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Biochemistry

सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई स्पलिसिओसोम सबकॉम्प्लेक्स के क्षणिक इंटरप् इंटरेक्टर्स का पता लगाने के लिए ग्रेफिक्स का उपयोग

Published: November 9, 2020 doi: 10.3791/61994
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Institute of Chemistry, University of Sao Paulo

Summary

यहां, हम एक क्रॉसलिंकर की उपस्थिति में ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र, ग्रेफिक्स (ग्रेडिएंट फिक्सेशन) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो स्प्लिकोसोम कॉम्प्लेक्स में क्षणिक रूप से बांधने वाले स्प्लिसिंग कारकों के बीच बातचीत की पहचान करता है।

Abstract

प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग एक बहुत ही गतिशील प्रक्रिया है जिसमें असेंबली, आरएनए प्रसंस्करण और जटिल घटकों की रिहाई के दौरान स्प्लिकोसोम सबकॉम्टेक्स के कई आणविक पुनर्व्यवस्था शामिल हैं। कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययनों के लिए प्रोटीन या आरएनपी (रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन) परिसरों को अलग करने के लिए ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र का उपयोग किया गया है। यहां, हम ग्रेफिक्स (ग्रेडिएंट फिक्सेशन) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जिसे पहले एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों को शुद्ध और स्थिर करने के लिए विकसित किया गया था, जो स्प्लिसिंग कारकों के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए है जो स्प्लिकोसोम कॉम्प्लेक्स में क्षणिक रूप से बांधते हैं। यह विधि परिसरों को स्थिर करने के लिए एक निर्धारण अभिवाचित की बढ़ती एकाग्रता में नमूनों के अपकेंद्रण पर आधारित है। ग्लाइसरोल ग्रेडिएंट्स पर लोड किए गए खमीर कुल अर्क के अपकेंद्रित्र होने के बाद, बरामद अंशों का विश्लेषण स्लिसियोसोम उप-परिसरों की पहचान और व्यक्तिगत स्प्लिसिंग कारकों की उपस्थिति के निर्धारण के लिए डॉट दाग द्वारा किया जाता है।

Introduction

स्प्लिसिंग एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है जिसके लिए समन्वित तरीके से कई कारकों को बाध्यकारी और जारी करने की आवश्यकता होती है। इन स्प्लिसिंग कारकों में आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन, एटीपीस, हेलीकेस, प्रोटीन किनासेस और फॉस्फेट, सर्वव्यापी लिगास शामिल हैं, अन्य1,2,3; और आणविक पुनर्व्यवस्थाओं को लेने की अनुमति देने के लिए, इनमें से कुछ कारक स्प्लिकोसोम सबकॉम्टेक्स के लिए बहुत क्षणिक रूप से बांधते हैं, जिससे इन आरएनपी मध्यवर्ती परिसरों का अलगाव और पहचान बहुत चुनौतीपूर्ण हो जाती है।

यहाँ, हमने बीएक्ट कॉम्प्लेक्स6के साथ खमीर स्प्लिसिंग फैक्टर Cwc24 की बातचीत को स्थिर करने के लिए ग्रेफिक्स विधि 4,5 का उपयोग किया ताकि उस सबकॉम्प्लेक्स के साथ-साथ अन्य कारकों की पहचान की अनुमति दी जा सके और यह निर्धारित किया जा सके कि क्या यह निर्धारित किया गया है कि क्या सर्वव्यापी ligase Prp19 उन्नीस (एनटीसी) परिसर के लिए Cwc24 के बाध्यकारी या रिहाई में किसी भी भूमिका निभाता है और सक्रियण से पहले intron के 5 ' अंत करने के लिए और पहली ट्रांसेस्टरिफिकेशन प्रतिक्रिया लेता है स्थान। ग्लिसरॉल ढाल के साथ क्रॉसलिंकर की बढ़ती एकाग्रता के लिए मैक्रोमॉलिक्यूल्स को उजागर करने का लाभ यह है कि यह इंटर-कॉम्प्लेक्स क्रॉसलिंक4, 5से बचाता है, और इसलिए, समुच्चय कागठन।

इस विधि का उपयोग प्रोटीन कोइमानोप्रिपिcipitेशन और पुल-डाउन परख के पूरक के रूप में किया जाता था, जो बड़े परिसरों के अलगाव की अनुमति देने के बावजूद, बड़े गतिशील परिसरों7,8के भीतर क्षणिक बातचीत को बनाए रखने के लिए विश्वसनीय नहीं हो सकता है। ग्लिसरोल ढाल में फिक्सेशन रिएजेंट्स का उपयोग ऐसे कारकों के बाध्यकारी को स्थिर करता है, जिससे सबकॉम्टेक्स के साथ विशिष्ट प्रोटीन की बातचीत की पुष्टि होती है। क्योंकि चुना क्रॉसलिंकर रासायनिक रूप से अपरिवर्तनीय था, बरामद अंशों में मौजूद प्रोटीन ढाल अपकेंद्रित्र के बाद डॉट दाग द्वारा विश्लेषण किया गया ।

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Protocol

1. खमीर कुल निकालने की तैयारी

  1. खमीर कोशिकाओं को 1 एल YNB-ग्लू मीडिया में टैप टैग9 में शामिल करने वाले स्प्लिसिंग कारकों में से एक को व्यक्त करें (खमीर नाइट्रोजन आधार 2% मीटर/वी ग्लूकोज के साथ पूरक) उपयुक्त अमीनो एसिड या न्यूक्लिक बेस के साथ, इस मामले में, एडेनिन (20 μg/mL), ल्यूसिन (30 μg/mL), ट्रिप्टोफान (30 μg/mL), OD600 = 1.0 तक।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 x g पर तीन 500 एमएल सेंट्रलाइज बोतलों में अपकेंद्रित्र द्वारा 1 एल संस्कृति से कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 10 एमएल ठंडे बाँझ पानी के साथ दो बार धोएं।
  3. कोल्ड बफर ए (10 mmol L-1 HEPES पीएच = 7.9, 1.5 mmol L-1 MgCl2,50 mmol L-1 KCl, 5% v/v glycerol, 0.5 mmol L-1 DTT, EDTA-मुक्त प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल) ।
  4. तरल नाइट्रोजन में सेल निलंबन की छोटी बूंदों को फ्रीज करें। छोटी बूंदों को पुनर्निर् निलंबित सेल समाधान को पाइपिंग करके और 50 माइक्रोन को सीधे तरल नाइट्रोजन में छोड़कर प्राप्त किया जा सकता है।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन त्वचा या आंखों के संपर्क में चोटों का कारण बन सकता है। विनियोजित सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके संभालें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । सेल निलंबन की जमे हुए बूंदों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. खमीर कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 20 हर्ट्ज/एस पर छह चक्रों के माध्यम से एक बॉल मिल डिवाइस में पीसकर तैयार करें ।
    नोट: प्रत्येक चक्र के बाद, पिघलने से बचने के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए कोशिकाओं को शरण देने वाले कंटेनर को विसर्जित करें। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। जमे हुए अर्क -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। 10 , या मोर्टार औरमूसल11 , 12का उपयोग करने के लिए होमोजेनाइजर का उपयोग करके खमीर के स््लिसिंग अर्क भी तैयार किए जासकतेहैं।
  6. कभी-कभी हिलाते हुए, कमरे के तापमान पर पानी में युक्त ट्यूबों को रखकर निकालने को पिघलाएं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 45,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज अर्क।
  8. बीसीए विधि13द्वारा स्वीकृत सुपरनैंट की प्रोटीन सामग्री की मात्रा निर्धारित करें .
  9. अर्क के aliquots तैयार करें, उन्हें तरल नाइट्रोजन में तेजी से फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

2. ग्लिसरोल ढाल तैयारी

  1. बफर ए में दो ग्लिसरोल समाधान तैयार करें, एक जिसमें 10% v/v और दूसरा 30% v/v ग्लिसरोल युक्त है ।
  2. 30% v/v ग्लाइसेरोल समाधान में क्रॉसलिंकिंग एजेंट ग्लूटारल्डिहाइड को 0.1% v/v में जोड़ें और समरूपता के लिए मिलाएं।
    सावधानी: उचित सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके धुएं के हुड के अंदर ग्लूटारल्डिहाइड को संभालें।
  3. 12 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब (14 x 89 मिमी) के नीचे ठंड के 6 एमएल 10% v/v ग्लाइसेरोल घोल जोड़ें।
  4. ठंड के 6 एमएल जोड़ें 30% v/v ग्लिसरोल समाधान ट्यूब के नीचे ढाल मास्टर डिवाइस के साथ प्रदान की एक लंबी सुई से जुड़ी एक सिरिंज के साथ ग्लूटारल्डिहाइड के साथ पूरक, बस 10% v/v ग्लाइसेरोल समाधान के नीचे ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 10% v/v ग्लाइसरोल समाधान ध्यान से 30% v/v ग्लिसरोल/ग्लूटराल्डिहाइड समाधान के शीर्ष पर पाइप किया जा सकता है ।
  5. एक सतत घनत्व ढाल उत्पन्न करने के लिए ढाल मास्टर डिवाइस का उपयोग करें।
    नोट: ढाल मास्टर डिवाइस में, ट्यूबों एक उपयुक्त रैक में रखा जाता है और संक्षेप में घुमाया, मापदंडों (समय/कोण/गति) का निर्धारण करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के बाद । इस काम में हम इस्तेमाल किया: 2:25 मिनट/81.5 °/11 आरपीएम ।
  6. ध्यान से एक 7% v/v ग्लाइसरोल/बफर एक तकिया के २०० μL जोड़ें बस सेल अर्क के अलावा से पहले शीर्ष पर एक तकिया ।
    नोट: तकिया की ग्लिसेरोल एकाग्रता रैखिक ढाल बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले कम केंद्रित ग्लाइसेरोल समाधान से कम होनी चाहिए।

3. अर्क अपकेंद्रित्र

  1. प्रत्येक 12 एमएल रैखिक ग्लाइसेरोल ग्रेडिएंट 10%-30% ग्लूटाराल्डिहाइड के शीर्ष पर लगभग 2 मिलीग्राम कुल प्रोटीन को कुशन के साथ लोड करें।
  2. ट्यूबों को पहले से ठंडे झूले-बाल्टी रोटर में रखें।
    नोट: अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन से पहले मिश्रण से बचने के लिए ट्यूबों को धीरे से संभालें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 194,000 x g पर सेंट्रलाइज।
  4. एक अनुकूलित इकोनोसिस्टम का उपयोग करके या ध्यान से पाइपिंग करके चौबीस 500 माइक्रोन अंशों में प्रत्येक 12 एमएल ट्यूब को अलीकोट करें।
    नोट: एक अनुकूलित इकोनोसिस्टम में एक पेरिस्टाल्टिक पंप, यूवी डिटेक्टर और ट्यूब-छिद्रण डिवाइस से जुड़े अंश कलेक्टर होते हैं। तलछट प्रोफ़ाइल 280 एनएम पर अवशोषण के माप से निगरानी की जा सकती है।
  5. ट्यूब से ग्लिसेरोल 10%-30% ढाल को अंश कलेक्टर को पुश करने के लिए पेरिस्टाटिक पंप के माध्यम से 40% v/v ग्लिसरोल समाधान का उपयोग करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । उपयोग होने तक अंशों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. एक डॉट दाग या स्लॉट दाग डिवाइस पर नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली पर सीधे प्रत्येक अंश का 50 माइक्रोन लोड करें। सीबीपी (1:6,000, टैप टैग के सीबीपी हिस्से का पता लगाने के लिए) और एंटी-रैबिट आईजीजी के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लॉट द्वारा प्रोटीन का पता लगाएं, जो कि सिग्नेरिश पेरोक्सिडेस (1:15,000) के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में संयोजित है।

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Representative Results

Cwc24-TAP के तलछट प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ग्रेफिक्स विधि सबकॉम्टेक्स को स्प्लिस करने के लिए अपने बाध्यकारी को स्थिर करने के लिए प्रभावी थी, हमने एक क्रॉसलिंकिंग एजेंट के रूप में ग्लूटारलाइड की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट्स पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से Cwc24-TAP व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के कुल खमीर अर्क को अलग किया। चौबीस 500 μL अंशों के नमूनों तो नल टैग के सीबीपी भाग के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ स्लॉट दाग द्वारा विश्लेषण किया गया। परिणाम बताते हैं कि क्रॉसलिंकर की अनुपस्थिति में, Cwc24 लगभग 80 से 200 एमडीए 14 के परिसरों के अनुरूप 5 और13(चित्रा 1B)के अंशों के बीच केंद्रित है। क्रॉसलिंकर की उपस्थिति में, हालांकि, ढाल पर Cwc24 की स्थिति को ढाल के तल पर अंशों में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जो बड़े परिसरों(चित्र 1) केअनुरूप होता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ग्लूटारल्डिहाइड स्पैलिसिंग कॉम्प्लेक्स के साथ Cwc24 के संघ को स्थिर करता है।

यह स्थापित करने के लिए कि क्या CWC24 को बनाए रखने वाले कॉम्प्लेक्स Bact परिसर के अनुरूप हैं, जो snRNPs U2, U5, और U6 और एनटीसी कॉम्प्लेक्स द्वारा गठित है, हमने Cwc24 तलछट की तुलना U5 snRNP सबयूनिट Prp8 और NTC सबयूनिट Prp19 के उन लोगों से की है । नल टैग से जुड़े इन प्रोटीनों में से किसी को व्यक्त करने वाले खमीर उपभेदों को ग्रेफिक्स, ग्रैफिक्स, के अधीन किया गया था । इसके बाद प्रोटीन का पता लगाने के लिए डॉट दाग। इन तीन स्लिसिओसोम सबयूनिट ने इसी तरह की प्रोफाइल दिखाई, जो ढाल के तल पर बड़े परिसरों के साथ तलछट थी। Cwc24 एक ही अंश में केंद्रित है, लेकिन क्योंकि यह spliceosome के साथ क्षणिक सहयोगियों, यह भी हल्का अंश(चित्रा 2)में मौजूद है । डॉट्स का क्वांटिफिकेशन इन प्रोफाइल(चित्रा 2B) को दिखाताहै ।

दिलचस्प बात यह है कि अंश 11 और 12 वे हैं जहां Prp8 और Prp19 ध्यान केंद्रित करना शुरू करते हैं, सुझाव है कि यह ढाल का हिस्सा है जहां Bact जटिल तलछट शुरू होता है । यह पता लगाने के लिए कि ये प्रोटीन इन अंशों में जटिलों से बंधे हुए हैं, 11 और 12 अंशों के aliquots देशी जैल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस के अधीन थे और बाद में पश्चिमी दाग के लिए । Prp8 और Prp19 के संकेत स्मीयरों के रूप में दिखाई देते हैं जो मुश्किल से 8% एक्रिलामाइड जेल में प्रवेश करते हैं, जिससे पता चलता है कि वास्तव में वे बड़े परिसरों(चित्रा 3)का हिस्सा हैं। Cwc24 अंश 12 में भी मौजूद है, लेकिन बहुत कम एकाग्रता में, Bact परिसर के लिए अपने क्षणिक बाध्यकारी के अनुरूप । इन परिणामों से पता चलता है कि ग्लूटारल्डिहाइड का उपयोग क्रॉसलिंकर के रूप में किया जा सकता है ताकि क्षणिक कारकों के बाध्यकारी को सबकॉम्प्लेक्स को स्प्लाइज करने के लिए स्थिर किया जा सके।

Figure 1
चित्रा 1: Grafix बड़े परिसरों से जुड़े Cwc24 रखती है । Cwc24-TAP व्यक्त कोशिकाओं के कुल खमीर निकालने को क्रॉसलिंकर ग्लूटाराल्डिहाइड की अनुपस्थिति या उपस्थिति में ग्लाइसरोल ग्रेडिएंट्स पर अपकेंद्री द्वारा अलग किया गया था। (A)ढाल के विषम अंशों को टैप टैग के सीबीपी हिस्से के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ Cwc24-TAP के इम्यूनोडेटेक्शन के लिए स्लॉट दाग के अधीन किया गया था । (ख)इमेज जे का उपयोग करके Cwc24-TAP का क्वांटिफिकेशन ग्लाइसरोल ढाल के अंशों के माध्यम से प्रोटीन की एकाग्रता को दर्शाता है । ग्लूटारल्डिहाइड की उपस्थिति या अनुपस्थिति इंगित की गई है। वाई अक्ष ढाल के माध्यम से Cwc24 की सापेक्ष मात्रा से पता चलता है, अंशों में संकेत की तीव्रता के रूप में गणना, पहले अंश के सापेक्ष (एफएन/एफ1)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ग्लाइसरोल/ग्लूटारल्डिहाइड ग्रेडिएंट्स के माध्यम से स्प्लिसिंग कारकों का तलछट। नल टैग के लिए या तो Cwc24, Prp8, या Prp19 को अभिव्यक्त करने वाली खमीर कोशिकाओं के अर्क को ग्लूटारल्डिहाइड युक्त ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट पर लोड किया गया था और स्प्लिसिंग कॉम्प्लेक्स के पृथक्करण के लिए अपकेंद्रित्र किया गया था। (क)ग्रेडिएंट के चौबीस अंशों के नमूनों का विश्लेषण टैप टैग के सीबीपी हिस्से के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ टैप-फ्यूज्ड प्रोटीन के डॉट ब्लॉट और इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा किया गया था । (ख)इमेज जे का उपयोग करने वाले प्रोटीन का क्वांटिफिकेशन ग्लाइसरोल/ग्लूटारल्डिहाइड ग्रेडिएंट के निचले अंशों पर उनकी एकाग्रता को दर्शाता है । वाई-एक्सिस ढाल के माध्यम से प्रोटीन की सापेक्ष मात्रा दिखाता है, अंशों में संकेत की तीव्रता के रूप में गणना, पृष्ठभूमि के ऊपर एक संकेत दिखाने वाले पहले अंश के सापेक्ष (एफएन/एफ1)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: देशी पेज और इम्यूनोब्लॉट द्वारा स्प्लिसिंग कॉम्प्लेक्स का पता लगाना। चित्रा 2 में दिखाए गए ढाल के 11 और 12 अंशों के अलीकोट को इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा 8% एक्रिलामाइड देशी जेल पर अलग किया गया था और सीबीपी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लॉट के अधीन किया गया था। प्रोटीन बैंड के रूप में पता नहीं कर रहे हैं क्योंकि परिसरों देशी जैल पर अलग करने के लिए बहुत बड़े हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटीन-प्रोटीन और राइबोन्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन इंटरैक्शन को क्रॉसलिंकिंग एजेंटों का उपयोग करके स्थिर किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि परिणामी परिसर ग्लिसरोल ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का सामना करने के लिए स्थिर है। इसके अतिरिक्त, बफर शर्तों बातचीत की अनुमति चाहिए, लेकिन काफी कठोर गैर विशिष्ट बाध्यकारी से बचने के लिए । यहां दिखाए गए प्रयोगों में, हमने इन विट्रो स्प्लिसिंग प्रतिक्रियाओं के लिए पहले से ही स्थापित एक बफर समाधान का उपयोग किया15।

विश्लेषण किए जा रहे परिसरों के लिए अपकेंद्रित्र की गति और समय को अनुकूलित किया जाना चाहिए। हमने विभिन्न तलछट स्थितियों का परीक्षण किया, 94,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र नमूने और 194,000 x ग्राम 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, इसी तरह के परिणामों के साथ। ये नियंत्रण उन स्थितियों को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जिनमें विश्लेषण किया जा रहा परिसर ों में तेज़ी नहीं है।

हमने स्लॉट ब्लॉट या डॉट ब्लॉट सिस्टम का उपयोग करके झिल्ली पर सीधे पाइपिंग, विभिन्न दाग विधियों का भी परीक्षण किया, जिससे पता चला कि डॉट दाग ने अधिक प्रजनन योग्य परिणाम दिए।

क्रॉसलिंकर के रूप में ग्लूटारल्डिहाइड का उपयोग करने की एक बड़ी सीमा यह है कि क्रॉसलिंक को वापस नहीं किया जा सकता है। इसलिए, प्रोटीन का विश्लेषण एसडीएस-पेज के बाद इम्यूनोब्लॉट द्वारा नहीं किया जा सकता है, लेकिन केवल देशी जैल या डॉट दाग द्वारा। हालांकि, फॉर्मलडिहाइड जैसे रिवर्सिबल क्रॉसलिंकिंग एजेंटों का संभवतः उपयोग भी किया जा सकता है।

हमने पहले स्प्लिसिंग कॉम्प्लेक्स की पहचान करने के लिए प्रोटीन के सह-इम्यूनोप्रिपिक्शन का उपयोग किया है, लेकिन क्षणिक या कमजोर बातचीत7के मामले में, क्रॉसलिंक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अपने घटकों के बाद के निर्धारण के लिए मध्यवर्ती परिसरों के अलगाव में मदद कर सकता है। यद्यपि यहां हमारा ध्यान स्प्लिसेसोम था, इस विधि का उपयोग निश्चित रूप से अन्य गतिशील प्रक्रियाओं के अलगाव के लिए किया जा सकता है जिसमें अलग-अलग रचनाओं के साथ मध्यवर्ती परिसर शामिल हैं।

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Disclosures

लेखकों के हितों के टकराव नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एफएपीईपी ग्रांट (15/06477-9) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Millipore 07-482
ECL anti-Rabbit IgG GE Healthcare NA934
EconoSystem Bio-Rad 1-800-424-6723 Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
Fraction Recovery System Beckman Coulter 270-331580 Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip Biocomp 107-201M
Mixer Mill MM 200 Retsch 207460001 Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex Thermo Scientific 096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific 36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX Hitachi 901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) Beckman Coulter 344059

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References

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<em>सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई</em> स्पलिसिओसोम सबकॉम्प्लेक्स के क्षणिक इंटरप् इंटरेक्टर्स का पता लगाने के लिए ग्रेफिक्स का उपयोग
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Carvalho, F. A., Barros, M. R. A.,… More

Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes. J. Vis. Exp. (165), e61994, doi:10.3791/61994 (2020).

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