Summary
Här beskriver vi användningen av Grafix (Gradient Fixation), en glycerolgradient centrifugation i närvaro av en korslänkare, för att identifiera interaktioner mellan splitsfaktorer som binder tillfälligt till skarveosome komplexet.
Abstract
Pre-mRNA-splitsning är en mycket dynamisk process som involverar många molekylära omorganiseringar av de skarveosome subkomplexerna under montering, RNA-bearbetning och frisättning av de komplexa komponenterna. Glycerolgradientcentrifugation har använts för separation av protein- eller RiboNucleoProtein-komplex (RiboNucleoProtein) för funktionella och strukturella studier. Här beskriver vi användningen av Grafix (Gradient Fixation), som först utvecklades för att rena och stabilisera makromolekylära komplex för enstaka partikel cryo-elektronmikroskopi, för att identifiera interaktioner mellan splitsfaktorer som binder tillfälligt till skapliceosome komplexet. Denna metod är baserad på centrifugation av prover till en ökande koncentration av ett fixeringsreagens för att stabilisera komplexen. Efter centrifugation av jäst totala extrakt laddade på glycerol gradienter, återhämtade fraktioner analyseras av dot blot för identifiering av skarveosome subkomplex och bestämning av förekomsten av enskilda splitsfaktorer.
Introduction
Splitsning är en mycket dynamisk process som kräver bindning och frigörelse av en mängd faktorer på ett samordnat sätt. Dessa splitsfaktorer inkluderar RNA-bindande proteiner, ATPases, helicases, proteinkinaser och fosfataser, ubiquitin ligaser,bland andra 1,2,3; och för att möjliggöra molekylära omorganiseringar, binder några av dessa faktorer mycket tillfälligt till de skarveosome subcomplexesna, vilket gör isoleringen och identifieringen av dessa RNP mellanliggande komplex mycket utmanande.
Här, Vi använde Grafix-metoden4,5 för att stabilisera interaktionen mellan jästsplikationsfaktorn Cwc24 ochB-aktkomplexet 6 för att möjliggöra identifiering av andra faktorer som samtidigt är bundna till denna subkomplex och avgöra om ubiquitin ligase Prp19 spelar någon roll i bindningen eller frisättningen av Cwc24 till nittonde (NTC) komplexet och till 5' änden av intronen före aktivering och den första transesterifieringsreaktionen tar plats. Fördelen med att utsätta makromolekylerna för en ökande koncentration av tvärlänken längs glycerolgradienten är att den undviker interkomplexkorslänkar 4,5, och därför bildandet av aggregat.
Denna metod användes som komplement till proteinkoimmunoprecipitation och pull-down-analyser, som trots att de tillåter isolering av stora komplex kanske inte är tillförlitliga för att upprätthålla tillfälliga interaktioner inom stora dynamiska komplex7,8. Användningen av fixeringsreagenser i glycerolgradienten stabiliserar bindningen av sådana faktorer, vilket gör det möjligt att bekräfta interaktioner mellan specifika proteiner och splitsande subkomplexer. Eftersom den valda tvärlänken var kemiskt irreversibel analyserades proteiner som finns i de återvunna fraktionerna av dot blot efter gradientcentrifugationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Jäst total extraktberedning
- Odla jästcellerna som uttrycker en av de skarvningsfaktorer som smälts tillTAP-taggen 9 i 1 L YNB-glu-media (Jäst kvävebas kompletterad med 2% m/ v glukos) med lämpliga aminosyror eller nukleära baser, I detta fall adenin (20 μg/ml), leucin (30 μg/ml), tryptofan (30 μg/ml), upp tillOD 600 = 1,0.
- Samla cellerna från 1 L-kulturen genom att centrifugera i tre 500 ml centrifugeringsflaskor vid 17 000 x g i 10 min vid 4 °C och tvätta två gånger med 10 ml kallt sterilt vatten.
- Återanvänd de insamlade jästcellerna i 1/10 av cellvolymen av kallbuffert A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2,50 mmol L-1 KCl, 5% v/v glycerol, 0,5 mmol L-1 DTT, EDTA-fri Protease Inhibitor Cocktail).
- Frys små droppar cellfjädring i flytande kväve. De små dropparna kan erhållas genom att pipetting den återanvända celllösningen och släppa 50 μL direkt i flytande kväve.
VARNING: Flytande kväve kan orsaka skador i kontakt med hud eller ögon. Handtag med lämplig säkerhetsutrustning.
Protokollet kan pausas här. De frysta dropparna av cellupphängning kan förvaras vid -80 °C. - Förbered jästceller lysates genom att mala i en Ball Mill-enhet genom sex cykler vid 20 Hz/s i 3 min.
OBS: Sänk ned behållaren som hyser de frusna cellerna i flytande kväve efter varje cykel för att undvika smältning. Protokollet kan pausas här. De frysta extrakten kan förvaras vid -80 °C. Jästsppliceringsextrakt kan också beredas med hjälp av homogenisatorer för att lysa sfäroplaster10, eller med hjälp av mortel och mortel11,12. - Smält extraktet genom att placera rören som innehåller dem i vatten vid rumstemperatur och skaka ibland.
- Centrifugextrakt vid 45 000 x g i 1 timme vid 4 °C.
- Kvantifiera proteinhalten i den rensade supernatanten med BCA-metoden13.
- Förbered alikvoter av extrakten, frys dem snabbt i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
Protokollet kan pausas här.
2. Glycerol gradient beredning
- Förbered två glycerollösningar i buffert A, en som innehåller 10% v/v och den andra som innehåller 30% v/v glycerol.
- Tillsätt korslänkningsmedel glutaraldehyd till 0,1% v/v i 30% v/v glycerollösningen och blanda för att homogenisera.
VARNING: Hantera glutaraldehyd inuti rökhuven med lämplig säkerhetsutrustning. - Tillsätt 6 ml av den kalla 10% v/v glycerollösningen längst ner på 12 ml centrifugeringsrör (14 x 89 mm).
- Tillsätt 6 ml av den kalla 30% v/v glycerollösningen kompletterad med glutaraldehyd med en spruta fäst vid en lång nål som är försedd med Gradient Master-enheten längst ner i röret, precis under 10% v / v glycerollösningen.
OBS: Alternativt kan 10% v/v glycerollösningen försiktigt pipetted på toppen av 30% v/v glycerol/glutaraldehydlösningen. - Använd övertoningshanterarens enhet för att generera en kontinuerlig densitetsgradient.
OBS: I gradienthanteraren placeras rören i ett lämpligt rack och roteras kort, enligt tillverkarens rekommendationer för att bestämma parametrarna (tid/vinkel/hastighet). I detta arbete använde vi: 2:25 min/81.5°/11 rpm. - Tillsätt försiktigt 200 μL av en 7% v/v glycerol/buffert En kudde på toppen strax före tillsats av cellextrakten.
OBS: Kuddens glykolkoncentration måste vara lägre än den mindre koncentrerade glycerollösningen som används för att skapa den linjära lutningen.
3. Extraherar centrifugation
- Ladda cirka 2 mg totalt protein på toppen av varje 12 ml linjär glycerolgradient 10–30% glutaraldehyd med kudde.
- Placera rören i en förkyld gunghinkrotor.
OBS: Hantera rören försiktigt för att undvika blandning före ultracentrifugation. - Centrifugera vid 194 000 x g i 16 timmar vid 4 °C.
- Alikvot varje 12 ml rör i tjugofyra 500 μL fraktioner med hjälp av ett anpassat EconoSystem eller genom noggrann pipetting.
OBS: Ett anpassat EconoSystem består av en peristaltisk pump, UV-detektorn och fraktionssamlaren som är ansluten till rörperforeringsanordningen. Sedimenteringsprofilen kan övervakas genom mätning av absorbansen vid 280 nm. - Använd en 40% v/v glycerollösning genom peristaltic pumpen för att trycka glycerol 10%-30% lutning från röret till fraktionssamlaren.
Protokollet kan pausas här. Förvara fraktionerna vid -80 °C tills de används. - Ladda 50 μL av varje fraktion direkt på nitrocellulosamembran på en dot blot- eller slitsfläck. Detektera protein med immunoblot med antikroppar mot CBP (1:6,000, för att upptäcka CBP-delen av TAP-taggen) och antikanin IgG konjugerad med pepparrotsperoxidas (1:15,000) som sekundär antikropp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att analysera sedimenteringsprofilen för Cwc24-TAP och avgöra om Grafix-metoden var effektiv för att stabilisera dess bindning till splitsande subkomplexer separerade vi totala jästextrakt av celler som uttrycker Cwc24-TAP genom centrifugation på glycerolgradienter, i närvaro eller frånvaro av glutaraldehyd som ett korslänkningsmedel. Prover av tjugofyra 500 μL fraktioner analyserades sedan av slot blot med antikroppar mot CBP-delen av TAP-taggen. Resultaten visar att Cwc24 i avsaknad av tvärlänken är koncentrerad mellan fraktionerna 5 och 13 (figur 1B), vilket motsvarar komplex på cirka 80–200 MDa14. I närvaro av tvärlänken flyttas dock Cwc24:s position på övertoningen till fraktioner längst ner på övertoningen, motsvarande större komplex (figur 1). Dessa resultat tyder på att glutaraldehyd stabiliserar associeringen av Cwc24 med splitsning komplex.
För att fastställa om de komplex som behåller Cwc24 motsvarar Bact-komplexet, som bildas av snRNPs U2, U5 och U6 och NTC-komplexet, jämförde vi Cwc24-sedimentering med de av U5 snRNP-underenheten Prp8 och NTC-underenheten Prp19. Jäststammar som uttrycker något av dessa proteiner som smältes till TAP-taggen utsattes för Grafix, följt av prickfläck för påvisande av proteinerna. Dessa tre skarviga underenheter visade liknande profiler, sedimentering med större komplex längst ner i lutningen. Cwc24 är koncentrerad till samma fraktioner, men eftersom den förknippar tillfälligt med skapliceosomen finns den också i de lättare fraktionerna (figur 2). Kvantifieringen av punkterna visar dessa profiler (figur 2B).
Intressant nog är fraktionerna 11 och 12 de där Prp8 och Prp19 börjar koncentrera sig, vilket tyder på att detta är den del av lutningen där Bact-komplexet börjar sedimentera. För att fastställa att dessa proteiner är bundna till komplex i dessa fraktioner utsattes alikvoter av fraktionerna 11 och 12 för elektrofores på inhemska geler och därefter för västra fläckar. Signaler från Prp8 och Prp19 visas som fläckar som knappt kommer in i en 8% akrylamidgel, vilket visar att de verkligen är en del av stora komplex (Figur 3). Cwc24 finns också i bråkdel 12, men i mycket lägre koncentration, i överensstämmelse med dess övergående bindning till Bact-komplexet. Dessa resultat visar att glutaraldehyd kan användas som en tvärlänk för att stabilisera bindningen av övergående faktorer till splitsande subkomplexer.
Bild 1: Grafix rymmer Cwc24 som är associerad med större komplex. Totalt jästextrakt av celler som uttrycker Cwc24-TAP separerades av centrifugation på glycerol gradienter, antingen i avsaknad eller närvaro av tvärlänken glutaraldehyd. A)Udda fraktioner av lutningen utsattes för springa för immunodetection av Cwc24-TAP med antikroppar mot CBP-delen av TAP-taggen. B)Kvantifiering av Cwc24-TAP med bild J visar proteinkoncentrationen genom fraktionerna av glykolgradienten. Närvaro eller frånvaro av glutaraldehyd anges. Y-axeln visar de relativa mängderna Cwc24 genom övertoningen, beräknad som signalens intensitet i fraktionerna, i förhållande till den första fraktionen (Fn/F1). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Sedimentering av splitsfaktorer genom glykol/glutaraldehydgradienter. Extrakt av jästceller som uttrycker antingen Cwc24, Prp8 eller Prp19 som smälts till TAP-taggen laddades på glykolgradienter som innehåller glutaraldehyd och centrifugerades för separation av splitskomplex. A)Prover av de tjugofyra fraktionerna av lutningen analyserades genom punktfläck och immundetection av TAP- smälta proteiner med antikroppar mot CBP-delen av TAP-taggen. B)Kvantifieringen av proteinerna med hjälp av bild J visar deras koncentration i de nedre fraktionerna av glykol/glutaraldehydgradient. Y-axeln visar proteiners relativa mängder genom övertoningen, beräknad som signalens intensitet i fraktionerna, i förhållande till den första fraktionen som visar en signal ovanför bakgrunden (Fn/F1). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Detektion av skarvkomplex efter inbyggd SIDA och immunoblot. Alikvoter av fraktionerna 11 och 12 av den gradient som visas i figur 2 separerades av elektrofores på 8% akrylamid inhemsk gel och utsattes för immunoblot med antikroppar mot CBP. Proteiner detekteras inte som band eftersom komplex är för stora för att separera på inhemska geler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein och ribonukleinsyror-protein interaktioner kan stabiliseras med hjälp av korslänkningsmedel. Det är viktigt att det resulterande komplexet är stabilt för att motstå ultracentrifugation på glycerolgradient. Dessutom bör buffertvillkoren tillåta interaktionen, men vara tillräckligt stränga för att undvika icke-specifik bindning. I experimenten som visas här använde vi en buffertlösning som redan fastställts för in vitro-splitsreaktioner15.
Centrifugationshastigheten och centrifugeringen bör optimeras för de komplex som analyseras. Vi testade olika sedimenteringsförhållanden, centrifugeringsprover vid 94 000 x g och 194 000 x g i 16 timmar vid 4 °C, med liknande resultat. Dessa kontroller är viktiga för att bestämma under vilka förhållanden de komplex som analyseras inte fälls ut.
Vi testade också olika fläckar metoder, pipetting direkt på membranet, med hjälp av slot blot eller dot blot system, som visade att dot blot gav mer reproducerbara resultat.
En stor begränsning av att använda glutaraldehyd som tvärlänk är att korslänken inte kan återställas. Därför kan proteiner inte analyseras av immunoblot efter SDS-PAGE, men endast av inhemska geler eller dot blot. Reversibla korslänkningsmedel, såsom formaldehyd, skulle dock potentiellt också kunna användas.
Vi har tidigare använt co-immunoprecipitation av proteiner för att identifiera splitskomplex, men vid övergående eller svaga interaktioner7, crosslink kan hjälpa isolering av mellanliggande komplex för senare bestämning av deras komponenter genom masspektrometri. Även om vårt fokus här var skapliceosomen, kan denna metod säkert användas för isolering av andra dynamiska processer som inkluderar mellanliggande komplex med olika kompositioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett FAPESP-bidrag (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
