Summary
Este protocolo visa fabricar esferoides cardíacos 3D (CSs) co-culminando células em gotas penduradas. Os CSs embutidos em colágeno são tratados com doxorubicina (DOX, um agente cardiotóxico) em concentrações fisiológicas para modelar insuficiência cardíaca. Testes in vitro usando CSs tratados com DOX podem ser usados para identificar novas terapias para pacientes com insuficiência cardíaca.
Abstract
Apesar de vários avanços na engenharia de tecidos cardíacos, um dos grandes desafios a superar continua sendo a geração de uma rede vascular totalmente funcional, compreendendo vários níveis de complexidade para fornecer oxigênio e nutrientes dentro dos tecidos cardíacos bioengenhariados. Nosso laboratório desenvolveu um modelo in vitro tridimensional do coração humano, conhecido como "esferoide cardíaco" ou "CS". Isso apresenta características bioquímicas, fisiológicas e farmacológicas típicas do coração humano e é gerada por co-culminar seus três principais tipos celulares, como miócitos cardíacos, células endividadas e fibroblastos. Cardiomiócitos pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs ou iCMs) são co-cultivados em proporções que se aproximam das encontradas in vivo com fibroblastos cardíacos humanos (HCFs) e células endotelias da artéria coronária humana (HCAECs) em placas de cultura de queda suspensa por três a quatro dias. A análise confocal de CSs manchadas com anticorpos contra troponina cardíaca T, CD31 e vimentina (marcadores para miócitos cardíacos, células endoteliais e fibroblastos, respectivamente) mostra que os CSs apresentam uma complexa rede celular endotelial, assemelhando-se à nativa encontrada no coração humano. Isso é confirmado pela análise de renderização 3D dessas imagens confocal. Os CSs também apresentam proteínas de matriz extracelular (ECM) típicas do coração humano, como colágeno tipo IV, laminina e fibronectina. Finalmente, os CSs apresentam uma atividade contratil medida como contratilidade sinintiana mais próxima da típica do coração humano em comparação com CSs que contêm apenas iCMs. Quando tratada com um agente anticânceo cardiotóxico, como a doxorubicina (DOX, usada para tratar leucemia, linfoma e câncer de mama), a viabilidade de CSs tratados com DOX é significativamente reduzida a 10 μM inibição genética e química da sinfetetol óxido nítrico endotelial, alvo a jusante de DOX em HCFs e HCAECs, reduziu sua toxicidade em CSs. Dadas essas características únicas, os CSs são atualmente usados como modelos in vitro para estudar bioquímica cardíaca, fisiopatologia e farmacologia.
Introduction
O coração humano tem uma capacidade regenerativa limitada, enquanto as doenças cardiovasculares (DCV) continuam sendo a principal causa de morte em todo o mundo, apesar dos recentes avanços na engenharia de tecidos e tecnologias de células-tronco1. A necessidade de novas terapêuticas, incluindo abordagens moleculares e celulares para reparar um coração danificado ou evitar que um coração fale é uma das principais necessidades clínicas atuais para pacientes que sofrem de doença cardíaca2,3,4. O principal objetivo da engenharia de tecidos cardíacos é fabricar um tecido cardíaco tridimensional (3D) que apresente características moleculares, celulares e extracelulares típicas de um coração humano, incluindo sua rede vascular e função fisiológica contraicil4,5,6.
Com o objetivo de bioengenharia e fabricar um tecido cardíaco humano funcional que imita o coração humano para aplicações in vitro e in vivo, várias abordagens têm sido investigadas, incluindo tecidos cardíacos projetados (EHTs), folhas de células e culturas esferoides7,8. No entanto, esses tecidos falham em recapitular o microambiente 3D ideal típico do coração humano e seu uso potencial para pacientes com DCV não pode traduzir diretamente do banco para a cabeceira7. Isso porque eles não recapitulam a biologia complexa, morfologia e fisiologia dos tecidos cardíacos in vivo9. Um dos maiores desafios na engenharia de tecidos cardíacos inclui o desenvolvimento de uma rede vascular hierárquica dentro do tecido cardíaco bioengenharia, já que qualquer tecido maior que 200 μm de diâmetro desenvolve morte celular no meio2,10. Uma rede vascular devidamente formada em um tecido cardíaco humano desempenha um papel importante para o fornecimento de sangue, oxigênio e nutrientes para as células cardíacas11. Durante o desenvolvimento embrionário, capilares coronários e artérias formam-se através da vasculogênese (formação de vasos sanguíneos de novo) e angiogênese (geração de vasos sanguíneos dos pré-existentes) a partir de células progenitoras endoteliais8,12. Os fibroblastos cardíacos também desempenham um papel importante na formação adequada da rede vascular, fornecendo a matriz extracelular ideal (ECM) e a composição de crescimento13,14.
A rede vascular 3D de tecidos cardíacos bioengenheiros controla a sobrevivência e a função celular criando gradientes de oxigênio e nutrientes e sinalização paracrina, como interação celular homotípica, interação celular heterotípica, interação das células através de proteínas solúveis secretadas e interações celulares a ECM3,10,15,16,17,18. Isso previne a morte celular no meio do tecido e promove a viabilidade celular e a função fisiológica nos tecidos cardíacos bioengenharia16,18,19.
Culturas esferoides de células-tronco foram recentemente exploradas como modelos in vitro do coração humano20. Para melhorar ainda mais o microambiente cardíaco in vitro, eles incluíram o uso de todos os principais tipos de células encontrados no coração humano, como miócitos cardíacos, células endividadas e fibroblastos. As culturas esferoides apresentam o suporte estrutural 3D necessário para que as células cresçam e funcionem e podem ser usadas para bioengenharia uma rede vascular14,20,21,22. Nesse contexto, nosso laboratório desenvolveu esferoides cardíacos humanos (SSS) por meio de miócitos cardíacos, células endoteliais e fibroblastos em proporções encontradas no coração humano14. Este modelo é uma expansão do modelo de esferoide de células cardíacas ventriculares de ratos, gerado pela co-culturas cardíacas em culturas de queda suspensa, usado para modelar fibrose cardíaca21. Os CSs humanos podem ser usados como ensaios de toxicidade tratando-os da doxorubicina (DOX, um agente anticâncológico usado para tratar leucemia, linfoma e câncer de mama), que é bem conhecido por induzir fibrose cardíaca e insuficiência cardíaca (HF) mesmo 17 anos após sua sonorização14.
Neste manuscrito, descrevemos como gerar CSs humanos através da co-cultivo de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em cardiomiócitos derivados de células-tronco (hiPSC-CMs), fibroblastos cardíacos humanos (HCFs) e células endoteliais da artéria coronária humana (HCAECs) em culturas de queda suspensa. Para usar e imagem CSs para testes in vitro, eles são incorporados em um gel de colágeno. A análise confocal dos CSs manchados com anticorpos contra CD31, um marcador para células endoteliais, mostrou que essas células formam uma rede semelhante à observada in vivo. Para induzir hf e potencialmente testar novos agentes que possam tratá-lo ou preveni-lo, os CSs foram tratados com 10 μM DOX (uma concentração encontrada na corrente sanguínea de pacientes com câncer que recebem a droga). Quando manchadas com calcein-AM e homodimer de ethidium (colorindo células vivas e mortas, respectivamente), os CS tratados com DOX apresentam uma diminuição significativa da viabilidade em comparação com os CSs que não receberam a droga. Os CSs também apresentam uma atividade contraílétil homogênea quando acompanhados usando estimulação potencial de campo entre 1 e 3 Hz.
Protocol
NOTA: os hiPSC-CMs utilizados para este protocolo estão disponíveis comercialmente. Por favor, busque a aprovação do Comitê de Ética Humana Institucional antes de iniciar este trabalho, se necessário.
1. Fibroblasto cardíaco humano e cultura celular endotelial emplacamento e crescimento
- Degelo criovials contendo HCFs e HCAECs em um banho de água a 37 °C por um minuto.
- Mova criovials sob um estéril laminar flow biosafety cabinet classe 2.
- Colete 1 mL de suspensão celular dos criovials usando uma ponta de pipeta de 1000 μL e adicione em um tubo de 15 mL contendo 7 mL de Fibroblast Cardíaco Humano Médio para HCFs e 7 mL de Meio de Crescimento Humano Meso Endo para HCAECs.
NOTA: Para coletar a maioria das células de cada criovial, enxágüe-as duas vezes com 1 mL de meio de cultura a partir do mesmo tubo de 15 mL. - Misture suavemente as suspensões celulares.
- Transfira as suspensões celulares para separar frascos de cultura T75 usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
- Incubar células a 37 °C com 5% de CO2.
- Após 18 h, aspire o meio de ambos os frascos de cultura e enxágüe-os uma vez com soro fisiológico tamponado de fosfato estéril (PBS) para remover células médias e mortas congelantes.
- Substitua a PBS por 7 mL de cultura adequada a cada frasco de cultura e incubar a 37 °C.
- Examine a expansão celular e a viabilidade regularmente e substitua a mídia a cada dois dias até que as células atinjam 80-90% de confluência.
2. cultura de ICMS emplacando e crescimento
- Pré-cubra dois frascos de cultura T25 com 2 mL de PBS contendo 40 μg/mL de fibronectina (FN) e incubar a 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 4 horas.
- Após 4 horas, colete um criovial contendo iCMs e coloque-o em um banho de água a 37 °C por 4 min.
- Mova o criovial sob um estéril laminar flow biosafety cabinet classe 2.
- Transfira suavemente os iCMs do criovial para um tubo de centrífuga de 50 mL estéril usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Enxágüe o criovial vazio de iCMs com 1 mL de nível de temperatura ambiente médio para recuperar quaisquer células residuais. Transfira os 1 mL de lavagem média de revestimento da gota criovial de mais de 90 segundos para o tubo centrífuga de 50 mL contendo a suspensão da célula de ICMS.
NOTA: Gire suavemente o tubo enquanto adiciona o meio para misturar a solução completamente e diminuir o choque osmótico nas células descongeladas. - Adicione lentamente 8 mL de temperatura ambiente Meio de revestimento ao tubo centrífuga de 50 mL. Adicione os primeiros 1 mL dropwise acima de 30 - 60 s. Em seguida, adicione o volume restante sobre os próximos 30 s. Gire suavemente o tubo de centrífuga enquanto adiciona o meio de chapeamento. Misture suavemente o conteúdo do tubo de centrífuga de 50 mL invertendo 2 a 3 vezes (evitando tremor vigoroso ou vórtice).
- Realize imediatamente a contagem celular usando um hemócito e determine a densidade celular viável (em células/mL).
- Pegue os frascos T25 pré-revestidos da FN e aspire a solução FN-PBS sem deixar os frascos secarem. A este adicionar volume de semeadura de iCMs (1,6 x 106 iCMs viáveis em 8 mL de temperatura ambiente média).
- ICMs de cultura na incubadora por 48h a 37 °C, 5% CO2.
- Descongele o meio de manutenção durante a noite a 4 °C por dia antes do uso.
- Equilibre o Meio de Manutenção em um banho de água de 37 °C e use imediatamente.
- Após 2 dias, mova os frascos iCMs T25 sob o armário de biossegurança.
- Lave suavemente as células mortas e os detritos, canalizar suavemente o meio de revestimento para cima e para baixo 5 vezes.
- Aspire o Meio de Revestimento e substitua pelo 8 mL de Meio de Manutenção pré-aquecido. Coloque os frascos T25 de volta na incubadora. Substitua o Meio de Manutenção a cada dois dias e examine a confluência regularmente.
3. Isolamento celular e contagem
- Comece coletando primeiro HCAECs e HCFs e, em seguida, iCMs seguindo as etapas 3.2-3.12.
- Prepare o meio de cultura CS misturando 10 mL de ICMs Maintenance Medium, 5 mL de Manuto Cardíaco Humano Médio e 5 mL de Meso Endo Growth Medium.
- Remova o meio de cultura de cada frasco de tecido contendo HCFs e HCAECs e enxágue uma vez com 5 mL PBS para frascos T75. Remova o PBS.
- Adicione 5 mL de solução EDTA de trippsina de 0,25% a cada frasco T75 e incubar por 5 min a 37 °C, 5% de CO2.
- Uma vez que as células se desprendem, neutralize imediatamente a solução EDTA de trippsina com 5 mL de meio de cultura.
- Transfira as suspensões celulares para um tubo de 15 mL e células centrífugas a 300 x g por 4 min.
- Remova o supernatante cuidadosamente de cada tubo. Adicione 1 mL de meio CS a cada pelota de célula e resuspensá-los. Mantenha o tubo no gelo e conte células usando Trypan Blue e um hemócito.
- Remova o meio de manutenção dos frascos de tecido contendo iCMs e enxágue uma vez com 3 mL de PBS.
- Adicione 1 mL de solução EDTA de trippsina de 0,25% a cada frasco T75 e incubar a 37 °C, 5% DE CO2. Verifique as células a cada minuto até se separar.
- Uma vez que as células se desprendem, neutralize imediatamente a solução EDTA de trippsina com 4 mL de meio de cultura.
- Transfira as suspensões celulares para um tubo de 15 mL e centrífugue-as a 300 x g por 5 min.
- Remova o supernatante cuidadosamente de cada tubo. Adicione 1 mL de cultura média à pelota celular e resuspensá-la. Mantenha o tubo no gelo e conte células usando Trypan Blue e um hemócito.
Geração e crescimento .CS 4
- Misturar iCMs, HCFs e HCAECs em proporção 2:1:1 por plating 10.000 iCMs, 5.000 HCFs e 5.000 HCAECs por cultura de queda suspensa contendo 20 μL de meio CS. Ajuste ao volume final para o número total de CSs.
- Pipeta 20 μL de suspensão celular em cada poço da placa 384 bem HDC manualmente ou usando uma pipeta multicanal robótica para manuseio líquido automatizado.
- Pipeta 1,5 mL de PBS estéril em cada lado do canal ao redor da placa de gota pendurada para evitar a secagem de CSs. Incubar a placa HDC a 37 °C.
- Examine a formação de CSs diariamente até que um esferoide totalmente formado seja observado na maioria dos poços. Adicione 7,5 μL de meio CS a cada poço a cada dois dias até que um CS seja formado.
5.CS incorporando em géis de colágeno
- Colete CSs com uma ponta de pipeta de 1 mL.
NOTA: É necessário cortar a ponta da pipeta em torno de 0,2 cm da borda antes de seu uso com uma superfície afiada estéril (um bisturi ou uma tesoura) para evitar qualquer dano embutida spheroids em gel durante sua coleta. - Colete a suspensão CS em um tubo de 50 mL no gelo.
- Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min.
NOTA: a pelota obtida deve ser mantida no gelo até o uso. - Prepare uma solução de gel de colágeno (100 μL/well para 30 poços de 96 placas de bem) no gelo usando colágeno de cauda de rato e meio CS em uma proporção de 3:7.
- Remova o supernatante do tubo que contém CSs.
- Misture os CSs pelleted dentro da solução de gel de colágeno.
- Adicione 1 μL/mL de hidróxido de sódio de 5 mM à suspensão do gel de colágeno CS e misture suavemente.
- Transfira 100 μL de cs-colágeno para uma microplaca de poliestireno preto claro 96 bem preto e incubar a 37 °C por 30 min.
6. Medições de viabilidade e toxicidade de CSs tratados com DOX
- Depois de 30 min recolher a placa de 96 poços da incubadora
- Prepare um DOX de 10 μM (baseado no protocolo previamente estabelecido para morte celular em CSs14).
NOTA: Para testar potencialmente outros agentes que possam proteger contra HF em CSs, gere soluções contendo DOX + Agente A, B, etc. - Adicione 100 μL de soluções contendo DOX e/ou outros agentes a cada poço. As culturas de controle contêm mídia sem qualquer DOX.
- Incubar placa por 18 h a 37 °C, 5% CO2.
- No dia seguinte, colete as soluções de estoque de reagente de coloração Live/Dead e permita que descongelem no gelo no escuro em um armário de biossegurança.
- Prepare uma solução contendo mancha hoechst, 4 μM de homodimer de ethidium e 2 μM calcein-AM.
- Adicione 100 μL de mancha hoechst, solução de homodimer calcein-AM/ethidium em cada poço.
- Meça a fluorescência em cada poço a 645 nm para homodimer de ethidium e a 530 nm para calcein-AM, respectivamente, utilizando leitor de microplaca multimodo.
- Transfira as medidas de fluorescência em Graphpad PRISM (ou um software equivalente para análise estatística).
- Use o software GraphPad Prism para análise de dados e estatísticas.
- Para controle de qualidade, verifique sob um microscópio de epifluorescência para a coloração dos núcleos, juntamente com o homodimer calcein-AM e ethidium.
Avaliação de função contraída 7.CS
- Colete a microplacão preparada na etapa 5.8.
- Ligue o computador que contém o software IonOptix para uma detecção de borda baseada em vídeo, a Interface de Assistência à Fluorescência e o Estimulador de Campo MyoPacer.
- Coloque um novo deslizamento de cobertura na plataforma do suporte de tecido e monte banho de água com eletrodos.
- Colete suavemente CSs de géis de colágeno usando uma ponta de pipeta de 1 mL cortada a 0,5 mm da borda e transfira-as para um tubo falcão. Adicione mídia ao CS para evitar a secagem de CSs. Transferir CS (um de cada vez) com alguns μL de mídia no estágio do sistema IonOptix.
- Selecione o CS a ser analisado através da definição de picos no lado esquerdo e direito do CS usando o software IonOptix.
- Use o analisador de movimento baseado em computador para rastrear o movimento das bordas CS.
NOTA: Normalmente, a contratibilidade é medida em % encurtamento celular ou % encurtamento fracionado. Neste caso, medimos % encurtamento de esferoides. - Estabilize os picos de ajuste das opções de limiar e borda do computador.
- Exponha os CSs a diferentes frequências (0,3, 0,6, 1, 2 e 3 Hz) e tensões (1, 2, 3 e 5 V) utilizando o Estimulador de Campo DoMepacer.
- Encurtar o spheroid como alterações de comprimento de CS de CS tratados e CSs não tratados. Analisar dados usando o software Soft-Edge e média para cada CS.
8. Microscopia de CSs: fixação e imunolabeling
- Colete a placa de 96 poços após 30 min (conforme preparado na etapa 5.8) e fixe CSs em 4% de paraformaldeído (PFA) por 1h em temperatura ambiente.
- Remova a PFA e enxágue três vezes com PBS contendo azida de sódio de 0,01% (PBSA).
- Remova a PBSA.
- Adicione 200 μL de PBSA contendo 0,02% Triton-X-100 para cada poço por 30 minutos em um shaker.
NOTA: Este passo permeabilize CSs para melhor infiltração de anticorpos. - Adicione 200 μL de 3% de albumina de soro bovino na solução PBSA por 60 min a temperatura ambiente.
NOTA: Esta etapa bloqueia a ligação de anticorpos inespecíficos em CSs. - Prepare uma solução contendo 10 μg/mL de anticorpos anti-humanos do mouse primário contra CD31 diluído na solução de bloqueio.
- Adicione 100 μL de solução de anticorpos primários a cada poço e incubar durante a noite a 4 °C em um shaker.
- Enxágüe a placa três vezes com PBSA por 20 minutos em temperatura ambiente em uma placa de balanço.
- Prepare uma solução contendo mancha de DNA Hoechst e 10 μg/mL de anticorpo anti-rato de burro secundário conjugado Cy3 diluído em solução de bloqueio.
- Adicione 100 μL de solução de anticorpos secundários contendo mancha hoechst em cada poço e incubar durante a noite a 4 °C em um shaker.
NOTA: Cubra a placa com papel alumínio a partir deste ponto. - Enxágüe a placa três vezes por 20 minutos com PBSA à temperatura ambiente em uma placa de balanço.
- Adicione 100 μL de vectashield meio de montagem a cada poço.
- CS de imagem sob um microscópio confocal de varredura a laser. Execute seção óptica ao longo do eixo Z e destrua imagens em um único plano focal usando o software ImageJ.
Representative Results
O protocolo descrito neste manuscrito representa uma abordagem alternativa para desenvolver uma complexa rede de células endoteliais cardíacas dentro de um tecido cardíaco bioengenheiro com melhor viabilidade celular e função em comparação com os modelos existentes(Figura 1). A recapitulação do microambiente 3D in vivo coração dentro dos CSs promoveu sua resposta ao DOX na concentração encontrada na corrente sanguínea de pacientes com câncer (entre 5 e 10 μM, Figura 2). O DOX tratado CSs apresentou uma redução estatisticamente significativa na viabilidade celular em comparação com o controle (sem DOX) CSs dentro de 24 h(Figura 2), um efeito tóxico que é observado em pacientes com câncer humano mesmo 17 anos após seu tratamento com a droga.
Figura 1. Análise de Formação e Vascularização da CS. (A) Protocolo que mostra os passos para a formação de um CS a partir da co-cultura de iCMs, HCAECs e HCFs em gotas de suspensão. Imagens de Brightfield no lado direito mostram a formação progressiva de esferoides a partir de células únicas em gotas penduradas. (B) Colapsadas Z-stacks de imagens confocal de um CS manchadas com anticorpos contra troponina cardíaca T (cTNT), PECAM e vimentina, mrócitos cardíacos, células endoteliais e fibroblastos, respectivamente. Este número foi modificado a partir de14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Viabilidade e Toxicidade em SCSs. Análises estatísticas de calceínio-AM (A) e fluorescência de ethidium homodimer(B) fluorescência de CSs tratadas apenas na presença de mídia apenas (DOX 0 μM) ou doxorubicina (10 μM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
De forma desenvolvimento, a formação adequada da rede vascular é fundamental para a geração de tecidos funcionais, incluindo o coração humano10,12,23,24,25,26. A consideração pela vascularização adequada dos tecidos 3D permite a troca de oxigênio, fatores de crescimento, moléculas de sinalização e nutrientes, impedindo o desenvolvimento de necrose celular dentro de qualquer tecido mais espesso que 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Atualmente, os modelos cardíacos 3D in vitro que apresentam uma rede vascular apresentam principalmente redes vasculares capilares, desorganizadas e carecem da vascularização ramificada hierárquica observada in vivo6,8,29. A abordagem alternativa para desenvolver uma complexa rede de células endoteliais cardíacas descrita neste manuscrito apresenta melhor viabilidade e função celular em comparação com os modelos existentes (Figura 1)14,22. 3D in vitro CSs modelam o coração humano recapitulando melhor seu microambiente in vivo, incluindo seus componentes moleculares, celulares e extracelulares14,22. A geração de CS a partir de células-tronco derivadas das gotas de enforcamento permite que suas culturas em condições definidas (por exemplo, tipos e razão celular, formação adequada de tecidos). Co-culturas de iCMs juntamente com HCFs e HCAECs dentro dos CSs definem o crosstalk molecular e celular que regula a fisiopatologia cardíaca, incluindo sua função contratil e resposta a drogas em concentrações encontradas na corrente sanguínea do paciente14. Devido a essas características únicas, os CSs têm sido utilizados para modelar fibrose cardíaca, uma consequência grave do infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca21. Nossos estudos anteriores mostraram como a presença de células endoteliais e fibroblastos é fundamental para a recapitulação do microambiente vascular no coração humano, permitindo a deposição ideal de proteínas ECM derivadas do fibroblasto, como laminina, fibronectina e colágeno tipo IV, localizadas nas proximidades de uma rede celular endotelial em desenvolvimento14,21.
O DOX é um conhecido medicamento cardiotóxico que pode desenvolver insuficiência cardíaca em pacientes com câncer mesmo 17 anos após seu tratamento30. No entanto, continua sendo uma droga escolhida para o tratamento de leucemia e linfoma em pacientes pediátricos e câncer de mama em mulheres30. O tratamento DOX em SCss tem sido então usado para modelar insuficiência cardíaca (HF) in vitro para estudar tanto os mecanismos que regulam a toxicidade em miócitos cardíacos, células endoteliais e fibroblastos14 e para modelar fibrose cardíaca induzida por HF21. A viabilidade celular foi estatisticamente reduzida em DOX tratado CSs dentro de 24 h quando exposto à droga na concentração encontrada na corrente sanguínea de pacientes com câncer (entre 5 e 10 μM)14 (Figura 2). Estudos anteriores em nosso laboratório também demonstraram os efeitos tóxicos do DOX em ambas as células endoteliais cardíacas e fibroblastos através da sinthase de óxido nítrico endotelial (eNOS) utilizando inibidores genéticos e químicos desta via de sinalização14. O uso de antagonistas genéticos (NOS3 shRNA) e químicos (N5-(1-iminoetil)-L-ornithine, dihidrocriloreto ou L-NIO) antagonistas da via de sinalização do eNOS como alvo a jusante do DOX impediu seus efeitos tóxicos tanto em células endoteliais cardíacas quanto em fibroblastos14.
A atividade contractile dentro dos CSs também foi medida graças ao acoplamento elétrico das células cardíacas quando expostas à estimulação potencial de campo. Descobrimos que os CSs cultivados com mídia de controle (DOX 0 μM) contraem espontaneamente e de forma homogênea a uma taxa de espancamento que pode ser acompanhada por estimulação de campo dentro de 1 e 3 Hz, comparáveis com um coração humano saudável. Por outro lado, os CSs tratados com DOX não seguem a estimulação elétrica, pois não podem contrair. Juntamente com as medidas de viabilidade celular e toxicidade utilizando calcein-AM e homodimer de ethidium, este ensaio funcional para função cs contratixile permite a avaliação do cenário complexo típico do coração humano in vitro, atualmente não alcançável com outros modelos. Em comparação com as medidas de atividade contratil de células cardíacas únicas usando o mesmo sistema, não somos capazes de visualizar e medir o sarcomere em CSs. Portanto, estamos limitados a medições de % esferoide encurtando ao longo do tempo, um ensaio que tivemos que desenvolver dentro de nosso laboratório. À medida que controlamos o número de células, co-cultura em cada CS e, portanto, o tamanho de cada CS, utilizamos CSs com tamanho semelhante que de fato apresentam função contraílétil homogênea. No entanto, mesmo no caso de gerarmos CSs de diferentes tamanhos, sua atividade contratante não mudou.
Também é importante informar que a natureza multicelular dos CSs os torna pesados o suficiente para localização na parte inferior do deslizamento de cobertura no sistema Ion-Optix, mesmo no caso de serem superfundidos. Com base no fato de que os CSs sentam-se sozinhos em uma posição específica, não precisamos fazê-los aderir ao coverlip, ao contrário do que é comumente feito com células cardíacas únicas na maioria dos laboratórios.
A análise microscópica de CSs manchados com anticorpos contra troponina cardíaca T, CD31/PECAM e PECAM (como marcadores para iCMs, HCAECs e HCFs, respectivamente) mostrou a formação de uma rede celular enditelial(Figura 1, azul). Para excluir totalmente a necrose na parte interna dos CSs, a avaliação espacial da viabilidade celular foi realizada em nosso laboratório por meio de análise confocal de CSs manchado de calceínio-AM/ethidium (dados não apresentados). No entanto, é importante reconhecer que os desenvolvimentos futuros no campo da biofabização para melhor recapitular outras características complexas típicas do coração humano in vivo, atualmente não disponíveis no modelo existente. Estes incluem: i) função contratil típica de cardiomiócitos adultos; ii) forças de fluxo sanguíneo e pressão; iii) sinalização paracrina; iv) resposta imune, que será fundamental para melhorar este e outros modelos cardíacos in vitro6. Como qualquer outro modelo visa recapitular as principais características de um tecido saudável ou de um estado de doença, o protocolo para a geração e uso de CS descrito neste manuscrito visa ajudar o pesquisador a abordar questões específicas, que podem não ser exaustivas usando essa abordagem. Por exemplo, o uso potencial de células derivadas do paciente para a geração de CSs forneceria ferramentas para medicamentos personalizados, atualmente não disponíveis usando ensaios de alto rendimento comumente disponíveis para pesquisas cardiovasculares.
Em conclusão, demonstramos uma maneira simples de recapitular melhor o microambiente do coração humano usando células cardíacas. Os esferoides cardíacos apresentam uma rede de células endoteliais que melhor recapitula a presente no coração humano em comparação com as culturas monocamadas das células cardíacas. Dadas suas características únicas, eles representam ferramentas avançadas para testes in vitro para pesquisa cardiovascular. Estudos futuros usando células derivadas do paciente poderiam fornecer opções para medicamentos personalizados e novas terapias para prevenir e tratar melhor doenças cardiovasculares.
Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Um agradecimento especial a Nat Johnston pela gravação e edição do vídeo.
Poonam Sharma foi apoiado pela Universidade de Newcastle com bolsas uniprs e unrs central & faculty school (UNRSC5050). Carmine Gentile foi apoiado por um financiamento de sementes da UTS, Arquidiocese Católica de Sydney Grant para Pesquisa de Células-Tronco Adultas e uma Bolsa de Pesquisa em Cirurgia Cardiotorácica da Fundação Escola de Medicina de Sydney.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
| Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
| Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
| Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
| Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
| Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
| NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
| Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
| 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
| 384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |
References
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