Summary
Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), einer Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomkomplex binden.
Abstract
Pre-mRNA-Spleißen ist ein sehr dynamischer Prozess, der viele molekulare Umlagerungen der Spleißosom-Subkomplexe während der Montage, RNA-Verarbeitung und Freisetzung der komplexen Komponenten beinhaltet. Die Glyceringradientenzentrifugation wurde zur Trennung von Protein- oder RNP-Komplexen (RiboNucleoProtein) für funktionelle und strukturelle Studien verwendet. Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), das zuerst entwickelt wurde, um makromolekulare Komplexe für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie zu reinigen und zu stabilisieren, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomenkomplex binden. Diese Methode basiert auf der Zentrifugation von Proben in eine zunehmende Konzentration eines Fixierungsreagenz zur Stabilisierung von Komplexen. Nach der Zentrifugation von Hefe-Gesamtextrakten, die auf Glyceringradienten geladen sind, werden die wiedergewonnenen Fraktionen durch Dot-Blot analysiert, um die Spleißosom-Subkomplexe zu identifizieren und das Vorhandensein einzelner Spleißfaktoren zu bestimmungen.
Introduction
Spleißen ist ein hochdynamischer Prozess, der eine Vielzahl von Faktoren koordiniert binden und freisetzen muss. Zu diesen Spleißfaktoren gehören RNA-bindende Proteine, ATPasen, Helikasen, Proteinkinasen und Phosphatasen, Ubiquitinligasen, unter anderem1,2,3; und um die molekularen Umlagerungen zu ermöglichen, binden einige dieser Faktoren sehr vorübergehend an die Spleißosom-Subkomplexe, was die Isolierung und Identifizierung dieser RNP-Zwischenkomplexe sehr schwierig macht.
Hier haben wir die Grafix-Methode4,5 verwendet, um die Wechselwirkung des Hefe-Spleißfaktors Cwc24 mit demB-Act-Komplex 6 zu stabilisieren, um die Identifizierung anderer Faktoren zu ermöglichen, die gleichzeitig an diesen Subkomplex gebunden sind, und um festzustellen, ob die Ubiquitinligase Prp19 eine Rolle bei der Bindung oder Freisetzung von Cwc24 an den Nineteen (NTC) -Komplex und an das 5'-Ende des Introns vor der Aktivierung spielt und die erste Transesterreaktion dauert Ort. Der Vorteil der Exposition der Makromoleküle gegenüber einer zunehmenden Konzentration des Vernetzers entlang des Glyceringradienten besteht darin, dass es Interkomplexvernetzungen4,5und damit die Bildung von Aggregaten vermeidet.
Diese Methode wurde als Ergänzung zu Protein-Coimmunopräzipitations- und Pull-Down-Assays verwendet, die, obwohl sie die Isolierung großer Komplexe ermöglichen, möglicherweise nicht zuverlässig sind, um transiente Wechselwirkungen innerhalb großer dynamischer Komplexeaufrechtzuerhalten 7,8. Die Verwendung von Fixierungsreagenzien im Glyceringradienten stabilisiert die Bindung solcher Faktoren und ermöglicht die Bestätigung der Wechselwirkungen spezifischer Proteine mit Spleißsubkomplexen. Da der gewählte Vernetzer chemisch irreversibel war, wurden die in den wiederhergestellten Fraktionen vorhandenen Proteine nach der Gradientenzentrifugation per Punktblot analysiert.
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Protocol
1. Zubereitung von Hefe-Gesamtextrakt
- Wachsen sie die Hefezellen, die einen der mit dem TAP-Tag9 verschmolzenen Spleißfaktoren in 1 L YNB-Glu-Medien (Hefestickstoffbasis ergänzt mit 2% m/v Glucose) mit den entsprechenden Aminosäuren oder Nukleinbasen, in diesem Fall Adenin (20 μg/ml), Leucin (30 μg/ml), Tryptophan (30 μg/ml), bis zu OD600 = 1,0, exprimieren.
- Die Zellen aus der 1 L-Kultur durch Zentrifugieren in drei 500-ml-Zentrifugenflaschen bei 17.000 x g für 10 min bei 4 °C sammeln und zweimal mit 10 ml kaltem sterilem Wasser waschen.
- Resuspendieren Sie die gesammelten Hefezellen in 1/10 des Zellvolumens des Kaltpuffers A (10 mmolL-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmolL-1 MgCl2, 50 mmolL-1 KCl, 5% v/v Glycerin, 0,5 mmolL-1 DTT, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail).
- Kleine Tropfen Zellsuspension in flüssigem Stickstoff einfrieren. Die kleinen Tropfen können erhalten werden, indem die resuspendierte Zelllösung pipetiert und 50 μL direkt in flüssigen Stickstoff fallen gelassen werden.
ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann bei Kontakt mit Haut oder Augen zu Verletzungen führen. Handhabung mit geeigneter Sicherheitsausrüstung.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die gefrorenen Tropfen der Zellsuspension können bei -80 °C gelagert werden. - Bereiten Sie Hefezellen Lysate vor, indem Sie in einem Kugelmühlengerät durch sechs Zyklen bei 20 Hz / s für 3 min mahlen.
HINWEIS: Tauchen Sie nach jedem Zyklus den Behälter, in dem sich die gefrorenen Zellen befinden, in flüssigen Stickstoff, um ein Schmelzen zu vermeiden. Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die gefrorenen Extrakte können bei -80 °C gelagert werden. Hefe-Spleißextrakte können auch mit Homogenisatoren hergestellt werden, um Spheroplasten10zu lysatieren, oder mit Mörser und Stößel11,12. - Schmelzen Sie den Extrakt, indem Sie die Röhrchen, die sie enthalten, bei Raumtemperatur in Wasser legen und gelegentlich schütteln.
- Zentrifugenextrakte bei 45.000 x g für 1 h bei 4 °C.
- Quantifizierung des Proteingehalts des geklärten Überstandes mit der BCA-Methode13.
- Aliquoten der Extrakte vorbereiten, schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
2. Glyceringradientenvorbereitung
- Bereiten Sie zwei Glycerinlösungen in Puffer A vor, eine mit 10% v / v und die andere mit 30% v / v Glycerin.
- Das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd zu 0,1% v/v in die 30%ige v/v Glycerinlösung geben und homogenisieren.
ACHTUNG: Behandeln Sie Glutaraldehyd im Abzug mit geeigneten Sicherheitsvorrichtungen. - 6 mL der kalten 10% v/v Glycerinlösung am Boden des 12 mL Zentrifugenröhrchens (14 x 89 mm) hinzufügen.
- Fügen Sie 6 ml der kalten 30% v / v Glycerinlösung, ergänzt mit Glutaraldehyd, mit einer Spritze hinzu, die an einer langen Nadel befestigt ist, die mit dem Gradient Master-Gerät am Boden des Röhrchens geliefert wird, direkt unter der 10% v / v Glycerinlösung.
HINWEIS: Alternativ kann die 10% v/v Glycerinlösung vorsichtig auf die Oberseite der 30%igen v/v Glycerin/Glutaraldehyd-Lösung pipettiert werden. - Verwenden Sie das Gradient Master-Gerät, um einen kontinuierlichen Dichtegradienten zu generieren.
HINWEIS: Im Gradient Master-Gerät werden die Rohre in ein geeignetes Rack gelegt und kurz gedreht, wobei die Empfehlungen des Herstellers zur Bestimmung der Parameter (Zeit/Winkel/Geschwindigkeit) befolgt werden. In dieser Arbeit verwendeten wir: 2:25 min/81,5°/11 rpm. - Fügen Sie vorsichtig 200 μL eines 7% v / v Glycerin / Puffer-A-Kissens auf der Oberseite kurz vor der Zugabe der Zellextrakte hinzu.
HINWEIS: Die Glycerinkonzentration des Kissens muss niedriger sein als die weniger konzentrierte Glycerinlösung, die zur Erstellung des linearen Gradienten verwendet wird.
3. Extrahiert zentrifugation
- Laden Sie ca. 2 mg Gesamtprotein auf die Oberseite jedes 12 ml linearen Glyceringradienten 10% bis 30% Glutaraldehyd mit Kissen.
- Legen Sie die Rohre in einen vorgekühlten Schaufelrotor.
HINWEIS: Behandeln Sie die Röhrchen vorsichtig, um eine Vermischung vor der Ultrazentrifugation zu vermeiden. - Zentrifuge bei 194.000 x g für 16 h bei 4 °C.
- Aliquot jedes 12 mL Röhrchen in vierundzwanzig 500 μL Fraktionen mit einem angepassten EconoSystem oder durch sorgfältiges Pipettieren.
HINWEIS: Ein angepasstes EconoSystem besteht aus einer Peristaltikpumpe, dem UV-Detektor und dem Fraktionskollektor, der mit der Rohrperforationsvorrichtung verbunden ist. Das Sedimentationsprofil kann durch die Messung der Absorption bei 280 nm überwacht werden. - Verwenden Sie eine 40% v/ v Glycerinlösung durch die Peristaltikpumpe, um den Glyceringradienten von 10% bis 30% vom Rohr zum Fraktionskollektor zu drücken.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Lagern Sie die Fraktionen bei -80 °C bis zum Gebrauch. - Laden Sie 50 μL jeder Fraktion direkt auf Nitrocellulosemembranen auf einem Dot-Blot- oder Slot-Blot-Gerät. Nachweis von Protein durch Immunoblot mit Antikörpern gegen CBP (1:6.000, um den CBP-Teil des TAP-Tags nachzuweisen) und Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (1:15.000) als sekundärer Antikörper.
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Representative Results
Um das Sedimentationsprofil von Cwc24-TAP zu analysieren und festzustellen, ob die Grafix-Methode wirksam war, um seine Bindung an Spleißsubkomplexe zu stabilisieren, trennten wir Gesamthefeextrakte von Zellen, die Cwc24-TAP durch Zentrifugation auf Glyceringradienten exprimieren, in Gegenwart oder Abwesenheit von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel. Proben von vierundzwanzig 500 μL-Fraktionen wurden dann durch Slot-Blot mit Antikörpern gegen den CBP-Teil des TAP-Tags analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Cwc24 in Abwesenheit des Vernetzers zwischen den Fraktionen 5 und 13 konzentriert ist (Abbildung 1B), entsprechend Komplexen von etwa 80 bis 200 MDa14. In Gegenwart des Vernetzers wird jedoch die Position von Cwc24 auf dem Gradienten auf Brüche am unteren Rand des Gradienten verschoben, was größeren Komplexen entspricht (Abbildung 1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Glutaraldehyd die Assoziation von Cwc24 mit Spleißkomplexen stabilisiert.
Um festzustellen, ob die Cwc24-beständigen Komplexe dem Bact-Komplex entsprechen, der aus den snRNPs U2, U5 und U6 und dem NTC-Komplex gebildet wird, verglichen wir die Cwc24-Sedimentation mit denen der U5-snRNP-Untereinheit Prp8 und der NTC-Untereinheit Prp19. Hefestämme, die eines dieser mit dem TAP-Tag verschmolzenen Proteine exprimierten, wurden Grafix unterzogen. gefolgt von Punkt-Blot zum Nachweis der Proteine. Diese drei Spleißosomen-Untereinheiten zeigten ähnliche Profile und sedimentierten mit größeren Komplexen am unteren Rand des Gradienten. Cwc24 ist in den gleichen Fraktionen konzentriert, aber da es sich vorübergehend mit dem Spleißosom verbindet, ist es auch in den leichteren Fraktionen vorhanden (Abbildung 2). Die Quantifizierung der Punkte zeigt diese Profile (Abbildung 2B).
Interessanterweise sind die Fraktionen 11 und 12 diejenigen, bei denen sich Prp8 und Prp19 zu konzentrieren beginnen, was darauf hindeutet, dass dies der Teil des Gradienten ist, in dem der Bact-Komplex zu sedimentieren beginnt. Um festzustellen, ob diese Proteine an Komplexe in diesen Fraktionen gebunden sind, wurden Aliquoten der Fraktionen 11 und 12 einer Elektrophorese auf nativen Gelen und anschließend einem Western Blot unterzogen. Signale von Prp8 und Prp19 erscheinen als Abstriche, die kaum in ein 8% iges Acrylamidgel gelangen, was zeigt, dass sie tatsächlich Teil großer Komplexe sind (Abbildung 3). Cwc24 ist auch in Fraktion 12 vorhanden, jedoch in viel geringerer Konzentration, was mit seiner vorübergehenden Bindung an den Bact-Komplex übereinstimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Glutaraldehyd als Vernetzer verwendet werden kann, um die Bindung von transienten Faktoren an Spleißsubkomplexe zu stabilisieren.
Abbildung 1: Grafix enthält Cwc24, das größeren Komplexen zugeordnet ist. Der gesamte Hefeextrakt von Zellen, die Cwc24-TAP exprimierten, wurde durch Zentrifugation auf Glyceringradienten getrennt, entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart des Vernetzers Glutaraldehyd. (A) Ungerade Fraktionen des Gradienten wurden einem Slot-Blot für die Immundetektion von Cwc24-TAP mit Antikörpern gegen den CBP-Teil des TAP-Tags unterzogen. (B) Die Quantifizierung von Cwc24-TAP anhand von Bild J zeigt die Konzentration des Proteins durch die Fraktionen des Glyceringradienten. Das Vorhandensein oder Fehlen von Glutaraldehyd ist angegeben. Die Y-Achse zeigt die relativen Mengen von Cwc24 durch den Gradienten, berechnet als Intensität des Signals in den Fraktionen, relativ zum ersten Bruch (Fn/ F1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Sedimentation von Spleißfaktoren durch Glycerin/Glutaraldehyd-Gradienten. Extrakte von Hefezellen, die entweder Cwc24, Prp8 oder Prp19 exprimierten und mit dem TAP-Tag verschmolzen waren, wurden auf Glyceringradienten geladen, die Glutaraldehyd enthielten, und für die Trennung von Spleißkomplexen zentrifugiert. (A) Proben der vierundzwanzig Fraktionen des Gradienten wurden durch Punktblot und Immundetektion der TAP-verschmolzenen Proteine mit Antikörpern gegen den CBP-Teil des TAP-Tags analysiert. (B) Die Quantifizierung der Proteine anhand von Bild J zeigt ihre Konzentration an den unteren Fraktionen des Glycerin/Glutaraldehyd-Gradienten. Die Y-Achse zeigt die relativen Mengen der Proteine durch den Gradienten, berechnet als Intensität des Signals in den Fraktionen, relativ zur ersten Fraktion, die ein Signal über dem Hintergrund zeigt (Fn/ F1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nachweis von Spleißkomplexen durch native PAGE und Immunoblot. Aliquots der Fraktionen 11 und 12 des in Abbildung 2 gezeigten Gradienten wurden durch Elektrophorese auf 8% Nativem Acrylamidgel getrennt und einem Immunoblot mit Antikörper gegen CBP unterzogen. Proteine werden nicht als Banden nachgewiesen, da Komplexe zu groß sind, um sich auf nativen Gelen zu trennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Protein-Protein- und Ribonukleinsäure-Protein-Interaktionen können mit Vernetzern stabilisiert werden. Es ist wichtig, dass der resultierende Komplex stabil ist, um einer Ultrazentrifugation auf Glyceringradient standzuhalten. Darüber hinaus sollten die Pufferbedingungen die Interaktion ermöglichen, aber streng genug sein, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. In den hier gezeigten Experimenten haben wir eine bereits etablierte Pufferlösung für In-vitro-Spleißreaktionenverwendet 15.
Die Geschwindigkeit und der Zeitpunkt der Zentrifugation sollten für die zu analysierenden Komplexe optimiert werden. Wir testeten verschiedene Sedimentationsbedingungen, zentrifugierten Proben bei 94.000 x g und 194.000 x g für 16 h bei 4 °C, mit ähnlichen Ergebnissen. Diese Kontrollen sind wichtig, um die Bedingungen zu bestimmen, unter denen die analysierten Komplexe nicht ausfällt.
Wir testeten auch verschiedene Blot-Methoden, Pipettieren direkt auf der Membran, mit Slot-Blot- oder Dot-Blot-Systemen, die zeigten, dass Dot-Blot reproduzierbarere Ergebnisse lieferte.
Eine wesentliche Einschränkung bei der Verwendung von Glutaraldehyd als Vernetzer besteht darin, dass die Vernetzung nicht rückgängig gemacht werden kann. Daher können Proteine nicht per Immunoblot nach SDS-PAGE analysiert werden, sondern nur durch native Gele oder Dot Blot. Möglicherweise könnten aber auch reversible Vernetzungsmittel wie Formaldehyd eingesetzt werden.
Wir haben zuvor die Co-Immunpräzipitation von Proteinen verwendet, um Spleißkomplexe zu identifizieren, aber im Falle von transienten oder schwachen Wechselwirkungen7kann die Vernetzung bei der Isolierung von Zwischenkomplexen für die spätere Bestimmung ihrer Komponenten durch Massenspektrometrie helfen. Obwohl unser Fokus hier auf dem Spleißosom lag, kann diese Methode sicherlich zur Isolierung anderer dynamischer Prozesse verwendet werden, die Zwischenkomplexe mit unterschiedlichen Zusammensetzungen umfassen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein FAPESP-Stipendium (15/06477-9) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
