों के लिए किया जाना चाहिए28.
    2. जैसा कि जानवर शंकु के दूर किनारे पर अपने अग्रपादों के साथ पकड़ता है, धीरे-धीरे पूंछ को पीछे खींचते हैं और खुले भट्ठा के माध्यम से पूंछ को पारित करते हैं। शंकु के आधार पर जानवर के पिछले छोर को सुरक्षित करें एक हिंद पैर शंकु से बाहर निकलते हैं ताकि पार्श्व नस 12 बजे की स्थिति में दिखाई दे। या तो हिंद पैर फैलाया जा सकता है क्योंकि दो पार्श्व नसों, प्रत्येक पक्ष पर एक(चित्रा 3B)हैं ।
    3. अंगूठे और तर्जनी के बीच गैर-प्रमुख हाथ के साथ मध्य से दो-तिहाई लंबाई में पूंछ को पकड़ें, पूंछ की स्थिति और वासोडिलेशन को बनाए रखने के लिए पार्श्व नस पर मामूली तनाव डालें।
      नोट: गर्मी उपचार द्वारा फैली नसों की बढ़ी हुई दृश्यता उपयोगकर्ता को सबसे अच्छे परिणामों(चित्र 4)के लिए एक इंजेक्शन साइट को जल्दी से निर्धारित करने में सक्षम बनाती है।
    4. इंजेक्शन साइट की त्वचा को 70% अल्कोहल के साथ गीला धुंध स्पंज या पैड के साथ पोंछें। पूंछ में जलन से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके साफ करें।
      नोट: इस प्रक्रिया को संस्थागत IACUC के विवेक पर छोड़ा जा सकता है।
    5. सिरिंज को प्रमुख हाथ से पकड़ें, और सुई को पूंछ के समानांतर रखें। रक्त प्रवाह की दिशा की ओर सुई डालें, 10-15 डिग्री कोण(चित्रा 5ए-बी)पर रहें, और 2-4 मिमी(चित्रा 5सी-डी)को भेदकर नस के ल्यूमेन में आगे बढ़ें। धीरे-धीरे समाधान इंजेक्ट करें।
      नोट: यदि इंजेक्शन सफल है, प्लंजर पर कोई प्रतिरोध महसूस किया जाना चाहिए, और तरल पदार्थ नस के माध्यम से चलती देखा जा सकता है । इंजेक्शन साइट के ऊपर प्रतिरोध या सफेद फफोले के मामले में, सुई को हटा दें और मूल सुई प्लेसमेंट के ऊपर एक साइट पर दूसरे इंजेक्शन का प्रयास करें। प्रारंभिक इंजेक्शन साइट के नीचे इंजेक्ट करने का प्रयास न करें क्योंकि तरल पदार्थ प्रारंभिक साइट के माध्यम से जारी होगा। यदि एक पार्श्व नस का इंजेक्शन असफल है, तो जानवर को विपरीत दिशा में फिर से स्थान दें और विपरीत नस पर अधिक प्रयास करें। प्रयासों की अधिकतम संख्या इस बात पर निर्भर करेगी कि नस के साथ इंजेक्शन की कोशिश कहां शुरू होती है और छूटे हुए प्रयासों के साथ सूजन हो सकती है। गलत इंजेक्शन और संबद्ध चोटों के लिए संस्थागत IACUC नियमों से परामर्श करें।
    6. सुई निकालें, और इंजेक्शन समाधान और/ एक साफ धुंध के साथ कोमल संपीड़न लागू करने के लिए जारी रखें/पोंछ या ऊतक जब तक खून बह रहा बंद कर दिया है(चित्रा 6)।
    7. अपने पिंजरे में जानवर वापस, और कम से कम 5 मिनट के लिए निगरानी। सुनिश्चित करें कि जानवर आगे रक्तस्राव के बिना सामान्य गतिविधि शुरू करता है।

3. फंगल खून के संक्रमण और सेप्सिस का एक मुरीन मॉडल

  1. माउस उपभेदों
    1. Acclimate महिला स्विस वेबस्टर संस्थागत रूप से अनुशंसित दिशा निर्देशों के प्रति आयु के 6 सप्ताह में चूहों को मात दी । वैकल्पिक रूप से, संशोधित इनोकुला (नोट देखें) के साथ इस प्रोटोकॉल के लिए inbred/आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों (जैसे, C57BL/6 पृष्ठभूमि) का उपयोग करें ।
      नोट (विस्तार के लिए चर्चा देखें): अंधेरे फर के साथ चूहों की पूंछ नसों अक्सर गहरी रंजक पूंछ(चित्रा 4)के कारण हल्का फर के साथ उन लोगों की तुलना में कम दिखाई दे रहे हैं । विभिन्न माउस उपभेदों के बीच फंगल सेप्सिस/घातकता के लिए अलग-अलग संवेदनशीलता है। स्विस वेबस्टर के अलावा अन्य माउस उपभेदों के उपयोग के लिए प्रासंगिक कारकों (जैसे, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, आयु, लिंग, शरीर के आकार) पर विचार करके अतिरिक्त प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है जो मेजबान प्रतिरक्षा स्थिति को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, C57BL/6 चूहों में एक घातक चुनौती आम तौर पर स्विस वेबस्टर चूहों में देखी गई मृत्यु दर के स्तर को प्राप्त करने के लिए उच्च इनोकुला (10x तक) की आवश्यकता होती है ।
  2. सूक्ष्मजीवों
    1. एक घातक चुनौती (सेप्सिस) के लिए, कैंडिडा एल्बिकान तनाव DAY185 (या पसंद के उपभेदों) के लकीर जमे हुए शेयरों सबूरौद डेक्सट्रोस एगर पर और 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    2. एक कॉलोनी को 10 एमएल खमीर निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोस शोरबा में स्थानांतरित करें, और संस्कृति को मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए विकास के स्थिर चरण में स्थानांतरित करें।
  3. इनोकुलम समाधान
    1. एक घातक चुनौती के दिन, शोरबा संस्कृति को इकट्ठा करें, और बाँझ पीबीएस में अपकेंद्रित्र (800 × जी)द्वारा 3 बार गोली धोएं।
    2. ट्राइपैन ब्लू डाई अपवर्जन द्वारा व्यवहार्य खमीर कोशिकाओं की पहचान करें, और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गणना करें। कमरे के तापमान पर बाँझ पीबीएस में 1 x10 6 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
      नोट: प्रत्येक जानवर को इनोकुलम समाधान के 100 माइक्रोन प्राप्त होंगे। इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान संभावित नुकसान के लिए अनुमति देने के लिए इनोकुलम (>500 माइक्रोन) की अतिरिक्त मात्रा तैयार करें। अंतिम इनोकुलम प्रति माउस 1 x 105 कोशिकाएं हैं। तदनुसार कोशिका एकाग्रता को समायोजित करके इनोकुलम की मात्रा को 200 माइक्रोन तक बढ़ाया जा सकता है।
      सावधानी: फंगल इनोकुलम समाधान इंजेक्शन से पहले कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए। शरीर के तापमान के लिए इनोकुलम समाधान वार्मिंग खमीर कोशिकाओं से हाइफाई के लिए एक रूपात्मक परिवर्तन प्रेरित कर सकते हैं । इसके विपरीत, ठंडे समाधानों के बोलस यानी प्रशासन जानवर के शरीर के तापमान को तेजी से कम कर सकता है और इससे बचा जाना चाहिए।
  4. नसों में टीका
    1. जानवरों को गर्म करें, और धारा 2 में प्रक्रियाओं का पालन करके वासोडिलेशन को प्रेरित करें।
    2. 27 जी, आधा-सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके पूंछ की नस में इनोकुलम समाधान के 100 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
  5. टीका लगाने के बाद की निगरानी
    1. सेप्सिस-प्रेरित रुग्णता के निम्नलिखित संकेतों के लिए जानवरों की निगरानी करें: i) फर पहलू (उदाहरण के लिए, चिकनी, झालरदार), ii) गतिविधि (जैसे, स्वतंत्र रूप से चलती है, गैर-जिम्मेदार), iii) आसन (जैसे, कूबड़, कठोर), चतुर्थ) व्यवहार (उदाहरण के लिए, धीमी, कोई स्थानांतरण), v) छाती आंदोलनों (जैसे, सामान्य श्वास, डिस्पीना), छठी) पलकें (जैसे, खुला, बंद)43।
  6. सेप्सिस स्कोरिंग
    1. प्रत्येक श्रेणी में 0 से 3 तक चार-बिंदु ग्रेडिंग पैमाने में सेप्सिस (एम-CASS) के लिए एक संशोधित माउस नैदानिक मूल्यांकन स्कोर के अनुसार मनाया रुग्णता स्कोर: 0, सामान्य; 1, हल्के; 2, मध्यम; 3, गंभीर43.
  7. वैकल्पिक प्रोटोकॉल: फंगल सेप्सिस के खिलाफ टीकाकरण
    1. एक घातक चुनौती से चौदह दिन पहले, कैंडिडा डबलिनिएंसिस स्ट्रेन Wü284 या तनु सी एल्बिकान उपभेदों के साथ चूहों को टीका लगाते हैं, जैसे किefg1/1x105 कोशिकाएं प्रति माउस), जैसा कि सी एल्बिकेंस DAY185 के बदले 3.2-3.4 वर्गों में वर्णित है।
    2. टीका लगाए गए चूहों में एक घातक चुनौती का संचालन करें, जैसा कि धारा 3.2-3.4 में वर्णित है, और वर्ग 3.5-3.6 में वर्णित सेप्सिस-प्रेरित रुग्णता के संकेतों के लिए निगरानी करें।

Representative Results

वार्मिंग चैंबर के अंदर तापमान लगातार आंतरिक सेंसर और थर्मोस्टेट द्वारा ऑटो विनियमित द्वारा पता लगाया जाता है। सबसे पहले, थर्मोस्टेट का नियंत्रण डायल निर्धारित तापमान का चयन करने के लिए 78, 85, 90, या 95 डिग्री एफ (26, 29, 32, या 95 डिग्री सेल्सियस) पर तैनात किया गया था। एक बार हीटर(चित्रा 7,पीले डॉट्स) सक्रिय हो जाने के बाद, प्रकाश बल्ब द्वारा गर्मी उत्सर्जन ने सेट तापमान के आधार पर पहले 5-15 मिनट के दौरान आंतरिक तापमान को तेजी से बढ़ाया। हीटर प्रकाश बल्ब निष्क्रिय अगर पता चला आंतरिक तापमान सेट तापमान (ग्रे डॉट्स) से अधिक है । प्रारंभिक अधिकतम तापमान पशु हस्तांतरण के दौरान तापमान के नुकसान की भरपाई करने के लिए सभी समूहों में सेट तापमान से ऊपर 5-7 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ना चाहिए। इसके बाद, डिवाइस स्वचालित रूप से गर्मी चक्र को दोहराता रहता है और सेट तापमान पर वार्मिंग चैंबर को बनाए रखता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूंछ की नस के सफल इंजेक्शन द्वारा प्राप्त प्रायोगिक आंकड़ों का एक उदाहरण चित्र 8 में दिखाया गयाहै । सेप्सिस के परिणामस्वरूप रक्तप्रवाह कैंडिडियासिस के माउस मॉडल में, स्विस वेबस्टर चूहों में कैंडिडा एल्बिकान (1 x 105 कोशिकाओं प्रति माउस) के साथ एक i.v. चुनौती के कारण सेप्सिस की तेजी से शुरुआत हुई और जीवों का प्रसार हुआ, जिससे 3-4 दिनों (ओपन डॉट्स)(चित्रा 8A)के भीतर उच्च मृत्यु दर हुई। इसके विपरीत, जानवरों को सेप्सिस से एक अक्षात्मक खमीर तनाव, कैंडिडा डबलिनिएंसिसके साथ पूर्व i.v. प्रतिरक्षण/टीकाकरण द्वारा संरक्षित किया जा सकता है, उग्र सी एल्बिकान (ठोस डॉट्स) के साथ घातक i.v. चुनौती के बाद >९५% अस्तित्व को प्राप्त करने । प्रगतिशील मृत्यु दर बनाम वैक्सीन-मध्यस्थता संरक्षण में इन परिणामों को चार स्वतंत्र प्रयोगों(पूरक चित्रा 1)में पुन: प्राप्त किया गया था। इसी तरह के संरक्षण ऐसे तनु सी albicans म्यूटेंट (1efg1/Τcph1) (नहीं दिखाया डेटा) के रूप में अंय avirulent खमीर उपभेदों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । सेप्सिस के रूप में अच्छी तरह से निगरानी की जा सकती है और मृत्यु दर से सहसंबद्ध; घातक संक्रमण के साथ बिना टीका लगाए गए जानवरों में सेप्सिस-प्रेरित रुग्णता में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी, जबकि टीका लगाए गए समूह ने घातक चुनौती(चित्रा 8B)के बाद न्यूनतम लक्षणों का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1: कृंतक वार्मिंग और निरोधक डिवाइस का विवरण। (क) वार्मिंग डिवाइस के बाहरी दृश्य से पता चलता है, जिसमें शामिल हैं:

  1. थर्मोस्टेट कवर - थर्मोस्टेट को बेनकाब करने के लिए हैंडल से ऊपर की ओर उठाएं
  2. बिजली के बाड़े - सुरक्षा के लिए स्थायी रूप से सील
  3. कक्ष ढक्कन - पशु हस्तांतरण के दौरान ऊपर की ओर लिफ्ट करने के लिए/
  4. वार्मिंग चैंबर - हटाने योग्य, उपयोग से पहले बिस्तर के साथ फर्श को कवर
  5. संयम तंत्र - उपयोग में नहीं रहते हुए हीटिंग डिवाइस के साथ स्टोवेबल
  6. पावर स्विच - मेन ऑन/ऑफ कार्यों के लिए इनलाइन रॉकर स्विच
  7. पावर कॉर्ड - वोल्टेज/वर्तमान: 120V/10A

(ख) वार्मिंग डिवाइस के इंटीरियर से पता चलता है:

  1. गरमागरम प्रकाश बल्ब - 100 वाट पर प्रकाश उत्पादन
  2. लाइट बल्ब सुरक्षा कवच - बल्ब प्रतिस्थापन के लिए हटाने योग्य
  3. तापमान सेंसर जांच - कक्ष के अंदर स्थित
  4. आंतरिक तापमान थर्मामीटर - तापमान की निगरानी के लिए कक्ष के अंदर जगह

(ग) वार्मिंग डिवाइस थर्मोस्टेट के घटकों से पता चलता है:

  1. आंतरिक तापमान थर्मामीटर
  2. थर्मोस्टेट - ऑटो हीटर को नियंत्रित करता है
  3. सेटपॉइंट कंट्रोल लीवर - न्यूनतम/अधिकतम: 78 डिग्री एफ/108 डिग्री एफ (25 डिग्री सेल्सियस/42 डिग्री सेल्सियस)
  4. थर्मोस्टेट पावर इंडिकेटर - हरी बत्ती सामान्य संचालन को इंगित करती है
  5. थर्मोस्टेट हीटर संकेतक - हीटिंग चक्र के दौरान लाल जलाया

(घ) निरोधक डिवाइस के घटकों को दिखाता है:

  1. शंकु - कृंतक संयम के लिए डिज़ाइन की गई लचीला एल्यूमीनियम शीट
  2. टेल चैनल - पूंछ की चिकनी स्थिति की अनुमति देने के लिए आकार का
  3. कोन लिफ्ट प्लेटफॉर्म - शंकु आधार की मजबूत लिफ्ट प्रदान करता है
  4. ऊंचाई समायोजन घुंडी - मैनुअल ऊंचाई समायोजन के लिए बनाया गया
  5. कैंची जैक - ऊंचाई 45-140 मिमी (1.77-5.52") से सीमा
  6. समर्थन प्लेट - स्थिरता प्रदान करने के लिए रबर के पैरों के साथ स्थापित कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कृंतक वार्मिंग और निरोधक डिवाइस। (क)उपयोग से पहले, डिवाइस के दो भागों को एक साफ बेंच टॉप पर साथ-साथ रखा जाता है। (ख)एक बार वार्मिंग डिवाइस पर संचालित है, थर्मोस्टेट हीटर सक्रिय करता है । प्रकाश बल्ब जलाया रहता है और गर्मी उत्सर्जन करता है जब तक वार्मिंग चैंबर सेट तापमान तक पहुंच गया है । वार्मिंग डिवाइस आंतरिक तापमान को बनाए रखने के लिए स्वचालित रूप से गर्मी चक्र को दोहराता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: चूहों (C57BL/6) वार्मिंग और निरोधक डिवाइस में रखा । (A)चूहों को वासोडिलेशन के लिए हीट ट्रीटमेंट प्राप्त करना । जानवरों (उपचार के प्रति 4-6 चूहों) को उनके आवास पिंजरे से डिवाइस के वार्मिंग कक्ष में स्थानांतरित कर दिया जाता है और कम से कम 5-10 मिनट के लिए गर्मी का इलाज किया जाता है।(बी)पूंछ नस इंजेक्शन के लिए संयमित माउस। माउस को वार्मिंग चैंबर से अपनी पूंछ खुली भट्ठा से गुजरने के साथ निरोधक डिवाइस के शंकु खोलने में स्थानांतरित कर दिया जाता है। माउस को धीरे-धीरे शंकु के दूर किनारे पर पीछे खींच लिया जाता है जब तक कि पूंछ का आधार शंकु की नोक तक नहीं पहुंच जाता है। के रूप में जानवर एक कोमल पार्श्व रोटेशन के साथ शंकु के आधार की ओर खींचा जाता है, एक हिंद पैर ऊपर की ओर तैनात है ताकि यह खुले भट्ठा से बाहर निकलता है पार्श्व पूंछ नस 12 बजे तैनात होने की अनुमति । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: चूहों में पार्श्व पूंछ नसों की पहचान। (क)एक अनुपचारित स्विस वेबस्टर माउस की पूंछ । माउस को वासोडिलेशन के लिए पूर्व गर्मी उपचार के बिना निरोधक डिवाइस में रखा जाता है। पार्श्व पूंछ नस को एक पतले अंधेरे बर्तन के रूप में पहचाना जा सकता है जो त्वचा के नीचे पाठ्यक्रम करता है। (ख)एक स्विस वेबस्टर माउस की पूंछ 10 मिनट के लिए वार्मिंग डिवाइस के साथ इलाज किया । गर्मी का इलाज माउस पूंछ नस इंजेक्शन के लिए रोका जाता है। वासोडिलेशन से प्रेरित बढ़े हुए पोत व्यास के कारण त्वचा के माध्यम से पार्श्व पूंछ नस आसानी से दिखाई देती है। (ग)एक C57BL/6 माउस की पूंछ 10 मिनट के लिए वार्मिंग डिवाइस के साथ इलाज किया और पूंछ नस इंजेक्शन के लिए रोका । वासोडिलेशन गहरी पिगमेंटेड त्वचा के माध्यम से पूंछ नस की दृश्यता को बढ़ाता है, हालांकि नस के खिलाफ कमजोर रंग के विपरीत के कारण हल्के रंग के स्विस वेबस्टर चूहों में आसानी से दिखाई नहीं देती है। लाल तीर पार्श्व पूंछ नस के स्थान को निरूपित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: पूंछ नस इंजेक्शन गर्मी का इलाज चूहों (स्विस वेबस्टर) में प्रदर्शन किया । (A-B) इंजेक्शन स्थल पर पार्श्व पूंछ नस में सुई प्रविष्टि। सुई (27 जी, 1/2-in) बेवेल अप के साथ पूंछ नस के समानांतर तैनात है और रक्त प्रवाह की ओर इशारा किया और डाला । (सी-डी) पूंछ नस और इंजेक्शन में सुई प्लेसमेंट। सुई की नोक नस के ल्यूमेन में 2-4 मिमी आगे उन्नत होती है। अंगूठे सिरिंज के प्लंजर पर तैनात है, और वांछित मात्रा धीमी और स्थिर दबाव के साथ तिरस्कृत है । ओवल हलकों इंजेक्शन साइटों का संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: इंजेक्शन के बाद की प्रक्रिया। (क)इंजेक्शन स्थल पर रक्तस्राव का क्षेत्र। सुई हटाने के तुरंत बाद इंजेक्शन समाधान का रक्तस्राव और बैकफ्लो होता है। इसे अंगूठे के साथ इंजेक्शन साइट पर फर्म संपीड़न लागू करके कम किया जा सकता है। (ख)इंजेक्शन स्थल पर रक्त का थक्का गठन। एक साफ धुंध के साथ कोमल संपीड़न/पोंछ इंजेक्शन घाव पर रक्त थक्का की सुविधा । तीर इंजेक्शन साइटों को निरूपित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: उपयोग के दौरान वार्मिंग कक्ष का आंतरिक तापमान। वार्मिंग डिवाइस निर्धारित निर्धारित तापमान पर वार्मिंग के लिए सक्रिय किया गया था । डिवाइस के वार्मिंग चैंबर आंतरिक हवा के तापमान और गर्मी चक्र (प्रकाश बल्ब पर/पीले डॉट्स, बंद/ग्रे डॉट्स) के लिए निगरानी की गई थी ४५ मिनट से अधिक दर्ज की गई । नारंगी क्षेत्र कृंतक में वासोडिलेशन को शामिल करने के लिए इष्टतम तापमान सीमा को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: सेप्सिस मृत्यु दर बनाम टीका मध्यस्थता सुरक्षा कैंडिडा एल्बिकानके साथ एक घातक चुनौती के बाद । चूहों (8 सप्ताह पुरानी स्विस वेबस्टर महिलाओं) को नसों के साथ टीका लगाया गया था, जिसके बाद 14 दिन बाद जंगली प्रकार के सी एल्बिकन्स डे 185 (1 x 105 कोशिकाओं) के साथ एक घातक नसों में चुनौती दी गई थी। (क)घातक चुनौती के बाद 10 दिनों में मृत्यु दर का आकलन किया गया था । (ख)सेप्सिस रुग्णता के लिए पशुओं की निगरानी की गई और सेप्सिस (एम-CASS)४३के लिए एक संशोधित माउस नैदानिक मूल्यांकन स्कोर के अनुसार रन बनाए गए । डेटा प्रति समूह 10 चूहों के साथ 4 स्वतंत्र प्रयोगों का संचयी है और Mantel-कॉक्स लॉग रैंक परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया । पी < 0.0001। SEM, मतलब की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: रक्तप्रवाह कैंडिडा एल्बिकान चैलेंज से सेप्सिस मृत्यु दर और वैक्सीन-मध्यस्थता अस्तित्व की प्रजनन क्षमता। प्रत्येक पैनल चार स्वतंत्र प्रयोगों के आंकड़ों का प्रतिनिधित्व करता है जो चित्र 8एमें दिखाए गए संचयी परिणाम में शामिल हैं । प्रत्येक प्रयोग प्रति समूह 10 चूहों का उपयोग कर आयोजित किया गया था और Mantel-कॉक्स लॉग रैंक परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया । सीए, कैंडिडा एल्बिकान। सीडी, कैंडिडा डबलिनिएंसिस। पी < 0.0001। पी < 0.01। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

पशु मॉडल में प्रयोगात्मक विश्वसनीयता के लिए सुसंगत और सटीक डोजिंग प्रमुख आवश्यकताएं हैं। यह विशेष रूप से वीएस प्रशासन के मामलों में महत्वपूर्ण है जहां इंजेक्शन एजेंटों की प्रणालीगत जैव उपलब्धता अन्य प्रशासनमार्गोंकी तुलना में काफी अधिक/तेज है । इस प्रकार, पूंछ नस इंजेक्शन में त्रुटियों का अध्ययन परिणामों पर हानिकारक प्रभाव पड़ सकता है। ऐतिहासिक रूप से, इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन, बजाय i.v., तकनीकी सादगी और सुविधा के कारण कृंतक में प्रणालीगत पहुंच के लिए सबसे आम तरीका रहा है। हालांकि, जानवरों से प्रीक्लिनिकल रीडआउट का नैदानिक सेटिंग्स में अनुवाद करते समय प्रशासन मार्ग अधिक महत्वपूर्ण हो जाते हैं। इसलिए, कृंतक प्रोटोकॉल में निरंतर सुधार की आवश्यकता है जो सफल पूंछ नस इंजेक्शन की सुविधा प्रदान कर सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रमुख उन्नति अभिनव थर्मोरैलेयडिंग वार्मिंग डिवाइस है जो कृंतक में वासोडिलेशन के प्रभावी प्रेरण को सक्षम बनाता है, जो नाटकीय रूप से पूंछ की नसों और सुई संरेखण की दृश्यता में सुधार करता है। खराब थर्मोरेथाइन (जैसे, लैंप), सामयिक वासोडिलेटर या त्वचा की परेशानी (जैसे, जाइलीन) हीटिंग विधियां न केवल अविश्वसनीय हैं, बल्कि जानवर के लिए असुरक्षित भी हैं और44से बचा जाना चाहिए। अन्य पारंपरिक तरीकों के विपरीत, जैसे कि पूंछ को गर्म पानी में विसर्जित करना, इस डिवाइस की ऑटोरेगुलेशन क्षमता एक साथ कई जानवरों को सुरक्षित रूप से हालत में कर सकती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को इष्टतम रूप से डिजाइन किए गए निरोधक डिवाइस का उपयोग करके और जानवर के तेजी से और सुरक्षित स्थिरीकरण की स्थिति में अनुमति देकर और मजबूत किया जाता है जो पार्श्व पूंछ नस को सबसे अच्छा प्रदर्शित करता है।

कई वर्तमान निरोधकों में देखे गए पारदर्शी ट्यूबल प्रारूप, हालांकि व्यावहारिक रूप से अच्छी तरह से डिज़ाइन किए गए हैं, प्रत्येक जानवर के साथ अधिक हैंडलिंग समय की आवश्यकता होती है, इस प्रकार निरोधक प्रक्रिया45को लंबा करती है। यह आक्रामक लक्षणों के साथ कृंतक उपभेदों में अधिक समस्याग्रस्त हो सकता है जो सीमित सहयोग प्रदान करता है46,47. इसके विपरीत, निरोधक उपकरण की अर्ध-संलग्न शंकु संरचना पशु की त्वरित स्थिति की अनुमति देती है और संयम की अवधि को कम करने में सहायता करती है। एक साथ, अभिनव, अत्यधिक अनुकूलित वार्मिंग/निरोधक प्रणाली का उपयोग कर सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल इंजेक्शन प्रक्रिया को तेज करता है, जिससे जानवरों के बड़े समूहों की त्वरित और प्रभावी डोजिंग की अनुमति मिलती है । हमारी प्रयोगशाला में, हम आम तौर पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके 1 घंटे के भीतर हीट उपचार से इंजेक्शन की निगरानी के लिए 30 चूहों की एक पूरी इंजेक्शन प्रक्रिया को पूरा करते हैं।

उन्नत सुविधाओं के बावजूद, इस डिवाइस के कुछ स्पष्ट नुकसान हैं: पहला वार्मिंग चैंबर में डिवाइस और नियमित प्रकाश बल्ब प्रतिस्थापन की लागत है। हालांकि, इंजेक्शन की दक्षता और गति के अलावा, डिवाइस बार-बार उपयोग के लिए टिकाऊ है और सबसे आम कीटाणुनाशकों के साथ संगत है, उपयोगों के बीच डिवाइस की पूरी तरह से सफाई की अनुमति देता है। साथ में, यह प्रारंभिक निवेश को ऑफसेट करताहै। एसecond, सीमित कार्यक्षेत्र के साथ स्थितियों में, इस प्रोटोकॉल के लिए एक दोष एक समर्पित बेंच क्षेत्र के लिए आवश्यकता हो सकती है जो इंजेक्शन का प्रदर्शन करते समय दो इकाइयों को साथ-साथ रखने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, क्योंकि डिवाइस का उपयोग वी इंजेक्शन से जुड़े कई कृंतक प्रोटोकॉल में मोटे तौर पर किया जा सकता है, यह संभव है कि डिवाइस आइसोफ्लाणेन वाष्पीकरण जैसे अन्य सांप्रदायिक विवारियम उपकरणों के समान एक कोर उपकरण के रूप में काम कर सकता है। बावजूद, दो इकाइयों को आसानी से पोर्टेबल है और बंडल और जबकि उपयोग में नहीं चुराया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित मुरीन फंगल सेप्सिस का घातक चुनौती मॉडल मनुष्यों में सी एल्बिकान रक्तप्रवाह संक्रमणों की बारीकी से नकल करता है और इसका उपयोग फंगल उग्रता, एंटीफंगल उपचारों की परीक्षण प्रभावकारिता का अध्ययन करने और संक्रमण37,39,48के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की विशेषता के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। एक प्रजनन संक्रमण को प्राप्त करने के लिए, पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से i.v. टीका खून में जीवों की सटीक डिलीवरी सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है। वास्तव में, जानवर कैंडिडा यानी चुनौतियों के अलग-अलग स्तरों पर बहुत अलग ढंग से प्रतिक्रिया देते हैं; इनोकुलम की बहुत कम मात्रा के प्रशासन अवांछित सहज वसूली में परिणाम होगा, जबकि बहुत अधिक खुराक प्राप्त जानवरों समय से पहले शिकार होगा । सेप्सिस/मृत्यु दर के एक सुसंगत स्तर को प्रेरित करने के लिए किसी दिए गए जीव के लिए इनोकुलम आकारों की विशिष्ट खिड़की काफी हद तक फंगल उपभेदों और माउस उपभेदों दोनों पर निर्भर करती है ।

1 x 105 जंगली प्रकार सी एल्बिकान के इनोकुलम में स्विस वेबस्टर चूहों का उपयोग करके वर्तमान प्रोटोकॉल ने 1 दिन के भीतर सेप्सिस रुग्णता की शुरुआत को प्रेरित किया, जिसके परिणामस्वरूप प्रगतिशील मृत्यु दर 5-7 दिनों तक 100% घातक हो गई। इसके विपरीत, 1 x 105 से अधिक इनोकुला आमतौर पर त्वरित मौतों का कारण बनते हैं (यानी, 1-2 दिन 1 x 106,3-4 दिनों में 5 x 105पर), और 1 x 105 से कम वाले उप-घातक होते हैं। साहित्य में कई रिपोर्टों के अनुरूप, सी एल्बिकान के बदलेगैर-एल्बिकान कैंडिडा प्रजातियों के उपयोग के परिणामस्वरूप घातकता40, 49काफी कम हो जाती है। इसके अतिरिक्त, माउस उपभेदों, या यहां तक कि उपनिवेशों की उत्पत्ति का चुनाव, माउस उपभेदों के बीच अलग-अलग संवेदनशीलता के कारण संक्रमण परिणामों पर काफी प्रभाव डाल सकता है, जैसा कि अन्य39,40,41,50,51,52, 53,54,55द्वारा सूचित किया गया है। इसलिए, प्रयोगों को डिजाइन करते समय दोनों को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

एक घातक i.v. चुनौती के बाद, कवक कोशिकाएं रक्त के माध्यम से तेजी से फैलती हैं और कई अंगों पर आक्रमण करना शुरू करती हैं, जिनमें से सबसे अधिक प्रभावित गुर्दे41हैं। प्रभावित अन्य अंग मस्तिष्क, तिल्ली और अस्थि मज्जा48,56हैं। बावजूद, तीव्र सेप्सिस प्रारंभिक समयअंक 37पर मौत का अंतिम कारण है। जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, सेप्सिस गंभीरता का मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन सेप्सिस के लिए माउस क्लीनिकल असेसमेंट स्कोर (एम-CASS) द्वारा चुनौती प्राप्त जानवरों में सेप्सिस स्थिति के प्रदर्शित संकेतों के आधार पर किया जा सकता है43,57। घातक सेप्सिस के कई सरोगेट मार्कर में, हाइपोथर्मिया को नैदानिक और प्रयोगात्मकसेप्सिस43,58,59दोनों में आसन्न मृत्यु के लिए एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में सुझाया गया है।

यद्यपि इस मॉडल में सीधे इनस्ल बनाम आउटब्रीड चूहों की तुलना करने के लिए कोई औपचारिक अध्ययन नहीं किया गया है, लेकिन माना आनुवंशिक विषमता के बावजूद, आउटस्लरी स्विस वेबस्टर चूहों का उपयोग करके वर्तमान प्रोटोकॉल से प्राप्त डेटा विभिन्न सेप्सिस मापदंडों में असाधारण रूप से प्रजनन योग्य हैं। आम तौर पर, मृत्यु का एक पैटर्न जो 3-5 दिनों के भीतर पड़ता है, तीव्र सेप्सिस का एक दृढ़ मॉडल है, जैसा कि घातक चुनौती50, 51के बाद के घंटों के भीतर सेप्सिस रुग्णता और भड़काऊ मार्कर के स्तर में तेजी से ऊंचाई का सबूत है। लंबे समय तक जीवित रहने के समय (7-10 दिनों) के लिए, मृत्यु दर माइक्रोबियल बोझ का परिणाम है जिससे लक्षित अंगों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में घातक ऊतक क्षति होती है। सेप्सिस या माइक्रोबियल बोझ का चुनाव प्रतिरक्षा कार्यों या विरोधी भड़काऊ आहार या एंटीफंगल उपचार/टीकों के लिए प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक के रूप में लागू किया जा सकता है, जैसा कि इस्तेमाल किए गए इनोकुलम द्वारा निर्धारित किया जाता है ।

i.v. घातक चुनौती मॉडल के अलावा, एक आईपी चैलेंज के माध्यम से चूहों में सी एल्बिकन के साथ इंट्रा-पेट संक्रमण भी प्रसारित कैंडिडियासिस और बाद में सेप्सिस का कारण बन सकता है, हालांकि बैक्टीरियल रोगजनक, स्टेफिलोकोकस ऑरियस के साथ सह-टीका, सह-तरीके सी एल्बिकैन मोनो-संक्रमण 51,60,61की तुलना में मृत्यु दर को बढ़ाता है। आईपी घातक चुनौती मॉडल में, काफी अधिक माइक्रोबियल इनोकुला (1.75 x 107सी एल्बिकन/8 x 107एस ऑरियस प्रति माउस) को पॉलीमाइक्रोबियल पेरिटोनाइटिस और पेट की गुहा से रक्तधारा में जीवों के प्रसार का कारण बनने के लिए आवश्यक हैं। इसी प्रकार, चूहों में सी एल्बिकान के साथ गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमण इम्यूनोसप्रेसिव और/या म्यूकोसल-हानिकारक एजेंटों के साथ इलाज करने से फंगल कोशिकाओं को खून में स्थानांतरित हो जाता है और इसके परिणामस्वरूप फंगल सेप्सिस६२, ६३होताहै । विशिष्ट टीका मार्गों के बावजूद, आगामी फंगल सेप्सिस का तंत्र तीन रोग मॉडलों के बीच काफी हद तक अनुरूप है, जिसमें कैंडिडा के लिए एक अनियंत्रित प्रणालीगत प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया शामिल है जो अंग विफलता37,51,61की ओर जाता है। इसी प्रकार, मनुष्यों में, यह मेजबान प्रतिक्रिया की प्रक्रिया है, न कि केवल कैंडिडेमिया, जो स्वास्थ्य देखभाल सेटिंग्स64, 65में अधिग्रहीत हेमेटोनेकी रूप से प्रसारित कैंडिडिसिस से जुड़े उच्च रुग्णता/मृत्यु का कारणबनतीहै।

वर्तमान फंगल सेप्सिस मॉडल का उपयोग करते हुए, हम यहां प्रदर्शित करते हैं कि घातक सी एल्बिकन संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा को सी डबलिनिएन्सिस (एवायरुलेंट) या तनु सी एल्बिकन म्यूटेंट के साथ टीकाकरण से प्राप्त किया जा सकता है, जो सेप्सिस रुग्णता में महत्वपूर्ण कमी के साथ सहवर्ती है । संरक्षण सहज जीआर-1+ माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो बोन मैरो में प्रशिक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा66,67के रूप में प्रेरित दिखाई देती हैं। सी एल्बिकान रक्तप्रवाह संक्रमण के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा-मध्यस्थता संरक्षण के इस उपन्यास रूप की समझ का विस्तार करने के प्रयास चल रहे हैं ।

अंत में, अभिनव कृंतक वार्मिंग/निरोधक उपकरण एक कुशल और प्रभावी तरीके से बड़े पैमाने पर बहु समूह पशु अध्ययन के i.v. इंजेक्शन प्रदर्शन करने की हमारी क्षमता को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । जैसे, हम शब्द गढ़ा है, माउस एक मिनट, डिवाइस के लिए । डिवाइस विनिर्देशों एक समान डिवाइस की खरीद के लिए अनुरोध पर इसी लेखक से उपलब्ध हैं । यहां प्रदर्शित तकनीकों से अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में पूंछ नस इंजेक्शन को नियोजित करने वाले कृंतक मॉडलों में एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एलएसयूएचएससी फाउंडेशन (पीएलएफ) द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से U54 GM104940 द्वारा भाग में, जो लुइसियाना नैदानिक और ट्रांसलेशनल साइंस सेंटर को धन देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans strain DAY185 Carnegie Melon University N/A provided by the laboratory of Aaron Mitchell
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ University of Tennessee Health Sciences Center N/A provided by the laboratory of Glen Palmer
Candida dubliniensis strain Wü284 Trinity College, Dublin, Ireland N/A provided by the laboratory of Gary Moran
Mice Charles River Laboratories 551NCICr:SW Female Swiss Webster; 6-8 weeks old
Mice Charles River Laboratories 556NCIC57BL/6 Female C57BL/6; 6-8 weeks old
Needles, 27G, ½-in Becton Dickinson 305109 can be substituted from other vendors
Phosphate buffered saline (PBS) GE SH30028.02 can be substituted from other vendors
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) LSU Health custom order Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health
Sabouraud dextrose agar (SDA) Becton Dickinson 211584 can be substituted from other vendors
Syringes, 1 mL Becton Dickinson 309659 can be substituted from other vendors
Trypan blue solution Sigma T8154
Yeast peptone dextrose (YPD) broth Fisher Scientific BP2469 can be substituted from other vendors

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References

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Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M.… More

Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model. J. Vis. Exp. (165), e61961, doi:10.3791/61961 (2020).

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