Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Сердечные сфероиды как в пробирке Биоинженерные ткани сердца для изучения патофизиологии сердца человека

Published: January 23, 2021 doi: 10.3791/61962
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,3,4
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

Summary

Этот протокол направлен на изготовление 3D сердечных сфероидов (CSs) путем совместного культивирования клеток в висячих капель. Коллаген-встроенные CSs обрабатываются доксорубицин (DOX, кардиотоксический агент) в физиологических концентрациях для моделирования сердечной недостаточности. In vitro тестирования с использованием DOX-обработанных CSs могут быть использованы для выявления новых методов лечения для пациентов с сердечной недостаточностью.

Abstract

Несмотря на несколько достижений в области инженерии сердечной ткани, одной из основных проблем, которые необходимо преодолеть, остается генерация полностью функциональной сосудистой сети, включающей несколько уровней сложности для обеспечения кислородом и питательными веществами в биоинженерных тканях сердца. Наша лаборатория разработала трехмерную модель in vitro человеческого сердца, известную как "сердечный сфероид" или "CS". Это представляет биохимические, физиологические и фармакологические особенности, характерные для сердца человека и генерируется путем совместного культивирования трех основных типов клеток, таких как сердечные миоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные кардиомиоциты (hiPSC-CMs или iCMs) совместно культурируются в соотношениях, приближенных к тем, которые находятся в виво с человеческими сердечными фибробластами (HCFs) и эндотелиальными клетками коронарной артерии человека (HCAECs) в висячих пластинах культуры падения в течение трех-четырех дней. Конфокальный анализ СС, окрашенных антителами против сердечного тропонина Т, CD31 и виментина (маркеры для сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, соответственно), показывает, что СС представляют собой сложную эндотелианую сеть клеток, напоминающую родную, найденную в сердце человека. Это подтверждается 3D-анализом рендеринга этих конфокальных изображений. CSs также представляют внеклеточные матричные (ECM) белки, типичные для сердца человека, такие как коллаген типа IV, ламинин и фибронектин. Наконец, CS представляют 400-ю договорливную активность, измеряемую как синцитиальная сотышность, ближе к типичной для человеческого сердца, по сравнению с CS, которые содержат только iCMs. При лечении с кардиотоксическим противораковым агентом, таким как доксорубицин (DOX, используется для лечения лейкемии, лимфомы и рака молочной железы), жизнеспособность DOX-обработанных CSs значительно снижается на 10 МКМ генетического и химического ингибирования эндотелиального оксида азота синтазы, вниз по течению цель DOX в HCFs и HCAECs, снижение его токсичности в CSS. Учитывая эти уникальные особенности, CSs в настоящее время используются в качестве моделей in vitro для изучения биохимии сердца, патофизиологии и фармакологии.

Introduction

Сердце человека имеет ограниченную регенеративную способность, в то время как сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остается основной причиной смерти во всем мире, несмотря на последние достижения в области тканевой инженерии и технологийстволовых клеток 1. Потребность в новых терапевтических средств, включая молекулярные и клеточные подходы либо восстановить поврежденное сердце или предотвратить сердце от отказа является одним из основных текущих клинических потребностей для пациентов, страдающихот сердечно-сосудистых заболеваний 2,3,4. Основной целью инженерии сердечной ткани является изготовление трехмерной (3D) ткани сердца, которая представляет молекулярные, клеточные и внеклеточные особенности, характерные для сердца человека, включая его сосудистую сеть и физиологическую контрактивнуюфункцию 4,5,6.

Для того, чтобы биоинженер и изготовить функциональную сердечную ткань человека, которая имитирует сердце человека для in vitro и in vivo приложений, было исследовано несколько подходов, включая инженерии тканей сердца (EHTs), клеточных листов и сфероидныхкультур 7,8. Тем не менее, эти ткани терпят неудачу при повторном воспроизведении оптимальной 3D микроокноронности, характерной для сердца человека и их потенциальное использование для пациентов с ССЗ не может непосредственно перевести со скамейкина кровать 7. Это потому, что они не резюмируют сложные биологии, морфологии и физиологии in vivo сердечных тканей9. Одна из основных проблем в инженерии сердечной ткани включает в себя развитие иерархической сосудистой сети в биоинженерной сердечной ткани, так как любая ткань, которая больше, чем 200 мкм в диаметре развивается гибельклеток в середине 2,10. Правильно сформированная сосудистая сеть в сердечной ткани человека играет важную роль в поставках крови, кислорода и питательных веществ в сердечные клетки11. Во время эмбрионального развития коронарные капилляры и артерии образуются через васкулогенез (образование сосудов крови de novo) и ангиогенез (генерация кровеносных сосудов из уже существующих) из эндотелиальных клеток-предшественников8,12. Сердечные фибробласты также играют важную роль в правильном формировании сосудистой сети, обеспечивая оптимальную внеклеточную матрицу (ECM) исостав роста 13,14.

3D сосудистая сеть биоинженерных тканей сердца контролирует выживаемость клеток и функции, создавая кислородные и питательные градиенты и паракринную сигнализацию, такие как гомотипическое клеточное взаимодействие, гетеротипическое клеточное взаимодействие, взаимодействие клеток через секретные растворимые белки и клетки к взаимодействиям ECM3,10,15,16,17,18. Это предотвращает гибель клеток в середине ткани и способствует жизнеспособности клеток и физиологической функции в биоинженерныхтканей сердца 16,18,19.

Сфероидные культуры из стволовых клеток были недавно изучены как в пробирке модели человеческого сердца20. Для дальнейшего улучшения микроокновидения сердца в пробирке, они включали использование всех основных типов клеток, найденных в сердце человека, таких как сердечные миоциты, эндотелиальные клетки, и фибробласты. Сфероидные культуры представляют необходимую 3D структурную поддержку для клеток расти и функционировать и могут быть использованы для биоинженерасосудистой сети 14,20,21,22. В этом контексте, наша лаборатория разработала человека сердечных сфероидов (CSs) путем совместного культивирования сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов в соотношении, найденном в сердцечеловека 14. Эта модель является расширение крыс желудочковой сердечной модели клеток сердца сфероидов, порожденных совместного культивирования сердечных клеток в висячих культур падение, используется для моделирования сердечногофиброза 21. Человеческие CSs могут быть использованы в качестве анализа токсичности, рассматривая их доксорубицин (DOX, противоопухольный агент, используемый для лечения лейкемии, лимфомы и рака молочной железы), который хорошо известен, чтобы вызвать сердечный фиброз и сердечную недостаточность (HF) даже 17 лет послеего сомминистрации 14.

В этой рукописи мы описываем, как генерировать человеческие CSs путем совместного культивирования человека индуцированной плюрипотентной стволовой клетки, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs или iCMs), человека сердечных фибробластов (HCFs) и коронарной артерии человека эндотелиальных клеток (HCAECs) в висячих культурах падения. Для того, чтобы использовать и изображения CSs для тестирования в пробирке, они встроены в коллагеновый гель. Конфокальный анализ СС, окрашенных антителами против CD31, маркера эндотелиальных клеток, показал, что эти клетки образуют сеть, аналогичную той, которая наблюдается in vivo. Чтобы вызвать HF и потенциально проверить новые агенты, которые могут лечить или предотвращать его, CSs лечили с 10 МК DOX (концентрация в крови больных раком, получающих препарат). При окрашивания кальцеин-AM и ethidium homodimer (окрашивание живых и мертвых клеток, соответственно), DOX-обработанные CS представляют собой значительное снижение жизнеспособности по сравнению с CSs, которые не получили препарат. CSs также представляют однородную контрактиабельную активность при темпе, используя потенциальную стимуляцию поля между 1 и 3 Гц.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: hiPSC-CMs, используемые для этого протокола, доступны на коммерческой основе. Пожалуйста, ищите институционального комитета по этике человека утверждения до начала этой работы, если это необходимо.

1. Человеческий сердечный фибробласт и эндотелиальная культура клеток покрытие и рост

  1. Оттепель криовиалы, содержащие HCFs и HCAECs в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение одной минуты.
  2. Перемещение криовилов под стерильный ламинарный поток биобезопасности шкаф класса 2.
  3. Соберите 1 мл клеточной суспензии от криовилов с помощью наконечника пипетки 1000 л и добавьте в 15 мл трубки, содержащей 7 мл человеческой сердечной фибробластовой среды для HCFs и 7 мл человеческого Meso Endo Growth Medium для HCAECs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы собрать большинство клеток из каждого криовиального, промойте их дважды с 1 мл среды культуры из той же трубки 15 мл.
  4. Аккуратно смешайте клеточные подвески.
  5. Передача клеточных суспензий в отдельные колбы культуры T75 с использованием серологического пипетки 10 мл.
  6. Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
  7. После 18 ч, аспирировать среды из обеих культур колбы и промыть их один раз с стерильным фосфатом буферного солевого раствора (PBS) для удаления замораживания средних и мертвых клеток.
  8. Замените PBS на 7 мл соответствующей культуры среды для каждой культуры колбы и инкубировать при 37 градусов по Цельсию.
  9. Регулярно изучите клеточное расширение и жизнеспособность и замените мультимедиа через день, пока клетки не достигнут 80-90% слияния.

2. покрытие культуры iCM и рост

  1. Предварительно пальто две Т25 культуры колбы с 2 мл PBS, содержащие 40 мкг / мл фибронектина (FN) и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2, по крайней мере 4 часа.
  2. Через 4 часа соберите один криовиальный препарат, содержащий iCMs, и поместите его в водяную баню при 37 градусов по Цельсию в течение 4 минут.
  3. Перемести криовиальный под стерильный ламинарный поток биобезопасности шкафа класса 2.
  4. Аккуратно перенесите iCMs из криовиальной в стерильную центрифугу 50 мл с помощью наконечника пипетки 1 мл.
  5. Промыть пустые iCMs криовиальные с 1 мл комнатной температуры покрытие среды для восстановления любых остаточных клеток. Перенесите 1 мл покрытия среднего полоскания из криовиальной капли более 90 сек в 50 мл центрифуги трубки, содержащей подвеску клетки iCM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно вихрем трубки при добавлении среды, чтобы смешать раствор полностью и уменьшить осмотический шок на разморожевания клеток.
  6. Медленно добавьте 8 мл комнатной температуры Plating Medium в центрифугу 50 мл трубки. Добавить первый 1 мл dropwise более 30 - 60 с. Затем добавьте оставшийся объем в течение следующих 30 с. Аккуратно закружить центрифугу трубки при добавлении Plating среды. Аккуратно смешайте содержимое 50 мл центрифуги трубки, инвертирование 2 - 3 раза (избегая энергичной тряски или вихря).
  7. Немедленно выполните подсчет клеток с помощью гемоцитометра и определите жизнеспособную плотность клеток (в клетках/мл).
  8. Возьмите Флябы T25 с покрытием FN и оспирировать раствор FN-PBS, не давая колбам высохнуть. К этому добавить объем посева iCMs (1.6 x 106 жизнеспособных iCMs в 8 mL комнатной температуре покрытия среды).
  9. Культура iCMs в инкубаторе для 48 ч при 37 C, 5% CO2.
  10. Оттепель обслуживания Средний ночь на 4 градусов по Цельсию в день перед использованием.
  11. Equilibrate среднего обслуживания в 37 градусов по Цельсию водяной бане и использовать немедленно.
  12. Через 2 дня перемести iCMs T25 колбы под шкаф биобезопасности.
  13. Аккуратно смойте мертвые клетки и мусор, аккуратно трубя Plating Medium вверх и вниз 5 раз.
  14. Аспирировать Plating Medium и заменить 8 мл предварительно разогретой среды технического обслуживания. Поместите колбы T25 обратно в инкубатор. Замените средство обслуживания через день и регулярно осматривать слияние.

3. Изоляция клеток и подсчет

  1. Начните с сбора сначала HCAECs и HCFs, а затем iCMs, следуя шагам 3.2-3.12.
  2. Подготовка CS культуры среды путем смешивания 10 мл iCMs обслуживания среднего, 5 мл человека сердечной fibroblast среднего и 5 мл Мезо Эндо среднего роста.
  3. Удалите культурную среду из каждой ткани колбы, содержащей HCFs и HCAECs и промыть один раз с 5 мл PBS для колб T75. Удалите PBS.
  4. Добавить 5 мл 0,25% трипсина EDTA решение для каждой колбы T75 и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  5. Как только клетки отсоединяются, немедленно нейтрализуем трипсин EDTA раствор с 5 мл среды культуры.
  6. Передача клеточных суспензий в 15 мл трубки и центрифуг клетки на 300 х г в течение 4 мин.
  7. Удалите супернатант тщательно из каждой трубки. Добавьте 1 мл CS среды для каждой ячейки гранулы и повторно их. Держите трубку на льду и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue и гемоцитометра.
  8. Удалите средство обслуживания из тканевых колб, содержащих iCMs, и смойте один раз 3 мл PBS.
  9. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина EDTA решение для каждой колбы T75 и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Проверяйте ячейки каждую минуту, пока не отсоединились.
  10. Как только клетки отсоединяются, немедленно нейтрализуем трипсин EDTA раствор с 4 мл среды культуры.
  11. Передача подвесок клеток в трубку 15 мл и центрифуга их при 300 х г в течение 5 мин.
  12. Удалите супернатант тщательно из каждой трубки. Добавьте 1 мл среды культуры в клеточные гранулы и повторно посовейте его. Держите трубку на льду и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue и гемоцитометра.

4.CS поколение и рост

  1. Смешайте iCMs, HCF и HCAECs в соотношении 2:1:1, помечая 10 000 iCMs, 5000 HCFs и 5000 HCAECs на висячие культуры падения, содержащие 20 КЛ среды CS. Отрегулируйте к окончательному объему для полного числа CSs.
  2. Pipette 20 МКЛ клеточной подвески в каждой колодец 384 хорошо HDC пластины либо вручную или с помощью роботизированной многоканальной пипетки для автоматизированной обработки жидкости.
  3. Pipette 1.5 мл стерильных PBS в каждой стороне канала вокруг Висячие Drop плиты, чтобы предотвратить высыхание CSs. Инкубация пластины HDC при 37 градусов по Цельсию.
  4. Изучить образование СС на ежедневной основе, пока полностью сформированный сфероид наблюдается в большинстве скважин. Добавляйте 7,5 МКЛ среды CS к каждому хорошо через день, пока CS не образуется.

5.CS встраивание в коллагеновые гели

  1. Соберите CSs с наконечником пипетки 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо вырезать кончик пипетки около 0,2 см от края перед его использованием со стерильной резкой поверхности (либо скальпелем или ножницами), чтобы предотвратить любые повреждения гель встроенных сфероидов во время их сбора.
  2. Соберите подвеску CS в трубку 50 мл на льду.
  3. Центрифуга трубки на 300 х г в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: полученные гранулы должны храниться на льду до его использования.
  4. Приготовьте раствор коллагенового геля (100 йл/колодец для 30 скважин из 96 скважин) на льду с использованием коллагена крысиного хвоста и CS среды в соотношении 3:7.
  5. Удалите супернатант из трубки, содержащей CSs.
  6. Смешайте гранулированное CSs в растворе коллагенового геля.
  7. Добавьте 1 мл/мл гидроксида натрия 5 мм в суспензию cs-коллагенового геля и аккуратно перемешайте.
  8. Передача 100 йл CS-коллагена гель на ясное плоское дно 96 хорошо черный полистирол микроплюрат и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.

6. Измерения жизнеспособности и токсичности обработанных DOX СС

  1. После 30 мин собирать 96 хорошо пластины из инкубатора
  2. Подготовь 10 МК DOX (на основе ранее установленного протокола для смерти клеток в CSs14).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для потенциального тестирования других агентов, которые могут защитить от HF в CS, генерировать решения, содержащие DOX и агент A, B и т.д.
  3. Добавьте к каждой хорошо 100 йл решений, содержащих DOX и/или другие агенты. Культуры управления содержат средства массовой информации без каких-либо DOX.
  4. Инкубационая пластина для 18 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  5. На следующий день, собирать Live / Dead окрашивания реагентов фондовых решений и позволить им оттаивать на льду в темноте в биобезопасности кабинета.
  6. Подготовь раствор, содержащий пятно Хоэхста, 4 МКМ омодимера этидиума и 2 МК кальцеин-АМ.
  7. Добавьте 100 йл пятна Hoechst, calcein-AM/ethidium гомодимер раствор в каждой хорошо.
  8. Измерьте флуоресценцию в каждую хорошо на 645 нм для ethidium homodimer и на 530 нм для кальцина-AM, соответственно, с помощью мультимодной микроплекан считывателя.
  9. Передача измерений флуоресценции в Graphpad PRISM (или эквивалентное программное обеспечение для статистического анализа).
  10. Используйте программное обеспечение GraphPad Prism для анализа данных и статистики.
  11. Для контроля качества, проверьте под микроскопом эпифлуоресценции для окрашивания ядер, вместе с кальциин-AM и ethidium homodimer.

7.CS оценка контрактильной функции

  1. Соберите микроплюжку, подготовленную в шаге 5.8.
  2. Включите компьютер, содержащий программное обеспечение IonOptix для видео-обнаружения края, интерфейс помощи флуоресценции, и стимулятор поля MyoPacer.
  3. Поместите новую крышку скольжения на платформе держателя ткани и собрать водяную баню с электродами.
  4. Аккуратно соберите CS из коллагеновых гелей с помощью наконечника пипетки 1 мл, вырезанного на 0,5 мм от края, и перенесите их в соколиную трубку. Добавьте мультимедиа на CS, чтобы предотвратить высыхание CSs. Transfer CS (по одному) с несколькими средствами массовой информации на стадии системы IonOptix.
  5. Выберите CS для анализа с помощью настройки пиков на левой и правой стороне CS с помощью программного обеспечения IonOptix.
  6. Используйте компьютерный анализатор движения для отслеживания движения краев CS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, сократительность измеряется либо в % сокращения клеток или % дробного сокращения. В этом случае мы измерили % сокращение сфероидов.
  7. Стабилизация как пиков, регулирующих порог, так и параметры края с компьютера.
  8. Подвергайте CS различным частотам (0,3, 0,6, 1, 2 и 3 Гц) и напряжениям (1, 2, 3 и 5 В) с помощью стимулятора Myopacer Field.
  9. Запись сфероидного сокращения по мере изменения длины CS doX-обработанных и необработанных CS. Анализ данных с помощью программного обеспечения Soft-Edge и усредовка для каждого CS.

8. Микроскопия СС: фиксация и иммунолабелирование

  1. Соберите пластину 96 хорошо после 30 мин (как подготовлено в шаге 5,8) и исправить CSs в 4% параформальдегид (PFA) для 1 ч при комнатной температуре.
  2. Удалите PFA и промыть три раза с PBS, содержащий 0,01% натрия азида (PBSA).
  3. Удалите PBSA.
  4. Добавьте 200 МКЛ PBSA, содержащего 0,02% Triton-X-100 к каждой хорошо в течение 30 минут на шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг пронизывает CSs для лучшего инфильтрации антител.
  5. Добавьте 200 МКЛ из 3% альбумин сыворотки крупного рогатого скота в растворе PBSA в течение 60 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг блокирует неспецифическое связывание антител в CSs.
  6. Подготовь решение, содержащее 10 мкг/мл первичных анти-человеческих антител мыши против CD31, разбавленного блокирующим раствором.
  7. Добавьте 100 МКЛ первичного раствора антител к каждой хорошо и инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию на шейкере.
  8. Промыть пластину три раза с PBSA в течение 20 минут при комнатной температуре на качалке пластины.
  9. Подготовь решение, содержащее пятно ДНК Hoechst и 10 мкг/мл спряченных вторичных антител осла, разбавленных блокирующим раствором.
  10. Добавьте 100 МКЛ вторичного раствора антител, содержащего пятно Hoechst к каждой колодец и инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию на шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка пластины с алюминиевой фольгой с этого момента и далее.
  11. Промыть пластину три раза в течение 20 минут с PBSA при комнатной температуре на качалке пластины.
  12. Добавьте к каждой хорошо 100 МКЛ монтажной среды Vectashield.
  13. Изображение CSs под лазерным сканированием конфокального микроскопа. Выполняйте оптическое сечение вдоль оси и сфудили изображения в единую фокусную плоскость с помощью программного обеспечения ImageJ.

Representative Results

Протокол, описанный в этой рукописи представляет собой альтернативный подход к разработке сложной сердечной эндотелиальной клеточной сети в биоинженерной сердечной ткани с улучшенной жизнеспособности клеток и функции по сравнению с существующими моделями (Рисунок 1). Повторная перепросмотр 3D микроокноронности сердца in vivo в СС способствовала их реакции на DOX в концентрации, найденной в крови онкологических больных (от 5 до 10 МКМ, рисунок 2). DOX лечение CSs представил статистически значимое снижение жизнеспособности клеток по сравнению с контролем (без DOX) CSs в пределах 24 ч (Рисунок 2), токсический эффект, который наблюдается у больных раком человека даже через 17 лет после их лечения препаратом.

Figure 1
Рисунок 1. CS Формирование и анализ васкуляризации. (A)Протокол, показывающий шаги для формирования CS из совместной культуры iCMs, HCAECs и HCFs в висячих капель. Яркие изображения на правой стороне показывают прогрессивное образование сфероидов из одиночных клеток в висячих каплях. (B) Рухнули стеки конфокальных изображений CS окрашенных антителами против сердечного troponin T (cTNT), PECAM и виментин, окрашивание сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, соответственно. Эта цифра была изменена с14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. Жизнеспособность и токсичность в CSs. Статистический анализ кальцина-AM (A) и этидия гомодимера (B )флуоресценцииCS, обработанных в присутствии либо средств массовой информации только (DOX 0 МК) или доксорубицин (10 МКМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

В развитии правильное формирование сосудистой сети имеет решающее значение для генерации функциональныхтканей, в том числе сердца человека 10,12,23,24,25,26. Рассмотрение правильной васкуляризации 3D тканей позволяет обмениваться кислородом, факторами роста, сигнализацией молекул и питательных веществ, предотвращая развитие клеточного некроза в любой ткани толще 200мкм 6,10,12,17,24,25,26,27,28. В настоящее время доступны в пробирке 3D модели сердца, которые представляют сосудистой сети в первую очередь представления капиллярного размера, дезорганизованных сосудистых сетей и отсутствие иерархического комплекса разветвленной васкуляризациинаблюдаетсяв vivo 6,8,29. Альтернативный подход к разработке сложной сердечной эндотелиальной клеточной сети, описанный в этой рукописи, представляет улучшенную жизнеспособность и функцию клеток посравнению с существующими моделями (рисунок 1)14,22. 3D в пробирке CSs модели человеческого сердца, лучше recapitulating его в vivo микроэнvironment, в том числе его молекулярных, клеточных ивнеклеточных компонентов 14,22. Поколение CS из клеток, полученных из стволовых клеток в висячих каплях, позволяет их культурам в определенных условиях (например, типы клеток и соотношение, правильное образование тканей). Совместно культуры iCMs совместно с HCFs и HCAECs внутри CSs определяют молекулярный и клетчатый перекрестный разговор который регулирует патофизиологию сердца, включая свою контрактильной функцию и реакцию к снадобьям на концентрациях найденных в крови пациента14. Благодаря этим уникальным особенностям, CSs были использованы для моделирования сердечного фиброза, тяжелое следствие инфаркта миокарда и сердечной недостаточности21. Наши предыдущие исследования показали, как наличие как эндотелиальных клеток, так и фибробластов имеет решающее значение для перепросмотра микрооколонки сосудов в сердце человека, что позволяет оптимальное осаждение фибробластов, полученных ECM белков, таких как ламинин, фибронектин и коллаген типа IV, локализованных в непосредственной близости от развивающейсяэндотелиальной клеточной сети 14,21.

DOX является известным кардиотоксическим препаратом, который может развиться сердечная недостаточность у больных раком даже через 17 лет после ихлечения 30. Тем не менее, он остается препаратом выбора для лечения лейкемии и лимфомы у педиатрических пациентов и рака молочной железы уженщин 30. DOX лечение в CSs затем был использован для моделирования сердечной недостаточности (HF) in vitro для изучения как механизмы, регулирующие токсичность в сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов14 и модели HF-индуцированного сердечного фиброза21. Жизнеспособность клеток была статистически снижена в DOX лечение CSs в пределах 24 ч при воздействии препарата в концентрации, найденной в крови больных раком (между 5 и 10МК) 14 (Рисунок 2). Предыдущие исследования в нашей лаборатории также продемонстрировали токсическое воздействие DOX как на сердечные эндотелиальные клетки, так и на фибробласты с помощью эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) с использованием как генетических, так и химических ингибиторов этогосигнального пути 14. Использование генетических (NOS3 shRNA) и химических (N5-(1-iminoethyl)-L-орнитин, дигидрохлорид, или L-NIO) антагонистов eNOS сигнализации пути в качестве вниз по течению цель DOX предотвратить его токсическое воздействие как в сердечной эндотелиальных клеток ифибробластов 14.

Контрактильной активности в CSs также измеряется благодаря электрической связи сердечных клеток при воздействии на поле потенциальной стимуляции. Мы обнаружили, что CSs, культурные с средствами управления (DOX 0 МК) контракт спонтанно и однородно на избиение скорость, которая может быть темп по стимуляции поля в пределах 1 и 3 Гц, сопоставимы со здоровым сердцем человека. С другой стороны, обработанные DOX CS не следуют электрической стимуляции, поскольку они не могут контракт. Наряду с измерениями жизнеспособности клеток и токсичности с использованием calcein-AM и ethidium homodimer, этот функциональный анализ для CS контрактильной функции позволяют оценку сложного сценария, типичного для человеческого сердца in vitro, в настоящее время не достижимо с другими моделями. По сравнению с измерениями контрактной активности одиночных сердечных клеток, использующих ту же систему, мы не в состоянии визуализировать и измерить саркомер в CSs. Таким образом, мы ограничены измерениями % сфероидного сокращения с течением времени, анализ, который мы должны были разработать в нашей лаборатории. Как мы контролируем количество клеток, мы совместно культуры в каждом CS и, следовательно, размер каждого CS, мы используем CS с аналогичным размером, что действительно присутствует однородная контрактивная функция. Однако даже в случае, если мы генерировали СС разных размеров, их контрактная деятельность не меняться.

Важно также сообщить, что многоклеточный характер CS делает их достаточно тяжелыми, чтобы локализовать в нижней части крышки в системе Ion-Optix, даже если они наколены. Основываясь на том факте, что СС сидят сами по себе в определенном положении, нам не нужно, чтобы заставить их придерживаться крышки, вопреки тому, что обычно делается с одной сердечной клетки в большинстве лабораторий.

Микроскопический анализ CSs окрашенных антителами против сердечного тропонина T, CD31/PECAM, и PECAM (в качестве маркеров для iCMs, HCAECs, и HCFs, соответственно) показали формирование эндотелиальной сети клеток(рисунок 1, синий). Чтобы полностью исключить некроз во внутренней части CSs, пространственная оценка жизнеспособности клеток была проведена в нашей лаборатории конфокального анализа кальцина-AM/ethidium homodimer окрашенных CSs(данные не показаны). Тем не менее, важно признать, что будущие разработки в области биофабрикации, чтобы лучше резюмировать другие сложные особенности, типичные для человеческого сердца in vivo, в настоящее время не доступны в существующей модели. К ним относятся: i) контрактильной функции, характерные для взрослых кардиомиоцитов; ii) кровоток и силы давления; iii) паракринная сигнализация; iv) иммунный ответ, который будет иметь решающее значение для улучшения этого и других в пробирке сердечныхмоделей 6. Поскольку любая другая модель направлена на повторение основных особенностей либо здоровой ткани, либо состояния болезни, протокол для генерации и использования CS, описанный в этой рукописи, направлен на оказание помощи исследователю в решении конкретных вопросов, которые не могут быть исчерпывающими с помощью этого подхода. Например, потенциальное использование клеток, полученных пациентами для генерации СС, обеспечит инструменты для персонализированной медицины, которые в настоящее время недоступны с использованием общедоступных высокоопруговых анализов для сердечно-сосудистых исследований.

В заключение, мы продемонстрировали простой способ лучше резюмировать микроокноронию сердца человека с помощью сердечных клеток. Сердечные сфероиды представляют эндотелиальную клеточную сеть, которая лучше резюмирует тот, который присутствует в сердце человека по сравнению с монослойными культурами сердечных клеток. Учитывая их уникальные особенности, они представляют собой передовые инструменты для тестирования in vitro для сердечно-сосудистых исследований. Будущие исследования с использованием клеток, полученных пациентом, могли бы предоставить варианты персонализированной медицины и новых методов лечения как для профилактики, так и для лучшего лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Disclosures

Ни один

Acknowledgments

Особая благодарность Нэт Джонстон за запись и редактирование видео.

Пунам Шарма был поддержан Университетом Ньюкасла стипендиями UNIPRS и Central and Faculty School (UNRSC5050). Кармин Джентиле была поддержана UTS Семенное финансирование, католическая митрополия Сиднея Грант для взрослых исследований стволовых клеток и Сиднейской медицинской школы Фонд кардиоторакальной хирургии исследований Грант.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A1933
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies Jackson Immunological Research Labs, Inc. 715-165-150 Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody
Doxorubicin hydrochloride Sigma-Aldrich D1515
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG From Bovine Plasma
Human cardiac fibroblasts (HCFs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 306AK-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 300K-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF Growth medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 316-500
Human MesoEndo Cell Growth Medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA L3224
Maintenance Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM BD Pharmingen, San Diego, CA, USA 566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA R37605
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Plating Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Rat Tail Collagen Sigma-Aldrich C3867
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Trypsin–EDTA, 0.25% Gibco, Thermofisher Scientific 25200072
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher Scientific 15250061
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Tissue culture flasks (T25) Thermofisher Scientific 156367
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Corning, New York, USA 3603
384-Well Hanging Drop Plate 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA HDP1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538 (2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394 (2020).

Tags

Биоинженерия выпуск 167 Васкуляризированные сердечные сфероиды биоинженерные ткани сердца васкуляризация 3D-ко-культуры стволовые клетки кардиомиоциты фибробласты эндотелиальные клетки в пробирке тестирование доксорубицин кардиотоксичность.
Сердечные сфероиды как в пробирке Биоинженерные ткани сердца для изучения патофизиологии сердца человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac… More

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology. J. Vis. Exp. (167), e61962, doi:10.3791/61962 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter