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Bioengineering

मानव हृदय रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो बायोइंजीनियर्ड हार्ट ऊतकों के रूप में कार्डियक स्पेरोइड्स

Published: January 23, 2021 doi: 10.3791/61962
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,3,4
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य हैंगिंग बूंदों में सह-संस्कृति कोशिकाओं द्वारा 3डी कार्डियक स्फेरॉइड (सीएसएस) बनाना। कोलेजन-एम्बेडेड सीएसएस को शारीरिक सांद्रता में डॉक्सोरुबिकिन (डॉक्स, एक कार्डियोटॉक्सिक एजेंट) के साथ मॉडल हार्ट फेलियर के साथ इलाज किया जाता है। डॉक्स-इलाज CSs का उपयोग कर में विट्रो परीक्षण दिल की विफलता के रोगियों के लिए उपन्यास चिकित्सा की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग में कई प्रगति के बावजूद, दूर करने के लिए प्रमुख चुनौतियों में से एक पूरी तरह से कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क की पीढ़ी बनी हुई है जिसमें जैव इंजीनियरिंग हृदय ऊतकों के भीतर ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रदान करने के लिए जटिलता के कई स्तर शामिल हैं। हमारी प्रयोगशाला ने मानव हृदय का एक त्रि-आयामी इन विट्रो मॉडल विकसित किया है, जिसे "कार्डियक स्पेरोइड" या "सीएस" के रूप में जाना जाता है। यह मानव हृदय की विशिष्ट जैव रासायनिक, शारीरिक और औषधीय विशेषताएं प्रस्तुत करता है और अपने तीन प्रमुख सेल प्रकारों जैसे कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को सह-रूप से उत्पन्न करता है। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPSC-CMs या iCMs) तीन से चार दिनों के लिए ड्रॉप संस्कृति प्लेटों में मानव हृदय फाइब्रोब्लास्ट (HCFs) और मानव कोरोनरी धमनी एंडोथेलियल सेल (HCAECs) के साथ वीवो में पाए जाने वाले अनुपात में सह-संस्कारी हैं । कार्डियक ट्रोपोनिन टी, सीडी 31 और विमेंटिन (कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के लिए मार्कर क्रमशः) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग सीएसएस के कॉन्फोकल विश्लेषण से पता चलता है कि सीएसएस एक जटिल एंडोथेलियल सेल नेटवर्क पेश करता है, जो मानव हृदय में पाए जाने वाले देशी जैसा दिखता है। इसकी पुष्टि इन कॉन्फोकल छवियों के 3डी रेंडरिंग विश्लेषण से होती है। सीएसएस मानव हृदय के विशिष्ट एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन भी प्रस्तुत करता है, जैसे कोलेजन टाइप IV, लैमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन। अंत में, सीएसएस एक अनुबंध गतिविधि प्रस्तुत करता है जिसे सिंक्टाइल अनुबंध के रूप में मापा जाता है जो केवल आईसीएम होते हैं, जो सीएसएस की तुलना में मानव हृदय के एक विशिष्ट के करीब होता है। जब कार्डियोटॉक्सिक एंटी-कैंसर एजेंट के साथ इलाज किया जाता है, जैसे डॉक्सोरुबिक (डीओएक्स, ल्यूकेमिया, लिंफोमा और स्तन कैंसर के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है), DOX-इलाज सीएस की व्यवहार्यता एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस के 10 माइक्रोन आनुवंशिक और रासायनिक अवरोध पर काफी कम हो जाती है, एचसीएफ और एचसीएईएस में डीओएक्स का डाउनस्ट्रीम लक्ष्य, एचसीएफ और एचसीएईएस में डॉक्स का डाउनस्ट्रीम लक्ष्य, विषाक्त इन अनूठी विशेषताओं को देखते हुए, सीएसएस वर्तमान में दिल जैव रसायन, रोगविज्ञान, और फार्माकोलॉजी का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है।

Introduction

मानव हृदय में सीमित पुनर्योजी क्षमता है जबकि हृदय रोग (सीवीडी) ऊतक इंजीनियरिंग और स्टेम सेल प्रौद्योगिकियों में हाल ही में हुई प्रगति के बावजूद दुनिया भर में मौत का मुख्य कारण बना हुआ है1। क्षतिग्रस्त हृदय की मरम्मत या दिल को असफल होने से रोकने के लिए आणविक और सेलुलर दृष्टिकोण सहित उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की आवश्यकता हृदय रोग से पीड़ित रोगियों के लिए प्रमुख वर्तमान नैदानिक आवश्यकताओं में से एक है2,3,4. कार्डियक टिश्यू इंजीनियरिंग का मुख्य लक्ष्य एक त्रि-आयामी (3 डी) हृदय ऊतक बनाना है जो मानव हृदय की विशिष्ट आणविक, सेलुलर और बाह्य विशेषताओं को प्रस्तुत करता है, जिसमें इसके संवहनी नेटवर्क और शारीरिक संकुचन कार्य4,5,6शामिल हैं।

बायोइंजीनियर और एक कार्यात्मक मानव हृदय ऊतक बनाने के लिए जो इन विट्रो और वीवो अनुप्रयोगों के लिए मानव हृदय की नकल करता है, कई दृष्टिकोणों की जांच की गई है जिनमें इंजीनियर हृदय ऊतक (ईएचटी), सेल शीट और गोलाकार संस्कृतियां7,8शामिल हैं। हालांकि, ये ऊतक मानव हृदय के विशिष्ट इष्टतम 3डी माइक्रोएनवायरमेंट को पुनः प्राप्त करने में विफल हो जाते हैं और सीवीडी रोगियों के लिए उनके संभावित उपयोग सीधे बेंच से बेडसाइड7में अनुवाद नहीं कर सकते हैं। इसका कारण यह है कि वे वीवो हृदय ऊतकों में जटिल जीव विज्ञान, आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान9को फिर से नहीं करते हैं। कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग में प्रमुख चुनौतियों में से एक में बायोइंजीनियर्ड कार्डियक ऊतक के भीतर एक पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क का विकास शामिल है, क्योंकि व्यास में 200 माइक्रोन से बड़ा कोई भी ऊतक मध्य2,10में सेल मृत्यु विकसित करता है। मानव हृदय ऊतक में एक ठीक से गठित संवहनी नेटवर्क हृदय कोशिकाओं को रक्त, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए एक प्रमुख भूमिका निभाता है11। भ्रूणीय विकास के दौरान, कोरोनरी केशिकाएं और धमनियां वैक्यूलोजेनेसिस (डी नोवो रक्त वाहिका निर्माण) और एंजियोजेनेसिस (पूर्व-मौजूदा लोगों से रक्त वाहिकाओं की पीढ़ी) के माध्यम से एंडोथेलियल प्रोजेनिटर कोशिकाओं से8,12। कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट इष्टतम एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और विकास संरचना13,14प्रदान करके उचित संवहनी नेटवर्क गठन में भी प्रमुख भूमिका निभाते हैं।

बायोइंजीनियर्ड हार्ट टिश्यू का 3डी वैस्कुलर नेटवर्क ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के ग्रेडिएंट और पैराक्रिन सिग्नलिंग बनाकर सेल सर्वाइवल और फंक्शन को नियंत्रित करता है, जैसे होमोसाइलिक सेल इंटरैक्शन, हेटेरियोपिक सेल इंटरैक्शन, स्रावित घुलनशील प्रोटीन और सेल टू ईसीएम इंटरैक्शन के जरिए कोशिकाओं की बातचीत3,10,15,16,17, 18। यह ऊतकों के बीच में कोशिका मृत्यु को रोकता है और बायोइंजीनियर्ड हृदय ऊतकों में कोशिका व्यवहार्यता और शारीरिक कार्य को बढ़ावा देता है16,18,19.

स्टेम सेल से स्पेरोइड संस्कृतियों को हाल ही में मानव हृदय20के इन विट्रो मॉडल के रूप में खोजा गया है । विट्रो में कार्डियक माइक्रोएनवायरमेंट को और बेहतर बनाने के लिए उन्होंने मानव हृदय में पाए जाने वाले सभी मुख्य कोशिका प्रकारों जैसे कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के उपयोग को शामिल किया है। स्फेरॉयड संस्कृतियां कोशिकाओं के विकास और कार्य करने के लिए आवश्यक 3डी संरचनात्मक सहायता प्रस्तुत करती हैं और इसका उपयोग एक संवहनी नेटवर्क 14 , 20 ,21,22के लिए किया जा सकताहै। इस संदर्भ में, हमारी प्रयोगशाला ने मानव हृदय14में पाए जाने वाले अनुपात में कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को सह-संस्कृति द्वारा मानव हृदय स्फेरॉइड (सीएसएस) विकसित किया है। यह मॉडल रैट वेंट्रिकुलर कार्डियक कोशिकाओं स्फेरॉइड मॉडल का विस्तार है, जो हैंगिंग ड्रॉप संस्कृतियों में कार्डियक कोशिकाओं को सह-संस्कृति से उत्पन्न करता है, जो कार्डियक फाइब्रोसिस21को मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाता है। मानव CSs विषाक्तता परख के रूप में उन्हें डॉक्सोरुबिकिन (DOX, एक विरोधी कैंसर ल्यूकेमिया, लिंफोमा और स्तन कैंसर के इलाज के लिए इस्तेमाल एजेंट) के इलाज के द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, जो अच्छी तरह से हृदय फाइब्रोसिस और दिल की विफलता (एचएफ) प्रेरित करने के लिए जाना जाता है यहां तक कि 17 साल अपने somministration14के बाद ।

इस पांडुलिपि में, हम वर्णन करते हैं कि मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीसी-सीएम या आईसीएएमएस), मानव हृदय फाइब्रोब्लास्ट (एचसीएफ) और मानव कोरोनरी धमनी एंडोथेलियल सेल (एचसीएईसी) द्वारा मानव सीएसएस को लटकाने वाली ड्रॉप संस्कृतियों में कैसे उत्पन्न किया जाए। इन विट्रो परीक्षण के लिए उपयोग और छवि सीएसएस के लिए, वे कोलेजन जेल में एम्बेडेड हैं। सीडी 31 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग सीएसएस के कॉन्फोकल विश्लेषण, एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, पता चला है कि इन कोशिकाओं को एक वीवो में मनाया एक के समान नेटवर्क के रूप में । एचएफ और संभावित परीक्षण उपन्यास एजेंटों को प्रेरित करने के लिए जो इसका इलाज कर सकते हैं या इसे रोक सकते हैं, सीएसएस को 10 माइक्रोन डीओएक्स (दवा प्राप्त करने वाले कैंसर रोगियों के खून में पाई जाने वाली एकाग्रता) के साथ इलाज किया गया था। जब कैल्सेइन-एएम और एथिडियम होमोमर (क्रमशः लाइव और मृत कोशिकाओं को धुंधला करना) से सना जाता है, तो डीओएक्स-इलाज किए गए सीएसएस ने दवा प्राप्त नहीं करने वाले सीएसएस की तुलना में व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी पेश की। सीएसएस 1 और 3 हर्ट्ज के बीच क्षेत्र संभावित उत्तेजना का उपयोग करते समय एक सजातीय अनुबंधीय गतिविधि भी पेश करता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले आईआईपीएससी-सीएम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। यदि आवश्यक हो तो इस कार्य को शुरू करने से पहले संस्थागत मानव आचार समिति की मंजूरी लें ।

1. मानव हृदय फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल सेल संस्कृति चढ़ाना और विकास

  1. एक मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में एचसीएफ और एचसीएईसी युक्त गल क्रायोवियल।
  2. एक बाँझ लैमिनार प्रवाह जैवसेफ्टी कैबिनेट कक्षा 2 के तहत क्रायोवियल्स ले जाएँ।
  3. 1000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके क्रायोविअल्स से सेल निलंबन की 1 एमएल एकत्र करें और एचसीएफ के लिए मानव कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 7 एमएल और एचसीएईसी के लिए मानव मेसो एंडो ग्रोथ मीडियम के 7 एमएल युक्त 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक क्रायोवियल से अधिकांश कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, उन्हें एक ही 15 एमएल ट्यूब से संस्कृति माध्यम के 1 एमएल के साथ दो बार कुल्ला।
  4. धीरे-धीरे सेल सस्पेंशन मिलाएं।
  5. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके T75 संस्कृति फ्लास्क को अलग करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
  6. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाएं।
  7. 18 घंटे के बाद, दोनों संस्कृति फ्लास्क से माध्यम को एस्पिरेट करें और उन्हें एक बार बाँझ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ कुल्ला करें ताकि ठंड मध्यम और मृत कोशिकाओं को हटाया जा सके।
  8. पीबीएस को उपयुक्त संस्कृति माध्यम के 7 एमएल के साथ प्रत्येक संस्कृति फ्लास्क और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए प्रतिस्थापित करें।
  9. नियमित रूप से सेलुलर विस्तार और व्यवहार्यता की जांच करें और हर दूसरे दिन मीडिया की जगह जब तक कोशिकाओं 80-90% की लहर तक पहुंचने ।

2. आईसीएम संस्कृति चढ़ाना और विकास

  1. प्री-कोट पीबीएस के 2 एमएल के साथ दो टी-25 कल्चर फ्लैक्स जिसमें फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के 40 μg/mL और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, कम से कम 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 होता है।
  2. 4 घंटे के बाद, एक क्रायोवियल युक्त आईसीएम एकत्र करें और इसे 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें।
  3. एक बाँझ लैमिनार प्रवाह जैवसेफ्टी कैबिनेट वर्ग 2 के तहत क्रायोवियल ले जाएँ।
  4. 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके टीसीएम को क्रायोवियल से बाँझ 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में धीरे-धीरे स्थानांतरित करें।
  5. किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान चढ़ाना माध्यम के 1 एमएल के साथ खाली iCMs क्रायोवियल कुल्ला । 90 सेकंड से अधिक क्रायोवियल ड्रॉप वार से 1 एमएल कुल्ला को आईसीएम सेल सस्पेंशन युक्त 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: धीरे से ट्यूब भंवर जबकि माध्यम जोड़ने के लिए समाधान पूरी तरह से मिश्रण और गल कोशिकाओं पर ओस्मोटिक सदमे को कम करने के लिए ।
  6. धीरे-धीरे 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में कमरे के तापमान चढ़ाना माध्यम के 8 एमएल जोड़ें। 30 - 60 एस से अधिक पहले 1 एमएल ड्रॉपवाइज जोड़ें। फिर, अगले 30 एस पर शेष मात्रा जोड़ें। चढ़ाना माध्यम जोड़ते समय धीरे-धीरे अपकेंद्रित्र ट्यूब को चक्कर लगाते हैं। धीरे-धीरे 2 - 3 बार उलटा करके 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब की सामग्री मिलाएं (जोरदार मिलाते हुए या भंवर से बचें)।
  7. तुरंत एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन और व्यवहार्य सेल घनत्व (कोशिकाओं में/एमएल में) का निर्धारण ।
  8. एफएन-प्री-कोटेड टी-25 फ्लैक्स लें और फ्लास्क को सूखने दिए बिना एफएन-पीबीएस समाधान को एस्पिरेट करें। इसके लिए आईसीएम की सीडिंग वॉल्यूम (8 एमएल रूम टेम्परेचर प्लेटिंग मीडियम में1.6 x 10 6 व्यवहार्य आईसीएम) जोड़ें।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में संस्कृति iCMs, 5% सीओ2.
  10. उपयोग से एक दिन पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रखरखाव माध्यम रात भर गल।
  11. रखरखाव माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में बराबर करें और तुरंत उपयोग करें।
  12. 2 दिनों के बाद, बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत आईसीएम टी-25 फ्लैक्स को स्थानांतरित करें।
  13. धीरे से 5 बार ऊपर और नीचे चढ़ाना माध्यम पाइपिंग द्वारा मृत कोशिकाओं और मलबे को धो ।
  14. चढ़ाना माध्यम को एस्पिरेट करें और प्री-वार्म्ड मेंटेनेंस माध्यम के 8 एमएल से बदलें। टी-25 फ्लैक्स को इनक्यूबेटर में वापस रखें। हर दूसरे दिन रखरखाव माध्यम को बदलें और नियमित रूप से योग्यता की जांच करें।

3. सेल अलगाव और गिनती

  1. पहले एचसीएईसी और एचसीएफ एकत्र करके शुरू करें, और फिर 3.2-3.12 चरणों का पालन करके आईसीएएम।
  2. आईसीएम मेंटेनेंस मीडियम की 10 एमएल, ह्यूमन कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट मीडियम की 5 एमएल और मेसो एंडो ग्रोथ मीडियम की 5 एमएल मिलाकर सीएस कल्चर मीडियम तैयार करें।
  3. एचसीएफ और एचसीएईसी युक्त प्रत्येक ऊतक फ्लास्क से संस्कृति माध्यम निकालें और T75 फ्लास्क के लिए 5 एमएल पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला करें। पीबीएस निकालें।
  4. प्रत्येक T75 फ्लास्क में 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए समाधान का 5 मिलियन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. एक बार कोशिकाओं को अलग करने के बाद, तुरंत संस्कृति माध्यम के 5 एमएल के साथ ट्राइप्सिन EDTA समाधान बेअसर।
  6. 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर 15 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज कोशिकाओं में सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
  7. प्रत्येक ट्यूब से सुपरनेट को ध्यान से हटा दें। प्रत्येक सेल पेलेट में सीएस मीडियम का 1 एमएल डालकर उन्हें रीसल्ड करें। बर्फ पर ट्यूब रखें और ट्राइपैन ब्लू और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।
  8. आईसीएम युक्त ऊतक फ्लास्क से रखरखाव माध्यम निकालें और पीबीएस के 3 एमएल के साथ एक बार कुल्ला करें।
  9. प्रत्येक T75 फ्लास्क में 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए समाधान का 1 मिलियनल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें। अलग होने तक हर मिनट कोशिकाओं की जांच करें।
  10. एक बार कोशिकाओं को अलग करने के बाद, तुरंत संस्कृति माध्यम के 4 एमएल के साथ ट्राइप्सिन EDTA समाधान को बेअसर करें।
  11. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें और उन्हें 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्री करें।
  12. प्रत्येक ट्यूब से सुपरनेट को ध्यान से हटा दें। सेल पेलेट में कल्चर मीडियम का 1 एमएल डालकर उसे रीसल्ड करें। बर्फ पर ट्यूब रखें और ट्राइपैन ब्लू और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।

4.CS पीढ़ी और विकास

  1. 2:1:1 अनुपात में आईसीएएम, एचसीएफ और एचसीएईसी को 10,000 आईसीएम, 5,000 एचसीएफ और 5,000 एचसीएईसी प्रति हैंगिंग ड्रॉप कल्चर द्वारा मिलाएं जिसमें सीएस माध्यम के 20 माइक्रोन शामिल हैं। सीएसएस की कुल संख्या के लिए अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
  2. 384 अच्छी तरह से एचडीसी प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन के पिपेट 20 माइक्रोन या तो मैन्युअल रूप से या स्वचालित तरल हैंडलिंग के लिए रोबोट मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके।
  3. सीएसएस को सुखाने से रोकने के लिए हैंगिंग ड्रॉप प्लेट के आसपास चैनल के प्रत्येक हिस्से में बाँझ पीबीएस का 1.5 एमएल। 37 डिग्री सेल्सियस पर एचडीसी प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. अधिकांश कुओं में पूरी तरह से गठित स्फेरॉइड पाए जाने तक दैनिक आधार पर सीएसएस के गठन की जांच करें। सीएस बनने तक हर दूसरे दिन प्रत्येक अच्छी तरह से सीएस माध्यम के 7.5 माइक्रोल जोड़ें।

5.CS कोलेजन जैल में एम्बेडिंग

  1. 1 एमएल पिपेट टिप के साथ सीएसएस ले लीजिए।
    नोट: अपने संग्रह के दौरान किसी भी क्षति को रोकने के लिए बाँझ तेज सतह (या तो एक स्केलपेल या कैंची) के साथ इसके उपयोग से पहले किनारे से 0.2 सेमी के आसपास पिपेट की नोक को काटना आवश्यक है।
  2. बर्फ पर एक 50 एमएल ट्यूब में सीएस निलंबन ले लीजिए।
  3. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
    नोट: प्राप्त गोली का उपयोग होने तक बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
  4. 3:7 अनुपात में चूहा पूंछ कोलेजन और सीएस माध्यम का उपयोग करके बर्फ पर एक कोलेजन जेल समाधान (100 μL/well 96 अच्छी प्लेट के 30 कुओं के लिए) तैयार करें।
  5. सीएसएस युक्त ट्यूब से सुपरनैंट निकालें।
  6. कोलेजन जेल समाधान के भीतर गोली सीएसएस मिलाएं।
  7. सीएस-कोलेजन जेल सस्पेंशन में 5 एमएम सोडियम हाइड्रोक्साइड का 1 माइक्रोन/एमएल डालें और धीरे-धीरे मिलाएं ।
  8. सीएस-कोलेजन जेल के 100 माइक्रोल को एक स्पष्ट फ्लैट बॉटम 96 अच्छी तरह से ब्लैक पॉलीस्टीरिन माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

6. डॉक्स-इलाज CSs की व्यवहार्यता और विषाक्तता माप

  1. 30 मिनट के बाद इनक्यूबेटर से ९६ अच्छी तरह से थाली इकट्ठा
  2. एक 10 μM DOX तैयार (CSs14में सेल मृत्यु के लिए पहले से स्थापित प्रोटोकॉल के आधार पर) ।
    नोट: अन्य एजेंटों का संभावित परीक्षण करने के लिए जो सीएसएस में एचएफ के खिलाफ रक्षा कर सकते हैं, DOX + एजेंट ए, बी आदि वाले समाधान उत्पन्न करते हैं।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से DOX और/या अन्य एजेंटों युक्त समाधानों के 100 μL जोड़ें। नियंत्रण संस्कृतियों में बिना किसी डॉक्स के मीडिया होते हैं।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 18 घंटे के लिए इनक्यूबेट प्लेट।
  5. अगले दिन, लाइव/डेड स्टेनिंग रिएजेंट स्टॉक समाधान एकत्र करें और उन्हें जैव सुरक्षा कैबिनेट में अंधेरे में बर्फ पर गल जाने की अनुमति दें ।
  6. होचस्ट दाग, 4 माइक्रोनएम एथिडियम होमेमर और 2 माइक्रोन कैल्सिन-एएम युक्त समाधान तैयार करें।
  7. प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोन ऑफ होएस्ट दाग, कैल्सीन-एएम/एथिडियम होमाडिमर समाधान जोड़ें।
  8. मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके क्रमशः कैल्सीन-एएम के लिए 645 एनएम पर और कैल्सीन-एएम के लिए 530 एनएम पर प्रत्येक कुएं में फ्लोरेसेंस को मापें।
  9. ग्राफपैड चश्मे (या सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक समकक्ष सॉफ्टवेयर) में फ्लोरेसेंस माप स्थानांतरित करें।
  10. डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी के लिए ग्राफपैड चश्मे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  11. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, न्यूक्लियी स्टेनिंग के लिए एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें, एक साथ कैल्सीन-एएम और एथिडियम होमोडाइमर के साथ।

7.CS अनुबंध समारोह मूल्यांकन

  1. चरण 5.8 में तैयार माइक्रोप्लेट लीजिए।
  2. वीडियो-आधारित एज-डिटेक्शन, फ्लोरेसेंस असिस्टेंस इंटरफेस और मायोपेसर फील्ड स्टिमुलेटर के लिए आयनऑप्टिक्स सॉफ्टवेयर वाले कंप्यूटर को चालू करें।
  3. टिश्यू होल्डर प्लेटफॉर्म पर एक नया कवर स्लिप रखें और इलेक्ट्रोड के साथ वॉटर बाथ को असेंबल करें ।
  4. धीरे-धीरे 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके कोलेजन जैल से सीएसएस एकत्र करें और किनारे से 0.5 मिमी काट लें और उन्हें फाल्कन ट्यूब में स्थानांतरित करें। CSs के सूखने को रोकने के लिए सीएस पर मीडिया जोड़ें। आयनऑप्टिक्स सिस्टम के मंच पर मीडिया के कुछ μL के साथ सीएस (एक समय में एक) स्थानांतरण करें।
  5. आयनऑप्टिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सीएस के बाएं और दाईं ओर चोटियों की स्थापना के माध्यम से विश्लेषण किए जाने वाले सीएस का चयन करें।
  6. सीएस किनारों के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए कंप्यूटर आधारित मोशन एनालाइजर का उपयोग करें।
    नोट: आम तौर पर, संकुचन या तो% सेल छोटा या% आंशिक छोटा में मापा जाता है । इस मामले में, हमने% स्फेरॉइड छोटा मापा।
  7. कंप्यूटर से सीमा और किनारे विकल्पों को समायोजित करने वाली दोनों चोटियों को स्थिर करें।
  8. मायोपॉसर फील्ड स्टिमुलेटर का उपयोग करके विभिन्न आवृत्तियों (0.3, 0.6, 1, 2 और 3 हर्ट्ज) और वोल्टेज (1, 2, 3 और 5 वी) के लिए सीएसएस का पर्दाफाश करें।
  9. डीओएक्स-उपचारित और अनुपचारित सीएस के सीएस लंबाई परिवर्तन के रूप में रिकॉर्ड स्फेरॉइड छोटा करना। सॉफ्ट-एज सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें और प्रत्येक सीएस के लिए औसत।

8. सीएसएस की माइक्रोस्कोपी: निर्धारण और इम्यूनोबेलिंग

  1. 30 मिनट के बाद 96 अच्छी तरह से प्लेट ले लीजिए (जैसा कि चरण 5.8 में तैयार है) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में सीएसएस को ठीक करें।
  2. पीएफए निकालें और 0.01% सोडियम अज़ाइड (पीबीएसए) वाले पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला करें।
  3. पीबीएसए को हटा दें।
  4. एक शेकर पर 30 मिनट के लिए प्रत्येक कुएं में 0.02% ट्राइटन-एक्स-100 युक्त पीबीएसए के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: यह कदम बेहतर एंटीबॉडी घुसपैठ के लिए CSs को पार करता है ।
  5. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए PBSA समाधान में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: यह कदम सीएसएस में अविशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को ब्लॉक करता है।
  6. समाधान को अवरुद्ध करने में पतला सीडी 31 के खिलाफ प्राथमिक माउस एंटी-ह्यूमन एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन/एमएल युक्त समाधान तैयार करें।
  7. प्रत्येक कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें और एक शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  8. एक कमाल की थाली पर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए PBSA के साथ तीन बार थाली कुल्ला ।
  9. Hoechst डीएनए दाग और Cy3 के 10 μg/mL युक्त एक समाधान तैयार-संयुग्मित माध्यमिक गधा विरोधी माउस एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान में पतला ।
  10. प्रत्येक कुएं में होचस्ट दाग युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL जोड़ें और एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस बिंदु के बाद से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली को कवर करें।
  11. एक कमाल की थाली पर कमरे के तापमान पर PBSA के साथ 20 मिनट के लिए तीन बार थाली कुल्ला ।
  12. प्रत्येक अच्छी तरह से वेक्टाशिल्ड माउंटिंग मीडियम का 100 माइक्रोल जोड़ें।
  13. एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत छवि CSs। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जेड एक्सिस और पतन छवियों के साथ ऑप्टिकल सेक्शनिंग करें।

Representative Results

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल मौजूदा मॉडल(चित्रा 1)की तुलना में बेहतर सेल व्यवहार्यता और कार्य के साथ बायोइंजीनियर कार्डियक ऊतक के भीतर जटिल कार्डियक एंडोथेलियल सेल नेटवर्क विकसित करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। सीएसएस के भीतर वीवो हार्ट माइक्रोएनवायरमेंट में 3डी के पुनर्पूंजीकरण ने कैंसर रोगियों के खून में पाई जाने वाली एकाग्रता (5 से 10 माइक्रोनएम, चित्रा 2के बीच) पर DOX के प्रति उनकी प्रतिक्रिया को बढ़ावा दिया । DOX इलाज CSs 24 घंटे(चित्रा2), एक विषाक्त प्रभाव है कि मानव कैंसर के रोगियों में भी 17 साल दवा के साथ उनके इलाज के बाद मनाया जाता है के भीतर नियंत्रण (कोई DOX) CSs के साथ तुलना में सेल व्यवहार्यता में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी प्रस्तुत की ।

Figure 1
चित्रा 1। सीएस फॉर्मेशन एंड वैस्कुलराइजेशन एनालिसिस। (A)हैंगिंग बूंदों में आईसीएम, एचसीएईसी और एचसीएफ की सह-संस्कृति से सीएस के गठन के लिए कदम दिखाते हुए प्रोटोकॉल । दाईं ओर ब्राइटफील्ड छवियां हैंगिंग बूंदों में एकल कोशिकाओं से प्रगतिशील गोलाकार गठन दिखाती हैं। (ख)कार्डियक ट्रोपोनिन टी (सीटीएनटी), पेकैम और विमेंटिन, स्टेनिंग कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग वाले सीएस की कॉन्फोकल छवियों के ढह गए जेड-स्टैक क्रमशः । इस आंकड़े को14से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। सीएसएस में व्यवहार्यता और विषाक्तता। केवल मीडिया (DOX 0 μM) या doxorubicin (10 μM) की उपस्थिति में इलाज किए गए सीएसएस के कैल्सेइन-एएम(ए)और एथिडियम होमोडिमर(बी)फ्लोरेसेंस के सांख्यिकीय विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

मानव हृदय10, 12,23, 24, 25, 26सहित कार्यात्मक ऊतकों के उत्पादनकेलिए उचित संवहनी नेटवर्कगठनमहत्वपूर्ण है। 3 डी ऊतकों के उचित संवहनी के लिए विचार ऑक्सीजन, विकास कारकों, संकेत अणुओं और पोषक तत्वों के आदान-प्रदान की अनुमति देता है, जो किसी भी ऊतक के भीतर कोशिका परिगलन के विकास को 200 माइक्रोन6,10, 12,17,24,25,26, 27,28से मोटा होता है। वर्तमान में विट्रो 3 डी हार्ट मॉडल में उपलब्ध है जो एक संवहनी नेटवर्क प्रस्तुत करते हैं, मुख्य रूप से केशिका-आकार, अव्यवस्थित संवहनी नेटवर्क पेश कर रहे हैंऔर वीवो6,8,29में देखे गए पदानुक्रमित जटिल शाखाबद्ध संवहनीकरण की कमी है। इस पांडुलिपि में वर्णित जटिल कार्डियक एंडोथेलियल सेल नेटवर्क विकसित करने का वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूदा मॉडलों की तुलना में बेहतर कोशिका व्यवहार्यता और कार्य प्रस्तुत करता है (चित्र 1,14,22. 3डी इन विट्रो सीएसएस मानव हृदय को वीवो माइक्रोएनवायरमेंट में बेहतर रीकैपिटल करके मॉडल करता है, जिसमें इसके आणविक, सेलुलर और बाहुलर घटक14,22शामिल हैं । फांसी की बूंदों में स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोशिकाओं से सीएस पीढ़ी अपनी संस्कृतियों को परिभाषित स्थितियों (जैसे, सेल प्रकार और अनुपात, उचित ऊतक निर्माण) में अनुमति देती है। सीएसएस के भीतर एचसीएफ और एचसीएईसी के साथ आईसीएएमएस की सह-संस्कृतियों ने आणविक और सेलुलर क्रॉसटॉक को परिभाषित किया है जो हृदय रोगविज्ञान को नियंत्रित करता है, जिसमें इसके संकुचन कार्य और रोगी के खून में पाई जाने वाली सांद्रता पर दवाओं की प्रतिक्रिया शामिल है14। इन अनूठी विशेषताओं के कारण, सीएसएस का उपयोग मॉडल कार्डियक फाइब्रोसिस के लिए किया गया है, जो मायोकार्डियल इन्फेक्शन और हार्ट फेलियर21का गंभीर परिणाम है। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कैसे एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट दोनों की उपस्थिति मानव हृदय में संवहनी माइक्रोएनवायरमेंट के पुनर्पूंजीकरण के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न ईसीएम प्रोटीन, जैसे लेमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन प्रकार IV के इष्टतम जमाव की अनुमति दी गई है, जो एक विकासशील एंडोथेलियल सेल नेटवर्क14,21के निकट स्थानीय है।

DOX एक प्रसिद्ध कार्डियोटॉक्सिक दवा है जो कैंसर रोगियों में उनके इलाज30के 17 साल बाद भी दिल की विफलता विकसित कर सकती है । फिर भी, यह30महिलाओं में बाल रोगियों और स्तन कैंसर में ल्यूकेमिया और लिंफोमा के इलाज के लिए पसंद की दवा बनी हुई है। सीएसएस में DOX उपचार तो मॉडल दिल की विफलता (एचएफ) विट्रो में दोनों कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट14 में विषाक्तता को विनियमित करने के लिए और मॉडल एचएफ प्रेरित हृदय फाइब्रोसिस21में विषाक्तता को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया गयाहै । कोशिका व्यवहार्यता सांख्यिकीय 24 घंटे के भीतर DOX इलाज CSs में कम किया गया था जब कैंसर रोगियों के खून में पाया एकाग्रता पर दवा के संपर्क में (5 और 10 μM के बीच)14 (चित्रा 2)। हमारी प्रयोगशाला में पिछले अध्ययनों ने इस सिग्नलिंग पाथवे14के आनुवंशिक और रासायनिक अवरोधकों का उपयोग करके एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (एनओएस) के माध्यम से कार्डियक एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट दोनों पर डॉक्स के जहरीले प्रभावों का भी प्रदर्शन किया। आनुवंशिक (एनओएस 3 श्र्ना) और रासायनिक (एन5-(1-इमिनोएथिल) के उपयोग-एल-ऑर्निथिन, डाइहाइड्रोक्लोराइड, या एल-एनआईओ) एनओएस सिग्नलिंग मार्ग के विरोधी डीओएक्स के डाउनस्ट्रीम लक्ष्य के रूप में कार्डियक एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट14दोनों में इसके जहरीले प्रभावों को रोकते हैं।

सीएसएस के भीतर अनुबंध गतिविधि भी क्षेत्र संभावित उत्तेजना के संपर्क में आने पर हृदय कोशिकाओं के विद्युत युग्मन के लिए धन्यवाद मापा गया है। हमने पाया कि सीएसएस नियंत्रण मीडिया (DOX 0 μM) अनुबंध के साथ सुसंस्कृत अनायास और समरूप रूप से एक पिटाई दर है कि 1 और 3 हर्ट्ज के भीतर क्षेत्र उत्तेजना द्वारा पुस्तक किया जा सकता है, एक स्वस्थ मानव दिल के साथ तुलनीय पर । दूसरी ओर, DOX-इलाज CSs विद्युत उत्तेजना का पालन नहीं करते क्योंकि वे अनुबंध नहीं कर सकते हैं। कैल्सीन-एएम और एथिडियम होमोमर का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता और विषाक्तता के मापन के साथ, सीएस अनुबंधीय कार्य के लिए यह कार्यात्मक परख विट्रो में मानव हृदय के विशिष्ट जटिल परिदृश्य के मूल्यांकन की अनुमति देता है, वर्तमान में अन्य मॉडलों के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है। एक ही प्रणाली का उपयोग कर एकल हृदय कोशिकाओं के संकुचन गतिविधि माप की तुलना में, हम कल्पना और CSs में सारकोमेरे उपाय करने में सक्षम नहीं हैं । इसलिए, हम समय के साथ छोटा% स्फेरॉइड के माप तक ही सीमित हैं, एक परख हमें अपनी प्रयोगशाला के भीतर विकसित करना था। जैसा कि हम कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित करते हैं, हम प्रत्येक सीएस में सह-संस्कृति और इसलिए प्रत्येक सीएस के आकार, हम समान आकार के साथ सीएसएस का उपयोग करते हैं जो वास्तव में समरूप संकुचन कार्य पेश करते हैं। हालांकि, यदि हमने विभिन्न आकारों के सीएसएस उत्पन्न किए हैं, तो भी उनकी अनुबंध गतिविधि नहीं बदली।

यह रिपोर्ट करना भी महत्वपूर्ण है कि सीएसएस की बहुकोशिकीय प्रकृति उन्हें आयन-ऑप्टिक्स सिस्टम में कवरस्लिप के तल पर स्थानीयकरण करने के लिए पर्याप्त भारी बनाती है, भले ही वे अतितरित हों। इस तथ्य के आधार पर कि सीएसएस खुद को एक विशिष्ट स्थिति में बैठते हैं, हमें उन्हें कवरलिप का पालन करने की आवश्यकता नहीं है, जो आमतौर पर अधिकांश प्रयोगशालाओं में एकल हृदय कोशिकाओं के साथ किया जाता है।

कार्डियक ट्रोपोनिन टी, सीडी 31/पेकैम, और पेकैम (क्रमशः आईसीएएमएस, एचसीएईसी और एचसीएफ के लिए मार्कर के रूप में) के खिलाफ एंटीबॉडी से सना हुआ सीएसएस के सूक्ष्म विश्लेषण ने एंडोथेलियल सेल नेटवर्क(चित्रा 1,नीला) का गठन दिखाया। सीएसएस के भीतरी हिस्से में परिगलन को पूरी तरह से बाहर करने के लिए, कैल्सीन-एएम/एथिडियम होमाडिमर दाग सीएसएस(डेटा नहीं दिखाएगए) के कॉन्फोकल विश्लेषण द्वारा हमारी प्रयोगशाला में सेल व्यवहार्यता का स्थानिक मूल्यांकन किया गया था। हालांकि, यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि बायोफैब्रिकेशन क्षेत्र में भविष्य की घटनाओं को बेहतर तरह से वीवो में मानव हृदय की विशिष्ट अन्य जटिल विशेषताओं को फिर से रीकैपिटेट करने के लिए, वर्तमान में मौजूदा मॉडल में उपलब्ध नहीं है। इनमें शामिल हैं: i) वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स की विशिष्ट अनुबंधीय कार्य; ii) रक्त प्रवाह और दबाव बल; iii) पैराक्रिन सिग्नलिंग; iv) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जो इस और अन्य इन विट्रो कार्डियक मॉडल6में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण होगा . जैसा कि किसी भी अन्य मॉडल का उद्देश्य स्वस्थ ऊतक या रोग राज्य की प्रमुख विशेषताओं का पुनर्मूल्यांकन करना है, इस पांडुलिपि में वर्णित सीएस की पीढ़ी और उपयोग के लिए प्रोटोकॉल का उद्देश्य विशिष्ट प्रश्नों को संबोधित करने में शोधकर्ता की मदद करना है, जो इस दृष्टिकोण का उपयोग करके संपूर्ण नहीं हो सकता है। उदाहरण के लिए, सीएसएस की पीढ़ी के लिए रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का संभावित उपयोग व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए उपकरण प्रदान करेगा, वर्तमान में हृदय अनुसंधान के लिए आमतौर पर उपलब्ध उच्च थ्रूपुट परख का उपयोग करके उपलब्ध नहीं है।

अंत में, हमने हृदय कोशिकाओं का उपयोग करके मानव हृदय माइक्रोएनवायरमेंट को बेहतर तरह से पुनः प्राप्त करने का एक सरल तरीका प्रदर्शित किया। कार्डियक स्फेरॉइड एक एंडोथेलियल सेल नेटवर्क पेश करते हैं जो हृदय कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृतियों की तुलना में मानव हृदय में मौजूद एक को बेहतर रीकैपिटुलेट करता है। उनकी अनूठी विशेषताओं को देखते हुए, वे हृदय अनुसंधान के लिए इन विट्रो परीक्षण के लिए उन्नत उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग कर भविष्य के अध्ययन दोनों को रोकने और बेहतर हृदय रोग के इलाज के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा और उपन्यास चिकित्सा के लिए विकल्प प्रदान कर सकता है ।

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

रिकॉर्डिंग और वीडियो संपादन के लिए नेट जॉनसन के लिए एक विशेष धन्यवाद।

पूनम शर्मा को यूनिप्र्स और यूएनआरएस सेंट्रल एंड फैकल्टी स्कूल (यूएनआरएससी 5050) छात्रवृत्तियों के साथ न्यूकैसल विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। कारमाइन गेंटाइल को यूटीएस सीड फंडिंग, एडल्ट स्टेम सेल रिसर्च के लिए सिडनी ग्रांट के कैथोलिक आर्कसूबा और सिडनी मेडिकल स्कूल फाउंडेशन कार्डियोथोरेसिक सर्जरी रिसर्च ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A1933
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies Jackson Immunological Research Labs, Inc. 715-165-150 Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody
Doxorubicin hydrochloride Sigma-Aldrich D1515
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG From Bovine Plasma
Human cardiac fibroblasts (HCFs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 306AK-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 300K-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF Growth medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 316-500
Human MesoEndo Cell Growth Medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA L3224
Maintenance Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM BD Pharmingen, San Diego, CA, USA 566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA R37605
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Plating Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Rat Tail Collagen Sigma-Aldrich C3867
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Trypsin–EDTA, 0.25% Gibco, Thermofisher Scientific 25200072
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher Scientific 15250061
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Tissue culture flasks (T25) Thermofisher Scientific 156367
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Corning, New York, USA 3603
384-Well Hanging Drop Plate 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA HDP1385

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बायोइंजीनियरिंग अंक 167 वैस्कुलराइज्ड कार्डियक स्फेरॉइड बायोइंजीनियर्ड हार्ट टिश्यू वैस्कुलराइजेशन 3डी सह-संस्कृतियों स्टेम सेल कार्डियोमायोसाइट्स फाइब्रोब्लास्ट्स एंडोथेलियल सेल इन विट्रो टेस्टिंग डॉक्सोरुबिसिन कार्डियोटॉक्सीसिटी।
मानव हृदय रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो बायोइंजीनियर्ड हार्ट ऊतकों के रूप में कार्डियक स्पेरोइड्स
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Sharma, P., Gentile, C. Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology. J. Vis. Exp. (167), e61962, doi:10.3791/61962 (2021).

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