Summary
Qui, descriviamo l'utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), una centrifugazione a gradiente di glicerolo in presenza di un reticolante, per identificare le interazioni tra fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma.
Abstract
Lo splicing pre-mRNA è un processo molto dinamico che coinvolge molti riarrangiamenti molecolari dei sottocomplessi dello spliceosoma durante l'assemblaggio, l'elaborazione dell'RNA e il rilascio dei componenti complessi. La centrifugazione a gradiente di glicerolo è stata utilizzata per la separazione di complessi proteici o RNP (RiboNucleoProtein) per studi funzionali e strutturali. Qui, descriviamo l'utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), che è stato sviluppato per la prima volta per purificare e stabilizzare i complessi macromolecolari per la microscopia crioeletnica a singola particella, per identificare le interazioni tra i fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma. Questo metodo si basa sulla centrifugazione di campioni in una concentrazione crescente di un reagente di fissazione per stabilizzare i complessi. Dopo la centrifugazione degli estratti totali di lievito caricati su gradienti di glicerolo, le frazioni recuperate vengono analizzate mediante dot blot per l'identificazione dei sotto-complessi spliceosomiali e la determinazione della presenza di singoli fattori di splicing.
Introduction
Lo splicing è un processo altamente dinamico che richiede il legame e il rilascio di una moltitudine di fattori in modo coordinato. Questi fattori di splicing includono proteine leganti l'RNA, ATPasi, elicasi, protein chinasi e fosfatasi, ubiquitina ligases, tra gli altri1,2,3; e per consentire i riarrangiamenti molecolari, alcuni di questi fattori si legano molto transitoriamente ai sottocomplessi dello spliceosoma, rendendo molto impegnativo l'isolamento e l'identificazione di questi complessi intermedi RNP.
Qui, abbiamo usato il metodo Grafix4,5 per stabilizzare l'interazione del fattore di splicing del lievito Cwc24 con il complesso diatto B6 per consentire l'identificazione di altri fattori legati contemporaneamente a quel sottocomplesso e determinare se l'ubiquitina ligasi Prp19 svolge un ruolo nel legame o nel rilascio di Cwc24 al complesso Nineteen (NTC) e all'estremità 5' dell'intron prima dell'attivazione e della prima reazione di transesterificazione prende luogo. Il vantaggio di esporre le macromolecole ad una concentrazione crescente del reticolante lungo il gradiente glicerolo è che evita i collegamenti incrociati inter-complessi4,5e quindi, la formazione di aggregati.
Questo metodo è stato utilizzato come complemento ai saggi di coimmunoprecipitazione e pull-down proteici, che, pur consentendo l'isolamento di grandi complessi, potrebbero non essere affidabili per mantenere interazioni transitorie all'interno di grandi complessidinamici 7,8. L'uso di reagenti di fissazione nel gradiente del glicerolo stabilizza il legame di tali fattori, consentendo la conferma delle interazioni di proteine specifiche con sottocomplessi di splicing. Poiché il reticolante scelto era chimicamente irreversibile, le proteine presenti nelle frazioni recuperate sono state analizzate mediante dot blot dopo la centrifugazione a gradiente.
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Protocol
1. Preparazione dell'estratto totale di lievito
- Crescono le cellule di lievito esprimendo uno dei fattori di splicing fusi al TAP tag9 in 1 L YNB-glu media (Yeast Nitrogen Basis integrato con glucosio 2% m/v) con gli aminoacidi o le basi nucleiche appropriate, in questo caso adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptofano (30 μg/mL), fino a OD600 = 1,0.
- Raccogliere le cellule dalla coltura da 1 L centrifugando in tre flaconi di centrifuga da 500 mL a 17.000 x g per 10 minuti a 4 °C e lavare due volte con 10 ml di acqua sterile fredda.
- Risospesso le cellule di lievito raccolte in 1/10 del volume cellulare del tampone freddo A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v / v glicerolo, 0,5 mmol L-1 DTT, edTA-free Protease Inhibitor Cocktail).
- Congelare piccole gocce di sospensione cellulare in azoto liquido. Le piccole gocce possono essere ottenute pipettando la soluzione cellulare rinsosciata e facendo cadere 50 μL direttamente nell'azoto liquido.
ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare lesioni a contatto con la pelle o gli occhi. Maneggiare utilizzando attrezzature di sicurezza appropriate.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Le gocce congelate di sospensione cellulare possono essere conservate a -80 °C. - Preparare i lasati di cellule di lievito macinando in un dispositivo Ball Mill attraverso sei cicli a 20 Hz / s per 3 minuti.
NOTA: Dopo ogni ciclo, immergere il contenitore che ospita le celle congelate in azoto liquido per evitare la fusione. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Gli estratti congelati possono essere conservati a -80 °C. Gli estratti di splicing del lievito possono anche essere preparati utilizzando omogeneizzatori per lisato sferoplasti10,o utilizzando mortaio e pestello11,12. - Sciogliere l'estratto mettendo i tubi che li contengono in acqua a temperatura ambiente, agitando di tanto in tanto.
- Centrifugare estratti a 45.000 x g per 1 ora a 4 °C.
- Quantificare il contenuto proteico del surnatante eliminato con il metodo BCA13.
- Preparare aliquote degli estratti, congelarli rapidamente in azoto liquido e conservarli a -80 °C.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Preparazione del gradiente di glicerolo
- Preparare due soluzioni di glicerolo nel tampone A, una contenente il 10% v/v e l'altra contenente il 30% di glicerolo v/v.
- Aggiungere l'agente reticolante glutaraldeide allo 0,1% v/v nella soluzione di glicerolo al 30% v/v e mescolare per omogeneizzare.
ATTENZIONE: Maneggiare la glutaraldeide all'interno della cappa aspirante utilizzando appositi dispositivi di sicurezza. - Aggiungere 6 mL della soluzione fredda di glicerolo al 10% v/v sul fondo del tubo della centrifuga da 12 mL (14 x 89 mm).
- Aggiungere 6 mL della soluzione fredda di glicerolo al 30% v/v integrata con glutaraldeide con una siringa attaccata a un ago lungo fornito con il dispositivo Gradient Master nella parte inferiore del tubo, appena sotto la soluzione di glicerolo al 10% v/v.
NOTA: In alternativa, la soluzione di glicerolo al 10% v/v può essere accuratamente pipettata sulla parte superiore della soluzione di glicerolo/glutaraldeide al 30% v/v. - Utilizzare il dispositivo Master sfumatura per generare una sfumatura di densità continua.
NOTA: nel dispositivo Gradient Master, i tubi vengono inseriti in un rack appropriato e ruotati brevemente, seguendo le raccomandazioni del produttore per determinare i parametri (tempo/angolo/velocità). In questo lavoro abbiamo usato: 2:25 min/81.5°/11 rpm. - Aggiungere con attenzione 200 μL di un cuscino di glicerolo/tampone al 7% v/v sulla parte superiore poco prima dell'aggiunta degli estratti cellulari.
NOTA: La concentrazione di glicerolo del cuscino deve essere inferiore alla soluzione di glicerolo meno concentrata utilizzata per creare il gradiente lineare.
3. Centrifugazione degli estratti
- Caricare circa 2 mg di proteine totali sulla parte superiore di ogni 12 mL gradiente lineare di glicerolo 10%-30% glutaraldeide con cuscino.
- Posizionare i tubi in un rotore a benna oscillante pre-raffreddato.
NOTA: Maneggiare delicatamente i tubi per evitare la miscelazione prima dell'ultracentrifugazione. - Centrifuga a 194.000 x g per 16 ore a 4 °C.
- Aliquotare ogni tubo da 12 mL in ventiquattro frazioni da 500 μL utilizzando un EconoSystem adattato o mediante pipettaggio attento.
NOTA: un EconoSystem adattato è costituito da una pompa peristaltica, dal rilevatore UV e dal collettore di frazioni collegato al dispositivo di perforazione del tubo. Il profilo di sedimentazione può essere monitorato mediante la misurazione dell'assorbanza a 280 nm. - Utilizzare una soluzione di glicerolo al 40% v/v attraverso la pompa peristaltica per spingere il gradiente del glicerolo del 10%-30% dal tubo al collettore di frazione.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare le frazioni a -80 °C fino all'uso. - Caricare 50 μL di ogni frazione direttamente sulle membrane di nitrocellulosa su un dispositivo dot blot o slot blot. Rileva la proteina mediante immunoblot utilizzando anticorpi contro CBP (1:6.000, per rilevare la porzione CBP del tag TAP) e IgG anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (1:15.000) come anticorpo secondario.
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Representative Results
Per analizzare il profilo di sedimentazione di Cwc24-TAP e determinare se il metodo Grafix fosse efficace per stabilizzare il suo legame ai sottocomplessi di splicing, abbiamo separato estratti di lievito totali di cellule che esprimono Cwc24-TAP attraverso centrifugazione su gradienti di glicerolo, in presenza o assenza di glutaraldeide come agente reticolante. Campioni di ventiquattro frazioni da 500 μL sono stati poi analizzati mediante slot blot con anticorpo contro la porzione CBP del tag TAP. I risultati mostrano che in assenza del reticolante, Cwc24 è concentrato tra le frazioni 5 e 13 (Figura 1B), corrispondenti a complessi di circa 80-200 MDa14. In presenza del reticolante, tuttavia, la posizione di Cwc24 sul gradiente viene spostata su frazioni nella parte inferiore del gradiente, corrispondenti a complessi più grandi (Figura 1). Questi risultati indicano che la glutaraldeide stabilizza l'associazione di Cwc24 con i complessi di giunzione.
Per stabilire se i complessi che trattengono Cwc24 corrispondono al complesso Bact, che è formato da snRP U2, U5 e U6 e al complesso NTC, abbiamo confrontato la sedimentazione Cwc24 con quelle della subunità U5 snRNP Prp8 e della subunità NTC Prp19. I ceppi di lievito che esprimono una di queste proteine fuse al tag TAP sono stati sottoposti a Grafix, seguito da dot blot per la rilevazione delle proteine. Queste tre subunità di spliceosomi mostravano profili simili, sedimentando con complessi più grandi nella parte inferiore del gradiente. Cwc24 è concentrato nelle stesse frazioni, ma poiché si associa transitoriamente allo spliceosoma, è presente anche nelle frazioni più leggere (Figura 2). La quantificazione dei punti mostra questi profili (Figura 2B).
È interessante notare che le frazioni 11 e 12 sono quelle in cui Prp8 e Prp19 iniziano a concentrarsi, suggerendo che questa è la porzione del gradiente in cui il complesso bact inizia a sedimentare. Per accertare che queste proteine sono legate a complessi in queste frazioni, aliquote delle frazioni 11 e 12 sono state sottoposte a elettroforesi su gel nativi e successivamente a western blot. I segnali di Prp8 e Prp19 appaiono come strisci che a malapena entrano in un gel di acrilammide all'8%, dimostrando che in effetti fanno parte di grandi complessi (Figura 3). Cwc24 è presente anche nella frazione 12, ma in concentrazione molto più bassa, coerente con il suo legame transitorio al complesso bact. Questi risultati mostrano che la glutaraldeide può essere utilizzata come reticolante per stabilizzare il legame di fattori transitori ai sottocomplessi di giunzione.
Figura 1: Grafix tiene Cwc24 associato a complessi più grandi. L'estratto totale di lievito delle cellule che esprimono Cwc24-TAP è stato separato mediante centrifugazione su gradienti di glicerolo, sia in assenza che in presenza del reticolante glutaraldeide. (A) Frazioni dispari del gradiente sono state sottoposte a slot blot per l'immunodetezione di Cwc24-TAP con anticorpo contro la porzione CBP del tag TAP. (B) La quantificazione di Cwc24-TAP utilizzando l'immagine J mostra la concentrazione della proteina attraverso le frazioni del gradiente di glicerolo. È indicata la presenza o l'assenza di glutaraldeide. L'asse Y mostra le quantità relative di Cwc24 attraverso il gradiente, calcolate come intensità del segnale nelle frazioni, rispetto alla prima frazione (Fn/F1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sedimentazione dei fattori di giunzione attraverso gradienti glicerolo/glutaraldeide. Estratti di cellule di lievito che esprimono Cwc24, Prp8 o Prp19 fusi al tag TAP sono stati caricati su gradienti di glicerolo contenenti glutaraldeide e centrifugati per la separazione dei complessi di giunzione. (A) Campioni delle ventiquattro frazioni del gradiente sono stati analizzati mediante dot blot e immunodetezione delle proteine fuse TAP con anticorpo contro la porzione CBP del tag TAP. (B) La quantificazione delle proteine utilizzando l'immagine J mostra la loro concentrazione nelle frazioni inferiori del gradiente glicerolo/glutaraldeide. L'asse Y mostra le quantità relative delle proteine attraverso il gradiente, calcolate come intensità del segnale nelle frazioni, rispetto alla prima frazione che mostra un segnale sopra lo sfondo (Fn/ F1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilevamento di complessi di splicing da parte di PAGE nativo e immunoblot. Le aliquote delle frazioni 11 e 12 del gradiente mostrato nella Figura 2 sono state separate mediante elettroforesi su gel nativo di acrilammide all'8% e sottoposte a immunoblot con anticorpi contro CBP. Le proteine non vengono rilevate come bande perché i complessi sono troppo grandi per separarsi sui gel nativi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le interazioni proteina-proteina e acidi ribonucleici-proteina possono essere stabilizzate utilizzando agenti reticolanti. È importante che il complesso risultante sia stabile per resistere all'ultracentrifugazione sul gradiente di glicerolo. Inoltre, le condizioni del buffer dovrebbero consentire l'interazione, ma essere abbastanza rigorose da evitare binding non specifici. Negli esperimenti qui mostrati, abbiamo utilizzato una soluzione tampone già stabilita per le reazioni di splicing in vitro15.
La velocità e il tempo di centrifugazione dovrebbero essere ottimizzati per i complessi analizzati. Abbiamo testato diverse condizioni di sedimentazione, centrifugando campioni a 94.000 x g e 194.000 x g per 16 ore a 4 °C, con risultati simili. Questi controlli sono importanti per determinare le condizioni in cui i complessi analizzati non precipitano.
Abbiamo anche testato diversi metodi di blot, pipettando direttamente sulla membrana, utilizzando sistemi slot blot o dot blot, che hanno dimostrato che dot blot ha dato risultati più riproducibili.
Una delle principali limitazioni dell'uso della glutaraldeide come reticolante è che la reticolazione non può essere ripristinata. Pertanto, le proteine non possono essere analizzate da immunoblot dopo SDS-PAGE, ma solo da gel nativi o dot blot. Tuttavia, potrebbero potenzialmente essere utilizzati anche agenti reticolanti reversibili, come la formaldeide.
In precedenza abbiamo utilizzato la co-immunoprecipitazione delle proteine per identificare i complessi di splicing, ma nel caso di interazioni transitorie o deboli7, la reticolazione può aiutare l'isolamento di complessi intermedi per la successiva determinazione dei loro componenti mediante spettrometria di massa. Sebbene il nostro focus qui fosse lo spliceosoma, questo metodo può certamente essere utilizzato per l'isolamento di altri processi dinamici che includono complessi intermedi con composizioni variabili.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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