Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hjertesfæroider som in vitro bioingeniør hjertevev for å studere humant hjerte patofysiologi

Published: January 23, 2021 doi: 10.3791/61962
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,3,4
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

Summary

Denne protokollen tar sikte på å fremstille 3D hjertesfæroider (CSs) ved å co-culturing celler i hengende dråper. Kollagen-innebygde CSs behandles med doksorubicin (DOX, et kardiotoksisk middel) ved fysiologiske konsentrasjoner for å modellere hjertesvikt. In vitro-testing med DOX-behandlede CS-er kan brukes til å identifisere nye behandlinger for hjertesviktpasienter.

Abstract

Til tross for flere fremskritt innen hjertevevsteknikk, er en av de store utfordringene for å overvinne fortsatt generasjonen av et fullt funksjonelt vaskulært nettverk bestående av flere nivåer av kompleksitet for å gi oksygen og næringsstoffer innen bioingeniørhjertevev. Vårt laboratorium har utviklet en tredimensjonal in vitro modell av det menneskelige hjerte, kjent som "hjertesfæroid" eller "CS". Dette presenterer biokjemiske, fysiologiske og farmakologiske egenskaper som er typiske for det menneskelige hjerte og genereres ved å co-culturing sine tre store celletyper, som hjerte myocytter, endotelceller, og fibroblaster. Humane induserte pluripotente stamceller-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller iCMs) er co-kultivert i forhold som tilnærmer de som finnes in vivo med menneskelige hjertefibroblaster (HCFer) og humane koronararterie endotelceller (HCAECs) i hengende dråpekulturplater i tre til fire dager. Den confocal analyse av CSs farget med antistoffer mot hjerte Troponin T, CD31 og vimentin (markører for hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis) viser at CSs presentere en kompleks endotelcellenettverk, som ligner den innfødte som finnes i det menneskelige hjerte. Dette bekreftes av 3D-gjengivelsesanalysen av disse konfokale bildene. CSs også presentere ekstracellulære matrise (ECM) proteiner typisk for det menneskelige hjerte, som kollagen type IV, laminin og fibronectin. Til slutt presenterer CSs en kontraktil aktivitet målt som syncytial kontraktilitet nærmere den som er typisk for det menneskelige hjertet sammenlignet med CSs som bare inneholder iCMer. Når det behandles med et kardiotoksisk antikreftmiddel, som doksorubicin (DOX, brukes til å behandle leukemi, lymfom og brystkreft), reduseres levedyktigheten til DOX-behandlede CS-er betydelig ved 10 μM genetisk og kjemisk hemming av endotelial nitrogenoksidsyntase, et nedstrømsmål for DOX i HCFs og HCAECer, redusert toksisitet i CSs. Gitt disse unike funksjonene, CSs er for tiden brukt som in vitro modeller for å studere hjerte biokjemi, patofysiologi, og farmakologi.

Introduction

Det menneskelige hjerte har en begrenset regenerativ kapasitet mens kardiovaskulær sykdom (CVD) fortsatt er den viktigste dødsårsaken over hele verden til tross for de siste fremskrittene innen vevsteknikk og stamcelleteknologi1. Behovet for nye terapeutiske midler, inkludert molekylære og cellulære tilnærminger for å enten reparere et skadet hjerte eller for å forhindre at et hjerte svikter, er et av de viktigste nåværende kliniske behovene for pasienter som lider avhjertesykdom 2,3,4. Hovedmålet med hjertevev engineering er å fremstille en tredimensjonal (3D) hjertevev som presenterer molekylære, cellulære, og ekstracellulære funksjoner typisk for et menneskehjerte, inkludert det vaskulære nettverket og fysiologisk kontraktil funksjon4,5,6.

For å bioingeniør og fremstille et funksjonelt menneskelig hjertevev som etterligner det menneskelige hjerte for in vitro og in vivo-applikasjoner, har flere tilnærminger blitt undersøkt, inkludert konstruert hjertevev (EHTs), celleark og sfæroidkulturer7,8. Imidlertid, disse vevene mislykkes i å rekapulere den optimale 3D mikromiljø typisk for det menneskelige hjerte og deres potensielle bruk for CVD pasienter kan ikke direkte oversette fra benken til sengen7. Dette er fordi de ikke rekafulerer den komplekse biologien, morfologien og fysiologien til in vivo hjertevev9. En av de store utfordringene i hjertevevsteknikk inkluderer utviklingen av et hierarkisk vaskulært nettverk i det bioengineerte hjertevevet, da ethvert vev som er større enn 200 μm i diameter utvikler celledød i midten2,10. Et riktig dannet vaskulært nettverk i et menneskelig hjertevev spiller en viktig rolle for tilførsel av blod, oksygen og næringsstoffer til hjerteceller11. Under embryonisk utvikling dannes koronarkapillærer og arterier via vaskogenese (de novo blodkardannelse) og angiogenese (generering av blodkar fra eksisterende) fra endotelstamceller8,12. Hjertefibroblaster spiller også en viktig rolle i riktig vaskulær nettverksdannelse ved å gi den optimale ekstracellulære matrisen (ECM) og vekstsammensetning13,14.

3D vaskulært nettverk av bioingeniør hjertevev kontrollerer celleoverlevelse og funksjon ved å skape oksygen og næringsgradienter og paracrine signalering, som homotypisk celle interaksjon, heterotypisk celle interaksjon, interaksjon av celler gjennom utskilles løselige proteiner og celle til ECMinteraksjoner 3,10,15,16,17,18. Dette forhindrer celledød i midten av vevet og fremmer celle levedyktighet og fysiologisk funksjon i bioingeniør hjertevev16,18,19.

Sfæroidkulturer fra stamceller har nylig blitt utforsket som in vitro modeller av det menneskelige hjerte20. For ytterligere å forbedre hjertemikromiljøet in vitro, har de inkludert bruk av alle de viktigste celletypene som finnes i det menneskelige hjerte, som hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster. Sfæroidkulturer presenterer den nødvendige 3D strukturelle støtten for celler for å vokse og fungere og kan brukes til å bioingeniør et vaskulærtnettverk 14,20,21,22. I denne sammenheng har vårt laboratorium utviklet menneskelige hjertesfæroider (CSs) ved å co-culturing hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster i forhold som finnes i det menneskelige hjerte14. Denne modellen er en utvidelse av rotte ventrikulære hjerteceller sfæroid modell, generert av co-culturing hjerteceller i hengende dråpe kulturer, brukes til å modellere hjertefibrose21. Human CSs kan brukes som toksisitetsanalyser ved å behandle dem doksorubicin (DOX, et anti-kreftmiddel som brukes til å behandle leukemi, lymfom og brystkreft), som er kjent for å indusere hjertefibrose og hjertesvikt (HF) selv 17 år etter sin somministrasjon14.

I dette manuskriptet beskriver vi hvordan vi genererer menneskelige CS-er ved å co-culturing human indusert pluripotente stamcelle avledet kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller iCMs), menneskelige hjertefibroblaster (HCFs) og menneskelige koronar arterie endotelceller (HCAECs) i hengende dråpekulturer. For å bruke og bilde CSs for in vitro testing, er de innebygd i en kollagengel. Den konfokale analysen av CS-er farget med antistoffer mot CD31, en markør for endotelceller, viste at disse cellene danner et nettverk som ligner på det som ble observert in vivo. For å indusere HF og potensielt teste nye midler som kan behandle eller forhindre det, ble CSs behandlet med 10 μM DOX (en konsentrasjon funnet i blodet av kreftpasienter som fikk stoffet). Når farget med calcein-AM og ethidium homodimer (farging levende og døde celler, henholdsvis), DOX-behandlet CSs presentere en betydelig reduksjon i levedyktighet i forhold til CSs som ikke fikk stoffet. CSs presenterer også en homogen kontraktil aktivitet når tempoet ved hjelp av feltet potensiellstimulering mellom 1 og 3 Hz.

Protocol

MERK: hiPSC-CMs som brukes for denne protokollen er kommersielt tilgjengelige. Vennligst søk institusjonell godkjenning av human etikkkomité før du starter dette arbeidet hvis nødvendig.

1. Human hjerte fibroblast og endotelcellekultur plating og vekst

  1. Tin kryovialer som inneholder HCFs og HCAECs i et vannbad ved 37 ° C i ett minutt.
  2. Flytt kryovialer under en steril laminær strømningsbiosikkerhetsskap klasse 2.
  3. Samle 1 ml cellesuspensjon fra kryovialene ved hjelp av en 1000 μL pipettespiss og legg til et 15 ml rør som inneholder 7 ml humant hjertefibroblastmedium for HCFs og 7 ml human meso endovekstmedium for HCAECer.
    MERK: For å samle de fleste cellene fra hver kryovial, skyll dem to ganger med 1 ml kulturmedium fra samme 15 ml rør.
  4. Bland forsiktig cellesuspensjoner.
  5. Overfør cellesuspensjoner for å skille T75-kulturflasker ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
  6. Inkuber celler ved 37 °C med 5 % CO2.
  7. Etter 18 timer, aspirere mediet fra begge kulturflasker og skyll dem en gang med steril fosfat bufret saltvann (PBS) for å fjerne frysende middels og døde celler.
  8. Erstatt PBS med 7 ml passende kulturmedium til hver kulturkolbe og inkuber ved 37 °C.
  9. Undersøk cellulær ekspansjon og levedyktighet regelmessig og erstatt media annenhver dag til cellene når 80-90% samløpet.

2. iCM kultur plating og vekst

  1. Pre-coat to T25 kultur kolbe med 2 ml PBS som inneholder 40 μg / ml fibronectin (FN) og inkubere ved 37 ° C, 5% CO2 i minst 4 timer.
  2. Etter 4 timer, samle en kryovial som inneholder iCMer og plassere den i et vannbad ved 37 °C i 4 min.
  3. Flytt kryovialen under en steril laminær strømningsbiosikkerhetsskap klasse 2.
  4. Overfør forsiktig iCMer fra kryovialen til et sterilt 50 ml sentrifugerør ved hjelp av en 1 ml pipettespiss.
  5. Skyll de tomme iCMs cryovial med 1 ml romtemperatur plating medium for å gjenopprette eventuelle gjenværende celler. Overfør 1 ml plating medium skyll fra kryovial drop-wise over 90 sek til 50 ml sentrifugerør som inneholder iCM celle suspensjon.
    MERK: Virvle forsiktig røret mens du legger til mediet for å blande oppløsningen helt og for å redusere det osmotiske sjokket på de tinte cellene.
  6. Tilsett langsomt 8 ml romtemperatur Plating Medium til 50 ml sentrifugerør. Legg til de første 1 ml dropwise over 30 - 60 s. Deretter legger du til det gjenværende volumet i løpet av de neste 30 s. Virvle forsiktig sentrifugerøret mens du legger til Plating-mediet. Bland forsiktig innholdet i 50 ml sentrifugerør ved å snu 2 - 3 ganger (unngå kraftig risting eller vortexing).
  7. Utfør umiddelbart celletellingen ved hjelp av et hemocytometer og bestem den levedyktige celletettheten (i celler/ml).
  8. Ta FN-pre-coated T25 flasker og aspirere FN-PBS løsning uten å la kolbene tørke. Til dette legge såing volum av iCMs (1,6 x 106 levedyktige iCMer i 8 ml romtemperatur plating medium).
  9. Kultur iCMer i inkubatoren i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  10. Tin vedlikeholdsmediet over natten ved 4 °C daglig før bruk.
  11. Likevekt vedlikeholdsmediet i et 37 °C vannbad og bruk umiddelbart.
  12. Etter 2 dager flytter du iCMs T25-flasker under biosikkerhetsskapet.
  13. Vask forsiktig av døde celler og rusk ved å forsiktig pipettere Plating Medium opp og ned 5 ganger.
  14. Aspirer Plating Medium og erstatt med 8 ml forhåndsoppvarmet vedlikeholdsmedium. Plasser T25-kolben tilbake i inkubatoren. Skift ut vedlikeholdsmediet annenhver dag og undersøk samløpet regelmessig.

3. Cellerisolasjon og telling

  1. Start med å samle inn første HCAECer og HCFs, og deretter iCMer ved å følge trinn 3.2-3.12.
  2. Forbered CS kultur medium ved å blande 10 ml iCMs Maintenance Medium, 5 ml Human Cardiac Fibroblast Medium og 5 ml Meso Endo Growth Medium.
  3. Fjern kulturmedium fra hver vevkolbe som inneholder HCFs og HCAECs og skyll en gang med 5 ml PBS for T75 flasker. Fjern PBS.
  4. Tilsett 5 ml 0,25 % trypsin EDTA-oppløsning i hver T75 kolbe og inkuber i 5 min ved 37 °C, 5 % CO2.
  5. Når cellene løsner, nøytraliserer du umiddelbart trypsin EDTA-løsningen med 5 ml kulturmedium.
  6. Overfør cellesuspensjoner til et 15 ml rør og sentrifugeceller ved 300 x g i 4 min.
  7. Fjern supernatanten forsiktig fra hvert rør. Legg til 1 ml CS medium til hver cellepellet og gjenoppussette dem. Hold røret på is og telle celler ved hjelp av Trypan Blue og et hemocytometer.
  8. Fjern Vedlikeholdsmedium fra vevsflasker som inneholder iCMer og skyll én gang med 3 ml PBS.
  9. Tilsett 1 ml 0,25 % trypsin EDTA-oppløsning i hver T75 kolbe og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2. Kontroller celler hvert minutt til de er løsrevet.
  10. Når cellene løsner, nøytraliserer du umiddelbart trypsin EDTA-løsningen med 4 ml kulturmedium.
  11. Overfør cellesuspensjoner til et 15 ml rør og sentrifuger dem ved 300 x g i 5 min.
  12. Fjern supernatanten forsiktig fra hvert rør. Tilsett 1 ml kulturmedium til cellepelleten og gjenoppusst den. Hold røret på is og telle celler ved hjelp av Trypan Blue og et hemocytometer.

4.CS generasjon og vekst

  1. Bland iCMer, HCFs og HCAECs i 2:1:1-forhold ved å plating 10.000 iCMer, 5000 HCFer og 5000 HCAECs per hengende dråpekultur som inneholder 20 μL cs medium. Juster til det endelige volumet for totalt antall CS-er.
  2. Pipette 20 μL cellefjæring i hver brønn av 384-brønn HDC-platen enten manuelt eller ved hjelp av en robotkanals pipette for automatisert væskehåndtering.
  3. Pipette 1,5 ml steril PBS i hver side av kanalen rundt hengende dropplate for å hindre uttørking av CSs. Inkuber HDC-plate ved 37 °C.
  4. Undersøk dannelsen av CSs daglig til en fullt dannet sfæroid observeres i de fleste brønner. Legg til 7,5 μL CS medium til hver brønn annenhver dag til en CS er dannet.

5.CS innebygging i kollagengeler

  1. Samle CS-er med en 1 ml pipettespiss.
    MERK: Det er nødvendig å kutte tuppen av pipetten rundt 0,2 cm fra kanten før den brukes med en steril skarp overflate (enten en skalpell eller en saks) for å forhindre skade gel innebygde sfæroider under innsamlingen.
  2. Samle CS suspensjon i en 50 ml rør på is.
  3. Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 min.
    MERK: den oppnådde pelleten må oppbevares på is til bruk.
  4. Forbered en kollagengelløsning (100 μL/brønn for 30 brønner med 96 brønnplate) på is ved hjelp av rottehalekollagen og CS-medium i et 3:7-forhold.
  5. Fjern supernatanten fra røret som inneholder CSs.
  6. Bland pelleted CSs i kollagengeloppløsningen.
  7. Tilsett 1 μL/ml natriumhydroksid på 5 mM i CS-kollagengelfjæringen og bland forsiktig.
  8. Overfør 100 μL CS-kollagengel til en klar flat bunn 96 godt svart polystyrenmikroplate og inkuber ved 37 °C i 30 min.

6. Levedyktighets- og toksisitetsmålinger av DOX-behandlede CS-er

  1. Etter 30 min samle 96 brønnplaten fra inkubator
  2. Forbered en 10 μM DOX (basert på tidligere etablert protokoll for celledød i CSs14).
    MERK: For å potensielt teste andre agenter som kan beskytte mot HF i CSs, generere løsninger som inneholder DOX + Agent A, B, etc.
  3. Tilsett 100 μL med løsninger som inneholder DOX og/eller andre midler i hver brønn. Kontrollkulturer inneholder medier uten DOX.
  4. Inkuber plate i 18 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  5. Dagen etter samler du live/dead-eagensløsningene og lar dem tine på is i mørket i et biosikkerhetsskap.
  6. Forbered en løsning som inneholder Hoechst flekk, 4 μM ethidium homodimer og 2 μM calcein-AM.
  7. Tilsett 100 μL Hoechst flekk, calcein-AM / ethidium homodimer løsning i hver brønn.
  8. Mål fluorescensen i hver brønn på 645 nm for ethidium homodimer og på 530 nm for calcein-AM, henholdsvis ved hjelp av multimode mikroplateleser.
  9. Overfør fluorescensmålinger til Graphpad PRISM (eller en tilsvarende programvare for statistisk analyse).
  10. Bruk GraphPad Prism programvare for dataanalyse og statistikk.
  11. For kvalitetskontroll, sjekk under et epifluorescence mikroskop for kjernefarging, sammen med calcein-AM og ethidium homodimer.

7.CS kontraktil funksjon evaluering

  1. Samle mikroplaten som klargjort i trinn 5.8.
  2. Slå på datamaskinen som inneholder IonOptix-programvaren for en videobasert kantdeteksjon, Fluorescence Assistance Interface og MyoPacer Field Stimulator.
  3. Plasser et nytt deksel slip på vevholderplattformen og monter vannbad med elektroder.
  4. Samle forsiktig CSs fra kollagengeler ved hjelp av en 1 ml pipettespiss kuttet 0,5 mm fra kanten og overfør dem til et falkerør. Legg til medier på CS for å hindre tørking av CSs. Overfør CS (en om gangen) med noen få μL med medier på scenen i IonOptix-systemet.
  5. Velg CS som skal analyseres via innstillingstopper på venstre og høyre side av CS ved hjelp av IonOptix-programvaren.
  6. Bruk den databaserte bevegelsesanalysatoren til å spore bevegelsen av CS-kanter.
    MERK: Vanligvis måles kontraktsløshet i enten % celleforkortelse eller % fraksjonell forkortelse. I dette tilfellet målte vi % sfæroid forkortelse.
  7. Stabiliser både toppene som justerer terskel- og kantalternativer fra datamaskinen.
  8. Utsett CS-er for forskjellige frekvenser (0,3, 0,6, 1, 2 og 3 Hz) og spenninger (1, 2, 3 og 5 V) ved hjelp av Myopacer Field Stimulator.
  9. Registrer sfæroid forkortelse som CS lengde endringer av DOX-behandlet og ubehandlet CSs. Analyser data ved hjelp av Soft-Edge programvare og gjennomsnitt for hver CS.

8. Mikroskopi av CSs: fiksering og immunolabeling

  1. Samle 96 brønnplaten etter 30 min (som klargjort i trinn 5.8) og fest CSs i 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved romtemperatur.
  2. Fjern PFA og skyll tre ganger med PBS som inneholder 0,01 % natriumazid (PBSA).
  3. Fjern PBSA.
  4. Tilsett 200 μL PBSA som inneholder 0,02 % Triton-X-100 i hver brønn i 30 minutter på en shaker.
    MERK: Dette trinnet gjennomsyrer CS for bedre antistoffinfiltrasjon.
  5. Tilsett 200 μL med 3 % storfe serumalbumin i PBSA-oppløsning i 60 min ved romtemperatur.
    MERK: Dette trinnet blokkerer uspesifisert antistoffbinding i CS.
  6. Forbered en løsning som inneholder 10 μg/ml primærmusanti-menneskelige antistoffer mot CD31 fortynnet i blokkeringsløsning.
  7. Tilsett 100 μL primær antistoffløsning til hver brønn og inkuber over natten ved 4 °C på en shaker.
  8. Skyll platen tre ganger med PBSA i 20 min ved romtemperatur på en gyngeplate.
  9. Forbered en løsning som inneholder Hoechst DNA-flekk og 10 μg/ml Cy3-konjugert sekundært esel anti-mus antistoff fortynnet i blokkerende løsning.
  10. Tilsett 100 μL sekundær antistoffoppløsning som inneholder Hoechst-flekken til hver brønn og inkuber over natten ved 4 °C på en shaker.
    MERK: Dekk platen med aluminiumsfolie fra nå av.
  11. Skyll platen tre ganger i 20 min med PBSA ved romtemperatur på en gyngeplate.
  12. Tilsett 100 μL vectashield monteringsmedium til hver brønn.
  13. Bilde CSs under en laser skanning confocal mikroskop. Utfør optisk snitting langs Z-aksen og skjul bilder i et enkelt fokalplan ved hjelp av ImageJ-programvaren.

Representative Results

Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet representerer en alternativ tilnærming til å utvikle komplekse hjerte endotelcellenettverk i et bioingeniørt hjertevev med forbedret celle levedyktighet og funksjon sammenlignet med eksisterende modeller (figur 1). Rekakuleringen av 3D in vivo hjertemikromiljø i CS-er fremmet deres respons på DOX ved konsentrasjonen som ble funnet i blodet av kreftpasienter (mellom 5 og 10 μM, figur 2). DOX-behandlede CS-er ga en statistisk signifikant reduksjon i cellelevedisitet sammenlignet med kontroll (ingen DOX) CS innen 24 timer (figur 2), en toksisk effekt som observeres hos humane kreftpasienter selv 17 år etter behandling med legemidlet.

Figure 1
Figur 1. CS dannelse og vaskularisering analyse. (A)Protokoll som viser trinnene for dannelsen av en CS fra co-kulturen av iCMs, HCAECs og HCFs i hengende dråper. Brightfield-bilder på høyre side viser den progressive sfæroidformasjonen fra enkeltceller i hengende dråper. (B)Kollapset Z-stabler av konfokale bilder av en CS farget med antistoffer mot hjerte Troponin T (cTNT), PECAM og vimentin, farging hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis. Dette tallet er endret fra14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Levedyktighet og toksisitet i CSs. Statistiske analyser av calcein-AM (A) og ethidium homodimer (B) fluorescens av CSs behandlet i nærvær av begge medier (DOX 0 μM) eller doksorubicin (10 μM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Utviklingsmessig er riktig vaskulær nettverksdannelse avgjørende for generering av funksjonelle vev, inkludert det menneskelige hjerte10,12,23,24,25,26. Vurdering for riktig vaskularisering av 3D-vev tillater utveksling av oksygen, vekstfaktorer, signalmolekyler og næringsstoffer, og forhindrer utvikling av cellenekrose i noe vev tykkere enn 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Foreløpig tilgjengelig in vitro 3D hjertemodeller som presenterer et vaskulært nettverk er primært presentere kapillær-størrelse, uorganisert vaskulære nettverk og mangler hierarkisk kompleks forgrenet vaskularisering observert in vivo6,8,29. Den alternative tilnærmingen til å utvikle komplekse hjerte endotelcellenettverk beskrevet i dette manuskriptet presenterer forbedret celle levedyktighet og funksjon sammenlignet med eksisterende modeller (Figur 1)14,22. 3D in vitro CSs modellerer det menneskelige hjertet ved bedre å rekapulere in vivo mikromiljøet, inkludert molekylære, cellulære og ekstracellulærekomponenter 14,22. CS generasjon fra stamcelle-avledede celler i hengende dråper tillate sine kulturer i definerte forhold (f.eks celletyper og forhold, riktig vevdannelse). Co-kulturer av iCMs sammen med HCFs og HCAECs i CS definere molekylær og cellulær crosstalk som regulerer hjertet patofysiologi, inkludert sin kontraktile funksjon og respons på legemidler ved konsentrasjoner som finnes i pasientens blodbanen14. På grunn av disse unike funksjonene har CS-er blitt brukt til å modellere hjertefibrose, en alvorlig konsekvens av hjerteinfarkt og hjertesvikt21. Våre tidligere studier viste hvordan tilstedeværelsen av både endotelceller og fibroblaster er avgjørende for rekapbilisering av vaskulær mikromiljø i det menneskelige hjerte, slik at optimal avsetning av fibroblast-avledede ECM-proteiner, som laminin, fibronectin og kollagen type IV, lokalisert i nærheten av et utviklende endotelcellenettverk14,21.

DOX er et velkjent kardiotoksisk legemiddel som kan utvikle hjertesvikt hos kreftpasienter selv 17 år etter behandlingen30. Likevel er det fortsatt et stoff av valget for behandling av leukemi og lymfom hos pediatriske pasienter og brystkreft hos kvinner30. DOX-behandling i CSs har da blitt brukt til å modellere hjertesvikt (HF) in vitro for å studere både mekanismene som regulerer toksisitet i hjertemocytter, endotelceller og fibroblaster14 og modell HF-indusert hjertefibrose21. Celleleveabiliteten ble statistisk redusert i DOX-behandlede CS-er innen 24 timer når de ble eksponert for stoffet ved konsentrasjonen som ble funnet i blodet av kreftpasienter (mellom 5 og 10 μM)14 (figur 2). Tidligere studier i laboratoriet vårt viste også de toksiske effektene av DOX på både hjerteendeotelceller og fibroblaster via endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS) ved hjelp av både genetiske og kjemiske hemmere av denne signalveien14. Bruk av genetisk (NOS3 shRNA) og kjemiske (N5-(1-iminoethyl)-L-ornitin, dihydroklorid, eller L-NIO) antagonister av eNOS signalveien som et nedstrøms mål for DOX forhindret sine toksiske effekter i både hjerte endotelceller og fibroblaster14.

Kontraktil aktivitet innen CSs har også blitt målt takket være elektrisk kobling av hjerteceller når de utsettes for feltpotensial stimulering. Vi fant at CSs kultivert med kontrollmedier (DOX 0 μM) kontrakt spontant og homogent med en slaghastighet som kan paced av feltstimulering innen 1 og 3 Hz, sammenlignbar med et sunt menneskehjerte. Dox-behandlede CS-er følger derimot ikke den elektriske stimuleringen, da de ikke kan trekke seg sammen. Sammen med målinger av celle levedyktighet og toksisitet ved hjelp av calcein-AM og ethidium homodimer, denne funksjonelle analysen for CS kontraktil funksjon tillate evaluering av det komplekse scenariet typisk for det menneskelige hjerte in vitro, for tiden ikke oppnåelig med andre modeller. Sammenlignet med kontraktile aktivitetsmålinger av enkelthjerteceller som bruker samme system, er vi ikke i stand til å visualisere og måle sarkomene i CSs. Derfor er vi begrenset til målinger av % sfæroid forkortelse over tid, en analyse vi måtte utvikle i laboratoriet vårt. Når vi kontrollerer antall celler, vi co-kultur i hver CS og derfor størrelsen på hver CS, bruker vi CSs med lignende størrelse som faktisk presenterer homogen kontraktil funksjon. Men selv i tilfelle vi genererte CS-er av forskjellige størrelser, endret ikke deres kontraktile aktivitet.

Det er også viktig å rapportere at CSs flercellede natur gjør dem tunge nok til å lokalisere nederst på dekkslippen i Ion-Optix-systemet, selv i tilfelle de er superfundert. Basert på det faktum at CSs sitter alene i en bestemt posisjon, trenger vi ikke å få dem til å følge dekkslippen, tvert imot hva som vanligvis gjøres med enkelthjerteceller i de fleste laboratorier.

Den mikroskopiske analysen av CS-er farget med antistoffer mot hjertetroponin T, CD31/PECAM og PECAM (som markører for iCMer, HCAECer og HCFer) viste dannelsen av et endotelcellenettverk (figur 1, blå). For å utelukke nekrose fullt ut i den indre delen av CSs, ble romlig evaluering av celle levedyktighet utført i vårt laboratorium ved konfokal analyse av calcein-AM / ethidium homodimer farget CS(data ikke vist). Det er imidlertid viktig å erkjenne at fremtidig utvikling i biofabrikasjonsfeltet for bedre å rekafulere andre komplekse funksjoner som er typiske for det menneskelige hjertet in vivo, for tiden ikke tilgjengelig i den eksisterende modellen. Disse inkluderer: i) kontraktil funksjon typisk for voksne kardiomyocytter; ii) blodstrøm og trykkkrefter; iii) paracrine signalering; iv) immunrespons, som vil være avgjørende for å forbedre dette og andre in vitro hjertemodeller6. Som enhver annen modell tar sikte på å rekastatere viktige funksjoner i enten et sunt vev eller en sykdomstilstand, protokollen for generering og bruk av CS beskrevet i dette manuskriptet tar sikte på å hjelpe forskeren på å løse spesifikke spørsmål, som kanskje ikke er uttømmende ved hjelp av denne tilnærmingen. For eksempel, den potensielle bruken av pasient-avledede celler for generering av CSs ville gi verktøy for personlig medisin, for tiden ikke tilgjengelig ved hjelp av allment tilgjengelige høy gjennomstrømning analyser for kardiovaskulær forskning.

Til slutt viste vi en enkel måte å bedre rekabrere det menneskelige hjertemikromiljøet ved hjelp av hjerteceller. Hjertesfæroider presenterer et endotelcellenettverk som bedre rekafulerer den som er tilstede i det menneskelige hjerte sammenlignet med monolayerkulturer i hjerteceller. Gitt deres unike egenskaper, representerer de avanserte verktøy for in vitro testing for kardiovaskulær forskning. Fremtidige studier ved hjelp av pasientavledede celler kan gi alternativer for personlig medisin og nye terapier for både å forebygge og bedre behandle kardiovaskulær sykdom.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

En spesiell takk til Nat Johnston for innspillingen og redigering av videoen.

Poonam Sharma ble støttet av University of Newcastle med UNIPRS og UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) stipender. Carmine Gentile ble støttet av en UTS Seed Funding, katolsk erkebispedømme av Sydney Grant for Adult Stem Cell Research og en Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A1933
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies Jackson Immunological Research Labs, Inc. 715-165-150 Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody
Doxorubicin hydrochloride Sigma-Aldrich D1515
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG From Bovine Plasma
Human cardiac fibroblasts (HCFs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 306AK-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 300K-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF Growth medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 316-500
Human MesoEndo Cell Growth Medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA L3224
Maintenance Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM BD Pharmingen, San Diego, CA, USA 566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA R37605
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Plating Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Rat Tail Collagen Sigma-Aldrich C3867
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Trypsin–EDTA, 0.25% Gibco, Thermofisher Scientific 25200072
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher Scientific 15250061
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Tissue culture flasks (T25) Thermofisher Scientific 156367
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Corning, New York, USA 3603
384-Well Hanging Drop Plate 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA HDP1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538 (2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394 (2020).

Tags

Bioengineering Vaskulariserte hjertesfæroider bioingeniør hjertevev vaskularisering 3D-kokulturer stamceller kardiomyocytter fibroblaster endotelceller in vitro-testing doksorubicin kardiotoksisitet.
Hjertesfæroider som in vitro bioingeniør hjertevev for å studere humant hjerte patofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac… More

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology. J. Vis. Exp. (167), e61962, doi:10.3791/61962 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter