Summary
このプロトコルは、吊り下げ低下中の細胞を共培養することによって3D心臓スフェロイド(CD)を製造することを目的としています。コラーゲン埋め込みCDは、心不全をモデル化するために生理学的濃度でドキソルビシン(DOX、心毒性剤)で治療される。DOX治療のCDを用いたインビトロ検査は、心不全患者に対する新規治療法を同定するために用いることができる。
Abstract
心臓組織工学のいくつかの進歩にもかかわらず、克服するための主要な課題の1つは、生体工学された心臓組織内の酸素および栄養素を提供するために、いくつかのレベルの複雑さを含む完全に機能する血管ネットワークの生成のままである。当研究室では、心臓スフェロイドまたはCSと呼ばれるヒト心臓の3次元インビトロモデルを開発しました。これは、人間の心臓の典型的な生化学的、生理学的、および薬理学的特徴を提示し、心臓筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞などの3つの主要な細胞タイプを共培養することによって生成される。ヒト誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞(hiPSC-CMまたはiCM)は、3〜4日間の吊り下げ培養プレート中のヒト心臓線維芽細胞(HFF)およびヒト冠動脈内皮細胞(HCAIC)と共培養される。心臓トロポニンT、CD31およびビメンチン(それぞれ心臓筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞のマーカー)に対する抗体で染色されたCSsの共焦点分析は、CSがヒト心臓に見られる天然細胞ネットワークに似た複雑な内皮細胞ネットワークを提示することを示している。これは、これらの共焦点画像の 3D レンダリング解析によって確認されます。また、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質、例えばコラーゲン型IV型、ラミニンおよびフィブロネクチンを有する。最後に、CDは、iCMのみを含むCDと比較して、人間の心臓の典型的な収縮性に近いと測定される収縮活性を提示する。ドキソルビシン(DOX、白血病、リンパ腫、乳癌の治療に使用されるDOX)などの心毒性抗癌剤で治療すると、DOX処置されたCSの生存率は、DOX inFs HCFsおよびHCAIcの下流標的である内皮一酸化窒素合成酵素の10μMの遺伝的および化学的阻害で有意に減少する。これらのユニークな特徴を考えると、CSは現在、心臓生化学、病態生理学、薬理学を研究するためにインビトロモデルとして使用されています。
Introduction
心臓血管疾患(CVD)は、組織工学と幹細胞技術の最近の進歩にもかかわらず、世界的に死の主な原因である一方で、人間の心臓は再生能力が限られています1.損傷した心臓を修復するか、心臓の障害を防ぐための分子および細胞アプローチを含む新しい治療法の必要性は、心臓病2、3、4に罹患している患者にとって現在の主要な臨床ニーズの1つである。心臓組織工学の主な目的は、血管ネットワークおよび生理的収縮機能4、5、6を含む、ヒト心臓の典型的な分子、細胞、および細胞外特徴を提示する3次元(3D)心臓組織を作製することである。
生体工学と生体外および生体内の適用のために人間の心臓を模倣する機能的なヒト心臓組織を製造するために、いくつかのアプローチが、設計された心臓組織(EHTs)、細胞シートおよびスフェロイド培養7、8を含む調査されている。しかし、これらの組織は、ヒト心臓の典型的な最適な3D微小環境を再現し、CVD患者に対するそれらの潜在的な使用は、ベンチからベッドサイド7に直接翻訳できない。これは、生体内心臓組織の複雑な生物学、形態、生理学を再現しないためです。心臓組織工学における主要な課題の1つは、生体工学された心臓組織内の階層的血管ネットワークの開発を含み、直径200μmを超える組織が中間2,10で細胞死を発症する。ヒト心臓組織における適切に形成された血管ネットワークは、心臓細胞11への血液、酸素および栄養素の供給に大きな役割を果たす。胚発生時に、冠状動脈毛細血管および動脈は血管形成(脱ノボ血管形成)および血管新生(既存血管の形成)を介して形成される(既存の血管から血管の生成)内皮前駆細胞8,12から。心臓線維芽細胞はまた、最適な細胞外マトリックス(ECM)および成長組成物13、14を提供することにより、適切な血管ネットワーク形成において主要な役割を果たす。
生体工学に基いた心臓組織の3D血管ネットワークは、均質な細胞相互作用、異種細胞相互作用、分泌された可溶性タンパク質および細胞を介した細胞の相互作用3、10、15、16、17、18などの酸素および栄養勾配およびパラクリンシグナル伝達を作成することによって細胞の生存および機能を制御する。これは、組織の途中で細胞死を防ぎ、生体工学心臓組織16、18、19における細胞生存率および生理機能を促進する。
幹細胞由来のスフェロイド培養は、ヒト心臓20のインビトロモデルとして最近探求されている。さらに、インビトロで心臓微小環境を改善するために、心臓筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞など、ヒト心臓に見られるすべての主要な細胞タイプの使用が含まれています。スフェロイド培養物は、細胞が成長し、機能するために必要な3D構造サポートを提示し、血管ネットワーク14、20、21、22をバイオエンジニアリングするために使用することができる。この文脈で、我々の研究室は、心臓筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞をヒト心臓14に見られる比率で共培養することによって、ヒト心臓スフェロイド(CS)を開発した。このモデルは、ラット心室心房スフェロイドモデルの拡大であり、吊り下げ低下培養物中で心臓細胞を共培養して生成し、心臓線維症21をモデル化するために用いられる。ヒトCDは、ドキソルビシン(DOX、白血病、リンパ腫および乳癌の治療に使用される抗癌剤)を治療することによって毒性アッセイとして使用することができ、これは、その支配14後17年も心臓線維症および心不全(HF)を誘発することがよく知られている。
本稿では、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CMまたはiCM)、ヒト心筋線維芽細胞(HTF)、ヒト冠動脈内皮細胞(HCAIC)を吊り下げ培養で共培養することによりヒトCDを生成する方法を説明する。インビトロ検査に使用して画像CDを使用するために、コラーゲンゲルに埋め込まれています。内皮細胞のマーカーであるCD31に対する抗体で染色されたCSsの共焦点解析は、これらの細胞が生体内で観察されたものと同様のネットワークを形成することを示した。HFを誘導し、それを治療または予防する可能性のある新しい薬剤を潜在的に試験するために、CSは10 μM DOX(薬物を受けている癌患者の血流中に見られる濃度)で治療された。カルセインAMおよびエチジウムホモジマー(それぞれ生細胞と死細胞の染色)で染色すると、DOX処理されたCDは、薬物を受け取らなかったCSと比較して生存率の有意な減少を示す。また、1~3Hzの間の電界電位刺激を使用してペースを合うと、同種の収縮活性を示します。
Protocol
注: このプロトコルに使用される hiPSC-CM は市販されています。必要に応じて、この作業を開始する前に、制度的な人間倫理委員会の承認を求めてください。
1. ヒト心臓線維芽細胞および内皮細胞培養めっきと増殖
- 37°Cの水浴にHFとHCAICを含む凍結を1分間解凍する。
- 滅菌層流量バイオセーフティキャビネットクラス2の下でクライオビアルを移動します。
- 1000 μL ピペットチップを使用して、クリオシャルから 1 mL の細胞懸濁液を収集し、HF 用のヒト心臓線維芽細胞培地 7 mL と HAIC 用のヒトメソ Endo 成長培地 7 mL を含む 15 mL チューブに追加します。
注:各凍結細胞から細胞の大部分を収集するために、同じ15 mLチューブから1mLの培養培地で2回リンスします。 - 細胞懸濁液を軽く混ぜます。
- 細胞懸濁液を10 mL血清ピペットを用いてT75培養フラスコを分離する。
- 5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートする。
- 18時間後、両方の培養フラスコから培地を吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で一度リンスし、凍結培地および死細胞を除去する。
- 各培養フラスコに対してPBSを7mLの適切な培養培地に置き換え、37°Cでインキュベートする。
- 細胞の拡張と生存率を定期的に調べ、細胞が80〜90%の合流に達するまで1日おきに培地を交換します。
2. iCM培養めっきと成長
- フィブロネクチン(FN)の40μg/mLを含む2mLのPBSを用いた2つのT25培養フラスコをプレコートし、37°Cでインキュベートし、5%CO2を少なくとも4時間培養した。
- 4時間後、iCMを含む1つのクライボシャルを集め、37°Cの水浴に4分間置きます。
- 滅菌層流のバイオセーフティキャビネットクラス2の下でクライオビアルを移動します。
- 1 mL ピペットチップを使用して、iCM を凍結管から無菌 50 mL 遠心分離チューブにそっと移します。
- 空のiCMを1 mLの室温メッキ培地で洗い換え、残留細胞を回収します。1 mLのメッキ培地リンスを、90秒以上の凍結滴下から、iCM細胞懸濁液を含む50 mL遠心分離管に移します。
注:溶液を完全に混合し、解凍した細胞の浸透衝撃を減少させるために媒体を追加しながら、チューブを穏やかに旋回させます。 - 50 mL遠心分離管に室温めっき培地を8 mLゆっくり加えます。最初の 1 mL を 30 ~ 60 s 以上のドロップワイズに追加します。次に、残りのボリュームを次の 30 s に追加します。めっき媒体を加えながら遠心管を軽く旋回します。50 mL遠心管の内容物を2~3回反転して軽く混ぜます(激しい揺れや渦を避ける)。
- 速やかに、ヘモサイトメーターを使用して細胞計数を行い、生存可能な細胞密度(細胞/mL内)を決定します。
- FNプレコーティングされたT25フラスコを取り、フラスコを乾燥させることなくFN-PBS溶液を吸引する。これにiCMのシード量を加える(8 mL室温めっき媒体で1.6 x 10 6実行可能なiCM)。
- 培養器内の培養iCMは、37°Cで48時間、5%CO2.
- 使用前の1日4°Cでメンテナンス中の媒体を一晩解凍してください。
- メンテナンス中の媒体を37°Cの水浴で平衡化し、すぐに使用してください。
- 2日後、バイオセーフティキャビネットの下でiCM T25フラスコを移動します。
- めっき培地を5回軽くピペット化して、死んだ細胞や破片を静かに洗い流します。
- めっき媒体を吸引し、予め温めたメンテナンスミディアムの8 mLに交換してください。T25フラスコをインキュベーターに戻します。メンテナンスメディアを1日おきに交換し、コンフルエンスを定期的に確認します。
3. 細胞の分離とカウント
- 最初の HAIC と HCF を収集してから、次の手順 3.2 ~ 3.12 に従って iCM を収集します。
- ICM維持培地の10mL、ヒト心臓線維芽細胞培地の5mLおよび5mLのメソ遠心成長培地を混合してCS培地を調製する。
- HFLおよびHcAICを含む各組織フラスコから培養培地を取り出し、T75フラスコ用に5mL PBSで一度リンスします。PBS を削除します。
- 0.25%のトリプシンEDTA溶液を5 mLずつT75フラスコに加え、37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。
- 細胞が取り外されると、5 mLの培養培地で直ちにトリプシンEDTA溶液を中和する。
- 細胞懸濁液を15mLチューブに移し、遠心分離細胞を300xgで4分間移動させます。
- 各チューブから上清を慎重に取り除いてください。各細胞ペレットに1mLのCS培地を加え、再懸濁します。氷の上にチューブを維持し、トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
- iCMを含む組織フラスコからメンテナンス培地を取り除き、PBSの3 mLで一度すすいします。
- 各T75フラスコに0.25%トリプシンEDTA溶液の1mLを加え、37°C、5%CO2でインキュベートする。切り離されるまで、毎分セルをチェックします。
- 細胞が取り外されると、4 mLの培養培地で直ちにトリプシンEDTA溶液を中和する。
- 細胞懸濁液を15mLチューブに移し、300 x gで5分間遠心分離します。
- 各チューブから上清を慎重に取り除いてください。培養液1mLを細胞ペレットに加え、再懸濁させた。氷の上にチューブを維持し、トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
4.CS世代と成長
- CS培地20μLを含む吊り下げ培養液10,000個、HCF5,000、および吊り下げ液1回当たり5,000 HAICをめっきすることにより、2:1:1の比率でiCM、HcF、およびHCAICを混合します。CD の合計数の最終ボリュームに合わせて調整します。
- 384ウェルHDCプレートの各ウェルに、手動で、または自動液体処理用のロボットマルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液のピペット20 μL。
- ハンギングドロッププレートの周りのチャネルの両側に無菌PBSのピペット1.5 mLは、CSを乾燥させないようにします。
- 完全に形成されたスフェロイドが大多数のウェルで観察されるまで、毎日のCDの形成を調べる。CSが形成されるまで、1日おきに7.5μLのCS培地を各ウェルに加えます。
5.CSコラーゲンゲルに埋め込む
- 1 mL ピペットチップで CD を収集します。
注:ピペットの先端を、そのコレクション中にスフェロイドを埋め込んだ損傷を防ぐために、無菌の鋭い表面(メスまたははさみのいずれか)で使用する前に、エッジから約0.2 cmのピペットの先端を切断する必要があります。 - CSサスペンションを氷上の50mLチューブに回収します。
- チューブを300 x gで5分間遠心します。
注:得られたペレットは、使用するまで氷の上に保管する必要があります。 - ラットテールコラーゲンとCS培地を3:7比で使用し、氷の上にコラーゲンゲル溶液(96ウェルプレートの30ウェルに対して100 μL/well)を調製します。
- 上清を詰められたチューブから取り除く。
- コラーゲンゲル溶液内でペレット化したCDを混ぜます。
- CS-コラーゲンゲルサスペンションに水酸化ナトリウム5mMの1μL/mLを加え、やさしく混ぜます。
- 100 μLのCS-コラーゲンゲルを透明なフラットボトム96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレートに移し、37°Cで30分間インキュベートします。
6. DOX処理CDの生存率と毒性測定
- 30分後インキュベーターから96ウェルプレートを収集
- 10 μM DOX を準備します(CS14で細胞死のための以前に確立されたプロトコルに基づく)。
注: CS で HF から保護する可能性のある他のエージェントをテストする可能性がある場合は、DOX + エージェント A、B などを含むソリューションを生成します。 - DOXおよび/または他のエージェントを含む100 μLのソリューションを各ウェルに追加します。コントロール カルチャには、DOX を使用しないメディアが含まれています。
- インキュベートプレートは37°Cで18時間、CO2は5%である。
- 翌日、ライブ/デッド染色試薬ストックソリューションを収集し、バイオセーフティキャビネットで暗闇の中で氷の上で解凍することができます。
- ヘーヒスト染色、4 μMのエチジウムホモジマー、2 μM カルセイン-AMを含む溶液を調製します。
- 100 μLのヘヒスト染色、カルセインAM/エチジウムホモジマー溶液を各ウェルに加えます。
- マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、645 nmのエチジウムホモジマーの場合は645 nm、カルセイン-AMの場合は530 nmで各ウェルに蛍光を測定します。
- 蛍光測定をグラフパッドPRISM(または統計分析のための同等のソフトウェア)に移します。
- データ分析と統計にグラフパッド Prism ソフトウェアを使用します。
- 品質管理のために、核染色のための蛍光顕微鏡の下で、カルセインAMおよびエチジウムホモジマーと共に点検してください。
7.CS収縮関数評価
- ステップ5.8で準備したマイクロプレートを収集します。
- ビデオベースのエッジ検出、蛍光支援インターフェイス、およびMyoPacerフィールド刺激装置用のIonOptixソフトウェアを含むコンピュータをオンにします。
- ティッシュホルダーのプラットホームに新しいカバースリップを置き、電極と水浴を組み立てる。
- 1 mL ピペットチップカットを使用してコラーゲンゲルからCSを丁寧に採取し、その端から0.5mmカットして、ハヤブサチューブに移します。CSにメディアを追加して、CsSの乾燥を防ぎます。
- IonOptixソフトウェアを使用 して 、CSの左右のピークを設定して分析するCSを選択します。
- コンピュータベースのモーションアナライザを使用して、CS エッジの動きを追跡します。
注: 通常、収縮は%セルの短縮または分数の縮小率で測定されます。この場合、回転楕円体短縮率を測定した。 - コンピュータからしきい値とエッジ のオプションを調整するピークを安定させる。
- ミオパサーフィールド刺激装置を使用して、異なる周波数(0.3、0.6、1、2、3 Hz)と電圧(1、2、3、5 V)にCSを露出させます。
- DOX処理および未処理のCSのCS長変化に伴うスフェロイド短縮を記録します。
8. CDの顕微鏡:固定と免疫標識
- 30分後(ステップ5.8で作成)96ウェルプレートを回収し、室温で1時間の4%パラホルムアルデヒド(PFA)にCSを固定します。
- 0.01%のアジドナトリウム(PBSA)を含むPBSでPFAを3回除去し、すすいでください。
- PBSA を削除します。
- 0.02%トリトンX-100を含むPBSAを200μLずつ、シェーカーで30分間各ウェルに追加します。
注:このステップは、より良い抗体浸潤のためにCDを透過させます。 - PBSA溶液に200μLの3%ウシ血清アルブミンを室温で60分間加えます。
注:このステップは、CD内の非特異的抗体結合をブロックします。 - ブロッキング溶液で希釈したCD31に対して、10μg/mLの一次マウス抗ヒト抗体を含む溶液を調製します。
- 各ウェルに100μLの一次抗体溶液を加え、シェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。
- ロッキングプレート上の室温で20分間PBSAでプレートを3回洗いすみます。
- Hoechst DNA染色と10 μg/mLのCy3-共役ロバ抗マウス抗体をブロッキング溶液に希釈した溶液を調製します。
- 各ウェルにHoechst染色を含む2次抗体溶液100μLを加え、シェーカー上で一晩4°Cでインキュベートします。
注:この時点以降、アルミホイルでプレートを覆います。 - ロッキングプレート上の室温でPBSAでプレートを20分間3回洗いすみます。
- ベクタシールド取り付け媒体を100μLずつ各ウェルに追加します。
- レーザー走査共焦点顕微鏡下の画像CD。Z軸に沿って光断面を行い、ImageJソフトウェアを使用して画像を単一の焦点面に集約します。
Representative Results
本稿に記載されているプロトコルは、既存のモデルと比較して細胞生存率と機能が向上した生体工学心臓組織内で複雑な心臓内皮細胞ネットワークを開発するための代替アプローチを表している(図1)。CS内の生体内の心臓微小環境における3Dの再現は、がん患者の血流中に見られる濃度でDOXへの応答を促進した(5〜10μM、 図2)。DOX治療CDは、24時間以内のコントロール(DOXなし)CDS(図2)と比較して、細胞生存率の統計的に有意な減少を示し、薬物による治療後17年もヒト癌患者に観察される毒性効果である。
図 1.CS形成と血管化解析 (A) iCM、HcAIC、HCF の共存培養から CS を形成するためのステップを示すプロトコル。右側のブライトフィールド画像は、吊り下げ滴中の単一細胞からの進行性の回転楕円体形成を示しています。(B) 心臓トロポニンT(cTNT)、PECAMおよびビメンチンに対する抗体で染色されたCSの共焦点画像の崩壊Z-スタック、心臓筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の染色。この図は14から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.CSにおける生存率と毒性。 カルセインAM(A)およびエチジウムホモジマー(B)の培地のみ(DOX 0 μM)またはドキソルビシン(10 μM)の存在下で処理されたCSの蛍光の統計的分析。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
発達的には、適切な血管ネットワーク形成は、ヒト心臓10、12、23、24、25、26を含む機能的組織の生成にとって重要である。3D組織の適切な血管化に関する考察は、酸素、成長因子、シグナル伝達分子および栄養素の交換を可能にし、200 μm6、10、12、17、24、25、26、27、28より厚いあらゆる組織内の細胞壊死の発生を防止する。血管ネットワークを呈するin vitro 3D心臓モデルは、主に毛細管サイズの組織化されていない血管ネットワークを提示しており、生体内6、8、29において観察される階層的に複雑な分岐血管化を欠いている。本稿に記載された複雑な心臓内皮細胞ネットワークを開発する代替アプローチは、既存のモデル(図1)14,22と比較して細胞の生存率と機能が向上した。3D in vitro CSsは、その分子、細胞および細胞外成分14、22を含む生体内微小環境をより良く再現することによって、ヒト心臓をモデル化する。吊り下げ液中の幹細胞由来細胞からのCS生成は、定義された条件(例えば、細胞タイプおよび比率、適切な組織形成)においてそれらの培養を可能にする。CS内のHFFおよびHcAICと共にiCMの共同培養は、患者の血流14に見られる濃度における収縮機能および薬物への応答を含む、心臓病理生理を調節する分子および細胞クロストークを定義する。これらのユニークな特徴のために、CSは心筋線維症、心筋梗塞および心不全21の重篤な結果をモデル化するために利用されてきた。我々のこれまでの研究は、内皮細胞と線維芽細胞の両方の存在がヒト心臓における血管微小環境の再現にとっていかに重要であるかを示し、ラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲン型IVなどの線維芽細胞由来ECMタンパク質の最適な堆積を可能にし、現像する内皮細胞ネットワーク14、21の近くに局在する。
DOXは、治療後17年でもがん患者に心不全を発症する可能性のある、よく知られた心毒性薬です 30.それにもかかわらず、それは、小児患者における白血病およびリンパ腫および女性30における乳癌の治療のための選択の薬であり続ける。次いで、心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞14における毒性を調節するメカニズムを研究するために、インビトロで心不全(HF)をモデル化し、HF誘導心臓線維症21をモデル化するために、CDSにおけるDOX治療が用いられている。癌患者の血流中に見られる濃度で薬物に曝露した場合、24時間以内にDOX処置CDにおいて細胞生存率が統計的に低下した(図2)。我々の研究室での以前の研究はまた、このシグナル伝達経路の遺伝的および化学的阻害剤の両方を用いて内皮一酸化窒素シンターゼ(eNOS)を介して心臓内皮細胞および線維芽細胞の両方に対するDOXの毒性作用を実証した。遺伝性(NOS3 shRNA)および化学(N5-(1-イミノエチル)-L-オルニチン、ジヒドロクロリド、またはL-NIO)のアンタゴニストをDOXの下流標的として使用することにより、心臓内皮細胞および線維芽細胞の両方で毒性作用を防いだ。
また、CS内の収縮活性は、フィールド電位刺激にさらされると心細胞の電気結合のおかげで測定された。制御媒体(DOX 0 μM)を用いて培養したCDは、健康な人の心臓に匹敵する1Hzと3Hz以内のフィールド刺激によってペースアップできる拍動速度で自発的かつ均質に収縮することを発見した。一方、DOX処理のCDは収縮できないため、電気刺激に従わない。カルセインAMおよびエチジウムホモジマーを用いた細胞生存率および毒性の測定と共に、CS収縮関数に対するこの機能アッセイは、ヒト心臓の典型的な複雑なシナリオをインビトロで評価することを可能にし、現在のところ他のモデルでは達成できない。同じシステムを用いた単一心細胞の収縮活動測定と比較して、我々は、CDでサルコメアを可視化し、測定することができない。したがって、我々は時間の経過とともに%スフェロイドの短縮の測定に限定され、我々は我々の研究室内で開発しなければならなかったアッセイ。細胞の数を制御し、各CSで共培養し、各CSのサイズを持つため、同種の収縮機能を有する同じような大きさのCSを利用します。しかし、サイズの異なるCDを生成しても、収縮活動は変わらなかった。
また、複数の細胞性のCDが、Ion-Optixシステムのカバースリップの下部に局在するほど重くなっていることを報告することも重要です。特定の位置に座っている事は、ほとんどの研究室で一般的に単一の心臓細胞で行われていることとは逆に、CSsが単独で座っているという事実に基づいて、我々は彼らがカバーリップに付着させる必要はありません。
心臓トロポニンT、CD31/PECAM、およびPECAMに対する抗体で染色されたCSsの顕微鏡分析(それぞれiCC、HCAIC、およびHFのマーカーとして)は、内皮細胞ネットワークの形成を示した(図1、青)。CDの内側の壊死を完全に排除するために、カルセインAM/エチジウムホモジウム染色CDSの共焦点解析により、細胞生存率の空間的評価が行われた(データは示されていない)。しかし、生体構造分野における将来の発展は、生体内のヒト心臓に典型的な他の複雑な特徴をより良く再現し、現在既存のモデルでは利用できないことを認める必要がある。これらには、i)成人心筋細胞の典型的な収縮機能が含まれます。ii) 血流と圧力力;iii) パラクリンシグナリング;iv) 免疫応答は、これおよび他の体外心臓モデル6を改善するために重要となる。他のモデルは、健康な組織または疾患状態のいずれかの主要な特徴を再現することを目的としているので、この原稿に記載されているCSの生成と使用のためのプロトコルは、このアプローチを使用して網羅的ではないかもしれない特定の質問に対処する研究者を助けることを目的としています。例えば、CDの生成のための患者由来細胞の潜在的な使用は、現在、心血管研究のために一般的に利用可能なハイスループットアッセイを使用して利用できないパーソナライズされた医療のためのツールを提供するであろう。
結論として、心臓細胞を用いてヒト心臓微小環境をよりよく再現する簡単な方法を示した。心臓スフェロイドは、心臓細胞の単層培養と比較して、ヒト心臓に存在する細胞をよりよく再現する内皮細胞ネットワークを提示する。独自の特徴を考えると、彼らは心血管研究のためのインビトロテストのための高度なツールを表しています。患者由来の細胞を使用した将来の研究は、心血管疾患を予防し、より良く治療するためのパーソナライズされた医学と新しい治療法の選択肢を提供する可能性があります。
Disclosures
なし
Acknowledgments
録画とビデオの編集のためのナット・ジョンストンに特別な感謝。
プーナム・シャルマは、ニューカッスル大学の支援を受け、UNIPRSとUNRS中央・教職員養学校(UNRSC5050)奨学金を受けています。カーミン異邦人は、UTSシードファンディング、成人幹細胞研究のためのシドニー補助金のカトリック大司教区、シドニー医学部財団心臓胸部外科研究助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
| Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
| Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
| Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
| Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
| Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
| NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
| 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
| 384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |
References
- Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).
- Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
- Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).
- Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538 (2018).
- Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).
- Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
- Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
- Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).
- O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).
- Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
- Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).
- Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).
- Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
- Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
- Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).
- Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
- Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
- Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
- Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
- Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).
- Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
- Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
- Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
- Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
- Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394 (2020).
