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Bioengineering

Sphéroïdes cardiaques comme tissus cardiaques bioingénieurs in vitro pour étudier la pathophysiologie cardiaque humaine

Published: January 23, 2021 doi: 10.3791/61962
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,3,4
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

Summary

Ce protocole vise à fabriquer des sphéroïdes cardiaques 3D (CS) en co-culture des cellules dans des gouttes suspendues. Les CS incorporés au collagène sont traités avec de la doxorubicine (DOX, un agent cardiotoxique) à des concentrations physiologiques pour modéliser l’insuffisance cardiaque. Les tests in vitro à l’aide de CS traités par DOX peuvent être utilisés pour identifier de nouvelles thérapies pour les patients souffrant d’insuffisance cardiaque.

Abstract

Malgré plusieurs progrès dans l’ingénierie des tissus cardiaques, l’un des principaux défis à surmonter demeure la génération d’un réseau vasculaire entièrement fonctionnel comprenant plusieurs niveaux de complexité pour fournir de l’oxygène et des nutriments dans les tissus cardiaques bioingénieurs. Notre laboratoire a développé un modèle in vitro tridimensionnel du cœur humain, connu sous le nom de « sphéroïde cardiaque » ou « CS ». Ceci présente des dispositifs biochimiques, physiologiques, et pharmacologiques typiques du coeur humain et est produit en co-culturant ses trois types principaux de cellules, tels que des myocytes cardiaques, des cellules endothéliales, et des fibroblastes. Les cardiomyocytes pluripotents induits par l’homme dérivés des cellules souches (hiPSC-MC ou iMC) sont co-cultivés à des ratios se rapportant à ceux trouvés in vivo avec les fibroblastes cardiaques humains (HCF) et les cellules endothéliales coronaires humaines (HCAECs) dans les plaques de culture de chute suspendues pendant trois à quatre jours. L’analyse confocale des CS tachés d’anticorps contre la troponine cardiaque T, le CD31 et la vimentine (marqueurs pour les myocytes cardiaques, les cellules endothéliales et les fibroblastes, respectivement) montre que les CS présentent un réseau cellulaire endothélial complexe, ressemblant à celui indigène trouvé dans le cœur humain. Ceci est confirmé par l’analyse de rendu 3D de ces images confoccales. Les CS présentent également des protéines de matrice extracellulaire (ECM) typiques du cœur humain, telles que le collagène de type IV, la laminine et la fibronectine. Enfin, les CS présentent une activité contractile mesurée comme contractilité syncytiale plus proche de celle typique du cœur humain par rapport aux CS qui ne contiennent que des IMC. Lorsqu’elle est traitée avec un agent anticancéreux cardiotoxique, comme la doxorubicine (DOX, utilisée pour traiter la leucémie, le lymphome et le cancer du sein), la viabilité des SMC traités au DOX est considérablement réduite à 10 μM d’inhibition génétique et chimique de la synthase endothéliale d’oxyde nitrique, une cible en aval du DOX dans les HFC et les HCAECs, ce qui a réduit sa toxicité dans les CSC. Compte tenu de ces caractéristiques uniques, les CS sont actuellement utilisés comme modèles in vitro pour étudier la biochimie cardiaque, la pathophysiologie et la pharmacologie.

Introduction

Le cœur humain a une capacité de régénération limitée tandis que les maladies cardiovasculaires (MCV) restent la principale cause de décès dans le monde entier malgré les progrès récents dans l’ingénierie tissulaire et les technologies de cellulessouches 1. La nécessité de nouvelles thérapies, y compris des approches moléculaires et cellulaires pour réparer un cœur endommagé ou pour empêcher un cœur d’échouer est l’un des principaux besoins cliniques actuels pour les patientssouffrant de maladies cardiaques 2,3,4. L’objectif principal de l’ingénierie tissulaire cardiaque est de fabriquer un tissu cardiaque tridimensionnel (3D) qui présente des caractéristiques moléculaires, cellulaires et extracellulaires typiques d’un cœur humain, y compris son réseau vasculaire et sa fonction contractilephysiologique 4,5,6.

Afin de bioingénier et de fabriquer un tissu cardiaque humain fonctionnel qui imite le cœur humain pour des applications in vitro et in vivo, plusieurs approches ont été étudiées, y compris les tissus cardiaques artificiels (EHT), les feuilles cellulaires et les cultures sphéroïdes7,8. Cependant, ces tissus échouent à récapituler le microenvironnement 3D optimal typique du coeur humain et leur utilisation potentielle pour des patients de CVD ne peut pas traduire directement du banc au chevet7. C’est parce qu’ils ne récapitulent pas la biologie complexe, la morphologie et la physiologie des tissus cardiaques in vivo9. L’un des défis majeurs dans l’ingénierie des tissus cardiaques comprend le développement d’un réseau vasculaire hiérarchique dans le tissu cardiaque bioingénieuré, comme tout tissu qui est plus grand que 200 μm de diamètre développe la mort cellulaire au milieu2,10. Un réseau vasculaire correctement formé dans un tissu cardiaque humain joue un rôle majeur pour l’approvisionnement en sang, en oxygène et en nutriments aux cellules cardiaques11. Au cours du développement embryonnaire, des capillaires coronaires et des artères se forment par vasculogenèse (formation de vaisseaux sanguins de novo) et angiogenèse (génération de vaisseaux sanguins à partir de cellules progénitrices endothéliales8,12. Les fibroblastes cardiaques jouent également un rôle majeur dans la formation appropriée de réseau vasculaire en fournissant la matrice extracellulaire optimale (ECM) et la composition decroissance 13,14.

Le réseau vasculaire 3D des tissus cardiaques bioingénieurs contrôle la survie et la fonction cellulaires en créant des gradients d’oxygène et d’éléments nutritifs et la signalisation paracrine, telles que l’interaction cellulaire homotypique, l’interaction hétérotypique des cellules, l’interaction des cellules par des protéines solubles sécrétées et les interactions cellule à ECM3,10,15,16,17,18. Ceci empêche la mort cellulaire au milieu du tissu et favorise la viabilité cellulaire et la fonction physiologique dans les tissus cardiaques bioingénieurs16,18,19.

Les cultures sphéroïdes à partir de cellules souches ont été récemment explorées comme modèles in vitro du cœurhumain 20. Pour améliorer davantage le microenvironnement cardiaque in vitro, ils ont inclus l’utilisation de tous les types de cellules principales trouvés dans le cœur humain, tels que les myocytes cardiaques, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Les cultures sphéroïdes présentent le support structurel 3D requis pour que les cellules se développent et fonctionnent et peuvent être utilisées pour bioingénier un réseau vasculaire14,20,21,22. Dans ce contexte, notre laboratoire a mis au point des sphéroïdes cardiaques humains (SSC) en co-culture des myocytes cardiaques, des cellules endothéliales et des fibroblastes à des ratios trouvés dans le cœurhumain 14. Ce modèle est une expansion du modèle sphéroïde de cellules cardiaques ventriculaires de rat, généré par la co-culture des cellules cardiaques dans les cultures de chute suspendue, employées pour modéliser la fibrosecardiaque 21. Les CS humains peuvent être utilisés comme tests de toxicité en les traitant doxorubicine (DOX, un agent anticancéreur utilisé pour traiter la leucémie, le lymphome et le cancer du sein), qui est bien connu pour induire la fibrose cardiaque et l’insuffisance cardiaque (HF) même 17 ans après sa somministration14.

Dans ce manuscrit, nous décrivons comment générer des CS humains en co-culturant les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-MC ou iMC), les fibroblastes cardiaques humains (HCF) et les cellules endothéliales coronaires humaines (HCAECs) dans les cultures de chute suspendues. Afin d’utiliser et d’image css pour les tests in vitro, ils sont intégrés dans un gel de collagène. L’analyse confocale des CS tachés d’anticorps contre le CD31, un marqueur pour les cellules endothéliales, a montré que ces cellules forment un réseau similaire à celui observé in vivo. Pour induire hf et potentiellement tester de nouveaux agents qui peuvent le traiter ou le prévenir, CSs ont été traités avec 10 μM DOX (une concentration trouvée dans le sang des patients atteints de cancer recevant le médicament). Lorsqu’ils sont tachés de calcéine-AM et d’homodimer d’éthidium (colorant les cellules vivantes et mortes, respectivement), les SC traités par DOX présentent une diminution significative de la viabilité par rapport aux SC qui n’ont pas reçu le médicament. Les CS présentent également une activité contractile homogène lorsqu’ils sont arpentés à l’aide d’une stimulation potentielle sur le terrain comprise entre 1 et 3 Hz.

Protocol

REMARQUE : Les mcs hiPSC utilisés pour ce protocole sont disponibles dans le commerce. S’il vous plaît demander l’approbation du comité d’éthique humaine institutionnelle avant de commencer ce travail si nécessaire.

1. Placage et croissance humains de culture de cellules fibroblastes cardiaques et endothéliales

  1. Décongeler les cryoviaux contenant des HCF et des HCAECs dans un bain d’eau à 37 °C pendant une minute.
  2. Déplacez les cryovials sous un cabinet stérile de biosécurité à flux laminaire classe 2.
  3. Recueillir 1 mL de suspension cellulaire à partir des cryoviaux à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL et ajouter dans un tube de 15 mL contenant 7 mL de milieu fibroblaste cardiaque humain pour les HCF et 7 mL de milieu de croissance méso-endo humain pour les HCAECs.
    REMARQUE : Afin de recueillir la majorité des cellules de chaque cryovial, rincez-les deux fois avec 1 mL de milieu de culture à partir du même tube de 15 mL.
  4. Mélanger délicatement les suspensions cellulaires.
  5. Transférer les suspensions cellulaires pour séparer les flacons de culture T75 à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
  6. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2.
  7. Après 18 h, aspirer le milieu des deux flacons de culture et les rincer une fois à l’aide d’une solution saline tamponnée de phosphate stérile (PBS) pour éliminer les cellules moyennes et mortes gelées.
  8. Remplacez PBS par 7 mL de milieu de culture approprié à chaque flacon de culture et incubez à 37 °C.
  9. Examinez régulièrement l’expansion cellulaire et la viabilité et remplacez les médias tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %.

2. placage et croissance de culture d’iCM

  1. Pré-enrober deux flacons de culture T25 avec 2 mL de PBS contenant 40 μg/mL de fibronectine (FN) et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 4 heures.
  2. Après 4 heures, recueillir un cryovial contenant des iMC et le placer dans un bain d’eau à 37 °C pendant 4 min.
  3. Déplacez le cryovial sous un flux laminaire stérile de classe 2.
  4. Transférer délicatement les iMC du cryovial à un tube stérile de centrifugeuse de 50 mL à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL.
  5. Rincez les iMC cryoviaux vides avec 1 mL de milieu de placage à température ambiante pour récupérer les cellules résiduelles. Transférer le 1 mL de rinçage moyen de placage du cryovial drop-wise de plus de 90 sec au tube de centrifugeuse de 50 mL contenant la suspension cellulaire iCM.
    REMARQUE : Faites pivoter doucement le tube tout en ajoutant le milieu pour mélanger complètement la solution et diminuer le choc osmotique sur les cellules décongelées.
  6. Ajouter lentement 8 mL de placage à température ambiante Moyen au tube de centrifugeuse de 50 mL. Ajouter le premier 1 mL dropwise plus de 30 - 60 s. Ensuite, ajouter le volume restant au cours des 30 prochains s. Faites pivoter doucement le tube de centrifugeuse tout en ajoutant le milieu de placage. Mélanger délicatement le contenu du tube de centrifugeuse de 50 mL en inversant 2 à 3 fois (en évitant les secousses vigoureuses ou les tourbillons).
  7. Effectuez immédiatement le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et déterminez la densité cellulaire viable (dans les cellules/mL).
  8. Prenez les flacons T25 pré-enduits FN et aspirez la solution FN-PBS sans laisser sécher les flacons. À cela s’ajoutent un volume d’ensemencement d’iMC (1,6 x10 6 iMC viables dans un milieu de placage de température ambiante de 8 mL).
  9. IMC culture dans l’incubateur pour 48 h à 37 °C, 5 % CO2.
  10. Décongeler le milieu d’entretien toute la nuit à 4 °C par jour avant l’utilisation.
  11. Equilibrer le milieu d’entretien dans un bain d’eau de 37 °C et utiliser immédiatement.
  12. Après 2 jours, déplacez les flacons IMC T25 sous l’armoire de biosécurité.
  13. Lavez doucement les cellules mortes et les débris en pipetting doucement le milieu de placage de haut en bas 5 fois.
  14. Aspirer le support de placage et remplacer par les 8 mL de medium d’entretien préchauffé. Remettre les flacons T25 dans l’incubateur. Remplacez le support d’entretien tous les deux jours et examinez la confluence régulièrement.

3. Isolement cellulaire et comptage

  1. Commencez par collecter d’abord des HCAECs et des HCF, puis des iMC en suivant les étapes 3.2-3.12.
  2. Préparez le milieu de culture CS en mélangeant 10 mL de support d’entretien iMC, 5 mL de milieu fibroblaste cardiaque humain et 5 mL de moyenne de croissance Meso Endo.
  3. Retirer le milieu de culture de chaque flacon de tissu contenant des HCF et des HCAECs et rincer une fois avec 5 mL PBS pour les flacons T75. Retirez PBS.
  4. Ajouter 5 mL de solution EDTA trypsine de 0,25 % à chaque flacon T75 et incuber pendant 5 min à 37 °C, 5 % de CO2.
  5. Une fois que les cellules se détachent, neutralisez immédiatement la solution trypsine EDTA avec 5 mL de milieu de culture.
  6. Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de 15 mL et les cellules centrifugeuses à 300 x g pendant 4 min.
  7. Retirer soigneusement le surnatant de chaque tube. Ajouter 1 mL de CS moyen à chaque granule cellulaire et les résuspendre. Gardez le tube sur la glace et comptez les cellules à l’aide de Trypan Blue et d’un hémocytomètre.
  8. Retirer le milieu d’entretien des flacons de tissu contenant des iMC et rincer une fois avec 3 mL de PBS.
  9. Ajouter 1 mL de solution EDTA trypsine de 0,25 % à chaque flacon T75 et incuber à 37 °C, 5 % de CO2. Vérifiez les cellules toutes les minutes jusqu’à ce qu’elles soient détachées.
  10. Une fois que les cellules se détachent, neutralisez immédiatement la solution trypsine EDTA avec 4 mL de milieu de culture.
  11. Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de 15 mL et les centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
  12. Retirer soigneusement le surnatant de chaque tube. Ajouter 1 mL de milieu de culture à la pastille cellulaire et la résuser. Gardez le tube sur la glace et comptez les cellules à l’aide de Trypan Blue et d’un hémocytomètre.

4.CS génération et croissance

  1. Mélangez les iMC, les HCF et les HCAECs en 2:1:1 ratio en placage de 10 000 iMC, 5 000 HCF et 5 000 HCAECs par culture de chute suspendue contenant 20 μL de CS moyen. S’adapter au volume final pour le nombre total de CS.
  2. Pipette 20 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque HDC du puits 384 soit manuellement, soit à l’aide d’une pipette robotisée multicanal pour la manipulation automatisée des liquides.
  3. Pipette 1,5 mL de PBS stérile de chaque côté du chenal autour de la plaque de chute suspendue pour éviter le dessèchement des CS. Incuber la plaque HDC à 37 °C.
  4. Examiner la formation de CS sur une base quotidienne jusqu’à ce qu’un sphéroïde entièrement formé soit observé dans la majorité des puits. Ajouter 7,5 μL de CS moyen à chaque puits tous les deux jours jusqu’à ce qu’un CS soit formé.

5.CS dans des gels de collagène

  1. Recueillir les CS avec une pointe pipette de 1 mL.
    REMARQUE : Il est nécessaire de couper la pointe de pipette à environ 0,2 cm du bord avant son utilisation avec une surface nette stérile (soit un scalpel ou un ciseaux) pour éviter tout gel endommagé intégré sphéroïdes au cours de leur collecte.
  2. Recueillir la suspension CS dans un tube de 50 mL sur la glace.
  3. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min.
    REMARQUE : la pastille obtenue doit être conservée sur la glace jusqu’à utilisation.
  4. Préparer une solution de gel de collagène (100 μL/puits pour 30 puits de 96 plaques de puits) sur la glace à l’aide de collagène de queue de rat et de cs moyen dans un rapport de 3:7.
  5. Retirer le surnatant du tube contenant des CS.
  6. Mélanger les CS granulés dans la solution de gel de collagène.
  7. Ajouter 1 μL/mL d’hydroxyde de sodium de 5 mM à la suspension gel de collagène CS et mélanger délicatement.
  8. Transférer 100 μL de gel de collagène CS sur un fond plat clair 96 microplaques en polystyrène bien noir et incuber à 37 °C pendant 30 min.

6. Mesures de viabilité et de toxicité des SS traités au DOX

  1. Après 30 min recueillir la plaque de puits 96 de l’incubateur
  2. Préparez un DOX de 10 μM (basé sur le protocole précédemment établi pour la mort cellulaire dans les CSs14).
    REMARQUE : Pour tester potentiellement d’autres agents qui peuvent se protéger contre la HF dans les CS, générer des solutions contenant dox + agent A, B, etc.
  3. Ajoutez 100 μL de solutions contenant du DOX et/ou d’autres agents à chaque puits. Les cultures de contrôle contiennent des supports sans dox.
  4. Plaque d’incubation de 18 h à 37 °C, 5 % de CO2.
  5. Le lendemain, recueillez les solutions de stock de reagent staining Live/Dead et laissez-les décongeler sur la glace dans l’obscurité dans une armoire de biosécurité.
  6. Préparer une solution contenant de la tache hoechst, 4 μM d’homodimer et 2 μM de calcéine-AM.
  7. Ajouter 100 μL de tache hoechst, calcéine-AM/ethidium homodimer solution dans chaque puits.
  8. Mesurer la fluorescence dans chaque puits à 645 nm pour l’homodimer et à 530 nm pour la calcéine-AM, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaque multimode.
  9. Transférer les mesures de fluorescence dans Graphpad PRISM (ou un logiciel équivalent pour l’analyse statistique).
  10. Utilisez le logiciel GraphPad Prism pour l’analyse des données et les statistiques.
  11. Pour un contrôle de la qualité, vérifiez au microscope épifluorescence si les noyaux sont contaminés, ainsi que la calcéine-AM et l’homodimer d’éthidium.

7.CS de fonction contractile

  1. Recueillir la microplaque préparée à l’étape 5.8.
  2. Allumez l’ordinateur contenant le logiciel IonOptix pour une détection de bord basée sur la vidéo, l’interface d’assistance à la fluorescence et le stimulateur de champ MyoPacer.
  3. Placez un nouveau bordereau de couverture sur la plate-forme du porte-tissus et assemblez le bain d’eau à l’aide d’électrodes.
  4. Recueillir délicatement les CS des gels de collagène à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL coupée à 0,5 mm du bord et les transférer dans un tube à faucon. Ajouter des supports sur CS pour éviter le séchage des CS. Transférer CS (un à la fois) avec quelques μL de supports sur la scène du système IonOptix.
  5. Sélectionnez le CS à analyser via le réglage des pics sur le côté gauche et droit de CS à l’aide du logiciel IonOptix.
  6. Utilisez l’analyseur de mouvement informatiste pour suivre le mouvement des bords CS.
    REMARQUE : Normalement, la contractilité est mesurée en % de raccourcissement cellulaire ou en % de raccourcissement fractionnel. Dans ce cas, nous avons mesuré le shortening de sphéroïde de %.
  7. Stabilisez les deux pics en ajustant les options de seuil et de bord de l’ordinateur.
  8. Exposez les CS à différentes fréquences (0,3, 0,6, 1, 2 et 3 Hz) et aux tensions (1, 2, 3 et 5 V) à l’aide du stimulateur de champ Myopacer.
  9. Enregistrer le raccourcissement sphéroïde à mesure que la longueur du CS change de CS traité par DOX et non traité. Analyser les données à l’aide du logiciel Soft-Edge et faire la moyenne pour chaque CS.

8. Microscopie des CS : fixation et immunolabeling

  1. Recueillir la plaque de puits 96 après 30 min (tel que préparé à l’étape 5.8) et fixer les CS en paraformaldéhyde de 4% (PFA) pendant 1 h à température ambiante.
  2. Retirer la PFA et rincer trois fois avec du PBS contenant 0,01 % d’azide de sodium (PBSA).
  3. Retirez PBSA.
  4. Ajouter 200 μL de PBSA contenant 0,02% de Triton-X-100 à chaque puits pendant 30 min sur un shaker.
    REMARQUE : Cette étape perméabilise les CS pour une meilleure infiltration d’anticorps.
  5. Ajouter 200 μL d’albumine de sérum bovin à 3 % dans la solution PBSA pendant 60 min à température ambiante.
    REMARQUE : Cette étape bloque la liaison anticorps non spécifique dans les CS.
  6. Préparer une solution contenant 10 μg/mL d’anticorps anti-humains primaires de souris contre le CD31 dilué dans la solution de blocage.
  7. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps primaires à chaque puits et incuber toute la nuit à 4 °C sur un shaker.
  8. Rincer la plaque trois fois avec PBSA pendant 20 min à température ambiante sur une plaque à bascule.
  9. Préparer une solution contenant la tache d’ADN hoechst et 10 μg/mL d’anticorps anti-souris secondaire conjugué Cy3 dilué dans la solution de blocage.
  10. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps secondaire contenant de la tache hoechst à chaque puits et incuber toute la nuit à 4 °C sur un shaker.
    REMARQUE : Couvrir la plaque de papier d’aluminium à partir de ce moment.
  11. Rincer la plaque trois fois pendant 20 min avec du PBSA à température ambiante sur une plaque à bascule.
  12. Ajouter 100 μL de vectashield moyen de montage à chaque puits.
  13. CSs d’image sous un microscope confocal de balayage de laser. Effectuez des sections optiques le long de l’axe Z et effondrez des images en un seul plan focal à l’aide du logiciel ImageJ.

Representative Results

Le protocole décrit dans ce manuscrit représente une approche alternative pour développer un réseau complexe de cellules endothéliales cardiaques dans un tissu cardiaque bioingénieuré avec une meilleure viabilité et fonction cellulaires par rapport aux modèles existants (figure 1). La récapitulation du microenvironnement cardiaque in vivo 3D chez les CS a favorisé leur réponse au DOX à la concentration trouvée dans le sang des patients atteints de cancer (entre 5 et 10 μM, figure 2). Les SC traités par DOX ont présenté une réduction statistiquement significative de la viabilité cellulaire par rapport aux SC témoins (sans DOX) dans les 24 h (figure 2), un effet toxique qui est observé chez les patients atteints de cancer humain, même 17 ans après leur traitement avec le médicament.

Figure 1
Figure 1. Analyse de formation et de vascularisation de CS. (A) Protocole montrant les étapes pour la formation d’un CS de la co-culture des iMC, HCAECs et HCFs dans les gouttes suspendues. Les images de Brightfield sur le côté droit montrent la formation sphéroïde progressive des cellules simples dans les gouttes suspendues. (B) S’est effondré Z-piles d’images confocales d’un CS taché d’anticorps contre la troponine cardiaque T (cTNT), PECAM et vimentine, souindre les myocytes cardiaques, les cellules endothéliales et les fibroblastes, respectivement. Ce chiffre a été modifié à partirde 14. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Viabilité et toxicité dans les CS. Analyses statistiques de la fluorescence calcéine-AM(A)et ethidium homodimer(B)des CS traités en présence de médias seulement (DOX 0 μM) ou de doxorubicine (10 μM). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Sur le plan du développement, une formation adéquate du réseau vasculaire est essentielle pour la génération de tissus fonctionnels, y comprisle cœur humain 10,12,23,24,25,26. La prise en compte de la vascularisation appropriée des tissus 3D permet l’échange d’oxygène, de facteurs de croissance, de molécules de signalisation et de nutriments, empêchant le développement de nécrose cellulaire dans tout tissu plus épais que 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Les modèles cardiaques 3D in vitro actuellement disponibles qui présentent un réseau vasculaire présentent principalement des réseaux vasculaires capillaires et désorganisés et n’ont pas la vascularisation ramicale complexe hiérarchique observée in vivo6,8,29. L’approche alternative pour développer le réseau complexe de cellules endothéliales cardiaques décrite dans ce manuscrit présente une meilleure viabilité et fonction cellulaires par rapport aux modèles existants (figure 1)14,22. Les CS in vitro 3D modélisent le cœur humain en récapitulant mieux son microenvironnement in vivo, y compris ses composants moléculaires, cellulaires et extracellulaires14,22. La génération de CS à partir de cellules souches dérivées des gouttes suspendues permet à leurs cultures dans des conditions définies (p. ex., types et ratios cellulaires, formation appropriée de tissus). Les co-cultures d’iMC ainsi que les HCF et les HCAECs au sein des CSC définissent la tige croisée moléculaire et cellulaire qui régule la pathophysiologie cardiaque, y compris sa fonction contractile et sa réponse aux médicaments à des concentrations trouvées dans le sang du patient14. En raison de ces dispositifs uniques, des CS ont été utilisés pour modéliser la fibrose cardiaque, une conséquence grave de l’infarctus du myocarde et del’arrêt du coeur 21. Nos études précédentes ont montré comment la présence des cellules endothéliales et des fibroblastes est critique pour la récapitulation du microenvironnement vasculaire dans le cœur humain, permettant le dépôt optimal des protéines ECM dérivées du fibroblaste, telles que la laminine, la fibronectine et le collagène de type IV, localisées à proximité d’un réseau cellulaire endothélialen développement 14,21.

Dox est un médicament cardiotoxique bien connu qui peut développer une insuffisance cardiaque chez les patients atteints de cancer, même 17 ans après leur traitement30. Néanmoins, il reste un médicament de choix pour le traitement de la leucémie et du lymphome chez les patientes pédiatriques et le cancer du sein chez lesfemmes de 30 ans. Le traitement dox dans les CS a ensuite été employé pour modéliser l’insuffisance cardiaque (HF) in vitro pour étudier les mécanismes régulant la toxicité dans les myocytes cardiaques, les cellules endothéliales et les fibroblastes14 et pour modéliser la fibrose cardiaqueHF-induite 21. La viabilité cellulaire a été statistiquement réduite chez les CS traités par DOX dans les 24 h lorsqu’ils sont exposés au médicament à la concentration trouvée dans le sang des patients atteints de cancer (entre 5 et 10 μM)14 (figure 2). Des études antérieures dans notre laboratoire ont également démontré les effets toxiques du DOX sur les cellules endothéliales cardiaques et les fibroblastes par l’intermédiaire de synthase endothéliale d’oxyde nitrique (eNOS) utilisant des inhibiteurs génétiques et chimiques de cette voie de signalisation14. L’utilisation d’antagonistes génétiques (NOS3 shRNA) et chimiques (N5-(1-iminoethyl)-L-ornithine, dihydrochlorride, ou L-NIO) de la voie de signalisation eNOS comme cible en aval de DOX a empêché ses effets toxiques dans les cellules endothéliales cardiaques et les fibroblastes14.

L’activité contractile au sein des CS a également été mesurée grâce au couplage électrique des cellules cardiaques lorsqu’elles sont exposées à une stimulation potentielle sur le terrain. Nous avons constaté que les SS cultivés avec des supports de contrôle (DOX 0 μM) se contractent spontanément et homogénéement à un rythme de battement qui peut être suivi par la stimulation de champ dans un délai de 1 et 3 Hz, comparable à un coeur humain sain. D’autre part, les CS traités par DOX ne suivent pas la stimulation électrique car ils ne peuvent pas se contracter. Avec les mesures de la viabilité et de la toxicité cellulaires à l’aide de calcéine-AM et d’homodimer d’éthidium, cet essai fonctionnel pour la fonction contractile de CS permettent l’évaluation du scénario complexe typique du coeur humain in vitro, actuellement non réalisable avec d’autres modèles. Par rapport aux mesures d’activité contractile des cellules cardiaques individuelles utilisant le même système, nous ne sommes pas en mesure de visualiser et de mesurer le sarcome dans les SS. Par conséquent, nous sommes limités à des mesures de % de raccourcissement sphéroïde au fil du temps, un test que nous avons dû développer au sein de notre laboratoire. Comme nous contrôlons le nombre de cellules, nous co-culture dans chaque CS et donc la taille de chaque CS, nous utilisons des CS de taille similaire qui présentent en effet une fonction contractile homogène. Cependant, même dans le cas où nous avons généré des CS de différentes tailles, leur activité contractile n’a pas changé.

Il est également important de signaler que la nature multicellulaire des CS les rend suffisamment lourds pour être localisés au bas du coverslip du système Ion-Optix, même au cas où ils sont superfusés. Compte tenu du fait que les CS sont assis seuls dans une position spécifique, nous n’avons pas besoin de les faire adhérer à la couverture, au contraire de ce qui est couramment fait avec des cellules cardiaques simples dans la plupart des laboratoires.

L’analyse microscopique des CS tachés d’anticorps contre la troponine cardiaque T, CD31/PECAM et PECAM (comme marqueurs pour les iMC, les HCAECs et les HCF, respectivement) a montré la formation d’un réseau cellulaire endothélial(figure 1, bleu). Pour exclure complètement la nécrose dans la partie interne des CS, l’évaluation spatiale de la viabilité cellulaire a été effectuée dans notre laboratoire par l’analyse confoccale des CS tachés de calcéine-AM/ethidium homodimer(données non montrées). Cependant, il est important de reconnaître que les développements futurs dans le domaine de la biofabrication pour mieux récapituler d’autres caractéristiques complexes typiques du cœur humain in vivo, actuellement non disponibles dans le modèle existant. Il s’agit notamment de: i) fonction contractile typique des cardiomyocytes adultes; ii) la circulation sanguine et les forces de pression; iii) signalisation paracrine; iv) la réponse immunitaire, qui sera essentielle pour améliorer ceci et d’autres modèles cardiaques in vitro6. Comme tout autre modèle vise à récapituler les principales caractéristiques d’un tissu sain ou d’un état de maladie, le protocole pour la génération et l’utilisation de CS décrit dans ce manuscrit vise à aider le chercheur à répondre à des questions spécifiques, qui peuvent ne pas être exhaustives en utilisant cette approche. Par exemple, l’utilisation potentielle de cellules dérivées du patient pour la génération de CS fournirait des outils pour la médecine personnalisée, actuellement non disponible en utilisant des analyses à haut débit couramment disponibles pour la recherche cardiovasculaire.

En conclusion, nous avons démontré un moyen simple de mieux récapituler le microenvironnement cardiaque humain à l’aide de cellules cardiaques. Les sphéroïdes cardiaques présentent un réseau cellulaire endothélial qui récapitule mieux celui présent dans le cœur humain par rapport aux cultures monocouceuses des cellules cardiaques. Compte tenu de leurs caractéristiques uniques, ils représentent des outils avancés pour le dépistage in vitro de la recherche cardiovasculaire. De futures études utilisant des cellules dérivées du patient pourraient offrir des options pour la médecine personnalisée et de nouvelles thérapies pour prévenir et mieux traiter les maladies cardiovasculaires.

Disclosures

Aucun

Acknowledgments

Un grand merci à Nat Johnston pour l’enregistrement et le montage de la vidéo.

Poonam Sharma a reçu le soutien de l’Université de Newcastle avec des bourses de l’UNIPRS et de l’UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050). Carmine Gentile a reçu l’appui d’un financement de démarrage de l’UTS, d’une subvention catholique de l’archidiocèse de Sydney pour la recherche sur les cellules souches adultes et d’une subvention de recherche en chirurgie cardiothoracique de la Sydney Medical School Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A1933
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies Jackson Immunological Research Labs, Inc. 715-165-150 Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody
Doxorubicin hydrochloride Sigma-Aldrich D1515
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG From Bovine Plasma
Human cardiac fibroblasts (HCFs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 306AK-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 300K-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF Growth medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 316-500
Human MesoEndo Cell Growth Medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA L3224
Maintenance Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM BD Pharmingen, San Diego, CA, USA 566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA R37605
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Plating Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Rat Tail Collagen Sigma-Aldrich C3867
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Trypsin–EDTA, 0.25% Gibco, Thermofisher Scientific 25200072
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher Scientific 15250061
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Tissue culture flasks (T25) Thermofisher Scientific 156367
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Corning, New York, USA 3603
384-Well Hanging Drop Plate 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA HDP1385

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References

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Sphéroïdes cardiaques comme tissus cardiaques bioingénieurs in vitro pour étudier la pathophysiologie cardiaque humaine
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Sharma, P., Gentile, C. Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology. J. Vis. Exp. (167), e61962, doi:10.3791/61962 (2021).

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