Summary
Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
Pre-mRNA birleştirme, karmaşık bileşenlerin montajı, RNA işlemesi ve serbest bırakılması sırasında spliceosome alt komkomplexlerinin birçok moleküler yeniden düzenlenmesini içeren çok dinamik bir süreçtir. Gliserol gradyan santrifüjleme fonksiyonel ve yapısal çalışmalar için protein veya RNP (RiboNucleoProtein) komplekslerinin ayrılması için kullanılmıştır. Burada, ilk olarak tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi için makromoleküler kompleksleri arındırmak ve stabilize etmek, spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için geliştirilen Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu) kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntem, kompleksleri stabilize etmek için numunelerin artan bir sabitleme reaktif konsantrasyonuna santrifüjlenmesine dayanmaktadır. Gliserol gradyanlarına yüklenen maya toplam özlerinin santrifüjlenmesinden sonra, geri kazanılan fraksiyonlar spliceosome alt komplekslerinin tanımlanması ve bireysel birleştirme faktörlerinin varlığının belirlenmesi için nokta lekesi ile analiz edilir.
Introduction
Birleştirme, çok sayıda faktörün koordineli bir şekilde bağlanmasını ve serbest bırakılmasını gerektiren son derece dinamik bir işlemdir. Bu birleştirme faktörleri arasında RNA bağlayıcı proteinler, ATPases, helicases, protein kinazları ve fosfatazlar, ubiquitin ligases, diğerleri arasında1,2,3; ve moleküler yeniden düzenlemelerin gerçekleşmesine izin vermek için, bu faktörlerin bazıları çok geçici olarak spliceosome alt komitelerine bağlanır ve bu RNP ara komplekslerinin izolasyonu ve tanımlanmasını çok zorlaştırır.
İşte, Grafix yöntemi4,5'i, maya birleştirme faktörü Cwc24'ün Bact complex6 ile etkileşimini stabilize etmek için kullandık, bu alt sıkıştırıcıya birlikte bağlı diğer faktörlerin tanımlanmasına izin vermek ve ubiquitin ligase Prp19, Cwc24'ün on dokuz (NTC) kompleksine bağlanmasında veya serbest bırakılmasında ve aktivasyondan önce intronun 5' ucuna kadar herhangi bir rol oynar ve ilk transesterifikasyon reaksiyonu alır yer. Makromolekülleri gliserol gradyanı boyunca artan bir çapraz bağlantı konsantrasyonuna maruz kalmanın avantajı, kompleksler arası çaprazbağlantılardan 4,5ve dolayısıyla agregaların oluşumunu önlemesidir.
Bu yöntem, büyük komplekslerin izolasyonuna izin vermesine rağmen, büyük dinamik kompleksler içinde geçici etkileşimleri sürdürmek için güvenilir olmayabileceği protein koimmunoprecipitation ve çekme tahlillerinin tamamlayıcısı olarak kullanılmıştır7,8. Gliserol gradyanındaki fiksasyon reaktiflerinin kullanımı, bu faktörlerin bağlanmasını stabilize ederek, belirli proteinlerin birleştirme altcomplexes ile etkileşimlerinin onaylanmasını sağlar. Seçilen çapraz bağlantı kimyasal olarak geri döndürülemez olduğundan, geri kazanılan fraksiyonlarda bulunan proteinler gradyan santrifüjlemeden sonra nokta lekesi ile analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maya toplam özü hazırlığı
- 1 L YNB-glu ortam (%2 m/v glikoz ile desteklenmiş Maya Nitrojen Temeli)9'da TAP etiketine kaynaşmış birleştirme faktörlerinden birini uygun amino asitler veya çekirdek bazlarla ifade eden maya hücrelerini büyütün, Bu durumda, adenin (20 μg/mL), lösin (30 μg/mL), triptofan (30 μg/mL), OD600 = 1.0'a kadar.
- 1 L kültüründen hücreleri 17.000 x g'da üç adet 500 mL santrifüj şişesinde 4 °C'de 10 dakika santrifüjle toplayın ve 10 mL soğuk steril su ile iki kez yıkayın.
- Toplanan maya hücrelerini soğuk tampon A hücre hacminin 1/10'unda yeniden depolar (10 mmol L-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L-1 MgCl2,50 mmol L-1 KCl, %5 v/v gliserol, 0.5 mmol L-1 DTT, EDTA içermeyen Proteaz inhibitör Kokteyli).
- Sıvı nitrojende küçük hücre süspansiyon damlalarını dondurun. Küçük damlalar, yeniden sulandırılmış hücre çözeltisinin pipetleilmesi ve 50 μL'nin doğrudan sıvı nitrojene düşmesiyle elde edilebilir.
DİkKAT: Sıvı nitrojen cilt veya gözlerle temas halinde yaralanmalara neden olabilir. Uygun güvenlik ekipmanlarını kullanarak sapla.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Donmuş hücre süspansiyon damlaları -80 °C'de saklanabilir. - 3 dakika boyunca 20 Hz/s'de altı döngü boyunca bir Ball Mill cihazında öğüterek maya hücreleri lysates hazırlayın.
NOT: Her döngüden sonra, erimeyi önlemek için donmuş hücreleri barındıran kabı sıvı nitrojene batırın. Protokol burada duraklatılabilir. Dondurulmuş özler -80 °C'de saklanabilir. Maya birleştirme özleri, sferoplastları10'u yutacak homojenizatörler kullanılarak veya harç ve pestle11,12kullanılarak da hazırlanabilir. - İçerdiği tüpleri oda sıcaklığında suya yerleştirerek, ara sıra sallayarak özü eritin.
- Santrifüj, 4 °C'de 1 saat boyunca 45.000 x g'da santrifüj çıkarır.
- Temizlenen süpernatantın protein içeriğini BCA yöntemi ile ölçün13.
- Özlerin aliquotlarını hazırlayın, sıvı nitrojende hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
2. Gliserol gradyan hazırlığı
- Tampon A'da biri %10 v/v, diğeri %30 v/v gliserol içeren iki gliserol çözeltisi hazırlayın.
- Çapraz bağlama maddesi glutaraldehitini %30 v/v gliserol çözeltisine %0,1 v/v'ye ekleyin ve homojenize etmek için karıştırın.
DİkKAT: Uygun güvenlik ekipmanlarını kullanarak duman kaputunun içindeki glutaraldehiti kullanın. - 12 mL santrifüj tüpünün (14 x 89 mm) altına 6 mL soğuk %10 v/v gliserol çözeltisi ekleyin.
- Tüpün altındaki Degrade Master cihazı ile sağlanan uzun bir iğneye bağlı bir şırınga ile glutaraldehit ile desteklenmiş soğuk 30% v / v gliserol çözeltisinin 6 mL'sini ekleyin, % 10 v / v gliserol çözeltisinin hemen altında.
NOT: Alternatif olarak, %10 v/v gliserol çözeltisi% 30 v/v gliserol/glutaraldehit çözeltisinin üstüne dikkatlice pipetlenebilir. - Sürekli yoğunluk degradesi oluşturmak için Degrade Ana aygıtını kullanın.
NOT: Degrade Master cihazında, tüpler uygun bir rafa yerleştirilir ve parametrelerin belirlenmesi için üreticinin önerilerine (zaman/açı/hız) uyularak kısa bir süre döndürülür. Bu çalışmada kullandık: 2:25 dk/81.5°/11 rpm. - Hücre özlerinin eklenmesinden hemen önce tepeye 200 μL% 7 v / v gliserol / tampon A yastığı ekleyin.
NOT: Minderin gliserol konsantrasyonu, doğrusal gradyanı oluşturmak için kullanılan daha az konsantre gliserol çözeltisinden daha düşük olmalıdır.
3. Santrifüjü çıkarır
- Yastık ile her 12 mL lineer gliserol gradyanı 10% –30% glutaraldehitin üzerine yaklaşık 2 mg toplam protein yükleyin.
- Tüpleri önceden soğutulmuş bir salıncak kovası rotorasına yerleştirin.
NOT: Ultrasantrifüjlemeden önce karıştırmayı önlemek için tüpleri hafifçe takın. - 4 °C'de 16 saat için 194.000 x g'da santrifüj.
- Aliquot her 12 mL tüp yirmi dört 500 μL fraksiyonlarda uyarlanmış bir EconoSystem kullanarak veya dikkatlice pipetleme ile.
NOT: Uyarlanmış bir EconoSystem, peristaltik bir pompa, UV dedektörü ve tüp delinme cihazına bağlı fraksiyon toplayıcıdan oluşur. Çökeltme profili, emiciliğin 280 nm'de ölçülebilmesiyle izlenebilir. - Glistaltik pompadan %40 v/v gliserol çözeltisi kullanarak gliserol%10-%30 gradyanı tüpten fraksiyon toplayıcıya itin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Fraksiyonları kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. - Her kesirden 50 μL'yi doğrudan bir nokta lekesi veya yuva lekesi cihazına nitroselüloz zarlarına yükleyin. CBP'ye karşı antikor kullanarak immünoblot ile proteini tespit edin (TAP etiketinin CBP kısmını tespit etmek için 1:6.000) ve ikincil antikor olarak Horseradish Peroxidase (1:15.000) ile konjuge edilen tavşan karşıtı IgG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cwc24-TAP'ın sedimantasyon profilini analiz etmek ve Grafix yönteminin birleştirme altkompanlarına bağlanmasını stabilize etmek için etkili olup olmadığını belirlemek için, Cwc24-TAP'ı ifade eden hücrelerin toplam maya özlerini gliserol gradyanları üzerinde santrifüjleme yoluyla, çapraz bağlama ajanı olarak glutaraldehitin varlığında veya yokluğunda ayırdık. Yirmi dört 500 μL fraksiyon örnekleri daha sonra TAP etiketinin CBP kısmına karşı antikor içeren yuva lekesi ile analiz edildi. Sonuçlar, çapraz bağlantının yokluğunda, Cwc24'ün yaklaşık 80 ila 200 MDa14komplekslerine karşılık gelen kesir 5 ve 13 ( Şekil1B) arasında yoğunlaştığını göstermektedir. Bununla birlikte, çapraz bağlantının varlığında, Cwc24'ün degradedeki konumu, daha büyük komplekslere karşılık gelen degradenin altındaki kesirlere kaydırılır (Şekil 1). Bu sonuçlar glutaraldehitin Cwc24'ün birleştirme kompleksleriyle ilişkisini stabilize ettiğini göstermektedir.
Cwc24'ü tutan komplekslerin Bact kompleksine karşılık gelip gelmediğini belirlemek için, SnRNPs U2, U5 ve U6 ve NTC kompleksi tarafından oluşturulan, biz U5 snRNP alt ünülit Prp8 ve NTC alt ünülit Prp19 ile Cwc24 sedimans ile karşılaştırdık. proteinlerin tespiti için nokta lekesi takip eder. Bu üç spliceosome alt birliği, degradenin dibinde daha büyük komplekslerle çökelti gösteren benzer profiller gösterdi. Cwc24 aynı fraksiyonlarda yoğunlaşmıştır, ancak geçici olarak spliceosome ile ilişkilendirdiği için, daha hafif fraksiyonlarda da bulunur (Şekil 2). Noktaların nicelemesi bu profilleri gösterir (Şekil 2B).
İlginçtir ki, 11 ve 12.fraksiyonlar Prp8 ve Prp19'un konsantre olmaya başladığı bölümlerdir, bu da gradyanın Bact kompleksinin çökelmeye başladığı kısmı olduğunu göstermektedir. Bu proteinlerin bu fraksiyonlardaki komplekslere bağlı olduğunu tespit etmek için, 11 ve 12 fraksiyonlarının aliquotları yerel jeller üzerinde elektroforezise ve daha sonra batı lekesine maruz kaldı. Prp8 ve Prp19 sinyalleri, gerçekten büyük komplekslerin bir parçası olduklarını gösteren% 8 akrilamid jeline zar zor giren lekeler olarak görünür (Şekil 3). Cwc24 ayrıca kesir 12'de de bulunur, ancak Bact kompleksine geçici bağlanmasıyla tutarlı olarak çok daha düşük konsantrasyonda bulunur. Bu sonuçlar glutaraldehitin geçici faktörlerin altcomplexes birleştirmeye bağlanmasını stabilize etmek için bir çapraz bağlayıcı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Grafix, Cwc24'ü daha büyük komplekslere bağlı tutar. Cwc24-TAP'ı ifade eden hücrelerin toplam maya özü, çapraz bağ glutaraldehitin yokluğunda veya varlığında gliserol gradyanları üzerinde santrifüjleme ile ayrıldı. (A) Gradyanın tek fraksiyonları, TAP etiketinin CBP kısmına karşı antikor ile Cwc24-TAP'ın immündeteksiyonu için yuva lekesine maruz kaldı. (B) Görüntü J kullanılarak Cwc24-TAP nicelemesi, gliserol gradyan fraksiyonları aracılığıyla protein konsantrasyonunu gösterir. Glutaraldehit varlığı veya yokluğu belirtilir. Y ekseni, ilk kesire göre kesirlerdeki sinyalin yoğunluğu olarak hesaplanan degrade boyunca Cwc24'ün göreli miktarlarını gösterir (Fn/F1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Gliserol/glutaraldehit gradyanları ile birleştirme faktörlerinin tortulasyonu. TAP etiketine kaynaşmış Cwc24, Prp8 veya Prp19'u ifade eden maya hücrelerinin özleri glutaraldehit içeren gliserol gradyanlarına yüklendi ve birleştirme komplekslerinin ayrılması için santrifüjlendi. (A) Gradyanın yirmi dört fraksiyonunun örnekleri, TAP etiketinin CBP kısmına karşı antikor ile TAP ile kaynaşmış proteinlerin nokta lekesi ve immünodeteksiyonu ile analiz edildi. (B) Image J kullanılarak proteinlerin nicelleştirilmesi, gliserol/ glutaraldehit gradyanının alt fraksiyonlarındaki konsantrasyonlarını gösterir. Y ekseni, arka plan üzerinde bir sinyal gösteren ilk fraksiyona göre, fraksiyonlardaki sinyalin yoğunluğu olarakhesaplanan gradyanyoluyla proteinlerin göreli miktarlarını gösterir (F n /F1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Birleştirme komplekslerinin yerel PAGE ve immünoblot tarafından algılanmasını. Şekil 2'de gösterilen gradyanın 11 ve 12'lik fraksiyonlarının aliquotları % 8 akrilamid yerli jel üzerinde elektroforez ile ayrıldı ve CBP'ye karşı antikor ile immünoblot'a tabi tutuldu. Proteinler bant olarak algılanmaz, çünkü kompleksler yerel jellerde ayrılamayacak kadar büyüktür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein ve ribonik asitler-protein etkileşimleri çapraz bağlama ajanları kullanılarak stabilize edilebilir. Elde eden kompleksin gliserol gradyanı üzerinde ultrasantrifüjasyona dayanacak şekilde kararlı olması önemlidir. Ayrıca, arabellek koşulları etkileşime izin vermeli, ancak belirli olmayan bağlamayı önlemek için yeterince katı olmalıdır. Burada gösterilen deneylerde, in vitro birleştirme reaksiyonları için önceden kurulmuş bir tampon çözeltisi kullandık15.
Santrifüjleme hızı ve zamanı analiz edilen kompleksler için optimize edilmelidir. Farklı çökeltme koşullarını test ettik, numuneleri 94.000 x g ve 194.000 x g'da 4 °C'de 16 saat boyunca santrifüjleme örnekleri benzer sonuçlarla test ettik. Bu denetimler, analiz edilen komplekslerin çökelmediği koşulları belirlemek için önemlidir.
Ayrıca, nokta lekesinin daha tekrarlanabilir sonuçlar verdiğini gösteren yuva lekesi veya nokta lekesi sistemlerini kullanarak doğrudan membran üzerinde pipetleme yaparak farklı blot yöntemlerini test ettik.
Glutaraldehitin çapraz bağlantı olarak kullanılmasının önemli bir sınırlaması, çapraz bağlantının geri döndürülememesidir. Bu nedenle, proteinler SDS-PAGE'den sonra immünoblot tarafından analiz edilemez, sadece yerel jeller veya nokta lekesi ile analiz edilemez. Bununla birlikte, formaldehit gibi ters çevrilebilir çapraz bağlama aracıları da kullanılabilir.
Daha önce birleştirme komplekslerini tanımlamak için proteinlerin eş-immün önseçimini kullandık, ancak geçici veya zayıf etkileşimler durumunda7, çapraz bağlantı, bileşenlerinin kütle spektrometresi ile daha sonra belirlenmesi için ara komplekslerin izolasyonuna yardımcı olabilir. Buradaki odak noktamız spliceosome olmasına rağmen, bu yöntem kesinlikle farklı bileşimlere sahip ara kompleksleri içeren diğer dinamik süreçlerin izolasyonu için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Bu çalışma bir FAPESP hibesi (15/06477-9) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
