Summary
ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。
Abstract
プレmRNAスプライシングは、組立、RNA処理、および複合成分の放出中に、多くの分子再構成を伴う非常に動的なプロセスです。グリセリン勾配遠心分離は、機能および構造研究のためのタンパク質またはRNP(RiboNucleoProtein)複合体の分離のために使用されています。ここでは、単一粒子の凍結電子顕微鏡用の高分子複合体を精製・安定化するために最初に開発されたGrafix(勾配固定)の利用について述べ、一過性のスプライセソー複合体と結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。この方法は、複合体を安定化させる固定化試薬の濃度の増加にサンプルの遠心分離に基づいています。グリセロール勾配にロードされた酵母総抽出物の遠心分離後、回収された分率は、個々のスプライシング因子の存在の決定およびスプライセソームサブ複合体の同定のためにドットブロットによって分析される。
Introduction
スプライシングは、多数の因子の結合と解放を必要とする非常に動的なプロセスです。これらのスプライシング因子は、RNA結合タンパク質、ATPAses、ヘリカーゼ、タンパク質キナーゼおよびホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、とりわけ1、2、3を含む。また、分子の再調整を可能にするために、これらの要因のいくつかは、スプライセソームサブコンプレックスに非常に一時的に結合し、これらのRNP中間複合体の単離および同定を非常に困難にする。
ここでは、Grafix法4,5を使用して、酵母スプライシング因子Cwc24とBアクトコンプレックス6との相互作用を安定させ、そのサブ複合体に付随して結合する他の因子を同定し、ユビキチンリガーゼPrp19がCwc24の結合または放出に何らかの役割を果たしているかどうかを判断しました。場所。グリセロール勾配に沿って架橋剤の濃度を増加させる高分子を暴露する利点は、複合体間架橋4、5、したがって、凝集体の形成を回避することです。
この方法は、タンパク質共免疫沈降およびプルダウンアッセイの補完として使用されたが、これは、大きな複合体の単離を可能にするにもかかわらず、大きな動的複合体7,8内の一過性相互作用を維持するために信頼できない可能性がある。グリセロール勾配における固定化試薬の使用は、このような因子の結合を安定化させ、特定のタンパク質とスプライシングサブコンプレックスとの相互作用を確認することを可能にする。選択した架橋剤は化学的に不可逆的であったため、回収された画分に存在するタンパク質を、勾配遠心分離後のドットブロットで分析した。
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Protocol
1. 酵母総抽出物の調製
- 1 L YNB-glu培地(酵母窒素基底に2%m/vグルコースを補充)のTAPタグ9 に融合したスプライシング因子の1つを発現する酵母細胞を、適切なアミノ酸または核塩基で増殖させ、 この場合、アデニン(20μg/mL)、ロイシン(30μg/mL)、トリプトファン(30μg/mL)、OD600= 1.0まで。
- 1L培養から細胞を1L培養から採取し、4°Cで10分間17,000xgの3本の500mL遠心分離器ボトルで遠心し、10mL冷たい滅菌水で2回洗浄します。
- 採取した酵母細胞をコールドバッファーAの細胞体積の1/10に再懸濁させる(10 mmolL-1 HEPES pH = 7.9,1.5 mmolL-1 MgCl2,50mmolL-1 KCl,5%v/vグリセロール,0.5 mmol L-1 DTT,EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル)。
- 液体窒素中の細胞懸濁液の小さな滴を凍結します。小さな滴は、再懸濁された細胞溶液をピペット化し、50 μLを液体窒素に直接滴下することによって得ることができる。
注意:液体窒素は皮膚や目と接触して傷害を引き起こす可能性があります。適切な安全装置を使用して取り扱います。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。細胞懸濁液の凍結滴は-80°Cで保存することができる。 - ボールミル装置で20 Hz/sで6サイクル3分間粉砕して、酵母細胞のライセートを調製します。
注:各サイクルの後、凍結した細胞を含む容器を液体窒素に浸して、溶融を避けてください。プロトコルはここで一時停止することができます。凍結した抽出物は、-80°Cで保存することができる。 酵母スプライシング抽出物は、ホモジナイザーを用いて、スフェロプラスト10をリセートしたり、乳鉢および害虫11,12を使用して調製することもできる。 - それを含むチューブを室温で水に入れ、時折揺れ動かして抽出物を溶かします。
- 遠心分離機抽出物は4°Cで1時間45,000xgで抽出する。
- BCA法13によりクリアされた上澄みのタンパク質含有量を定量化する。
- 抽出物のアリコートを準備し、液体窒素で速く凍結し、-80°Cで保存します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
2. グリセロール勾配製剤
- バッファーAに2つのグリセロール溶液を調製し、1つは10%v/vを含み、もう1つは30%v/vグリセロールを含みます。
- 30%v/vグリセロール溶液中に0.1%v/vに架橋剤グルタルアルデヒドを加え、均質化するために混合する。
注意:適切な安全装置を使用して、ヒュームフード内のグルタルアルデヒドを取り扱います。 - 12 mL 遠心管の底部に冷10%v/vグリセロール溶液(14 x 89 mm)を加えます。
- 10%v/vグリセロール溶液のすぐ下に、チューブの底にグラジマスターデバイスを備えた長い針に付着した注射器を備えたグルタルアルデヒドを添加した冷たい30%v/vグリセロール溶液の6 mLを加えます。
注:または、10%v/vグリセロール溶液は、30%v/vグリセロール/グルタルアルデヒド溶液の上部に慎重にパイプすることができます。 - グラデーションマスターデバイスを使用して、連続した密度勾配を生成します。
注:勾配マスターデバイスでは、チューブは適切なラックに配置され、パラメータ(時間/角度/速度)を決定するためのメーカーの推奨事項に従って、短時間回転されます。この作業では、2:25分/81.5°/11rpmを使用しました。 - 細胞抽出物を添加する直前に、7%v/vグリセロール/バッファーAクッションを200 μL慎重に加えます。
注:クッションのグリセロール濃度は、線形勾配を作成するために使用されるあまり濃縮されたグリセロール溶液よりも低くなければなりません。
3. 遠心分離を抽出する
- 各12 mLリニアグリセロール勾配10%~30%のグルタルアルデヒドの上部に、合計タンパク質の約2mgをクッション付きでロードします。
- チューブをあらかじめ冷却されたスイングバケットローターに入れ。
メモ:超遠心分離の前に混合を避けるために、チューブを穏やかに処理します。 - 遠心分離機 194,000 x g で 16 時間 4 °C.
- アリコート 24 500 μL フラクションで、適合した Econo システムを使用するか、慎重にピペット処理を行います。
注:適合Econoシステムは、蠕動ポンプ、UV検出器、チューブ穿光装置に接続された分数コレクターで構成されています。沈み込みプロファイルは、280 nmでの吸光度の測定によって監視することができます。 - ペリスタリポンプを通して40%v/vグリセロール溶液を使用して、グリセロールをチューブから分画コレクターに10%~30%の勾配で押し込みます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。分数は使用するまで-80°Cで保管してください。 - ドットブロットまたはスロットブロットデバイス上のニトロセルロース膜に直接各画分の50 μLをロードします。2次抗体としてCBPに対する抗体(1:6,000、TAPタグのCBP部分を検出する)と抗ウサギIgG(1:15,000)を併用してタンパク質を検出した。
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Representative Results
Cwc24-TAPの沈殿プロファイルを解析し、グラフィックス法がスプライシングサブコンプレックスへの結合を安定化するのに有効であったかどうかを判断するために、Cwc24-TAPを発現する細胞の全酵母抽出物を、クロスリンク剤としてのグルタルアルデヒドの存在下または存在下にグリセロール勾配に遠心分離して分離した。24個の500 μL画分のサンプルを、次に、TAPタグのCBP部分に対する抗体を用いてスロットブロットで分析した。結果は、架橋器の不在時に、Cwc24が分数5と13(図1B)の間に集中し、約80〜200MDa14の複合体に対応することを示す。しかし、架橋器の存在下では、グラデーション上のCwc24の位置は、より大きな複合体に対応するグラデーションの下部の分数にシフトされる(図1)。これらの結果は、グルタルアルデヒドがCwc24とスプライシング複合体との関連を安定化させることを示す。
Cwc24を保持する複合体が、SnRNPs U2、U5、およびU6およびNTC複合体によって形成されるBact複合体に対応しているかどうかを確立するために、Cwc24沈殿をU5 snRNPサブユニットPrp8およびNTCサブユニットPrp19のタンパク質を発現するタンパク質の1つにそれらを比較した。 続いて、タンパク質の検出のためのドットブロットが続きます。これら3つのスプライオサムサブユニットは、グラデーションの下部に大きな複合体を有する堆積物、同様のプロファイルを示した。Cwc24は同じ分数に集中しているが、一過性にスプライセソームと関連付けるため、より軽い分数にも存在する(図2)。ドットの定量化は、これらのプロファイルを示しています (図 2B)。
興味深いことに、分数11と12はPrp8とPrp19が集中し始めるものであり、これがBact複合体が沈み始める勾配の部分であることを示唆している。これらのタンパク質がこれらの画分中の複合体に結合していることを確認するために、分画11および12のアリコートは、天然ゲル上の電気泳動を行い、その後ウェスタンブロットに供した。Prp8とPrp19のシグナルは、8%のアクリルアミドゲルに入るのがやっとのスミアとして現れ、それらが実際に大きな複合体の一部であることを示しています(図3)。Cwc24は画分12にも存在するが、はるかに低い濃度では、Bact複合体へのその過渡的結合と一致する。これらの結果は、グルタルアルデヒドが架橋剤として使用され、亜複合体のスプライシングへの過渡的因子の結合を安定化できることを示している。
図1:グラフィックスは、より大きな複合体に関連するCwc24を保持する。Cwc24-TAPを発現する細胞の全酵母抽出物は、架橋体グルタルアルデヒドの存在下または存在下のいずれかでグリセロール勾配上で遠心分離により分離した。(A)勾配の奇数分数は、TAPタグのCBP部分に対する抗体を有するCwc24-TAPの免疫検出のためにスロットブロットを施した。(B)画像Jを用いたCwc24-TAPの定量化は、グリセロール勾配の画分を通してタンパク質の濃度を示す。グルタルアルデヒドの有無が示される。Y軸は、Cwc24の勾配を通る相対量を示し、第1の分数(F n/F1)に対する、端数における信号の強度として計算する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:グリセロール/グルタルアルデヒド勾配によるスプライシング因子の沈殿Cwc24、Prp8、またはPrp19のいずれかを発現する酵母細胞の抽出物は、スプライシング複合体の分離のためにグルタルアルデヒドおよび遠心分離を含むグリセロール勾配にロードされた。(A)24画分の勾配のサンプルを、TAPタグのCBP部分に対する抗体を用いたTAP融合タンパク質のドットブロットおよび免疫検出によって分析した。(B)画像Jを用いたタンパク質の定量化は、グリセロール/グルタルアルデヒド勾配の下端での濃度を示す。Y軸は、グラディエントを通るタンパク質の相対量を示し、画分におけるシグナルの強度として計算し、背景上のシグナルを示す第1分に対して(Fn/F1)を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ネイティブPAGEおよびイムノブロットによるスプライシング複合体の検出。図2に示す勾配の画分11および12のアリコートは、8%アクリルアミド天然ゲル上の電気泳動によって分離され、CBPに対する抗体を有するイムノブロットに供された。タンパク質は、複合体が大きすぎてネイティブゲル上で分離できないため、バンドとして検出されません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
タンパク質とリボ核酸-タンパク質相互作用は、架橋剤を使用して安定化することができます。得られた複合体は、グリセロール勾配に対する超遠心化に耐える安定であることが重要である。さらに、バッファー条件では、相互作用を許可する必要がありますが、非特異的なバインドを回避するのに十分な厳格な必要があります。ここに示す実験では、インビトロスプライシング反応15に対して既に確立されている緩衝溶液を用いた。
遠心分離の速度と時間は、解析される複合体に合わせて最適化する必要があります。我々は、同様の結果で、94,000 x g で遠心サンプルと194,000 x g の16 hで異なる沈み込み条件をテストしました。これらのコントロールは、解析対象の複合体が沈殿しない条件を決定するために重要です。
また、ドットブロットがより再現性の高い結果を与えたことを示したスロットブロットまたはドットブロットシステムを使用して、膜上で直接ピペット化する異なるブロット法をテストしました。
クロスリンカーとしてグルタルアルデヒドを使用する主な制限は、架橋を元に戻すことができないということです。したがって、タンパク質はSDS-PAGEの後の免疫ブロットでは分析できませんが、ネイティブゲルまたはドットブロットによってのみ分析されます。しかし、ホルムアルデヒドなどの可逆的架橋剤も使用される可能性がある。
我々は以前、タンパク質の共免疫沈降を用いてスプライシング複合体を同定したが、一過性または弱い相互作用の場合、架橋は後で質量分析によるその成分の決定のために中間複合体の単離に役立つかもしれない。ここでの焦点は spliceosome でしたが、この方法は、さまざまな組成を持つ中間複合体を含む他の動的プロセスの分離に確実に使用できます。
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Disclosures
著者は利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、FAPESP 認可 (15/06477-9) によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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