Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الـ 25: الفيزياء القلبية كما في الأنسجة الحيوية للقلب لدراسة أمراض القلب البشري

Published: January 23, 2021 doi: 10.3791/61962
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,3,4
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى تصنيع 3D spheroids القلبية (CSs) من خلال الخلايا المشتركة في زراعة في قطرات شنقا. يتم التعامل مع الكولاجين جزءا لا يتجزأ من CSs مع دوكسوروبيسين (DOX, عامل سمية) في التركيزات الفسيولوجية لنموذج فشل القلب. في المختبر الاختبار باستخدام DOX المعالجة CSs يمكن استخدامها لتحديد العلاجات الجديدة لمرضى فشل القلب.

Abstract

على الرغم من التقدم في العديد من هندسة أنسجة القلب، لا يزال أحد التحديات الرئيسية للتغلب على توليد شبكة الأوعية الدموية تعمل بكامل طاقتها والتي تضم عدة مستويات من التعقيد لتوفير الأكسجين والمواد المغذية داخل أنسجة القلب المهندسة بيولوجيا. وقد طور مختبرنا نموذجًا ثلاثي الأبعاد في المختبر من قلب الإنسان، يعرف باسم "الزفير القلبي" أو "CS". هذا يعرض البيوكيميائية والفسيولوجية، والسمات الدوائية نموذجية من قلب الإنسان ويتم إنشاؤها عن طريق المشاركة في زراعة ثلاثة أنواع الخلايا الرئيسية، مثل myocytes القلب، والخلايا البطانية، واللولب الليفي. يتم زرع الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة بشريًا (hiPSC-CMs أو iCMs) في نسب تقارب النسب الموجودة في الجسم الحي مع الخلايا الليفية القلبية (HCFs) والخلايا البطانية الشريانية التاجية البشرية (HCAECs) في لوحات الثقافة المعلقة قطرة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. تحليل confocal من CSs ملطخة بالأجسام المضادة ضد القلب Troponin T، CD31 و vimentin (علامات ل myocytes القلبية، والخلايا البطانية والضخامات الليفية، على التوالي) يظهر أن CSs تقديم شبكة الخلايا البطانية المعقدة، تشبه واحد الأصلي وجدت في قلب الإنسان. وهذا ما أكده تحليل تقديم ثلاثي الأبعاد لهذه الصور confocal. CSs أيضا تقديم مصفوفة خارج الخلية (ECM) بروتينات نموذجية من قلب الإنسان، مثل الكولاجين نوع الرابع، لامينين وليفي. وأخيراً، تقدم CSs نشاطًا منقّطًا يقاس كعقد متزامن أقرب إلى نموذج القلب البشري مقارنة بـ CSs التي تحتوي على أجهزة iCMs فقط. عند علاجها بعامل مضاد للسرطان مضاد للسرطان، مثل دوكسوروبايسين (DOX، المستخدم لعلاج سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية وسرطان الثدي)، فإن قابلية البقاء في CSs المعالجة بـ DOX تنخفض بشكل كبير عند 10 ميكرومتر من تثبيط جيني والكيميائية من مركب ثنائي الغدد الليمفاوية أكسيد النيتريك سينثاني، وهو هدف من المصب لـ DOX في HCFs وHCAECs، مما يقلل من سميته في CS. ونظرا لهذه الميزات الفريدة، وتستخدم حاليا CS كنماذج في المختبر لدراسة الكيمياء الحيوية القلب، الفيزيولوجيا المرضية، وعلم الصيدلة.

Introduction

القلب البشري لديه قدرة تجديدية محدودة في حين أن أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) لا تزال السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم على الرغم من التقدم الأخير في هندسة الأنسجة وتقنيات الخلايا الجذعية1. إن الحاجة إلى علاجات جديدة بما في ذلك الأساليب الجزيئية والخلوية لإصلاح القلب التالف أو منع القلب من الفشل هي واحدة من الاحتياجات السريرية الرئيسية الحالية للمرضى الذين يعانون من أمراض القلب2,3,4. الهدف الرئيسي من هندسة أنسجة القلب هو تصنيع أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد (3D) التي تعرض الميزات الجزيئية والخلوية وخارج الخلية نموذجية من قلب الإنسان، بما في ذلك شبكتها الوعائية وظيفةالعقدية 4،5،6.

من أجل الهندسة الحيوية وتصنيع الأنسجة القلبية البشرية الوظيفية التي تحاكي قلب الإنسان لفي المختبر وفي تطبيقات الجسم الحي، وقد تم التحقيق في العديد من النهج بما في ذلك أنسجة القلب المهندسة (EHTs)، وأغطية الخلايا والثقافات spheroid7،8. ومع ذلك، هذه الأنسجة تفشل في تلخيص الأمثل 3D البيئة الدقيقة نموذجية من قلب الإنسان واستخدامها المحتمل لمرضى الأمراض القلبية الوعائية لا يمكن أن تترجم مباشرة من مقاعد البدلاء إلى السرير7. وذلك لأنها لا تُلخيّص البيولوجيا المعقدة، والمورفولوجيا، وعلم وظائف الأعضاء في أنسجة القلب في الجسم الحي9. أحد التحديات الرئيسية في هندسة الأنسجة القلبية يتضمن تطوير شبكة الأوعية الدموية الهرمية داخل أنسجة القلب المهندسة بيولوجيا، حيث أن أي نسيج أكبر من 200 ميكرومتر في القطر يطور موت الخلايا في منتصف2،10. شبكة الأوعية الدموية شكلت بشكل صحيح في أنسجة القلب البشري يلعب دورا رئيسيا في توريد الدم والأكسجين والمواد المغذية للخلايا القلبية11. خلال التطور الجنيني، تتشكل الشعيرات الشريانية التاجية والشرايين عن طريق تحلل الأوعية الدموية (تكوين الأوعية الدموية دي نوفو) وتكوين الأوعية الدموية (توليد الأوعية الدموية من تلك الموجودة مسبقا) من الخلايا السلف البطانية8،12. الليفية القلبية تلعب أيضا دورا رئيسيا في تكوين شبكة الأوعية الدموية السليم من خلال توفير المصفوفة من خارج الخلية الأمثل (ECM) وتكوين النمو13،14.

شبكة الأوعية الدموية 3D من أنسجة القلب الهندسة الحيوية تسيطر على بقاء الخلايا ووظيفتها من خلال خلق الأوكسجين والتدرجات المغذيات وإشارات paracrine، مثل تفاعل الخلايا المثلية، والتفاعل بين الخلايا غير المتغايرة، والتفاعل بين الخلايا من خلال البروتينات القابلة للذوبان المفرزة وخلية لتفاعلات ECM3،10،15،16،18. وهذا يمنع موت الخلايا في وسط الأنسجة ويعزز صلاحية الخلية والوظيفة الفسيولوجية في أنسجة القلب الهندسة الحيوية16,18,19.

وقد تم مؤخرا استكشاف الثقافات من الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية ونماذج في المختبر من قلب الإنسان20. لمزيد من تحسين البيئة الدقيقة القلبية في المختبر، وشملت استخدام جميع أنواع الخلايا الرئيسية الموجودة في قلب الإنسان، مثل myocytes القلب، والخلايا البطانية، والروبومات الليفية. الثقافات Spheroid تقديم الدعم الهيكلي 3D المطلوبة للخلايا للنمو وظيفة ويمكن استخدامها لهندسة حيوية شبكة الأوعيةالدموية 14,20,21,22. في هذا السياق، وقد وضعت مختبرنا spheroids القلب الإنسان (CSs) عن طريق زراعة الخلايا العضلية القلبية المشتركة، والخلايا البطانية والالخلايا الليفية في النسب الموجودة في قلب الإنسان14. هذا النموذج هو التوسع في الخلايا القلبية البطينية الفئران نموذج spheroid، ولدت من قبل الخلايا القلبية المشتركة في زراعة الثقافات قطرة معلقة، وتستخدم لنموذج تليف القلب21. يمكن استخدام CSs الإنسان كمقايسات سمية عن طريق علاجها دوكسيوروبيسين (DOX، وهو عامل مضاد للسرطان يستخدم لعلاج سرطان الدم، سرطان الغدد الليمفاوية وسرطان الثدي)، وهو معروف بالحث على تليف القلب وفشل القلب (HF) حتى 17 عاما بعد14من تنظيم الدم.

في هذه المخطوطة، نحن وصف كيفية توليد CSs الإنسان عن طريق زرع مشترك الإنسان الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من القلب (هيبس-CMs أو iCMs)، الخلايا الليفية القلبية (HCFs) والخلايا البطانية الشريان التاجي البشرية (HCAECs) في الثقافات قطرة معلقة. من أجل استخدام وصورة CSs للاختبار في المختبر، فهي جزءا لا يتجزأ من هلام الكولاجين. أظهر التحليل confocal من CSs ملطخة بالأجسام المضادة ضد CD31، علامة للخلايا البطانية، أن هذه الخلايا تشكل شبكة مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي. للحث HF وربما اختبار وكلاء الرواية التي قد علاج أو منع ذلك، تم علاج CSs مع 10 μM DOX (تركيز وجدت في مجرى الدم لمرضى السرطان تلقي الدواء). عندما تلطخ مع الكالسين-AM و ethidium homodimer (تلطيخ الخلايا الحية والميتة, على التوالي), DOX- المعالجة CSs تقديم انخفاض كبير في القدرة على البقاء بالمقارنة مع CSs التي لم تتلق الدواء. كما تقدم CSs نشاطًا مندّدًا متجانسًا عند سرعة الوتيرة باستخدام التحفيز المحتمل للمجال بين 1 و3 هرتز.

Protocol

ملاحظة: HIPSC-CMs المستخدمة لهذا البروتوكول متوفرة تجارياً. يرجى الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات الإنسانية المؤسسية قبل الشروع في هذا العمل إذا لزم الأمر.

1. الإنسان فيبرومية القلب والخلايا البطانية الطلاء والخلايا النمو

  1. ذوبان ذوبان اكوام تحتوي على HCFs وHCAECs في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
  2. نقل cryovials تحت تدفق معقم لامين السلامة البيولوجية الطبقة مجلس الوزراء 2.
  3. جمع 1 مل من تعليق الخلية من cryovials باستخدام 1000 ميكرولتر ماصة تلميح وإضافة إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 7 مل من القلب الليفية المتوسطة البشرية لHCFs و 7 مل من الإنسان Meso إندو نمو المتوسطة لHCAECs.
    ملاحظة: من أجل جمع غالبية الخلايا من كل كريوفيال، شطف لهم مرتين مع 1 مل من المتوسط ثقافة من نفس أنبوب 15 مل.
  4. خلط بلطف تعليق الخلية.
  5. نقل تعليق الخلية لفصل T75 قارورة ثقافة باستخدام ماصات المصلية 10 مل.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  7. بعد 18 ساعة، التعرق المتوسطة من كل من قارورة الثقافة وشطفها مرة واحدة مع الفوسفات المعقم العازل المالحة (PBS) لإزالة تجميد الخلايا المتوسطة والميتة.
  8. استبدال برنامج تلفزيوني مع 7 مل من الثقافة المناسبة المتوسطة لكل قارورة الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية.
  9. دراسة التوسع الخلوية وقابلية البقاء بانتظام واستبدال وسائل الإعلام كل يومين حتى الخلايا تصل إلى 80-90٪ التقاء.

2. iCM اللوحات الثقافية والنمو

  1. قبل معطف اثنين من قارورة ثقافة T25 مع 2 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 40 ميكروغرام / مل من الليفية (FN) واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات على الأقل.
  2. بعد 4 ساعات، وجمع واحد cryovial التي تحتوي على iCMs ووضعها في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  3. نقل cryovial تحت تدفق معقم لامين السلامة البيولوجية مجلس الوزراء فئة 2.
  4. نقل بلطف iCMs من التبريد إلى أنبوب معقمة أجهزة الطرد المركزي 50 مل باستخدام طرف ماصة 1 مل.
  5. شطف التبريد iCMs فارغة مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة طلاء المتوسطة لاسترداد أي خلايا المتبقية. نقل 1 مل من شطف المتوسطة الطلاء من انخفاض كرايلي الحكمة أكثر من 90 ثانية إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل التي تحتوي على تعليق الخلية iCM.
    ملاحظة: دوامة بلطف الأنبوب في حين إضافة المتوسطة لخلط الحل تماما، ولتقليل الصدمة التناضحة على الخلايا المذابة.
  6. إضافة ببطء 8 مل من درجة حرارة الغرفة Plating المتوسطة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. أضف أول 1 مل دروبي على مدى 30 - 60 s. ثم قم بإضافة وحدة التخزين المتبقية على الـ 30 s التالية. تدوير بلطف أنبوب الطرد المركزي مع إضافة المتوسطة الطلاء. خلط بلطف محتويات أنبوب الطرد المركزي 50 مل عن طريق عكس 2 -3 مرات (تجنب اهتزاز قوية أو دوامة).
  7. إجراء العد الخلية على الفور باستخدام قياس الهيموسيتات وتحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة (في الخلايا / مل).
  8. خذ قارورة T25 المغلفة مسبقًا من FN وابتني حل FN-PBS دون السماح للزجاجات بالجفاف. إلى هذا إضافة حجم البذر من iCMs (1.6 × 106 iCMs قابلة للحياة في 8 مل درجة حرارة الغرفة تصفيح المتوسطة).
  9. iCMs الثقافة في الحاضنة لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  10. ذوبان متوسط الصيانة بين عشية وضحاها في 4 °C يوميا قبل الاستخدام.
  11. اكويبيل متوسط الصيانة في حمام مائي 37 درجة مئوية واستخدامها على الفور.
  12. بعد يومين، حرّك قوارير iCMs T25 تحت خزانة السلامة البيولوجية.
  13. غسل بلطف قبالة الخلايا الميتة والحطام عن طريق الأنابيب بلطف متوسطة الطلاء صعودا وهبوطا 5 مرات.
  14. التعرق متوسطة الطلاء واستبدالها مع 8 مل من ما قبل تدفئة الصيانة المتوسطة. ضع قارورة T25 مرة أخرى في الحاضنة. استبدال "متوسط الصيانة" كل يومين ودراسة التقاء بانتظام.

3. عزل الخلايا والعد

  1. ابدأ بجمع أولاً HCAECs وHCFs ثم iCMs باتباع الخطوات 3.2-3.12.
  2. إعداد CS ثقافة المتوسطة عن طريق خلط 10 مل من iCMs صيانة المتوسطة, 5 مل من القلب الليفية المتوسطة الإنسان و 5 مل من ميزو إندو نمو المتوسطة.
  3. إزالة المتوسطة الثقافة من كل قارورة الأنسجة التي تحتوي على HCFs وHCAECs وشطف مرة واحدة مع PBS 5 مل ل T75 قارورة. إزالة برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة 5 مل من 0.25٪ تريبسين EDTA حل لكل قارورة T75 واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  5. مرة واحدة في فصل الخلايا، تحييد فورا حل EDTA التربسين مع 5 مل من ثقافة المتوسطة.
  6. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل وخلايا الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 4 دقائق.
  7. إزالة فائقة بعناية من كل أنبوب. إضافة 1 مل من CS المتوسطة لكل بيليه الخلية و resuspend لهم. الحفاظ على أنبوب على الجليد وعد الخلايا باستخدام Trypan الأزرق ومقياس الهيموسيت.
  8. إزالة الصيانة المتوسطة من قوارير الأنسجة التي تحتوي على iCMs وشطف مرة واحدة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني.
  9. إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين EDTA حل لكل قارورة T75 واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تحقق من الخلايا كل دقيقة حتى يتم فصلها.
  10. مرة واحدة في فصل الخلايا، تحييد فورا حل EDTA التربسين مع 4 مل من ثقافة المتوسطة.
  11. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي لهم في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  12. إزالة فائقة بعناية من كل أنبوب. إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة إلى بيليه الخلية و resuspend ذلك. الحفاظ على أنبوب على الجليد وعد الخلايا باستخدام Trypan الأزرق ومقياس الهيموسيت.

4.CS الأجيال والنمو

  1. مزيج iCMs، وHCFs وHCAECs في نسبة 2:1:1 عن طريق طلاء 10،000 iCMs، 5،000 HCFs و 5000 HCAECs لكل ثقافة إسقاط معلقة تحتوي على 20 ميكرولتر من CS المتوسطة. ضبط إلى وحدة التخزين النهائية للعدد الإجمالي لـ CSs.
  2. Pipette 20 μL من تعليق الخلية في كل بئر من 384 جيدا HDC لوحة إما يدويا أو باستخدام ماصة متعددة القنوات الروبوتية للتعامل مع السوائل الآلي.
  3. Pipette 1.5 مل من برنامج تلفزيوني عقيم في كل جانب من جوانب القناة حول لوحة قطرة معلقة لمنع تجفيف CSs. احتضان لوحة HDC في 37 درجة مئوية.
  4. فحص تشكيل CSs على أساس يومي حتى يتم ملاحظة الزفيرة كاملة التكوين في غالبية الآبار. إضافة 7.5 μL من CS المتوسطة لكل بئر كل يومين حتى يتم تشكيل CS.

5.CS تضمين في المواد الهلامية الكولاجين

  1. جمع CSs مع طرف ماصة 1 مل.
    ملاحظة: من الضروري قطع طرف الماصات حوالي 0.2 سم من الحافة قبل استخدامها مع سطح حاد معقمة (إما مشرط أو مقص) لمنع أي ضرر الجل جزءا لا يتجزأ من spheroids أثناء جمعها.
  2. جمع تعليق CS في أنبوب 50 مل على الجليد.
  3. الطرد المركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يجب أن تبقى بيليه التي تم الحصول عليها على الجليد حتى الاستخدام.
  4. إعداد حل هلام الكولاجين (100 ميكرولتر / بئر ل30 آبار من 96 لوحة جيدا) على الجليد باستخدام الكولاجين ذيل الفئران و CS المتوسطة في نسبة 3:7.
  5. إزالة المناط من أنبوب يحتوي على CSs.
  6. خلط CSs بيليه داخل حل هلام الكولاجين.
  7. أضف 1 ميكرولتر/مل من هيدروكسيد الصوديوم 5 مل م إلى تعليق جل الكولاجين CS وخلط بلطف.
  8. نقل 100 ميكرولتر من هلام الكولاجين CS إلى أسفل مسطحة واضحة 96 جيدا أسود البوليسترين microplate واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

6- قياسات الجدوى والسمية لـ DOX المعالجة لـ CSs

  1. بعد 30 دقيقة جمع لوحة 96 جيدا من حاضنة
  2. إعداد 10 μM DOX (استناداً إلى بروتوكول تم تحديدها سابقاً للوفاة الخلية في CSS14).
    ملاحظة: لاختبار عوامل أخرى قد تحمي من التردد العالي في CSs، قم بإنشاء حلول تحتوي على DOX + Agent A وB وما إلى ذلك.
  3. أضف 100 ميكرولتر من الحلول التي تحتوي على DOX و / أو عوامل أخرى لكل بئر. تحتوي ثقافات التحكم على وسائط بدون أي DOX.
  4. احتضان لوحة لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  5. في اليوم التالي، وجمع حلول المخزون الكاشف البقعة لايف / الميت والسماح لهم ذوبان الجليد في الظلام في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
  6. إعداد حل يحتوي على وصمة عار Hoechst، 4 μM من هومريم الإتيهيدوم و 2 μM calcein-AM.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من وصمة عار Hoechst، calcein-AM/ethidium homodimer حل في كل بئر.
  8. قياس الفلوريسنس في كل بئر في 645 نانومتر للهوم الإتيهيدوم و 530 نانومتر لcalcein-AM، على التوالي، وذلك باستخدام قارئ متعدد المستويات microplate.
  9. نقل قياسات الفلورسين إلى برنامج PrISM لـ Graphpad (أو برنامج مكافئ للتحليل الإحصائي).
  10. استخدام برنامج GraphPad Prism لتحليل البيانات والإحصاءات.
  11. لمراقبة الجودة، تحقق تحت مجهر epifluorescence لتلطيخ النوى، جنبا إلى جنب مع الكالسين-AM و ethidium homodimer.

7.CS تقييم وظيفة التعاقد

  1. جمع microplate كما أعدت في الخطوة 5.8.
  2. تشغيل الكمبيوتر الذي يحتوي على برنامج IonOptix للكشف عن حافة المستندة إلى الفيديو و "واجهة المساعدة الفلوريسين" و "محفز حقل MyoPacer".
  3. وضع زلة غطاء جديد على منصة حامل الأنسجة وتجميع حمام الماء مع الأقطاب الكهربائية.
  4. جمع بلطف CSs من المواد الهلامية الكولاجين باستخدام طرف ماصة 1 مل قطع 0.5 مم من الحافة ونقلها إلى أنبوب الصقر. إضافة وسائل الاعلام على CS لمنع تجفيف CSs. نقل CS (واحد في وقت واحد) مع μL قليلة من وسائل الإعلام على خشبة المسرح من نظام IonOptix.
  5. حدد CS ليتم تحليلها عن طريق وضع قمم على الجانب الأيسر والأيّني من CS باستخدام برنامج IonOptix.
  6. استخدم محلل الحركة المستند إلى الكمبيوتر لتتبع حركة حواف CS.
    ملاحظة: عادةً، يتم قياس قابلية التقلص إما في تقليل نسبة الخلية أو % بتقصير جزئي. في هذه الحالة، قمنا بقياس نسبة لتقصير الزفيرة.
  7. تحقيق الاستقرار في كل من القمم ضبط عتبة وحافة الخيارات من الكمبيوتر.
  8. تعريض CSs لترددات مختلفة (0.3 و0.6 و 1 و 2 و 3 هرتز) و الجهد (1 و 2 و 3 و 5 V) باستخدام محفز حقل Myopacer.
  9. سجل تقصير spheroid كما CS طول التغييرات من DOX المعالجة وغير المعالجة CSs. تحليل البيانات باستخدام البرمجيات لينة الحافة ومتوسط لكل CS.

8. مجهرية من CSs: التثبيت والمناعة

  1. جمع 96 لوحة جيدا بعد 30 دقيقة (كما أعدت في الخطوة 5.8) وإصلاح CSs في 4٪ شبهformaldehyde (PFA) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. إزالة PFA وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01٪ أزيد الصوديوم (PBSA).
  3. إزالة PBSA.
  4. إضافة 200 μL من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.02٪ تريتون- X-100 إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة على شاكر.
    ملاحظة: هذه الخطوة permeabilizes CS لتسلل الأجسام المضادة أفضل.
  5. إضافة 200 μL من 3٪ البوم مصل البقر في حل PBSA لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: هذه الخطوة بحظر ربط الأجسام المضادة غير محدد في CSs.
  6. إعداد حل يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة مضادة ماوس الأولية ضد CD31 المخفف في حل الحجب.
  7. إضافة 100 μL من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
  8. شطف لوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على لوحة هزاز.
  9. إعداد حل يحتوي على وصمة عار الحمض النووي Hoechst و 10 ميكروغرام / مل من Cy3-مترافق الثانوية حمار المضادة للماوس الأجسام المضادة المخففة في حل منع.
  10. إضافة 100 μL من محلول الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على وصمة عار Hoechst إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
    ملاحظة: غطي اللوحة بورق الألومنيوم من هذه النقطة فصاعدا.
  11. شطف لوحة ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة على لوحة هزاز.
  12. أضف 100 ميكرولتر من Vectashield متوسطة التركيب لكل بئر.
  13. CSs الصورة تحت مجهر ليزر المسح confocal. قم بإجراء القطع البصري على طول محور Z ثم قم بطي الصور في مستوى بؤري واحد باستخدام برنامج ImageJ.

Representative Results

البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة يمثل نهجا بديلا لتطوير معقدة شبكة الخلايا البطانية القلب داخل نسيج القلب الهندسة الحيوية مع تحسين جدوى الخلية ووظيفته بالمقارنة مع النماذج الموجودة(الشكل 1). وروجت خلاصة ثلاثية الأبعاد في بيئة القلب الدقيقة الحية داخل CSs استجابتها لـ DOX عند التركيز الموجود في مجرى الدم لمرضى السرطان (بين 5 و10 ميكرومتر ، الشكل 2). DOX CSs المعالجة قدمت انخفاضا هاما إحصائيا في صلاحية الخلية مقارنة مع السيطرة (لا DOX) CSs داخل 24 ح(الشكل 2),تأثير سام لوحظ في مرضى السرطان الإنسان حتى 17 بعد سنوات من علاجهم مع الدواء.

Figure 1
الشكل 1 CS تشكيل وتحليل الأوعية الدموية. (أ)بروتوكول يوضح خطوات تشكيل CS من الثقافة المشتركة لـ iCMs و HCAECs وHCFs في القطرات المعلقة. صور Brightfield على الجانب الأيمن تظهر تشكيل كروي التدريجي من الخلايا المفردة في قطرات شنقا. (B) انهارت Z- أكوام من الصور confocal من CS ملطخة بالأجسام المضادة ضد القلب تروبونين (cTNT), PECAM و vimentin, تلطيخ myocytes القلب, الخلايا البطانية والضخامات الليفية, على التوالي. وقد تم تعديل هذا الرقم من14. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 قابلية البقاء والسمية في CSs. التحليلات الإحصائية من الكالسين-AM(أ)و ethidium homodimer (B) الفلوري من CSs تعامل في وجود وسائل الإعلام فقط (DOX 0 μM) أو دوكسوروبايسين (10 μM). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الناحية التنموية ، وتشكيل شبكة الأوعية الدموية السليم أمر بالغ الأهمية لتوليد الأنسجة الوظيفية ، بما في ذلك قلب الإنسان10،12،23،24،25،26. النظر في الأوعية الدموية السليمة من الأنسجة 3D تسمح بتبادل الأكسجين، وعوامل النمو، الجزيئات الإشارات والمواد المغذية، ومنع تطور نخر الخلايا داخل أي الأنسجة سمكا من 200 ميكرومتر6،10،12،17،24،25،26،28. تتوفر حاليا في النماذج في المختبر 3D القلب التي تقدم شبكة الأوعية الدموية هي في المقام الأول تقديم الشعيرات الدموية الحجم، شبكات الأوعية الدموية غير المنظمة وتفتقر إلى المركب الهرمية تشعب الأوعية الدموية احظت في الجسم الحي6،8،29. إن النهج البديل لتطوير شبكة الخلايا البطانية القلبية المعقدة الموصوفة في هذه المخطوطة يعرض تحسين جدوى الخلية ووظيفته مقارنة بالنماذج الموجودة(الشكل 1)14،22. 3D في المختبر CSS نموذج قلب الإنسان عن طريق تلخيص أفضل لها في بيئة حيوية، بما في ذلك مكوناتها الجزيئية والخلوية وخارج الخلية14،22. CS جيل من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا في قطرات شنقا تسمح ثقافاتهم في ظروف محددة (على سبيل المثال، وأنواع الخلايا ونسبة، وتشكيل الأنسجة السليمة). الثقافات المشتركة لـ iCMs جنبا إلى جنب مع HCFs و HCAECs داخل CSs تحدد الTalk عبر الجزيئية والخلوية التي تنظم فيزيولوجيا أمراض القلب، بما في ذلك وظيفتها العقدية والاستجابة للأدوية بتركيزات موجودة في مجرى الدم للمريض14. بسبب هذه الميزات الفريدة، وقد استخدمت CSs لنموذج تليف القلب، نتيجة خطيرة ل احتشاء عضلة القلب وفشل القلب21. أظهرت دراساتنا السابقة كيف أن وجود كل من الخلايا البطانية والليفية أمر بالغ الأهمية لإعادة تجميع البيئة الدقيقة الوعائية في قلب الإنسان ، مما يسمح بالترسب الأمثل لبروتينات ECM المشتقة من الخلايا الليفية ، مثل اللامينين والألياف الكولاجينية من النوع الرابع ، مترجمة على مقربة من شبكة الخلايا البطانية النامية14،21.

DOX هو دواء معروف للرضع الكردي التي قد تتطور فشل القلب في مرضى السرطان حتى بعد 17 عاما من علاجهم30. ومع ذلك، فإنه لا يزال الدواء المفضل لعلاج سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية في المرضى الأطفال وسرطان الثدي لدى النساء30. وقد استخدم علاج DOX في CSs بعد ذلك لنموذج فشل القلب (HF) في المختبر لدراسة كل من الآليات المنظمة للسمية في الخلايا العضلية القلبية والخلايا البطانية والليفية14 ونموذج تليف القلب الناجم عن HF21. تم تخفيض صلاحية الخلية إحصائيا في DOX CSs المعالجة في غضون 24 ساعة عندما تعرضت للدواء في التركيز الموجود في مجرى الدم لمرضى السرطان (بين 5 و 10 μM)14 (الشكل 2). أظهرت الدراسات السابقة في مختبرنا أيضًا التأثيرات السامة لـ DOX على كل من الخلايا البطانية القلبية والأبلوستات الليفية عبر مركب أكسيد النيتريك البطانية (eNOS) باستخدام كل من مثبطات جينية والكيميائية لهذا المسار الإشارات14. استخدام الجينية (NOS3 SHRNA) والكيميائية (N5-(1-iminoethyl)-L-ornithine، ديهيدروكيلوريد، أو L-NIO) الخصوم من مسار إشارة eNOS كهدف المصب من DOX منع آثاره السامة في كل من الخلايا البطانية القلبية والليفية14.

كما تم قياس النشاط التقلصي داخل CSs بفضل اقتران كهربائي للخلايا القلبية عند التعرض للتحفيز الميداني المحتمل. وجدنا أن CSs مثقف مع وسائل الإعلام التحكم (DOX 0 μM) عقد تلقائيا وبشكل متجانس بمعدل الضرب التي يمكن أن يكون يسير من قبل التحفيز الميداني داخل 1 و 3 هرتز، قابلة للمقارنة مع قلب الإنسان السليم. من ناحية أخرى، لا تتبع CSs المعالجة بـ DOX التحفيز الكهربائي لأنها لا تستطيع التعاقد. جنبا إلى جنب مع قياسات صلاحية الخلية والسمية باستخدام الكالسين-AM و ethidium homodimer, هذا الاحسان وظيفية لوظيفة التعاقد CS تسمح بتقييم السيناريو المعقدة نموذجية من قلب الإنسان في المختبر, حاليا لا يمكن تحقيقه مع نماذج أخرى. بالمقارنة مع قياسات النشاط العقدي للخلايا القلبية المفردة باستخدام نفس النظام، فإننا لسنا قادرين على تصور وقياس الساركومير في CSs. لذلك ، نحن تقتصر على قياسات النسبة المئوية للتقصير spheroid مع مرور الوقت ، وهو فحص كان علينا أن نطوره داخل مختبرنا. ونحن السيطرة على عدد من الخلايا، ونحن شارك في الثقافة في كل CS، وبالتالي حجم كل CS، ونحن الاستفادة من CSs مع حجم مماثل أن تقدم في الواقع وظيفة المتعاقدة متجانسة. ومع ذلك ، حتى في حال قمنا بتوليد CSs من أحجام مختلفة ، لم يتغير نشاطها العقدي.

ومن المهم أيضاً أن نبلغ بأن طبيعة الخلايا المتعددة لـ CSs تجعلها ثقيلة بما يكفي لإضفاء الطابع المحلي على أسفل الغطاء في نظام أيون-أوبتيكس، حتى في حالة غرسها في المستويات الفائقة. استنادا إلى حقيقة أن CSs الجلوس بأنفسهم في موقف محدد، ونحن لسنا بحاجة لجعلها تلتزم غطاء، على العكس من ما يتم عادة مع خلايا القلب واحد في معظم المختبرات.

التحليل المجهري لCSS الملطخة بالأجسام المضادة ضد القلب تروبونين T، CD31/PECAM، وPECAM (كما علامات لCCMs، HCAECs، وHCFs، على التوالي) أظهرت تشكيل شبكة الخلايا البطانية(الشكل 1، الأزرق). لاستبعاد كامل نخر في الجزء الداخلي من CSs، تم إجراء التقييم المكاني لقابلية الخلية في مختبرنا عن طريق التحليل الثقفي من الكالسين-AM/ethidium homodimer الملطخة CSs(البيانات غير مبينة). ومع ذلك، من المهم أن نعترف بأن التطورات المستقبلية في مجال المعالجة البيولوجية لتكميم أفضل السمات المعقدة الأخرى النموذجية للقلب البشري في الجسم الحي، غير متوفرة حاليا في النموذج الحالي. وتشمل هذه: ط) وظيفة انكماشية نموذجية من أمراض القلب الكبار; 2) تدفق الدم وقوى الضغط؛ '3' إشارات الباراكرين؛ iv) الاستجابة المناعية, والتي ستكون حاسمة لتحسين هذا وغيره في نماذج القلب في المختبر6. كما أن أي نموذج آخر يهدف إلى تلخيص السمات الرئيسية إما لالأنسجة السليمة أو حالة المرض، بروتوكول لتوليد واستخدام CS الموصوفة في هذه المخطوطة يهدف إلى مساعدة الباحث في معالجة أسئلة محددة، التي قد لا تكون شاملة باستخدام هذا النهج. على سبيل المثال، من شأن الاستخدام المحتمل للخلايا المشتقة من المرضى لتوليد CSs توفير أدوات للطب الشخصي، غير متوفر حاليا باستخدام الأقوال المتاحة عادة عالية الإنتاجية لأبحاث القلب والأوعية الدموية.

في الختام، أظهرنا طريقة بسيطة لتكميم بيئة القلب البشري الدقيقة بشكل أفضل باستخدام خلايا القلب. الزنجيات القلبية تقديم شبكة الخلايا البطانية التي يلخص أفضل واحد موجود في قلب الإنسان مقارنة بثقافات أحادية الطبقات من الخلايا القلبية. نظراً لخصائصها الفريدة، فهي تمثل أدوات متقدمة للاختبارات المختبرية لأبحاث القلب والأوعية الدموية. يمكن أن توفر الدراسات المستقبلية باستخدام الخلايا المشتقة من المريض خيارات للطب الشخصي والعلاجات الجديدة لمنع أمراض القلب والأوعية الدموية وعلاجها بشكل أفضل.

Disclosures

اي

Acknowledgments

شكر خاص لنات جونستون لتسجيل وتحرير الفيديو.

وقد تم دعم بونام شارما من جامعة نيوكاسل مع UNIPRS و UNRS المركزية وكلية كلية (UNRSC5050) المنح الدراسية. تم دعم كارمين جنتيل من قبل تمويل البذور UTS، الأبرشية الكاثوليكية من منحة سيدني لأبحاث الخلايا الجذعية للبالغين ومؤسسة كلية الطب في سيدني جراحة القلب والصدر منحة البحوث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A1933
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies Jackson Immunological Research Labs, Inc. 715-165-150 Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody
Doxorubicin hydrochloride Sigma-Aldrich D1515
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG From Bovine Plasma
Human cardiac fibroblasts (HCFs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 306AK-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 300K-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF Growth medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 316-500
Human MesoEndo Cell Growth Medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA L3224
Maintenance Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM BD Pharmingen, San Diego, CA, USA 566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA R37605
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Plating Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Rat Tail Collagen Sigma-Aldrich C3867
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Trypsin–EDTA, 0.25% Gibco, Thermofisher Scientific 25200072
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher Scientific 15250061
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Tissue culture flasks (T25) Thermofisher Scientific 156367
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Corning, New York, USA 3603
384-Well Hanging Drop Plate 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA HDP1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538 (2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 167، spheroids القلب الوعائية، الأنسجة القلبية الهندسة الحيوية، الأوعية الدموية، 3D الثقافات المشتركة، الخلايا الجذعية، cardiomyocytes، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، في الاختبار في المختبر، دوكسيروبايسين، السمية اللبادية.
الـ 25: الفيزياء القلبية كما في الأنسجة الحيوية للقلب لدراسة أمراض القلب البشري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac… More

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology. J. Vis. Exp. (167), e61962, doi:10.3791/61962 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter