Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Cardiac Sfæroider som in vitro Bioengineered hjertevæv at studere Human Heart Patofysiologi

Published: January 23, 2021 doi: 10.3791/61962
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,3,4
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

Summary

Denne protokol har til formål at fremstille 3D hjerte sfæroider (CSs) ved co-dyrkning celler i hængende dråber. Kollagen-indlejrede CS'er behandles med doxorubicin (DOX, et kardiotoksisk middel) ved fysiologiske koncentrationer for at modellere hjertesvigt. In vitro-test ved hjælp af DOX-behandlede CS'er kan anvendes til at identificere nye behandlinger for hjertesvigt patienter.

Abstract

På trods af adskillige fremskridt inden for hjertevævsteknik er en af de største udfordringer at overvinde fortsat generationen af et fuldt funktionelt vaskulært netværk, der omfatter flere niveauer af kompleksitet for at give ilt og næringsstoffer i bioengineered hjertevæv. Vores laboratorium har udviklet en tre-dimensionel in vitro model af det menneskelige hjerte, kendt som "hjerte sfæroide" eller "CS". Dette præsenterer biokemiske, fysiologiske og farmakologiske træk typisk for det menneskelige hjerte og genereres ved co-culturing sine tre store celletyper, såsom hjerte myocytter, endotelceller, og fibroblaster. Humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller ICMs) er co-kulturperler ved nøgletal, der tilnærmer dem, der findes in vivo med humane hjertefiberblaster (HCF'er) og humane koronararterieceller (HCAEC) i hængende dråbekulturplader i tre til fire dage. Den konfokale analyse af CSs farves med antistoffer mod hjerte Troponin T, CD31 og vimentin (markører for hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis) viser, at CSs præsentere en kompleks endotel celle netværk, der ligner den indfødte findes i det menneskelige hjerte. Dette bekræftes af 3D-gengivelsesanalysen af disse konfokale billeder. CSs også præsentere ekstracellulære matrix (ECM) proteiner typisk for det menneskelige hjerte, såsom kollagen type IV, laminin og fibronectin. Endelig, CSs præsentere en kontraktile aktivitet målt som syncytial kontraktilitet tættere på den ene typisk for det menneskelige hjerte i forhold til CSs, der indeholder iCMs kun. Når det behandles med et kardiotoksisk anti-cancer-middel, såsom doxorubicin (DOX, anvendes til behandling af leukæmi, lymfom og brystkræft), er levedygtigheden af DOX-behandlede CS'er væsentligt reduceret ved 10 μM genetisk og kemisk hæmning af endotelnitriske oxidsyntase, et nedstrøms mål for DOX i HCF'er og HCAECs, reduceret sin toksicitet i CSs. I betragtning af disse unikke funktioner, er CSs i øjeblikket bruges som in vitro modeller til at studere hjerte biokemi, patofysiologi, og farmakologi.

Introduction

Det menneskelige hjerte har en begrænset regenerativ kapacitet, mens hjerte-kar-sygdom (CVD) fortsat er den vigtigste dødsårsag på verdensplan på trods af de seneste fremskridt inden for vævsteknik og stamcelleteknologier1. Behovet for nye terapeutiske herunder molekylære og cellulære tilgange til enten at reparere et beskadiget hjerte eller for at forhindre et hjerte i at mislykkes, er en af de vigtigste aktuelle kliniske behov forpatienter,der lider afhjertesygdomme 2,3,4. Hovedformålet med hjertevæv engineering er at fremstille en tre-dimensionel (3D) hjertevæv, der præsenterer molekylære, cellulære og ekstracellulære funktioner typisk for et menneskeligt hjerte, herunder dens vaskulære netværk og fysiologiske kontraktilefunktion 4,5,6.

For at bioengineer og fremstille en funktionel human hjertevæv, der efterligner det menneskelige hjerte for in vitro og in vivo applikationer, flere tilgange er blevet undersøgt, herunder manipuleret hjerte væv (EHTs), celleark og sfæroide kulturer7,8. Men disse væv mislykkes ved at opsummere den optimale 3D mikromiljø typisk for det menneskelige hjerte og deres potentielle anvendelse for CVD patienter kan ikke direkte oversætte fra bænken til sengen7. Dette skyldes, at de ikke opsummere den komplekse biologi, morfologi, og fysiologi in vivo hjerte væv9. En af de største udfordringer i hjertevæv engineering omfatter udvikling af et hierarkisk vaskulært netværk inden for bioengineered hjertevæv, som ethvert væv, der er større end 200 μm i diameter udvikler celledød i midten2,10. En korrekt dannet vaskulære netværk i et humant hjerte væv spiller en stor rolle for levering af blod, ilt og næringsstoffer til hjerteceller11. Under embryonal udvikling dannes koronarkapiller og arterier via vaskculogenese (de novo blodkardannelse) og angiogenese (generering af blodkar fra allerede eksisterende) fra endotelædecelleceller8,12. Hjertefibroblaster spiller også en stor rolle i korrekt vaskulær netværksdannelse ved at give den optimale ekstracellulære matrix (ECM) ogvækstsammensætning 13,14.

3D-vaskulære netværk af bioengineered hjertevæv styrer cellernes overlevelse og funktion ved at skabe ilt- og næringsstofgradienter og parakriminel signalering, såsom homotypiccelleinteraktion, heterotypcelleinteraktion, interaktion mellem celler gennem udskillede opløselige proteiner og celler til ECM-interaktioner3,10,15,16,17,18. Dette forhindrer celledød midt i vævet og fremmer cellernes levedygtighed og fysiologiske funktion i bioengineered hjertevæv16,18,19.

Sfæroide kulturer fra stamceller er for nylig blevet udforsket som in vitro modeller af det menneskelige hjerte20. For yderligere at forbedre hjertetmikromiljø in vitro, har de inkluderet brugen af alle de vigtigste celletyper findes i det menneskelige hjerte, såsom hjerte myocytter, endotelceller, og fibroblaster. Sfæriske kulturer præsentere den nødvendige 3D strukturelle støtte til celler til at vokse og funktion og kan bruges til bioengineer et vaskulært netværk14,20,21,22. I denne sammenhæng har vores laboratorium udviklet menneskelige hjerte sfæroider (CSs) ved co-culturing hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster på nøgletal findes i det menneskelige hjerte14. Denne model er en udvidelse af rotte ventrikulære hjerteceller sfæriske model, genereret af co-culturing hjerteceller i hængende drop kulturer, der anvendes til at modellere hjertefibrose21. Humane CSs kan bruges som toksicitet analyser ved at behandle dem doxorubicin (DOX, en anti-cancer agent, der anvendes til behandling af leukæmi, lymfom og brystkræft), som er velkendt for at fremkalde hjertefibrose og hjertesvigt (HF) selv 17 år efter sin somministration14.

I dette manuskript beskriver vi, hvordan man genererer menneskelige CS'er ved at co-dyrke humane inducerede pluripotente stamceller afledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller ICMs), humane hjertefiberblaster (HCF'er) og humane koronararterie endotelceller (HCAECs) i hængende drop kulturer. For at bruge og billede CSs til in vitro test, er de indlejret i en kollagen gel. Den konfokale analyse af CS'er, der er besynet med antistoffer mod CD31, en markør for endotelceller, viste, at disse celler danner et netværk svarende til det, der blev observeret in vivo. For at fremkalde HF og potentielt teste nye midler, der kan behandle eller forhindre det, blev CS'er behandlet med 10 μM DOX (en koncentration fundet i blodbanen hos kræftpatienter, der fik lægemidlet). Når plettet med calcein-AM og ethidium homodimer (farvning levende og døde celler, henholdsvis), DOX-behandlede CSs udgør et betydeligt fald i levedygtigheden i forhold til CSs, der ikke fik stoffet. CS'er præsenterer også en homogen kontraktileaktivitet, når de er i gang med at anvende potentiel stimulering i marken mellem 1 og 3 Hz.

Protocol

BEMÆRK: HiPSC-CMs, der bruges til denne protokol, er kommercielt tilgængelige. Søg venligst godkendelse af den institutionelle menneskelige etiske komité, før du påbegynder dette arbejde, hvis det er nødvendigt.

1. Human hjertefiberblæst og endotelcellekultur plating og vækst

  1. Tø kryoovialer indeholdende HCF'er og HCAECs i et vandbad ved 37 °C i et minut.
  2. Flyt kryofyr under en steril laminar flow biosikkerhed kabinet klasse 2.
  3. Opsaml 1 ml cellesuspension fra kryobriterne ved hjælp af en 1000 μL pipettespids og tilsættes i et 15 ml rør, der indeholder 7 ml humant hjertefibroblastmedium til HCF'er og 7 ml Human Meso Endo Growth Medium til HCAECs.
    BEMÆRK: For at indsamle størstedelen af cellerne fra hvert kryovialt skylles de to gange med 1 ml kulturmedium fra det samme 15 ml rør.
  4. Bland forsigtigt cellesuspensioner.
  5. Overfør cellesuspensioner til separate T75-kulds kolber ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette.
  6. Inkuber celler ved 37 °C med 5% CO2.
  7. Efter 18 timer aspirere mediet fra begge dyringskolber og skyl dem én gang med sterilt fosfatbufferetalal (PBS) for at fjerne frysende medium og døde celler.
  8. PBS erstattes med 7 ml passende kulturmedium til hver kuldekolbe og inkuberes ved 37 °C.
  9. Undersøg cellulære ekspansion og levedygtighed regelmæssigt og erstatte medier hver anden dag, indtil cellerne nå 80-90% sammenløb.

2. iCM kultur plettering og vækst

  1. Forlak to T25-kulds kolber med 2 ml PBS indeholdende 40 μg/ml fibronectin (FN) og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i mindst 4 timer.
  2. Efter 4 timer opsaml et kryovialt indhold, der indeholder iCMs, og det i et vandbad skal sættes i et vandbad ved 37 °C i 4 min.
  3. Flyt kryovialen under en steril laminar flow biosikkerhed kabinet klasse 2.
  4. Overfør forsigtigt iCMs fra kryovial til et sterilt 50 ml centrifugerør ved hjælp af en 1 ml pipettespids.
  5. Skyl de tomme iCMs cryovial med 1 ml rumtemperatur plating medium for at inddrive eventuelle resterende celler. Overfør 1 ml plating medium skyl fra cryovial drop-wise over 90 sek til 50 ml centrifuge rør, der indeholder iCM celle suspension.
    BEMÆRK: Svir forsigtigt røret, mens mediet tilsættes for at blande opløsningen helt og for at mindske det osmotiske stød på de optøede celler.
  6. Tilsæt langsomt 8 ml rumtemperatur Plating Medium til 50 ml centrifugerøret. Tilsæt de første 1 ml dropwise over 30 - 60 s. Tilføj derefter den resterende diskenhed i løbet af de næste 30 sekunder. Drej forsigtigt centrifugerøret, mens platingmediet tilsættes. Bland forsigtigt indholdet af 50 ml centrifugerøret ved at vende 2 - 3 gange (undgå kraftig omrystning eller vortexing).
  7. Udfør straks celletællingen ved hjælp af et hæmocytometer, og bestemme den levedygtige celletæthed (i celler/ml).
  8. Tag de FN-forbelagte T25-kolber og indsugning af FN-PBS-opløsningen uden at lade kolberne tørre. Til dette tilsættes såvolumen af iCM'er (1,6 x 106 levedygtige iCM'er i 8 ml rumtemperaturblægningsmedium).
  9. Kultur-iCM'er i inkubatoren i 48 timer ved 37 °C, 5% CO2.
  10. Opød vedligeholdelsesmediet natten over ved 4 °C om dagen før brug.
  11. Ligevægt vedligeholdelsesmediet i et 37 °C vandbad og skal straks anvendes.
  12. Efter 2 dage flyttes iCMs T25-kolberne under biosikkerhedsskabet.
  13. Vask forsigtigt døde celler og snavs ved forsigtigt at pipettere Plating Medium op og ned 5 gange.
  14. Indsugning af Plating Medium og udskift med 8 ml forvarmt vedligeholdelsesmedium. T25-kolberne anbringes tilbage i inkubatoren. Udskift vedligeholdelsesmediet hver anden dag, og undersøg sammenløbet regelmæssigt.

3. Celleisolering og optælling

  1. Start med at indsamle først HCAECs og HCF'er, og derefter iCMs ved at følge trin 3.2-3.12.
  2. Forbered CS kultur medium ved at blande 10 ml iCMs Vedligeholdelse Medium, 5 ml humant hjertefiberblæst Medium og 5 ml Meso Endo Vækst Medium.
  3. Der fjernes kulærium fra hver vævskolbe, der indeholder HCFC'er og HCAECs, og skyl én gang med 5 ml PBS til T75-kolber. Fjern PBS.
  4. Der tilsættes 5 ml 0,25 % trypsin EDTA-opløsning til hver T75-kolbe og inkuberes i 5 min. ved 37 °C, 5 % CO2.
  5. Når cellerne løsnes, neutraliseres trypsin EDTA-opløsningen med 5 ml kulturmedium.
  6. Overfør cellesuspensioner til et 15 ml rør og centrifugeceller ved 300 x g i 4 min.
  7. Fjern supernatanten forsigtigt fra hvert rør. Tilføj 1 ml CS medium til hver celle pellet og resuspend dem. Hold røret på is og tælle celler ved hjælp af Trypan Blue og et hæmocytometer.
  8. Fjern Vedligeholdelse Medium fra væv kolber, der indeholder iCMs og skyl én gang med 3 ml PBS.
  9. Der tilsættes 1 ml 0,25 % trypsin EDTA-opløsning til hver T75-kolbe og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2. Kontroller cellerne hvert minut, indtil de er afmonteret.
  10. Når cellerne løsnes, neutraliseres trypsin EDTA-opløsningen med 4 ml kulturmedium.
  11. Overfør cellesuspensioner til et 15 ml rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
  12. Fjern supernatanten forsigtigt fra hvert rør. Tilsæt 1 ml kulturmedium til cellepellet og opslæmp den igen. Hold røret på is og tælle celler ved hjælp af Trypan Blue og et hæmocytometer.

4.CS produktion og vækst

  1. Bland iCMs, HCF'er og HCAECs i forholdet 2:1:1 ved plating 10.000 ICMs, 5.000 HCF'er og 5.000 HCAECs pr hængende dråbekultur, der indeholder 20 μL CS medium. Juster til det endelige volumen for det samlede antal CS'er.
  2. Pipette 20 μL cellesuspension i hver brønd af 384 brønden HDC plade enten manuelt eller ved hjælp af en robot multikanal pipette til automatiseret væskehåndtering.
  3. Pipette 1,5 ml steril PBS i hver side af kanalen omkring hængende dråbeplade for at forhindre udtørring af CSs. Inkuber HDC-plade ved 37 °C.
  4. Undersøg dannelsen af CSs på daglig basis, indtil en fuldt dannet sfæroid er observeret i de fleste brønde. Tilsæt 7,5 μL CS medium til hver brønd hver anden dag, indtil en CS er dannet.

5.CS indlejring i kollagen geler

  1. Opsaml CS'er med en 1 ml pipettespids.
    BEMÆRK: Det er nødvendigt at skære spidsen af pipetten omkring 0,2 cm fra kanten, før den anvendes med en steril skarp overflade (enten en skalpel eller en saks) for at forhindre eventuelle skader gel indlejret sfæroider under deres indsamling.
  2. Cs-affjedringen opsamler i et 50 ml rør på is.
  3. Centrifuge røret ved 300 x g i 5 min.
    BEMÆRK: Den opnåede pellet skal opbevares på is, indtil den tages i brug.
  4. Forbered en kollagen gel opløsning (100 μL / godt for 30 brønde af 96 godt plade) på is ved hjælp af rotte hale kollagen og CS medium i en 3:7 forholdet.
  5. Fjern supernatanten fra røret, der indeholder CS'er.
  6. Bland de pelleterede CS'er i kollagengelopløsningen.
  7. Der tilsættes 1 μL/ml 5 mM natriumhydroxid til CS-kollagengelaffjedringen, og bland forsigtigt.
  8. Overfør 100 μL CS-kollagengel til en klar flad bund på 96 godt sort polystyrenmikroplade og inkuberes ved 37 °C i 30 min.

6. Målinger af levedygtighed og toksicitet af DOX-behandlede CS'er

  1. Efter 30 min indsamle 96 godt plade fra inkubator
  2. Der klargør en 10 μM DOX (baseret på tidligere fastlagt protokol for celledød i CSs14).
    BEMÆRK: For potentielt at teste andre midler, der kan beskytte mod HF i CS'er, skal du generere løsninger, der indeholder DOX + Agent A, B osv.
  3. Der tilsættes 100 μL opløsninger, der indeholder DOX og/eller andre agenser, til hver brønd. Kontrolkulturer indeholder medier uden DOX.
  4. Inkuber plade i 18 timer ved 37 °C, 5% CO2.
  5. Den følgende dag indsamles live/dødsfarvningsgenoperens reagensstrømløsninger, og lad dem tø op på is i mørke i et biosikkerhedsskab.
  6. Der klargøres en opløsning indeholdende Hoechst-plet, 4 μM ethidiumhomdimer og 2 μM calcein-AM.
  7. Der tilsættes 100 μL Hoechst-plet, calcein-AM/ethidium homodimeropløsning i hver brønd.
  8. Fluorescensen måles i hver brønd ved 645 nm for ethidiumhomdimer og ved henholdsvis 530 nm for calcein-AM ved hjælp af multimodemikropladelæser.
  9. Overfør fluorescensmålinger til Graphpad PRISM (eller en tilsvarende software til statistisk analyse).
  10. Brug GraphPad Prism-software til dataanalyse og statistik.
  11. For kvalitetskontrol, kontrollere under en epifluorescens mikroskop for kerner farvning, sammen med calcein-AM og ethidium homodimer.

7.CS kontraktile funktion evaluering

  1. Mikropladen opsamls som forberedt i trin 5.8.
  2. Tænd for computeren, der indeholder IonOptix-softwaren, til en videobaseret kantregistrering, Fluorescence Assistance Interface og MyoPacer Field Stimulator.
  3. Anslå en ny dæksel på vævsholderplatformen, og saml vandbadet sammen med elektroder.
  4. Forsigtigt indsamle CSs fra kollagen geler ved hjælp af en 1 ml pipette spids skåret 0,5 mm fra kanten og overføre dem til en falk rør. Tilføj medier på CS for at forhindre tørring af CSs. Transfer CS (en ad gangen) med et par μL medier på scenen af IonOptix-systemet.
  5. Vælg den CS, der skal analyseres via indstilling toppe på venstre og højre side af CS ved hjælp af IonOptix software.
  6. Brug den computerbaserede bevægelsesanalysator til at spore bevægelsen af CS-kanter.
    BEMÆRK: Normalt måles kontraktiliteten i enten % celleafkortning eller % fraktioneret afkortning. I dette tilfælde målte vi % spheroid afkortning.
  7. Stabilisere både toppe justere tærskel og kant muligheder fra computeren.
  8. Udsæt CS'er for forskellige frekvenser (0,3, 0,6, 1, 2 og 3 Hz) og spændinger (1, 2, 3 og 5 V) ved hjælp af Myopacer Field Stimulator.
  9. Optag sfæroid afkortning som CS længde ændringer af DOX-behandlede og ubehandlede CSs. Analysere data ved hjælp af Soft-Edge software og gennemsnit for hver CS.

8. Mikroskopi af CS'er: fiksering og immunmærkning

  1. Opsaml 96 brøndpladen efter 30 min (som forberedt i trin 5.8) og fastgør CS'er i 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved stuetemperatur.
  2. Fjern PFA og skyl tre gange med PBS indeholdende 0,01% natriumazid (PBSA).
  3. Fjern PBSA.
  4. Der tilsættes 200 μL PBSA indeholdende 0,02% Triton-X-100 til hver brønd i 30 min på en shaker.
    BEMÆRK: Dette trin permeabilizes CSs for bedre antistof infiltration.
  5. Der tilsættes 200 μL 3% kvægserumalbumin i PBSA-opløsning i 60 min ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Dette trin blokerer uspecifik antistofbinding i CS'er.
  6. Der klargøres en opløsning, der indeholder 10 μg/ml primære anti-humane antistoffer mod CD31, der fortyndes ved blokerende opløsning.
  7. Der tilsættes 100 μL primær antistofopløsning til hver brønd og inkuberes natten over ved 4 °C på en shaker.
  8. Skyl pladen tre gange med PBSA i 20 minutter ved stuetemperatur på en gyngeplade.
  9. Der klargøres en opløsning, der indeholder Hoechst DNA-pletten og 10 μg/ml Cy3-konjugeret sekundært æselantimusantistof fortyndet i blokerende opløsning.
  10. Der tilsættes 100 μL sekundær antistofopløsning, der indeholder Hoechst-pletten, til hver brønd og inkuberes natten over ved 4 °C på en shaker.
    BEMÆRK: Dæk pladen med aluminiumsfolie fra dette punkt og fremefter.
  11. Skyl pladen tre gange i 20 min. med PBSA ved stuetemperatur på en gyngeplade.
  12. Der tilsættes 100 μL Vectashield monteringsmedium til hver brønd.
  13. Billede CSs under en laser scanning konfokal mikroskop. Udfør optisk sektion langs Z-aksen, og skjul billeder i et enkelt brændpunkt ved hjælp af ImageJ-software.

Representative Results

Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, repræsenterer en alternativ metode til udvikling af komplekst hjerteendotelcellenetværk inden for et bioengineereret hjertevæv med forbedret celle levedygtighed og funktion sammenlignet med eksisterende modeller (Figur 1). Rekapitulationen af 3D in vivo hjertet mikromiljø i CSs fremmet deres reaktion på DOX ved koncentrationen findes i blodbanen af kræftpatienter (mellem 5 og 10 μM, Figur 2). DOX behandlede CS'er viste en statistisk signifikant reduktion i cellens levedygtighed sammenlignet med kontrol (ingen DOX) CS'er inden for 24 timer (figur 2), en toksisk virkning, der observeres hos kræftpatienter hos mennesker selv 17 år efter deres behandling med lægemidlet.

Figure 1
Figur 1. CS Dannelse og vaskulæreization Analyse. a) protokol, der viser trinene for dannelsen af en CS fra co-kultur af iCMs, HCAECs og HCF'er i hængende dråber. Brightfield billeder på højre side viser den progressive sfæroide formation fra enkelte celler i hængende dråber. (B)Kollapsede Z-stakke af konfokale billeder af en CS farves med antistoffer mod hjerteTroponin T (cTNT), PECAM og vimentin, farvning hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra14. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Levedygtighed og toksicitet i CS'er. Statistiske analyser af calcein-AM (A) og ethidiumhomormer (B) fluorescens af CS'er, der kun behandles ved tilstedeværelse af begge medier (DOX 0 μM) eller doxorubicin (10 μM). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Udviklingsmæssigt, korrekt vaskulære netværk dannelse er afgørende for dannelsen af funktionelle væv, herunder det menneskelige hjerte10,12,23,24,25,26. Hensyntagen til korrekt vaskularisering af 3D-væv gør det muligt at udveksle ilt, vækstfaktorer, signalmolekyler og næringsstoffer, hvilket forhindrer udviklingen af cellenekrose i væv, der er tykkere end 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. I øjeblikket fås in vitro 3D hjerte modeller, der præsenterer en vaskulær netværk er primært præsenterer kapillær størrelse, uorganiserede vaskulære netværk og mangler hierarkiske komplekse forgrenede vaskularisering observeret in vivo6,8,29. Den alternative metode til udvikling af et komplekst hjerteendotelcellenetværk , der er beskrevet i dette manuskript , giver forbedret celle levedygtighed og funktion sammenlignet med eksisterende modeller (figur 1)14,22. 3D in vitro CSs modellerer det menneskelige hjerte ved bedre at opsummere dets in vivo mikromiljø, herunder dets molekylære, cellulære og ekstracellulærekomponenter 14,22. CS-generation fra stamceller-afledte celler i de hængende dråber tillader deres kulturer under definerede forhold (f.eks. celletyper og forhold, korrekt vævsdannelse). Co-kulturer af iCMs sammen med HCF'er og HCAECs inden for CSs definere molekylære og cellulære krydstale, der regulerer hjertet patofysiologi, herunder dens kontraktile funktion og reaktion på lægemidler i koncentrationer findes i patientens blodbanen14. På grund af disse unikke funktioner, CSs er blevet udnyttet til model hjertefibrose, en alvorlig konsekvens af myokardie infarkt og hjertesvigt21. Vores tidligere undersøgelser viste, hvordan tilstedeværelsen af både endotelceller og fibroblaster er afgørende for rekapitulation af det vaskulære mikromiljø i det menneskelige hjerte, så den optimale aflejring af fibroblast-afledte ECM-proteiner, såsom laminin, fibronectin og kollagen type IV, lokaliseret i nærheden af en udviklende endotelcellenetværk14,21.

DOX er et velkendt kardiotoksisk lægemiddel, der kan udvikle hjertesvigt hos kræftpatienter selv 17 år efter deres behandling30. Ikke desto mindre er det stadig et lægemiddel valg til behandling af leukæmi og lymfom hos pædiatriske patienter og brystkræft hos kvinder30. DOX-behandling i CS'er er derefter blevet brugt til at modellere hjertesvigt (HF) in vitro til at undersøge både de mekanismer, der regulerer toksiciteten i hjertemykumytter, endotelceller og fibroblaster14 og til model HF-induceret hjertefibrose21. Cellegennemsyrenheden blev statistisk reduceret i DOX-behandlede CS'er inden for 24 timer, når de blev eksponeret for lægemidlet ved den koncentration, der blev fundet i blodbanen hos kræftpatienter (mellem 5 og 10 μM)14 (Figur 2). Tidligere undersøgelser i vores laboratorium viste også de toksiske virkninger af DOX på både hjerte endotelceller og fibroblaster via endotelnitriske nitrogenoxidsyntase (eNOS) ved hjælp af både genetiske og kemiske hæmmere af denne signalvej14. Brugen af genetiske (NOS3 shRNA) og kemiske (N5-(1-iminoethyl)-L-ornithin, dihydrochlorid eller L-NIO) antagonister af eNOS-signalvejen som nedstrømsmål for DOX forhindrede dens toksiske virkninger i både hjerteendotelceller og fibroblaster14.

Kontraktile aktivitet inden for CS'er er også blevet målt takket være den elektriske kobling af hjerteceller, når de udsættes for felt potentiel stimulation. Vi fandt, at CSs dyrket med kontrolmedier (DOX 0 μM) kontrakt spontant og homogent med en slåhastighed, der kan tempoet ved feltstimulering inden for 1 og 3 Hz, sammenlignes med et sundt menneskeligt hjerte. På den anden side følger DOX-behandlede CS'er ikke den elektriske stimulering, da de ikke kan indgå kontrakter. Sammen med målinger af celle levedygtighed og toksicitet ved hjælp af calcein-AM og ethidium homodimer, denne funktionelle analyse for CS kontraktile funktion tillader evaluering af det komplekse scenario typisk for det menneskelige hjerte in vitro, i øjeblikket ikke opnåelige med andre modeller. Sammenlignet med kontraktile aktivitetsmålinger af enkelt hjerteceller ved hjælp af det samme system er vi ikke i stand til at visualisere og måle sarkom i CS'er. Derfor er vi begrænset til målinger af % sfæroid afkortning over tid, en analyse, vi var nødt til at udvikle inden for vores laboratorium. Da vi kontrollerer antallet af celler, vi co-kultur i hver CS og derfor størrelsen af hver CS, vi udnytter CSs med samme størrelse, der faktisk præsentere homogene kontraktile funktion. Men selv hvis vi genererede CSs af forskellige størrelser, deres kontraktile aktivitet ikke ændre sig.

Det er også vigtigt at rapportere, at den flercellede karakter af CSs gør dem tunge nok til at lokalisere i bunden af coverslip i Ion-Optix-systemet, selv hvis de er superfunderet. Baseret på det faktum, at CSs sidde af sig selv i en bestemt position, behøver vi ikke at gøre dem overholde dækslet, tværtimod, hvad der almindeligvis gøres med enkelt hjerteceller i de fleste laboratorier.

Den mikroskopiske analyse af CS'er, der er besinklet med antistoffer mod hjertetroponin T, CD31/PECAM og PECAM (som markører for henholdsvis ICM'er, HCAEC'er og HCF'er) viste dannelsen af et endotelcellenetværk (Figur 1, blå). For fuldt ud at udelukke nekrose i den indre del af CS'er blev rumlig vurdering af cellernes levedygtighed udført i vores laboratorium ved konfokal analyse af calcein-AM/ethidium homodimer farvede CS'er (data ikke vist). Det er imidlertid vigtigt at erkende, at den fremtidige udvikling på biofabrikationsområdet bedre kan opsummere andre komplekse træk, der er typiske for det menneskelige hjerte in vivo, som i øjeblikket ikke findes i den eksisterende model. Disse omfatter: i) kontraktile funktion typisk for voksne kardiomyocytter; ii) blodgennemstrømning og trykkræfter; iii) parakritiske signalering; iv) immunrespons, som vil være afgørende for at forbedre denne og andre in vitro hjertemodeller6. Som enhver anden model har til formål at opsummere de vigtigste træk ved enten et sundt væv eller en sygdom tilstand, protokollen for generering og brug af CS beskrevet i dette manuskript har til formål at hjælpe forskeren til at løse specifikke spørgsmål, der kan ikke være udtømmende ved hjælp af denne tilgang. For eksempel, den potentielle brug af patient-afledte celler til generering af CSs ville give værktøjer til personlig medicin, i øjeblikket ikke tilgængelig ved hjælp af almindeligt tilgængelige high-throughput assays for hjerte-kar-forskning.

Afslutningsvis viste vi en enkel måde at opsummere det menneskelige hjerte mikromiljø ved hjælp af hjerteceller. Cardiac sfæroider præsentere en endotel celle netværk, der bedre opsummerer den ene til stede i det menneskelige hjerte i forhold til monolag kulturer af hjerteceller. I betragtning af deres unikke funktioner, repræsenterer de avancerede værktøjer til in vitro-test for hjerte-kar-forskning. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af patient-afledte celler kunne give muligheder for personlig medicin og nye behandlingsformer til både at forebygge og bedre behandle hjerte-kar-sygdom.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

En særlig tak til Nat Johnston for optagelsen og redigering af videoen.

Poonam Sharma blev støttet af University of Newcastle med UNIPRS og UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) stipendier. Carmine Gentile blev støttet af en UTS Seed Funding, katolske ærkebispedømme i Sydney Grant for Adult Stem Cell Research og en Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A1933
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies Jackson Immunological Research Labs, Inc. 715-165-150 Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody
Doxorubicin hydrochloride Sigma-Aldrich D1515
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG From Bovine Plasma
Human cardiac fibroblasts (HCFs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 306AK-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 300K-05a 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF Growth medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 316-500
Human MesoEndo Cell Growth Medium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA 212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA L3224
Maintenance Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM BD Pharmingen, San Diego, CA, USA 566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA R37605
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Plating Medium (iCells) Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. R1057 iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Rat Tail Collagen Sigma-Aldrich C3867
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Trypsin–EDTA, 0.25% Gibco, Thermofisher Scientific 25200072
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher Scientific 15250061
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Tissue culture flasks (T25) Thermofisher Scientific 156367
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Corning, New York, USA 3603
384-Well Hanging Drop Plate 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA HDP1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538 (2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394 (2020).

Tags

Bioengineering Vaskulære hjerte sfæroider bioengineered hjerte væv vaskulærisering 3D co-kulturer stamceller kardiomyocytter fibroblaster endotelceller in vitro-test doxorubicin kardiotoksicitet.
Cardiac Sfæroider som in vitro Bioengineered hjertevæv at studere Human Heart Patofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac… More

Sharma, P., Gentile, C. Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology. J. Vis. Exp. (167), e61962, doi:10.3791/61962 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter