Summary
هنا، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج)، والطرد المركزي التدرج الجلسرين في وجود crosslinker، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرا إلى مجمع اللصق.
Abstract
الربط قبل مرنا هي عملية ديناميكية للغاية التي تنطوي على العديد من الإعادة ترتيب الجزيئية من الربط الفرعي اللصقات أثناء التجميع، وتجهيز الحمض النووي الريبي، والإفراج عن المكونات المعقدة. وقد استخدم الطرد المركزي التدرج الجلسرين لفصل البروتين أو RNP (ريبونوكليوبروتين) مجمعات للدراسات الوظيفية والهيكلية. هنا ، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج) ، والتي وضعت لأول مرة لتنقية واستقرار المجمعات الجزيئية الكلية للجسيم واحد المجهر الكريكترون المبرد ، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرة لمجمع الربط. وتستند هذه الطريقة إلى الطرد المركزي للعينات في تركيز متزايد من كاشف التثبيت لتحقيق الاستقرار في المجمعات. بعد الطرد المركزي من خلاصات الخميرة الإجمالية المحملة على تدرجات الجلسرين ، يتم تحليل الكسور المستردة بواسطة نقطة لطخة لتحديد المجمعات الفرعية اللصق وتحديد وجود عوامل الربط الفردية.
Introduction
الربط هو عملية ديناميكية للغاية تتطلب ربط وإطلاق العديد من العوامل بطريقة منسقة. وتشمل هذه العوامل الربط البروتينات ملزمة الجيش الملكي النيبالي, ATPases, هيليكيس, كيناس البروتين وفوسفاتاسيس, ليغاسي في كل مكان, من بين أمور أخرى1,2,3; وللسماح لإعادة ترتيب الجزيئية أن يحدث، بعض هذه العوامل ربط عابر جدا إلى الربط الفرعي، مما يجعل عزل وتحديد هذه المجمعات المتوسطة RNP صعبة للغاية.
هنا، استخدمنا طريقة Grafix4،5 لتحقيق الاستقرار في التفاعل بين عامل الربط الخميرة Cwc24 معB act complex6 للسماح بتحديد العوامل الأخرى المرتبطة بيكوبليكس وتحديد ما إذا كان وpp19 ubiquitin ligase يلعب أي دور في ربط أو الافراج عن Cwc24 إلى تسعة عشر (NTC) المعقدة و إلى نهاية 5 'من intron قبل التنشيط وأول رد فعل عبر الترانس يأخذ مكان. ميزة تعريض الجزيئات الكلية لتركيز متزايد من crosslinker على طول التدرج الجلسرين هو أنه يتجنب الوصلات المتقاطعة بين المجمعات4،5، وبالتالي ، تشكيل المجاميع.
وقد استخدمت هذه الطريقة كتكميل للبروتين coimmunoprecipitation والانسحاب إلى أسفل المقايسات، والتي، على الرغم من السماح لعزل المجمعات الكبيرة، قد لا تكون موثوقة للحفاظ على التفاعلات العابرة داخل المجمعات الديناميكية الكبيرة7،8. استخدام الكواشف التثبيت في التدرج الجلسرين يستقر الربط من هذه العوامل، مما يسمح لتأكيد التفاعلات من بروتينات محددة مع الربط subcomplexes. ولأن الوصلة المتقاطعة المختارة لا رجعة فيها كيميائيا، فقد تم تحليل البروتينات الموجودة في الكسور المستردة بواسطة لطخة نقطة بعد الطرد المركزي المتدرجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الخميرة إعداد استخراج مجموع
- تنمو خلايا الخميرة التعبير عن واحدة من عوامل الربط تنصهر على علامة TAP9 في 1 L YNB-غلو وسائل الإعلام (الخميرة النيتروجين الأساس تكملها 2٪ م / v الجلوكوز) مع الأحماض الأمينية المناسبة أو القواعد النووية, في هذه الحالة، أدينين (20 ميكروغرام/ مل)، ليوستين (30 ميكروغرام/مل)، تريبتوفان (30 ميكروغرام/مل)، حتى OD600 = 1.0.
- جمع الخلايا من الثقافة 1 لتر عن طريق الطرد المركزي في ثلاث زجاجات الطرد المركزي 500 مل في 17000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وغسل مرتين مع 10 مل الماء البارد العقيم.
- Resuspend خلايا الخميرة التي تم جمعها في 1/10 من حجم الخلية من العازلة الباردة A (10 مليمول L-1 HEPES pH = 7.9، 1.5 ملليمول L-1 MgCl2، 50 ملليمول L-1 KCl ، 5٪ v / v الجلسرين ، 0.5 ملليمول L-1 DTT ، كوكتيل مثبطات Protease الخالي من EDTA).
- تجميد قطرات صغيرة من تعليق الخلية في النيتروجين السائل. يمكن الحصول على قطرات صغيرة عن طريق pipetting محلول الخلية resuspended وإسقاط 50 ميكرولتر مباشرة إلى النيتروجين السائل.
تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل إصابات ملامسة للبشرة أو العينين. التعامل مع استخدام معدات السلامة المخصصة.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين قطرات تجميد تعليق الخلية عند -80 درجة مئوية. - إعداد خلايا الخميرة lysates عن طريق طحن في جهاز مطحنة الكرة من خلال ست دورات في 20 هرتز / ثانية لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: بعد كل دورة، تزج الحاوية التي تؤوي الخلايا المجمدة في النيتروجين السائل لتجنب ذوبان. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين المستخلصات المجمدة عند -80 درجة مئوية. ويمكن أيضا أن تكون مستعدة مقتطفات الربط الخميرة باستخدام المتجانسات لlysate spheroplasts10، أو باستخدام هاون والحشرات11،12. - تذوب استخراج عن طريق وضع الأنابيب التي تحتوي عليها في الماء في درجة حرارة الغرفة، ويهتز في بعض الأحيان.
- مستخلصات الطرد المركزي عند 45,000 × غرام ل 1 ساعة عند 4 °C.
- قياس محتوى البروتين من supernatant تطهيرها من قبل طريقة BCA13.
- إعداد aliquots من مقتطفات، وتجميد سريع لهم في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
2. إعداد التدرج الجلسرين
- إعداد اثنين من حلول الجلسرين في المخزن المؤقت A, واحد يحتوي على 10٪ v/v والآخر يحتوي على 30٪ v/v الجلسرين.
- إضافة عامل الربط الجلوتارارالدهيد إلى 0.1٪ v/v في محلول 30٪ v/v الجلسرين ومزيج لتجانس.
تنبيه: التعامل مع الجلوتارالدهيد داخل غطاء الدخان باستخدام معدات السلامة المناسبة. - أضف 6 مل من محلول الجلسرين البارد 10٪ v/v في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي سعة 12 مل (14 × 89 مم).
- إضافة 6 مل من الباردة 30٪ v/v محلول الجلسرين تكملها الجلوتارارالدهيد مع حقنة تعلق على إبرة طويلة المقدمة مع جهاز ماجستير التدرج في الجزء السفلي من الأنبوب, فقط تحت 10٪ v/v حل الجلسرين.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن يكون الحل 10٪ v/v الجلسرين pipetted بعناية على الجزء العلوي من الحل 30٪ v/v الجلسرين / الجلوتارالدهيد. - استخدم الجهاز الرئيسي التدرج لإنشاء تدرج كثافة مستمر.
ملاحظة: في الجهاز الرئيسي المتدرجة، يتم وضع الأنابيب في رف مناسب وتدويرها لفترة وجيزة، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لتحديد المعلمات (الوقت / الزاوية / السرعة). في هذا العمل استخدمنا: 2:25 دقيقة / 81.5 درجة / 11 دورة في الدقيقة. - إضافة بعناية 200 μL من 7٪ v/v الجلسرين / العازلة وسادة على الجزء العلوي قبل إضافة مقتطفات الخلية.
ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الجلسرين للوسادة أقل من محلول الجلسرين الأقل تركيزا المستخدم لإنشاء التدرج الخطي.
3. مقتطفات الطرد المركزي
- تحميل ما يقرب من 2 ملغ من البروتين الكلي على رأس كل 12 مل خطية الجلسرين الانحدار 10٪-30٪ الغلوتارارالدهيد مع وسادة.
- ضع الأنابيب في دوار دلو أرجوحة مبرد مسبقا.
ملاحظة: التعامل مع الأنابيب بلطف لتجنب الاختلاط قبل الطرد الفائق. - جهاز طرد مركزي عند 194,000 x g لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- Aliquot كل أنبوب 12 مل في أربعة وعشرين 500 ميكرولتر الكسور باستخدام نظام EconoSystem تكييفها أو عن طريق الأنابيب بعناية.
ملاحظة: يتكون نظام EconoSystem المكيف من مضخة تعلجية وكاشف الأشعة فوق البنفسجية وجامع الكسور المتصل بجهاز ثقب الأنبوب. ويمكن رصد ملامح الترسيب عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر. - استخدام 40٪ v/v حل الجلسرين من خلال مضخة التجبير لدفع الجلسرين 10٪-30٪ الانحدار من الأنبوب إلى جامع الكسور.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين الكسور في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. - تحميل 50 ميكرولتر من كل كسر مباشرة على أغشية النيتروسليلوز على بقعة نقطة أو فتحة جهاز لطخة. الكشف عن البروتين عن طريق المناعة باستخدام الأجسام المضادة ضد CBP (1:6،000، للكشف عن الجزء CBP من علامة TAP) ومكافحة أرنب IgG المقترنة مع الفجل Peroxidase (1:15،000) كأجسام مضادة ثانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحليل الملف الشخصي للترسيب Cwc24-TAP وتحديد ما إذا كانت طريقة Grafix فعالة لتحقيق الاستقرار في ربطها بالربط subcomplexes ، فصلنا إجمالي مستخلصات الخميرة من الخلايا التي تعبر عن Cwc24-TAP من خلال الطرد المركزي على تدرجات الجلسرين ، في وجود أو عدم وجود glutaraldehyde كعامل ربط متقاطع. ثم تم تحليل عينات من أربعة وعشرين كسر 500 ميكرولتر بواسطة فتحة لطخة مع الأجسام المضادة ضد الجزء CBP من علامة TAP. تظهر النتائج أنه في غياب الوصلة المتقاطعة ، يتركز Cwc24 بين الكسور 5 و 13(الشكل 1B)، المقابلة للمجمعات من حوالي 80 إلى 200 MDa14. في وجود وصلة عرضية، ومع ذلك، يتم نقل موقف Cwc24 على التدرج إلى كسور في الجزء السفلي من التدرج، المقابلة لمجمعات أكبر (الشكل 1). وتشير هذه النتائج إلى أن الجلوتارالدهيد يعمل على استقرار ارتباط Cwc24 بمجمعات الربط.
من أجل تحديد ما إذا كانت المجمعات التي تحتفظ Cwc24 تتوافق مع مجمع Bact ، الذي يتم تشكيله بواسطة SnRNPs U2 و U5 و U6 ومجمع NTC ، قارنا ترسب Cwc24 بترسبات الوحدة الفرعية U5 snRNP Prp8 و NTC Subunit Prp19. تليها نقطة لطخة للكشف عن البروتينات. وأظهرت هذه الوحدات الفرعية الثلاثة اللصق ملامح مماثلة، والترسب مع مجمعات أكبر في الجزء السفلي من التدرج. يتركز Cwc24 في نفس الكسور ، ولكن لأنه يرتبط بشكل عابر مع اللصق ، فهو موجود أيضا في الكسور الأخف(الشكل 2). يظهر القياس الكمي للنقاط هذه الملامح(الشكل 2B).
ومن المثير للاهتمام أن الكسور 11 و 12 هي تلك التي يبدأ فيها Prp8 و Prp19 في التركيز ، مما يشير إلى أن هذا هو الجزء من التدرج حيث يبدأ مجمع Bact في الرواسب. للتأكد من أن هذه البروتينات مرتبطة بالمجمعات في هذه الكسور ، تعرضت aliquots من الكسور 11 و 12 للكهرومورفوريس على المواد الهلامية الأصلية وبعد ذلك إلى لطخة غربية. إشارات Prp8 وPrp19 تظهر كطاخات بالكاد تدخل هلام الأكريلاميد 8٪، مما يدل على أنها في الواقع جزء من المجمعات الكبيرة(الشكل 3). Cwc24 موجود أيضا في الكسر 12 ، ولكن بتركيز أقل بكثير ، بما يتفق مع ربطه العابر لمجمع Bact. تظهر هذه النتائج أنه يمكن استخدام الجلوتارالدهيد كلونكر لتثبيت ربط العوامل العابرة بالربط بين الوصلات الفرعية.
الشكل 1: غرافا يحمل Cwc24 المرتبطة المجمعات الكبيرة. تم فصل مجموع استخراج الخميرة من الخلايا التي تعبر عن Cwc24-TAP عن طريق الطرد المركزي على التدرجات الجلسرين، إما في غياب أو وجود الجلوتارالدهيد كروسلينكر. (أ)تعرضت كسور فردية من التدرج إلى فتحة لطخة للحذف المناعي Cwc24-TAP مع الأجسام المضادة ضد الجزء CBP من علامة TAP. (ب)كمي من Cwc24-TAP باستخدام صورة J يظهر تركيز البروتين من خلال كسور التدرج الجلسرين. يشار إلى وجود أو غياب الجلوتارارالدهيد. يعرض المحور ص المقادير النسبية ل Cwc24 من خلال التدرج، محسوبة كشدة الإشارة في الكسور، بالنسبة للكسر الأول (Fn/F1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ترسيب عوامل الربط من خلال تدرجات الجلاسيرول/الجلوتارارالدهيد. تم تحميل مقتطفات من خلايا الخميرة التي تعبر عن Cwc24 أو Prp8 أو Prp19 تنصهر في علامة TAP على تدرجات الجلسرين التي تحتوي على الجلوتارالدهيد والطرد المركزي لفصل مجمعات الربط. (أ)تم تحليل عينات من الكسور الأربعة والعشرين من التدرج بواسطة بقعة نقطة والحذف المناعي للبروتينات التي تنصهر TAP مع الأجسام المضادة ضد الجزء CBP من علامة TAP. (ب)تحديد كمية البروتينات باستخدام صورة J يظهر تركيزها في الكسور السفلية من التدرج الجلاسيرول / الجلوتارانديهيدي. يظهر المحور ص الكميات النسبية من البروتينات من خلال التدرج، محسوبة كشدة الإشارة في الكسور، بالنسبة إلى الكسر الأول الذي يظهر إشارة فوق الخلفية (Fn/F1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الكشف عن مجمعات الربط حسب الصفحة الأصلية والمناعة. تم فصل الاقتباسات من الكسور 11 و 12 من التدرج المبين في الشكل 2 عن طريق الكهروضوئيات على هلام 8٪ من الأكريلاميد الأصلي وتعرض للمناعة مع الأجسام المضادة ضد CBP. لا يتم الكشف عن البروتينات كعصابات لأن المجمعات كبيرة جدا لفصل على المواد الهلامية الأصلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتين البروتين والريبونوكليك الأحماض البروتين التفاعلات يمكن استقرت باستخدام عوامل الربط المتبادل. من المهم أن يكون المركب الناتج مستقرا لتحمل الطرد المركزي الفائق على تدرج الجلسرين. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تسمح شروط المخزن المؤقت التفاعل ولكن تكون صارمة بما يكفي لتجنب الربط غير محددة. في التجارب المبينة هنا، استخدمنا حل العازلة التي أنشئت بالفعل لردود الفعل الربط في المختبر15.
وينبغي تحسين سرعة ووقت الطرد المركزي للمجمعات التي يجري تحليلها. اختبرنا ظروف الترسيب المختلفة، وعينات الطرد المركزي في 94،000 × ز و 194،000 × ز لمدة 16 ساعة في 4 درجة مئوية، مع نتائج مماثلة. عناصر التحكم هذه مهمة لتحديد الشروط التي لا تعجل التعقيدات التي يتم تحليلها.
اختبرنا أيضا طرق لطخة مختلفة ، pipetting مباشرة على الغشاء ، وذلك باستخدام فتحة لطخة أو أنظمة نقطة لطخة ، والتي أظهرت أن نقطة لطخة أعطى نتائج أكثر استنساخها.
أحد القيود الرئيسية لاستخدام glutaraldehyde كلونكر هو أنه لا يمكن إعادة الوصلة المتقاطعة. لذلك ، لا يمكن تحليل البروتينات عن طريق المناعة بعد SDS-PAGE ، ولكن فقط عن طريق المواد الهلامية الأصلية أو لطخة النقطة. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام عوامل الربط المتقاطعة القابلة للعكس، مثل الفورمالديهايد.
لقد استخدمنا سابقا الإفراط في المناعة من البروتينات لتحديد مجمعات الربط ، ولكن في حالة التفاعلات العابرة أو الضعيفة7، قد يساعد الربط المتقاطع في عزل المجمعات المتوسطة لتحديد مكوناتها لاحقا عن طريق قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن تركيزنا هنا كان الربط ، إلا أنه يمكن استخدام هذه الطريقة بالتأكيد لعزل العمليات الديناميكية الأخرى التي تشمل مجمعات متوسطة ذات تكوينات مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
