Summary
Detta protokoll syftar till att fabricera 3D hjärt sfäroider (CSs) genom co-culturing celler i hängande droppar. Kollagen-inbäddade CSs behandlas med doxorubicin (DOX, ett kardiotoxiskt medel) vid fysiologiska koncentrationer för att modellera hjärtsvikt. In vitro-testning med DOX-behandlade CSs kan användas för att identifiera nya terapier för hjärtsviktspatienter.
Abstract
Trots flera framsteg inom hjärtvävnadsteknik, är en av de största utmaningarna att övervinna fortfarande genereringen av ett fullt fungerande kärlnätverk bestående av flera nivåer av komplexitet för att ge syre och näringsämnen inom bioengineered hjärtvävnader. Vårt laboratorium har utvecklat en tredimensionell in vitro-modell av det mänskliga hjärtat, känd som "hjärt sfäroid" eller "CS". Detta presenterar biokemiska, fysiologiska och farmakologiska funktioner som är typiska för det mänskliga hjärtat och genereras genom co-culturing dess tre stora celltyper, såsom hjärt myocyter, endotelceller och fibroblaster. Mänskliga inducerad pluripotenta stamceller-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs eller ICMs) är co-odlade vid nyckeltal approximera de som finns i vivo med mänskliga hjärt fibroblaster (HCFs) och mänskliga födans gatan endotelceller (HCAECs) i hängande droppe kultur plattor för tre till fyra dagar. Den confocal analys av CSs färgas med antikroppar mot hjärt Troponin T, CD31 och vimentin (markörer för hjärt myocyter, endoteliala celler och fibroblaster, respektive) visar att CSs presentera en komplex endotel cell nätverk, som liknar den infödda som finns i det mänskliga hjärtat. Detta bekräftas av 3D-renderingsanalysen av dessa konfokala bilder. CSs också presentera extracellulära matris (ECM) proteiner som är typiska för det mänskliga hjärtat, såsom kollagen typ IV, laminin och fibronectin. Slutligen, CSs presentera en kontraktil verksamhet mätt som syncytial kontraktilitet närmare den som är typisk för det mänskliga hjärtat jämfört med CSs som innehåller ICMs bara. När behandlas med en kardiotoxisk anti-cancer agent, såsom doxorubicin (DOX, används för att behandla leukemi, lymfom och bröstcancer), livskraften hos DOX-behandlade CSs minskas avsevärt vid 10 μM genetiska och kemiska hämning av endothelial kväveoxid syntas, en nedströms mål för DOX i HCFs och HCAECs, minskade dess toxicitet i CSS. Med tanke på dessa unika egenskaper, CSs används för närvarande som in vitro-modeller för att studera hjärtat biokemi, patofysiologi, och farmakologi.
Introduction
Det mänskliga hjärtat har en begränsad regenerativ kapacitet medan hjärt-kärlsjukdom (CVD) fortfarande är den främsta dödsorsaken i hela världen trots de senaste framstegen inom vävnadsteknik och stamcellsteknik1. Behovet av nya therapeutics inklusive molekylära och cellulära metoder för att antingen reparera ett skadat hjärta eller för att förhindra ett hjärta från att misslyckas är en av de stora nuvarande kliniska behoven för patienter som lider av hjärtsjukdom2,3,4. Det huvudsakliga målet med hjärtvävnadsteknik är att fabricera en tredimensionell (3D) hjärtvävnad som presenterar molekylära, cellulära och extracellulära funktioner som är typiska för ett mänskligt hjärta, inklusive dess vaskulära nätverk och fysiologiska kontraktilafunktion 4,5,6.
För att bioengineer och fabricera en funktionell mänsklig hjärtvävnad som efterliknar det mänskliga hjärtat för in vitro- och in vivo-tillämpningar har flera tillvägagångssätt undersökts inklusive konstruerade hjärtvävnader (EHT), cellark och sfäroidkulturer7,8. Dessa vävnader misslyckas dock med att rekapitulera den optimala 3D-mikromiljö som är typisk för det mänskliga hjärtat och deras potentiella användning för CVD-patienter kan inte direkt översätta från bänken till sängkanten7. Detta beror på att de inte rekapitulera den komplexa biologi, morfologi, och fysiologi in vivohjärtvävnader 9. En av de stora utmaningarna inom hjärtvävnadsteknik innefattar utvecklingen av ett hierarkiskt kärlnätverk inom den biotekniska hjärtvävnaden, eftersom all vävnad som är större än 200 μm i diameter utvecklar celldöd i mitten2,10. En korrekt bildade vaskulära nätverk i en mänsklig hjärtvävnad spelar en stor roll för tillförsel av blod, syre och näringsämnen till hjärtceller11. Under embryonal utveckling bildas koronar kapillärer och artärer via vasculogenesis (de novo blodkärlsbildning) och angiogenes (generering av blodkärl från redan existerande) från endotel progenitorceller8,12. Hjärtfibroblast spelar också en stor roll i korrekt vaskulär nätverksbildning genom att tillhandahålla den optimala extracellulära matrisen (ECM) ochtillväxtsammansättning 13,14.
3D-vaskulär nätverk av bioengineered hjärtvävnader styr cellernas överlevnad och funktion genom att skapa syre och näringsämnen gradienter och paracrin signalering, såsom homotypisk cell interaktion, heterotypisk cell interaktion, interaktion av celler genom utsöndras lösliga proteiner och cell till ECM interaktioner3,10,15,16,17,18. Detta förhindrar celldöd i mitten av vävnaden och främjar cellernas livskraft och fysiologiska funktion i bioengineered hjärtvävnader16,18,19.
Sfäroidkulturer från stamceller har nyligen utforskats som in vitro-modeller av det mänskliga hjärtat20. För att ytterligare förbättra hjärtmikromiljö in vitro, de har inkluderat användningen av alla de viktigaste celltyper som finns i det mänskliga hjärtat, såsom hjärt myocyter, endotelceller, och fibroblaster. Sfäroidkulturer presenterar det nödvändiga 3D-strukturstödet för att celler ska växa och fungera och kan användas för att bioengineer ettkärlnätverk 14,20,21,22. I detta sammanhang har vårt laboratorium utvecklat mänskliga hjärt sfäroider (CSs) genom co-culturing hjärt myocyter, endotelceller och fibroblaster vid nyckeltal som finns i det mänskliga hjärtat14. Denna modell är en expansion av råttan ventrikulära hjärtceller sfäroid modell, som genereras av co-culturing hjärtceller i hängande droppe kulturer, som används för att modellera hjärt fibros21. Mänskliga CSs kan användas som toxicitet assays genom att behandla dem doxorubicin (DOX, en anti-cancer agent som används för att behandla leukemi, lymfom och bröstcancer), som är välkänt för att framkalla hjärtfibros och hjärtsvikt (HF) även 17 år efter dess somministration14.
I detta manuskript beskriver vi hur man genererar mänskliga CSs genom co-culturing mänskliga inducerad pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs eller ICMs), mänskliga hjärt fibroblaster (HCFs) och mänskliga födans gatan endotelceller (HCAECs) i hängande droppe kulturer. För att kunna använda och avbilda CSs för in vitro-testning är de inbäddade i en kollagengel. Konfokal analys av CSs färgas med antikroppar mot CD31, en markör för endotelceller, visade att dessa celler bildar ett nätverk som liknar den som observerats in vivo. För att inducera HF och potentiellt testa nya medel som kan behandla eller förhindra det, behandlades CSs med 10 μM DOX (en koncentration som finns i blodomloppet hos cancerpatienter som fick läkemedlet). När färgas med calcein-AM och ethidium homodimer (färgning levande och döda celler, respektive), DOX-behandlade CSs presentera en betydande minskning av lönsamheten i jämförelse med CSs som inte fick drogen. CSs också presentera en homogen kontraktil verksamhet när paced med hjälp av fältet potential stimulering mellan 1 och 3 Hz.
Protocol
OBS: hiPSC-CMs som används för detta protokoll är kommersiellt tillgängliga. Vänligen sök institutionella mänskliga etiska kommitté godkännande innan detta arbete om det behövs.
1. Humant hjärtfibroblast och endotelcellskultur plätering och tillväxt
- Tina cryovials som innehåller HCFs och HCAECs i ett vattenbad vid 37 °C i en minut.
- Flytta cryovials under en steril laminär flöde biosäkerhet skåp klass 2.
- Samla 1 mL cell suspension från cryovials med hjälp av en 1000 μL pipett spets och lägg i en 15 mL rör som innehåller 7 mL av Human Cardiac Fibroblast Medium för HCFs och 7 mL av Human Meso Endo Growth Medium för HCAECs.
OBS: För att samla majoriteten av cellerna från varje cryovial, skölj dem två gånger med 1 mL av odlingsmedium från samma 15 mL rör. - Blanda cellupphängningar försiktigt.
- Överför cellupphängningar till separata T75-odlingskolvar med hjälp av en 10 mL serologisk pipett.
- Inkubera celler vid 37 °C med 5 % CO2.
- Efter 18 h aspirerar du mediet från båda odlingskolvarna och sköljer dem en gång med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna frysmedel och döda celler.
- Ersätt PBS med 7 mL lämpligt odlingsmedium till varje odlingskolv och inkubera vid 37 °C.
- Undersök cellulär expansion och viabilitet regelbundet och ersätta media varannan dag tills cellerna når 80-90% konfluency.
2. iCM kultur plätering och tillväxt
- Förlackera två T25-odlingskolvar med 2 mL PBS innehållande 40 μg/mL fibronectin (FN) och inkubera vid 37 °C, 5% CO2 i minst 4 timmar.
- Efter 4 timmar, samla en cryovial som innehåller iCMs och placera den i ett vattenbad vid 37 °C i 4 min.
- Flytta cryovial under en steril laminär flöde biosäkerhet skåp klass 2.
- För försiktigt över iCM:erna från kryoialen till ett sterilt 50 mL centrifugeringsrör med hjälp av en 1 mL pipettspets.
- Skölj den tomma iCMs cryovial med 1 mL av rumstemperatur plätering medium för att återvinna eventuella kvarvarande celler. Överför 1 mL av plätering medium skölj från cryovial drop-vis över 90 sek till 50 mL centrifuge röret som innehåller iCM cell suspension.
OBS: Snurra röret försiktigt samtidigt som mediet tillsätts för att blanda lösningen helt och för att minska den osmotiska chocken på de tinade cellerna. - Tillsätt långsamt 8 mL rumstemperatur Plating Medium till centrifugeringsröret på 50 mL. Tillsätt de första 1 mL dropwise över 30 - 60 s. Sedan lägger du till den återstående volymen under de kommande 30 s. Snurra försiktigt centrifugeringsröret samtidigt som du lägger till Plating-mediet. Blanda innehållet i 50 mL-centrifugröret försiktigt genom att invertera 2 - 3 gånger (undvika kraftig skakning eller vortexing).
- Omedelbart utföra cellräkningen med hjälp av en hemocytometer och bestämma den viabla celltätheten (i celler/mL).
- Ta de FN-förbelagda T25-kolvarna och aspirera LÖSNINGEN FN-PBS utan att låta kolvarna torka. Till detta lägga sådd volym av iCMs (1,6 x 106 livskraftiga iCMs i 8 mL rumstemperatur plätering medium).
- Odla iCMs i inkubatorn för 48 h vid 37 °C, 5% CO2.
- Tina Underhållsmediet över natten vid 4 °C om dagen före användning.
- Jämviktsrebalk Underhållsmediet i ett 37 °C vattenbad och använd omedelbart.
- Efter 2 dagar flyttar du iCMs T25-kolvarna under biosäkerhetsskåpet.
- Tvätta försiktigt bort döda celler och skräp genom att försiktigt pipettera Plating Medium upp och ner 5 gånger.
- Aspirera Plating Medium och ersätt med 8 mL förvättnad Underhåll Medium. Placera tillbaka T25-kolvarna i inkubatorn. Byt ut Underhållsmediet varannan dag och undersök konfluencyen regelbundet.
3. Cellisolering och räkning
- Börja med att samla in första HCAECs och HCFs, och sedan iCMs genom att följa steg 3.2-3.12.
- Förbered CS odlingsmedium genom att blanda 10 mL av iCMs Underhållsmedium, 5 mL humant fibroblast Medium och 5 mL Meso Endo Growth Medium.
- Avlägsna odlingsmedium från varje vävnadskolv som innehåller HCFs och HCAECs och skölj en gång med 5 mL PBS för T75-kolvar. Ta bort PBS.
- Tillsätt 5 mL av 0,25% trypsin EDTA-lösning till varje T75-kolv och inkubera i 5 min vid 37 °C, 5% CO2.
- När celler lossnar, omedelbart neutralisera trypsin EDTA lösning med 5 mL av odlingsmedium.
- Överför cellupphängningar till ett 15 mL-rör och centrifugceller vid 300 x g i 4 min.
- Ta bort supernatanten försiktigt från varje rör. Tillsätt 1 mL CS-medium till varje cellpellet och återanvänd dem. Håll röret på is och räkna celler med hjälp av Trypan Blue och en hemocytometer.
- Avlägsna Maintenance Medium från vävnadskolvar som innehåller iCMer och skölj en gång med 3 mL PBS.
- Tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin EDTA-lösning till varje T75 kolv och inkubera vid 37 °C, 5% CO2. Kontrollera celler varje minut tills lossnat.
- När celler lossnar, omedelbart neutralisera trypsin EDTA lösning med 4 mL av odlingsmedium.
- Överför cellupphängningar till ett 15 mL-rör och centrifug dem på 300 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten försiktigt från varje rör. Tillsätt 1 mL odlingsmedium till cellpelleten och resuspend det. Håll röret på is och räkna celler med hjälp av Trypan Blue och en hemocytometer.
4.CS generation och tillväxt
- Blanda ICMs, HCFs och HCAECs i 2:1:1 förhållande genom plätering 10.000 iCMs, 5.000 HCFs och 5.000 HCAECs per hängande droppe kultur som innehåller 20 μL CS medium. Justera till den slutliga volymen för det totala antalet CSs.
- Pipett 20 μL av cellupphängning i varje brunn av 384 brunn hdc-plattan antingen manuellt eller genom att använda en robotliknande flerkanalig pipett för automatiserad vätskehantering.
- Pipett 1,5 mL steril PBS i varje sida av kanalen runt Hanging Drop Plate för att förhindra uttorkning CSs. Inkubera HDC-plåt vid 37 °C.
- Undersök bildningen av CSs på en daglig basis tills en fullt bildad sfäroid observeras i majoriteten av brunnar. Tillsätt 7,5 μL CS-medium till varje brunn varannan dag tills en CS bildas.
5.CS inbäddning i kollagengeler
- Samla CSs med en 1 mL pipettspets.
OBS: Det är nödvändigt att skära spetsen av pipetten runt 0,2 cm från kanten innan dess användning med en steril skarp yta (antingen en skalpell eller en sax) för att förhindra eventuella skador gel inbäddade sfäroider under deras insamling. - Samla in CS-upphängningen i ett 50 mL-rör på is.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min.
OBS: den pellet som erhålls måste hållas på is tills användning. - Bered en kollagengellösning (100 μL/brunn för 30 brunnar av 96 brunnsplatta) på is med hjälp av råttstjärtkollagen och CS-medium i förhållandet 3:7.
- Ta bort supernatanten från röret som innehåller CSs.
- Blanda de pelleterade CS-rna inom kollagengellösningen.
- Tillsätt 1 μL/mL på 5 mM natriumhydroxid till CS-kollagengelens suspension och blanda försiktigt.
- Överför 100 μL CS-kollagengel till en klar platt botten 96 väl svart polystyren mikroplatta och inkubera vid 37 °C i 30 min.
6. Genombilitets- och toxicitetsmätningar av DOX-behandlade CSs
- Efter 30 min samla den 96 brunnsplattan från inkubator
- Förbered en 10 μM DOX (baserat på tidigare etablerat protokoll för celldöd i CSs14).
OBS: För att potentiellt testa andra medel som kan skydda mot HF i CSs, generera lösningar som innehåller DOX + Agent A, B, etc. - Tillsätt 100 μL lösningar som innehåller DOX och/eller andra medel till varje brunn. Kontrollkulturer innehåller media utan någon DOX.
- Inkubera plåt i 18 h vid 37 °C, 5% CO2.
- På följande dag, samla Live / Dead färgning reagens lager lösningar och låta dem tina på is i mörkret i en biosäkerhet skåp.
- Bered en lösning som innehåller Hoechst-fläck, 4 μM av ethidium homodimer och 2 μM calcein-AM.
- Tillsätt 100 μL hoechst-fläck, calcein-AM/ethidium homodimerlösning i varje brunn.
- Mät fluorescensen i varje brunn vid 645 nm för ethidium homodimer och vid 530 nm för calcein-AM, respektive, med hjälp av multimode mikroplattläsare.
- Överför fluorescensmätningar till Graphpad PRISM (eller en likvärdig programvara för statistisk analys).
- Använd GraphPad Prism mjukvara för dataanalys och statistik.
- För kvalitetskontroll, kontrollera under ett epifluorescensmikroskop för atomkärnorna färgning, tillsammans med calcein-AM och ethidium homodimer.
7.CS kontraktil funktion utvärdering
- Samla mikroplattan som förberedd i steg 5.8.
- Slå på datorn som innehåller IonOptix-programvaran för en videobaserad kantdetektering, Fluorescence Assistance Interface och MyoPacer Field Stimulator.
- Placera en ny täcksli på vävnadshållarplattformen och montera vattenbad med elektroder.
- Samla försiktigt in CSs från kollagengeler med hjälp av en 1 mL pipettspets som skärs 0,5 mm från kanten och överför dem till ett falcon-rör. Lägg till media på CS för att förhindra torkning av CSs. Överför CS (en i taget) med några μL media på scenen i IonOptix-systemet.
- Välj cs som ska analyseras via inställningstoppar till vänster och höger sida av CS med hjälp av programvaran IonOptix.
- Använd den datorbaserade rörelseanalysatorn för att spåra rörelsen av CS-kanter.
OBS: Normalt mäts kontraktiliteten i antingen % cell förkortning eller % fractional shortening. I det här fallet mätte vi % sfäroid förkortning. - Stabilisera både topparna justera tröskel och kant alternativ från datorn.
- Exponera CSs för olika frekvenser (0.3, 0.6, 1, 2 och 3 Hz) och spänningar (1, 2, 3 och 5 V) med hjälp av Myopacer Field Stimulator.
- Spela in spheroid förkortning som CS längd förändringar av DOX-behandlade och obehandlade CSs. Analysera data med hjälp av Soft-Edge programvara och i genomsnitt för varje CS.
8. Mikroskopi av CS: fixering och immunolabeling
- Samla upp 96 brunnsplattan efter 30 min (enligt iordningställd i steg 5.8) och fixera CSs i 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort PFA och skölj tre gånger med PBS innehållande 0,01% natriumazid (PBSA).
- Ta bort PBSA.
- Tillsätt 200 μL pbsa innehållande 0,02% Triton-X-100 till varje brunn i 30 min på en skakapparat.
OBS: Detta steg genomsyrar CSs för bättre antikroppsinfiltration. - Tillsätt 200 μL av 3% bovint serumalbumin i PBSA-lösning i 60 min vid rumstemperatur.
OBS: Detta steg blockerar ospecifik antikroppsbindning i CSs. - Bered en lösning som innehåller 10 μg/mL primära anti-humana antikroppar för mus mot CD31 utspädd i blockerande lösning.
- Tillsätt 100 μL primär antikroppslösning till varje brunn och inkubera över natten vid 4 °C på en skakmaskin.
- Skölj plattan tre gånger med PBSA i 20 min vid rumstemperatur på en gungplatta.
- Bered en lösning som innehåller Hoechst DNA-fläck och 10 μg/mL av Cy3-konjugerad sekundär åsne anti-mus-antikropp utspädd i blockerande lösning.
- Tillsätt 100 μL sekundär antikroppslösning som innehåller Hoechst-fläck till varje brunn och inkubera över natten vid 4 °C på en skakmaskin.
OBS: Täck plattan med aluminiumfolie från denna punkt och framåt. - Skölj plattan tre gånger i 20 min med PBSA i rumstemperatur på en gungplatta.
- Tillsätt 100 μL vectashield monteringsmedium till varje brunn.
- Bild CSs under en laserscanning confocal mikroskop. Utför optisk snittning längs Z-axeln och komprimera bilder till ett enda fokalplan med hjälp av ImageJ-programvara.
Representative Results
Det protokoll som beskrivs i detta manuskript representerar ett alternativt tillvägagångssätt för att utveckla komplexa hjärt endotelcellsnätverk inom en bioengineered hjärtvävnad med förbättrad cell livskraft och funktion jämfört med befintliga modeller (Figur 1). Rekapitulationen av 3D in vivo-hjärtats mikromiljö inom CSs främjade deras svar på DOX vid den koncentration som finns i blodomloppet hos cancerpatienter (mellan 5 och 10 μM, figur 2). DOX behandlade CSs presenterade en statistiskt signifikant minskning av cellernas livsduglighet jämfört med kontroll (ingen DOX) CSs inom 24 h (Figur 2), en toxisk effekt som observeras hos humana cancerpatienter även 17 år efter deras behandling med läkemedlet.
Bild 1. CS Bildande och vaskularisering Analys. (A) Protokoll som visar stegen för bildandet av en CS från samkulturen av ICMs, HCAECs och HCF i hängande droppar. Brightfield bilder på höger sida visar den progressiva sfäroidbildning från enstaka celler i hängande droppar. (B) Kollapsade Z-staplar av confocal bilder av en CS färgas med antikroppar mot hjärt Troponin T (cTNT), PECAM och vimentin, färgning hjärt myocyter, endotelceller och fibroblaster, respektive. Denna siffra har ändrats från14. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2. Livskraft och Toxicitet i CSs. Statistiska analyser av kalcein-AM (A) och ethidium homodimer (B) fluorescens av CSs som behandlats i närvaro av antingen enbart media (DOX 0 μM) eller doxorubicin (10 μM). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Utvecklingsmässigt är korrekt kärlnätverksbildning avgörande för generering av funktionella vävnader, inklusive det mänskliga hjärtat10,12,23,24,25,26. Hänsyn till korrekt vaskulärisering av 3D vävnader möjliggör utbyte av syre, tillväxtfaktorer, signalmolekyler och näringsämnen, förhindra utvecklingen av cellnekros inom någon vävnad tjockare än 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. För närvarande finns in vitro 3D-hjärta modeller som presenterar ett vaskulär nätverk är främst presentera kapillär-storlek, oorganiserade vaskulära nätverk och saknar den hierarkiska komplexa grenade vascularization observerats in vivo6,8,29. Det alternativa tillvägagångssättet för att utveckla komplexa hjärt endotelescellnätverk som beskrivs i detta manuskript presenterar förbättrad cell livskraft och funktion jämfört med befintliga modeller (figur 1)14,22. 3D in vitro CSs modellera det mänskliga hjärtat genom att bättre rekapitulera dess in vivo mikromiljö, inklusive dess molekylära, cellulära och extracellulärakomponenter 14,22. CS-generering från stamceller-härledda celler i de hängande dropparna tillåter sina kulturer i definierade förhållanden (t.ex., celltyper och förhållande, korrekt vävnadsbildning). Co-kulturer av iCMs tillsammans med HCFs och HCAECs inom CSs definierar den molekylära och cellulära överhörning som reglerar hjärtat patofysiologi, inklusive dess kontraktila funktion och svar på läkemedel vid koncentrationer som finns i patientens blodomloppet14. På grund av dessa unika egenskaper, CSs har utnyttjats för att modellera hjärt fibros, en allvarlig följd av hjärtinfarkt och hjärtsvikt21. Våra tidigare studier visade hur närvaron av både endotelceller och fibroblaster är avgörande för rekapitulation av den vaskulära mikromiljö i det mänskliga hjärtat, vilket möjliggör en optimal deposition av fibroblast-härledda ECM-proteiner, såsom laminin, fibronectin och kollagen typ IV, lokaliserad i närheten av ett utvecklande endotelcellsnätverk14,21.
DOX är ett välkänt kardioxiskt läkemedel som kan utveckla hjärtsvikt hos cancerpatienter även 17 år efter deras behandling30. Ändå, Det är fortfarande ett läkemedel val för behandling av leukemi och lymfom hos pediatriska patienter och bröstcancer hos kvinnor30. DOX behandling i CSs har sedan använts för att modellera hjärtsvikt (HF) in vitro för att studera både de mekanismer som reglerar toxiciteten i hjärtmyocyter, endotelceller och fibroblaster14 och för att modellera HF-inducerad hjärtfibros21. Cellens viabilitet minskade statistiskt i DOX behandlade CSs inom 24 h när den exponerades för läkemedlet vid den koncentration som finns i blodomloppet hos cancerpatienter (mellan 5 och 10 μM)14 (Figur 2). Tidigare studier i vårt laboratorium visade också toxiska effekter av DOX på både hjärt endotelceller och fibroblaster via endotel kväveoxid syntas (eNOS) med hjälp av både genetiska och kemiska hämmare av denna signalering väg14. Användning av genetiska (NOS3 shRNA) och kemiska (N5-(1-iminoetyl)-L-ornitin, dikklorid, eller L-) antagonister av eNOS signalväg som ett nedströms mål för DOX förhindrade dess toxiska effekter i både hjärt endothelial celler och fibroblaster14.
Kontraktil aktivitet inom CSs har också mätts tack vare den elektriska kopplingen av hjärtceller när de utsätts för fältpotentialstimulering. Vi fann att CSs odlade med kontroll media (DOX 0 μM) kontrakt spontant och homogent i en svävningsfrekvens som kan tempo av fältstimulering inom 1 och 3 Hz, jämförbar med ett friskt mänskligt hjärta. Å andra sidan, DOX-behandlade CSs följer inte den elektriska stimulering som de inte kan kontrakt. Tillsammans med mätningarna av cellernas livskraft och toxicitet med hjälp av calcein-AM och ethidium homodimer, denna funktionella assay för CS kontraktil funktion möjliggöra utvärdering av komplexa scenario typiska för det mänskliga hjärtat in vitro, för närvarande inte kan uppnås med andra modeller. Jämfört med kontraktila aktivitetsmätningar av enstaka hjärtceller med samma system kan vi inte visualisera och mäta sarkomet i CSs. Därför är vi begränsade till mätningar av % sfäroid förkortning över tiden, en analys vi var tvungna att utveckla inom vårt laboratorium. När vi kontrollerar antalet celler, vi samkultur i varje CS och därför storleken på varje CS, vi använder CSs med liknande storlek som verkligen presentera homogena kontraktil funktion. Men även i fall vi genererade CSs av olika storlekar, deras kontraktila verksamhet inte förändras.
Det är också viktigt att rapportera att den flercelliga karaktären av CSs gör dem tunga nog att lokalisera längst ner på täcket i Ion-Optix-systemet, även i fall de är superfunderade. Baserat på det faktum att CSs sitter själva i en specifik position, behöver vi inte få dem att hålla sig till täcket, tvärtom av vad som vanligen görs med enstaka hjärtceller i de flesta laboratorier.
Den mikroskopiska analysen av CSs färgas med antikroppar mot hjärt troponin T, CD31/PECAM och PECAM (som markörer för iCMs, HCAECs, och HCFs, respektive) visade bildandet av en endotelcell nätverk (Figur 1, blå). För att helt utesluta nekros i den inre delen av CSs, utfördes rumslig utvärdering av cellernas livskraft i vårt laboratorium genom confocal analys av calcein-AM/ethidium homodimer färgade CSs (data visas inte). Det är dock viktigt att erkänna att den framtida utvecklingen inom biofabriceringsområdet för att bättre rekapitulera andra komplexa funktioner som är typiska för det mänskliga hjärtat in vivo, för närvarande inte tillgänglig i den befintliga modellen. Dessa inkluderar: i) kontraktil funktion typisk för vuxna kardiomyocyter; ii) blodflödet och tryckkrafter; iii) paracrin signalering; iv) immunsvar, vilket kommer att vara avgörande för att förbättra denna och andra in vitro-hjärtmodeller6. Som någon annan modell syftar till att rekapitulera viktiga inslag i antingen en frisk vävnad eller en sjukdom tillstånd, protokollet för generering och användning av CS som beskrivs i detta manuskript syftar till att hjälpa forskaren att ta itu med specifika frågor, som kanske inte uttömmande med hjälp av denna metod. Till exempel skulle den potentiella användningen av patient-härledda celler för generering av CSs ge verktyg för personlig medicin, för närvarande inte tillgänglig med hjälp av allmänt tillgängliga högpresterande analyser för kardiovaskulär forskning.
Sammanfattningsvis visade vi ett enkelt sätt att bättre rekapitulera det mänskliga hjärtat mikromiljö med hjälp av hjärt celler. Hjärt sfäroider presentera en endotel cell nätverk som bättre rekapitulerar den som finns i det mänskliga hjärtat jämfört med monolayer kulturer av hjärtceller. Med tanke på deras unika egenskaper representerar de avancerade verktyg för in vitro-testning för kardiovaskulär forskning. Framtida studier med patient-härledda celler kan ge alternativ för personlig medicin och nya terapier för att både förebygga och bättre behandla hjärt-kärlsjukdom.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Ett särskilt tack till Nat Johnston för inspelningen och redigering av videon.
Poonam Sharma stöddes av University of Newcastle med UNIPRS och UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) stipendier. Carmine Gentile stöddes av en UTS Seed Finansiering, katolska ärkestiftet i Sydney Grant för adult stem cell research och en Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
| Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
| Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
| Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
| Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
| Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
| NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
| 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
| 384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |
References
- Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).
- Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
- Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).
- Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538 (2018).
- Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).
- Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
- Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
- Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).
- O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).
- Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
- Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).
- Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).
- Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
- Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
- Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).
- Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
- Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
- Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
- Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
- Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).
- Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
- Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
- Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
- Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
- Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394 (2020).
