Summary
여기서는 크로스링커가 있는 글리세롤 그라데이션 원심분리인 그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하여 쌍향적인 복합체에 일시적으로 결합하는 접합 요인 간의 상호 작용을 식별합니다.
Abstract
pre-mRNA 접합은 복잡한 성분의 조립, RNA 처리 및 방출 중에 화려한 하위 복합체의 많은 분자 재배열을 포함하는 매우 역동적인 과정입니다. 글리세롤 그라데이션 원심분리는 기능적 및 구조적 연구를 위해 단백질 또는 RNP(RiboNucleoProtein) 복합체의 분리를 위해 사용되어 왔다. 여기서는 단일 입자 저온 전자 현미경 검사법을 위한 거대 분자 복합체를 정화하고 안정화하기 위해 처음 개발된 Grafix(그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하며, 이는 스플렉션 컴플렉스에 일시적으로 결합되는 접합 인자 간의 상호 작용을 식별합니다. 이 방법은 시료의 원심분리를 복합체안정화를 위한 고정 시약의 농도증가로 기초한다. 글리세롤 그라데이션에 적재된 효모 총 추출물의 원심분리 후, 회수된 분획은 점블롯에 의해 분석되어 개별 접합 인자의 존재의 현물 및 의결을 위해.
Introduction
접합은 조정된 방식으로 다양한 요인의 바인딩 및 방출이 필요한 매우 역동적인 프로세스입니다. 이러한 접합 요인은 RNA 결합 단백질, ATPases, 헬리케이스, 단백질 키나아제 및 인산염, 유비퀴틴 리개세, 그 외1,2,3을포함한다. 그리고 분자 재배열이 일어날 수 있도록, 이러한 요인 중 일부는 매우 일시적인 이 RNP 중간 복합체의 격리 및 식별을 매우 어렵게 만듭니다.
여기서, 그라픽스 법4,5는 B액트 복합체 6과 효모 접합인자 Cwc24의 상호작용을 안정화하고, 유비퀴틴 리구아제 Prp19가 19(NTC)의 결합 또는 방출에 어떤 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해B액트 복합체6을 사용하였다. 장소. 글리세롤 그라데이션을 따라 크로스링커의 농도가 증가하는 거시분자를 노출시키는 장점은 복합간 교차링크4,5,따라서 골재형성을 피한다는 것이다.
이 방법은 단백질 면역 침전 및 풀다운 분석에 대한 보완으로 사용되었으며, 이는 큰 복합체의 분리를 허용함에도 불구하고 큰 동적복합체7,8내에서 과도 상호 작용을 유지하는 데 신뢰할 수 없을 수 있다. 글리세롤 그라데이션에서 고정 시약을 사용하면 이러한 요인의 결합을 안정화시켜 접합 서브콤플렉스와 특정 단백질의 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 선택된 크로스링커는 화학적으로 돌이킬 수 없기 때문에, 회수된 분획에 존재하는 단백질은 그라데이션 원심분리 후 점블롯에 의해 분석되었다.
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Protocol
1. 효모 총 추출물 준비
- TAP태그9에 융합된 접합인자 중 하나를 발현하는 효모 세포를 성장시키는 데 적합한 아미노산 또는 핵염기와 함께 L YNB-glu 미디어(효모 질소 기준 2%m/v 포도당으로 보충됨), 이 경우 아데닌(20 μg/mL), 류신(30 μg/mL), 트립토판(30 μg/mL), OD600 = 1.0까지.
- 1L 배양으로부터 100mL 원심분리기 병 3개에서 17,000x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 10mL 의 차가운 멸균물로 두 번 세척한다.
- 수집된 효모 세포를 콜드 버퍼 A의 세포 부피 1/10에서 재연하여(10mmolL-1 HEPES pH = 7.9, 1.5mmol L-1 MgCl2,50mmolL-1 KCl, 5% v/v 글리세롤, 0.5mmolL-1 DTT, EDTA-프리 프로제스트 억제제).
- 액체 질소에 셀 현탁액의 작은 방울을 동결. 작은 방울은 재중단 된 세포 용액을 파이프팅하고 50 μL을 액체 질소에 직접 떨어뜨려 얻을 수 있습니다.
주의: 액체 질소는 피부 또는 눈과 접촉하여 부상을 입을 수 있습니다. 적절한 안전 장비를 사용하여 처리하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 셀 서스펜션의 냉동 방울은 -80 °C에 저장 될 수있다. - 20Hz/s에서 6사이클을 통해 볼밀 장치에서 3분 동안 효모 세포용광을 준비합니다.
참고: 각 주기 후에, 녹지 않도록 액체 질소에 얼어붙은 세포를 품고 있는 용기를 담그세요. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 냉동 추출물은 -80°C에 보관할 수 있습니다. 효모 접합 추출물은 균질화제를 사용하여 구엽세포10을용해하거나 박격포 및유봉(11,12)을사용하여 제조할 수 있다. - 실내 온도에서 물에 들어 있는 튜브를 물에 넣고 가끔 흔들어 서 추출물을 녹입니다.
- 원심분리기는 4°C에서 1h에 45,000 x g에서 추출합니다.
- BCA방법(13)에의해 지워진 상체의 단백질 함량을 정량화한다.
- 추출물의 알리쿼트를 준비하고 액체 질소에 빠르게 고정하고 -80 °C에 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
2. 글리세롤 그라데이션 준비
- 버퍼 A에 두 개의 글리세롤 솔루션을 준비, 하나는 포함 10% v/v 와 다른 포함 30% v/v 글리세롤.
- 30% v/v 글리세롤 용액에 교차 연결 제글루타랄데히드를 0.1% v/v에 넣고 혼합하여 균질화합니다.
주의: 적절한 안전 장비를 사용하여 연기 후드 내부의 글루타랄데히드를 처리하십시오. - 12mL 원심분리기 튜브(14 x 89mm) 하단에 차가운 10% v/v 글리세롤 용액 6mL를 추가합니다.
- 튜브 하단에 그라데이션 마스터 장치가 제공된 긴 바늘에 부착된 주사기로 글루타랄데히드로 보충된 감기 30% v/v 글리세롤 용액6mL을 10% v/v 글리세롤 용액 아래에 추가합니다.
참고: 또는, 10% v/v 글리세롤 용액은 30% v/v 글리세롤/글루타랄데히드 용액의 상단에 조심스럽게 파이프화될 수 있다. - 그라데이션 마스터 장치를 사용하여 연속 밀도 그라데이션을 생성합니다.
참고: 그라데이션 마스터 장치에서 튜브는 매개 변수(시간/각도/속도)를 결정하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 랙에 배치되고 잠시 회전됩니다. 이 작품에서 우리는 사용 : 2:25 분 / 81.5 ° / 11 rpm. - 셀 추출물을 첨가하기 직전에 7% v/v 글리세롤/버퍼 A 쿠션의 200 μL을 조심스럽게 상단에 넣습니다.
참고: 쿠션의 글리세롤 농도는 선형 그라데이션을 만드는 데 사용되는 농축 글리세롤 용액보다 낮어야 합니다.
3. 원심분리추출
- 쿠션으로 12mL 선형 글리세롤 그라데이션 10%-30% 글루타랄데히드의 상단에 총 단백질 약 2 mg을 적재합니다.
- 미리 냉각된 스윙 버킷 로터에 튜브를 놓습니다.
참고: 초원심분리 전에 혼합하지 않도록 튜브를 부드럽게 처리합니다. - 원심분리기는 4°C에서 16h의 194,000 x g에서 원심분리기.
- Aliquot각 12 mL 튜브24 500 μL 분획적응 된 EconoSystem을 사용 하거나 신중 하 게 파이펫팅에 의해 분수.
참고: 적응된 EconoSystem은 연동 펌프, UV 검출기 및 튜브 천포링 장치에 연결된 분수 수집기로 구성됩니다. 침전 프로파일은 280 nm에서 흡광도의 측정에 의해 모니터링될 수 있다. - 연동 펌프를 통해 40% v/v 글리세롤 용액을 사용하여 튜브에서 분획 수집기로 글리세롤10%-30%의 그라데이션을 밀어넣습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 사용 전까지 분획을 -80°C에 보관합니다. - 점 얼룩 또는 슬롯 블롯 장치에 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 직접 각 분획의 50 μL을 로드합니다. CBP에 대한 항체를 이용한 면역블롯(1:6,000, TAP 태그의 CBP 부분을 검출함) 및 호스레디시어 페록시다제(1:15,000)와 결합한 항래빗 IgG를 이차 항체로 검출한다.
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Representative Results
Cwc24-TAP의 퇴적 프로파일을 분석하고 Grafix 방법이 서브콤플렉스를 접합하는 데 결합을 안정화시키는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해, 우리는 글리세롤 그라데이션에 원심분리를 통해 Cwc24-TAP를 표현하는 세포의 총 효모 추출물을 분리하여 교차 연결제로 글루타랄데히드의 존재 또는 부재에 있다. 24μL 분획의 샘플은 TAP 태그의 CBP 부분에 대한 항체를 가진 슬롯 블롯에 의해 분석되었다. 결과는 크로스링커가 없는 경우 Cwc24가 분획 5와 13(도1B)사이에 집중되어 있으며, 약 80~200MDa14의복합체에 해당한다. 그러나, 크로스링커의 존재에서, 그라데이션에 Cwc24의 위치는 더 큰 복합체에 대응하는 그라데이션의 하단에 분수로 이동된다(도1). 이러한 결과는 글루타랄데히드가 접합 복합체와 Cwc24의 협회를 안정화한다는 것을 나타냅니다.
Cwc24를 유지하는 복합체가 snRNPs U2, U5 및 U6 및 NTC 복합체에 의해 형성되는 박트 복합체에 해당하는지 여부를 확립하기 위해, 우리는 Cwc24 침전물을 U5 snRNP 서브유닛 Prp8 및 NTC 서브유닛 Prp19의 것과 비교하여 이러한 단백질 을 발동하였다. 단백질의 검출을 위한 점 얼룩다음에. 이 세 가지 화려한 하위 단위는 그라데이션의 하단에 더 큰 복합체와 퇴적, 유사한 프로파일을 보여 주었다. Cwc24는 동일한 분획에 집중되어 있지만, 화려하고 과도하게 연관되기 때문에, 또한 라이터 분획(도2)에존재한다. 점의 정량화는 이러한프로파일(도 2B)을나타낸다.
흥미롭게도, 분수 11 과 12 Prp8및 Prp19 집중하기 시작 하는 사람들, 이것은 박 트 복잡 한 퇴적물 시작 그라데이션의 부분 제안. 이러한 단백질이 이 분획에 있는 복합체에 묶여 있다는 것을 확인하기 위하여는, 분수 11 및 12의 알리쿼트가 네이티브 젤에 전기포고증을 실시하고 그 후에 서쪽 얼룩에 복종하였다. Prp8 및 Prp19의 신호는 거의 8% 아크릴아미드 젤을 입력 얼룩으로 나타납니다, 실제로 그들은 큰 복합체의 일부임을 보여주는(그림 3). Cwc24는 또한 분수 12에 존재하지만, 훨씬 낮은 농도에서, Bact 복합체에 대한 과도 결합과 일치. 이러한 결과는 글루타랄데히드가 교차링커로 사용하여 과도 요인의 결합을 안정화하여 서브콤플렉스를 접합할 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: Grafix는 더 큰 단지와 관련된 Cwc24를 보유하고 있습니다. Cwc24-TAP를 발현하는 세포의 총 효모 추출물은 크로스링커 글루타랄데히드의 부재 또는 존재에서 글리세롤 그라데이션에 대한 원심분리에 의해 분리되었다. (a)그라데이션의 홀수 분획은 TAP 태그의 CBP 부분에 대한 항체를 가진 Cwc24-TAP의 면역검출을 위한 슬롯 블롯을 실시하였다. (b)이미지 J를 이용한 Cwc24-TAP의 정량화는 글리세롤 그라데이션의 분획을 통해 단백질의 농도를 나타낸다. 글루타랄데히드의 존재 또는 부재가 표시됩니다. Y축은 그라데이션을 통해 Cwc24의 상대적 양을 나타내며, 첫 번째 분획(Fn/F1)에비해 분획에서 신호의 강도로 계산된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 글리세롤/글루타랄데히드 그라데이션을 통한 접합 인자의 퇴적물. TAP 태그에 융합된 Cwc24, Prp8 또는 Prp19를 발현하는 효모 세포의 추출물은 접합 복합체의 분리를 위해 글루타랄데히드와 원심분리를 함유한 글리세롤 그라데이션에 적재되었다. (A)그라데이션의 24분획의 샘플은 TAP 태그의 CBP 부분에 대하여 항체를 가진 TAP 융합 단백질의 도트 블롯 및 면역검출에 의해 분석되었다. (B)이미지 J를 사용하여 단백질의 정량화는 글리세롤/글루타랄데히드 그라데이션의 바닥 분획에서 의 농도를 나타낸다. Y축은 그라데이션을 통해 단백질의 상대적 양을 나타내며, 배경 위의 신호를 나타내는 첫 번째 분획에 비해 분획에서 신호의 강도로 계산된다(Fn/F1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 네이티브 PAGE 및 면역블롯에 의한 접합 복합체 검출. 도 2에 도시된 그라데이션의 분획 11 및 12의 알리쿼트는 8% 아크릴아미드 네이티브 젤에 전기전경에 의해 분리되었고 CBP에 대한 항체를 가진 면역blot를 실시하였다. 복합체가 네이티브 젤에서 분리하기에는 너무 커서 단백질이 밴드로 검출되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단백질 단백질 및 리보핵산 단백질 상호 작용은 교차 연결제를 사용하여 안정화될 수 있다. 결과 복합체는 글리세롤 그라데이션에 대한 초원심분리를 견딜 수 있는 안정성이 있는 것이 중요합니다. 또한 버퍼 조건은 상호 작용을 허용해야하지만 비특정 바인딩을 피할 수 있을 만큼 엄격해야 합니다. 여기에 표시된 실험에서, 우리는 이미 시험관 내 접합 반응(15)에대해 확립 된 버퍼 솔루션을 사용했다.
원심분리의 속도와 시간은 분석되는 복합체에 최적화되어야 합니다. 우리는 다른 퇴적 조건, 원심 분리 샘플 94,000 x g및 194,000 x g에서 4 °C에서 16 시간 동안, 유사한 결과를 테스트했습니다. 이러한 컨트롤은 분석중인 복합체가 침전되지 않는 조건을 결정하는 데 중요합니다.
우리는 또한 다른 블롯 방법을 테스트, 멤브레인에 직접 파이펫, 슬롯 블롯 또는 도트 얼룩 시스템을 사용하여, 이는 점 얼룩이 더 재현 가능한 결과를 준 것으로 나타났다.
크로스링커로 글루타랄데히드를 사용하는 주요 제한사항은 크로스링크를 되돌릴 수 없다는 것입니다. 따라서, 단백질은 SDS-PAGE 후에 면역 blot에 의해 분석될 수 없습니다, 그러나 네이티브 젤 또는 점 얼룩에 의해서만. 그러나 포름알데히드와 같은 가역적 교차 연결 제는 잠재적으로 사용될 수 있습니다.
우리는 이전에 접합 복합체를 확인하기 위해 단백질의 공동 면역 침전을 사용했지만, 일시적 또는 약한 상호 작용7의경우, 크로스 링크는 질량 분석법에 의해 자신의 구성 요소의 나중에 결정을 위한 중간 복합체의 격리를 도울 수 있습니다. 여기에 우리의 초점은 화려한했지만,이 방법은 확실히 다양한 조성을 가진 중간 복합체를 포함하는 다른 동적 프로세스의 격리에 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 FAPESP 보조금 (15/06477-9)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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