Summary
在这里，我们描述了Grafix（梯度固定）的利用，这是一种在交行器面前的甘油梯度离心，用于识别暂时与拼接体复合物结合的拼接因子之间的相互作用。
Abstract
mRNA 前拼接是一个非常动态的过程，在组装、RNA 处理和复杂组件的释放过程中涉及许多拼接体子复合物的分子重新排列。甘油梯度离心已用于分离蛋白质或RNP（核蛋白）复合物，用于功能和结构研究。在这里，我们描述了Grafix（梯度固定）的利用，这是首次开发用于净化和稳定单粒子低温电子显微镜的大分子复合物，以识别暂时与拼接体复合物结合的拼接因子之间的相互作用。此方法基于将样品离心到固定试剂的浓度增加，以稳定复合物。在甘油梯度上装载酵母总提取物离心后，通过点斑分析回收的分数，以识别拼接体子复合物并确定单个拼接因子的存在。
Introduction
拼接是一个高度动态的过程，需要以协调的方式约束和释放多种因素。这些拼接因子包括RNA结合蛋白、ATPases、螺旋酶、蛋白激酶和磷酸盐、无用性韧带等1、2、3：为了让分子重新排列发生，其中一些因素与拼接体子复杂性非常短暂地结合，使得这些RNP中间复合物的隔离和识别极具挑战性。
在这里， 我们使用Grafix方法4，5来稳定酵母拼接因子Cwc24与B行为复合物6的相互作用，以便识别与该子复合物相关的其他因素，并确定是否 泛素韧带Prp19在Cwc24的结合或释放到19（NTC）复合物和激活前内电的5'端和第一次转录反应中起任何作用地方。使大分子沿着甘油梯度使大分子接触到交叉链接器日益集中的优点是它避免了复合物交叉链路4、5，从而避免了聚合物的形成。
这种方法被用作蛋白质同位素沉淀和拉下测定的补充，尽管允许对大型复合物进行隔离，但对于在大型动态复合物7、8中维持瞬态相互作用可能并不可靠。在甘油梯度中使用固定试剂可以稳定这些因素的结合，从而确认特定蛋白质与拼接亚复合物的相互作用。由于所选的交联器在化学上不可逆转，因此在梯度离心后，通过点斑对恢复分数中的蛋白质进行分析。
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Protocol
1. 酵母总提取物制备
- 用适当的氨基酸或核基，将酵母细胞与TAP标签9 融合成1 L YNB-胶质（酵母氮基补充2%m/v葡萄糖）的拼接因子之一， 在这种情况下，腺苷（20 μg/mL）、柳辛（30微克/mL）、色氨酸（30微克/mL），最高可达OD600 = 1.0。
- 在 4 °C 下以 17，000 x g 的 10 分钟在 3 个 500 mL 离心机瓶中离心，从 1 L 培养物中收集细胞，然后用 10 mL 冷无菌水洗两次。
- 将收集的酵母细胞重新用于冷缓冲器 A 的 1/10 细胞体积 （10 mmol L-1 HEPES pH = 7.9， 1.5 mmol L-1 MgCl2， 50 mmol L-1 KCl， 5% v/v 甘油， 0.5 mmol L-1 DTT， EDTA 无蛋白酶抑制剂鸡尾酒）.。
- 将小滴细胞悬浮液氮冷冻。小滴可以通过管道重用电池溶液和直接将 50 μL 滴入液氮中获得。
警告：液氮可能会在与皮肤或眼睛接触时造成伤害。使用拨配的安全设备进行处理。
注：协议可以在此处暂停。电池悬浮液的冻结滴可以存储在 -80 °C 下。 - 准备酵母细胞解解，在球磨机设备中研磨，以20 Hz/s为6个周期，持续3分钟。
注：每个周期后，将容器浸入液氮中，以避免熔化。协议可以在此处暂停。冷冻提取物可储存在 -80 °C 下。 酵母拼接提取物也可以使用同质化物解解球体10，或使用迫击炮和害虫11，12。 - 将含有这些提取物的管子在室温下放入水中，偶尔摇晃，从而融化提取物。
- 离心机提取物在 45，000 x g 1 h 在 4 °C.
- 通过BCA方法13量化清除超高纳特的蛋白质含量。
- 准备提取物的无名小品，快速将其冷冻在液氮中，并储存在 -80 °C 下。
注：协议可以在此处暂停。
2. 甘油梯度制备
- 在缓冲区 A 中准备两个甘油溶液，一个包含 10% v/v，另一个包含 30% v/v 甘油。
- 在 30% v/v 甘油溶液中将交叉链接剂谷胱甘肽添加到 0.1% v/v，并混合以实现均质化。
注意事项：使用适当的安全设备处理烟罩内的谷胱甘肽。 - 在 12 mL 离心机管（14 x 89 mm）底部加入 6 mL 的冷 10% v/v 甘油溶液。
- 加入6 mL的冷30%v/v甘油溶液，辅以谷胱甘肽，将注射器连接到长针上，在管底提供梯度主设备，就在10%v/v甘油溶液下面。
注意：另外，10% v/v 甘油溶液可以在 30% v/v 甘油/谷胱甘肽溶液的顶部小心地管道。 - 使用梯度主设备生成连续密度梯度。
注：在梯度主设备中，管子被放置在一个适当的机架中，并根据制造商关于确定参数（时间/角度/速度）的建议进行短暂旋转。在这项工作中，我们使用： 2：25 分钟/81.5°/11 rpm。 - 在添加细胞提取物之前，小心地在顶部添加 200 μL 的 7% v/v 甘油/缓冲垫。
注：垫子的甘油浓度必须低于用于创建线性梯度的浓度较低的甘油溶液。
3. 提取离心机
- 将大约 2 毫克的总蛋白质加载到每个 12 mL 线性甘油梯度 10%至 30% 谷胱甘肽的顶部，并配有垫子。
- 将管子放在预冷却的回转桶转子中。
注意：轻轻处理管子，以避免在超中心处理前混合。 - 离心机在 194，000 x g 为 16 h 在 4 °C.
- Aliquot 每个 12 mL 管在 24 500 μL 分数使用适应的 Econosystem 或小心管道。
注：经过改造的 EconoSystem 由渗透泵、紫外线探测器和连接到管穿孔装置的分数收集器组成。沉降剖面可以通过测量280纳米的吸收度来监测。 - 使用 40% v/v 甘油溶液通过渗透泵将甘油 10%+30% 梯度从管子推至分数收集器。
注：协议可以在此处暂停。将分数存储在 -80 °C 下，直到使用。 - 将每个分数的 50 μL 直接加载到点斑或槽斑点上的硝基纤维素膜上。使用抗体对CBP（1：6，000，检测TAP标签的CBP部分）和与马萝卜过氧化酶（1：15，000）结合的抗兔IgG作为二级抗体，通过免疫膨胀检测蛋白质。
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Representative Results
为了分析 Cwc24-TAP 的沉积剖面，并确定 Grafix 方法是否有效稳定其与拼接亚复杂物的结合，我们通过甘油梯度的离心分离了表达 Cwc24-TAP 的细胞的总酵母提取物，无论是否存在谷胱甘肽作为交联剂。然后，通过带抗体对 TAP 标签的 CBP 部分进行带抗体的插槽斑点分析 24 个 500 μL 分数的样本。结果显示，在没有交联器的情况下，Cwc24集中在分数5和13之间（图1B），相对应于约80至200 MDA14的复合物。然而，在交叉链接器的存在下，Cwc24 在梯度上的位置被转移到梯度底部的分数，与较大的复合物相对应（图 1）。这些结果表明，谷胱甘肽稳定了Cwc24与拼接复合物的关联。
为了确定保留 Cwc24 的复合体是否与由 snRNP U2、U5 和 U6 以及 NTC 复合物形成的 Bact 复合物相对应，我们将 Cwc24 沉积与 U5 snRNP 子单位 Prp8 和 NTC 子单位 Prp19 的沉积进行了比较。 酵母菌株表示这些蛋白质中任何一种融合到 TAP 标签上， 都受到 Grafix 的处理， 其次是点斑，用于检测蛋白质。这三个拼接子单位显示了类似的轮廓，在梯度底部沉积了较大的复合物。Cwc24 集中在相同的分数中，但由于它与拼接体短暂关联，它也存在于较轻的分数中（图 2）。点的量化显示这些配置文件（图2B）。
有趣的是，分数 11 和 12 是 Prp8 和 Prp19 开始集中的部分，这表明这是 Bact 复合物开始沉积的梯度部分。为了确定这些蛋白质与这些分数中的复合物有关，11和12分的白化物在原生凝胶上受到电泳，随后又受到西方斑点的影响。Prp8和Prp19的信号显示为几乎不能进入8%丙烯酰胺凝胶的涂片，表明它们确实是大型复合物的一部分（图3）。Cwc24 也存在于第 12 部分， 但浓度要低得多， 与其与 Bact 复合物的瞬时结合一致。这些结果表明，谷胱甘肽可以用作交联器，以稳定瞬态因素与拼接亚复合物的结合。
图1：格拉菲克斯持有与较大复合物相关的Cwc24。表达Cwc24-TAP的细胞总酵母提取物通过甘油梯度的离心分离，无论是在没有或存在十字链球菌谷胱醛。（A） 梯度的奇数部分因Cwc24-TAP的免疫检测而出现槽斑，该斑点与TAP标签CBP部分的抗体有关。（B） 使用图像 J 对 Cwc24-TAP 进行量化，通过甘油梯度的分数显示蛋白质的浓度。表示是否存在谷胱甘肽。Y 轴通过梯度显示 Cwc24 的相对量，计算为分数中信号的强度，相对于第一个分数（Fn/F1）。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：通过甘油/谷胱甘肽梯度沉降拼接因子。表达 Cwc24、Prp8 或与 TAP 标签融合的酵母细胞的提取物被加载在含有谷胱甘肽的甘油梯度上，并离心用于分离拼接复合物。（A） 梯度的二十四个部分的样本通过点斑和TAP融合蛋白的免疫检测与TAP标签的CBP部分抗体进行分析。（B） 使用图像 J 对蛋白质进行量化，显示其浓度在甘油/谷胱甘肽梯度的底部部分。Y轴通过梯度显示蛋白质的相对量，计算为分数中信号的强度，相对于显示背景上方信号（Fn/F1）的第一个分数。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：通过原生PAGE和免疫布洛特检测拼接复合物。图2中显示的梯度中第11和12个部分的Aliquot通过8%丙烯酰胺原生凝胶上的电泳分离，并受到具有CBP抗体的免疫膨胀。蛋白质没有检测到带，因为复合物太大，无法分离在原生凝胶上。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
蛋白质蛋白和核糖核酸-蛋白质相互作用可以通过交联剂稳定下来。由此产生的复合物必须稳定，能够承受甘油梯度的超中心化。此外，缓冲条件应允许交互，但必须足够严格，以避免非特定的绑定。在下面显示的实验中，我们使用了已经为体外拼接反应15建立的缓冲液。
应针对分析的复合物优化离心的速度和时间。我们测试了不同的沉积条件，在 94，000 x g 下离心取样，在 4°C 下以 16 x g 16h 离心取样，结果相似。这些控件对于确定所分析的复合物不沉淀的条件非常重要。
我们还测试了不同的污点方法，直接在膜上管道，使用槽斑或点斑系统，这表明点斑给出了更可重复的结果。
使用谷胱甘肽作为交联器的一个主要限制是，十字链路无法恢复。因此，蛋白质不能在SDS-PAGE之后通过免疫膨胀进行分析，而只能通过原生凝胶或点斑进行分析。然而，可逆的交联剂，如甲醛，也可能被使用。
我们以前使用蛋白质的共免疫沉淀来识别拼接复合物，但在瞬态或弱相互作用的情况下，交行可能有助于中间复合物的分离，以便以后通过质谱法确定其成分。虽然我们在这里的重点是拼接体，这种方法当然可以用来隔离其他动态过程，包括具有不同成分的中间复合物。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了FAPESP赠款（15/06477-9）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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