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Bioengineering

Fabrication de plates-formes magnétiques pour l’organisation à l’échelle du micron de neurones interconnectés

doi: 10.3791/62013 Published: July 14, 2021

Summary

Ce travail présente une approche ascendante de l’ingénierie des forces magnétiques locales pour le contrôle de l’organisation neuronale. Les cellules de type neurone chargées de nanoparticules magnétiques (MNF) sont plaquées au sommet et contrôlées par une plate-forme micro-modelée avec une aimantation perpendiculaire. Sont également décrits la caractérisation magnétique, l’absorption cellulaire MNP, la viabilité cellulaire et l’analyse statistique.

Abstract

La capacité de diriger les neurones dans des réseaux neuronaux organisés a de grandes implications pour la médecine régénérative, l’ingénierie tissulaire et la bio-interfaçage. De nombreuses études ont visé à diriger les neurones à l’aide de repères chimiques et topographiques. Cependant, les rapports de contrôle organisationnel à l’échelle du micron sur de grandes surfaces sont rares. Ici, une méthode efficace a été décrite pour placer les neurones dans des sites prédéfinis et guider l’excroissance neuronale avec une résolution à l’échelle du micron, en utilisant des plates-formes magnétiques intégrées avec des éléments magnétiques micro-modelés. Il a été démontré que le chargement des neurones avec des nanoparticules magnétiques (MNF) les convertit en unités magnétiques sensibles qui peuvent être influencées par des gradients magnétiques. Suite à cette approche, une plate-forme magnétique unique a été fabriquée sur laquelle les cellules PC12, un modèle commun de type neurone, ont été plaquées et chargées de nanoparticules superparamagnétiques. Des films minces de multicouches ferromagnétiques (FM) avec l’aimantation perpendiculaire stable ont été déposés pour fournir des forces d’attraction efficaces vers les modèles magnétiques. Ces cellules PC12 chargées de MNP, plaquées et différenciées au sommet des plates-formes magnétiques, ont été préférentiellement attachées aux modèles magnétiques, et l’excroissance de la neurite était bien alignée avec la forme du motif, formant des réseaux orientés. Des méthodes quantitatives de caractérisation des propriétés magnétiques, de la prise cellulaire de MNP, de la viabilité de cellules, et de l’analyse statistique des résultats sont présentées. Cette approche permet le contrôle de la formation de réseaux neuronaux et améliore l’interface neurone-électrode grâce à la manipulation des forces magnétiques, qui peut être un outil efficace pour les études in vitro des réseaux et peut offrir de nouvelles directions thérapeutiques de biointerfaçage.

Introduction

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Le micropatterning des neurones présente un grandpotentiel de régénération tissulaire1,2,3,4,5 et le développement de dispositifs neuro-électroniques6,7,8. Cependant, le positionnement à l’échelle du micron des neurones à haute résolution spatiale, comme dans les tissus biologiques, pose un défi important. La formation de structures préconçues à cette échelle nécessite le guidage des processus des cellules nerveuses en contrôlant localement la motilité du soma et l’excroissance axonale. Des études antérieures ont suggéré l’utilisation d’indices chimiques et physiques9,10,11,12 pour guider la croissance neuronale. Ici, une nouvelle approche se concentre sur le contrôle du positionnement des cellules par des gradients de champ magnétique13,14,15,16,17,transformant les cellules chargées de MNF en unités sensibles au magnétique, qui peuvent être manipulées à distance.

Kunze et al., qui ont caractérisé la force nécessaire pour induire des réponses cellulaires à l’aide de cellules chargées de puces magnétiques et de MNP, ont prouvé que l’élongation axonale précoce peut être déclenchée par une tension mécanique à l’intérieur des cellules18. Tay et coll. ont confirmé que les substrats microfabriqués avec des gradients de champ magnétique améliorés permettent la stimulation sans fil des circuits neuronaux dosés avec des MLP à l’aide de colorants indicateurs de calcium19. De plus, Tseng et al. ont coalisé des nanoparticules à l’intérieur des cellules, ce qui a entraîné des forces localisées médiées par les nanoparticules qui se sont approchées de la tension cellulaire20. Cela a conduit à la fabrication de modèles définis de substrats micromagnétiques qui ont aidé à étudier la réponse cellulaire aux forces mécaniques. La tension cellulaire résultant de l’application de forces localisées médiées par les nanoparticules a été obtenue en coalisant des nanoparticules dans les cellules20. Un système hybride microfluidique à semi-conducteur à oxyde métallique complémentaire (CMOS) a été développé par Lee et al. qui ont intégré un réseau de micro-électro-aimants dans la puce CMOS pour contrôler le mouvement des cellules individuelles marquées avec des billes magnétiques21.

Alon et al. ont utilisé des tampons magnétiques à micro-échelle, préprogrammés, comme « points chauds » magnétiques pour localiser les cellules22. Une activité spécifique pourrait également être stimulée au sein des cellules à l’aide de réseaux magnétiques micro-modelés pour localiser des nanoparticules à des emplacements subcellulaires spécifiques23. L’absorption cellulaire de MNP a été démontrée avec succès dans la sangsue, le rat, et les neurones primaires de souris24,25,26. Ici, ceci a été démontré sur une variété de cellule de phéochromocytome PC12 de rat, qui a été précédemment rapportée pour montrer la prise élevée des MNF27. Au cours des dernières années, il y a eu diverses applications médicales des MLP, y compris l’administration de médicaments et la thermothérapie dans les traitements du cancer28,29,30,31. Plus précisément, les études traitent de l’application des MLP et des réseaux neuronaux32,33,34,35. Cependant, l’organisation magnétique des neurones utilisant des MLP à un niveau unicellulaire mérite une enquête plus approfondie.

Dans ce travail, une approche ascendante a été décrite pour concevoir des forces magnétiques locales via des plates-formes prédéfinies pour contrôler l’arrangement neuronal. La fabrication des modèles à l’échelle du micron des multicouches FM a été présentée. Cette structure multicouche FM unique crée une aimantation perpendiculaire stable qui se traduit par des forces d’attraction efficaces vers tous les modèles magnétiques. Par incubation, les MLP ont été chargés dans des cellules PC12, les transformant en unités sensibles magnétiques. des cellules MNP-chargées, plaquées et différenciées au-dessus des plates-formes magnétiques, ont été préférentiellement attachées aux modèles magnétiques, et l’excroissance de neurite a été bien alignée avec la forme de modèle, formant des réseaux orientés. Plusieurs méthodes ont été décrites pour caractériser les propriétés magnétiques des multicouches FM et des MNP, et des techniques pour l’absorption cellulaire de MNP et les essais de viabilité cellulaire ont également été présentées. De plus, les paramètres morphométriques de la croissance neuronale et l’analyse statistique des résultats sont détaillés.

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Protocol

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REMARQUE: Effectuez toutes les réactions biologiques dans une armoire de biosécurité.

1. Fabrication de plateformes magnétiques

  1. lithographie
    1. Couper les lames de verre en 2 x 2 cm2 à l’aide d’un stylo scriber. Nettoyez les lames de verre à l’acétone puis à l’isopropanol pendant 5 min chacune dans un bain d’ultra-sonication. Sécher avec de l’azote de très haute pureté (UHP).
    2. Enduire le verre de photorésine en utilisant un revêtement par spin à 6 000 tr/min pendant 60 s, pour atteindre 1,5 μm d’épaisseur, et cuire au four à 100 °C pendant 60 s. Exposez l’échantillon à une source de lumière, en utilisant une longueur d’onde appropriée pour la photorésine, avec un motif souhaité, à l’aide d’un photomasque ou d’une lithographie sans masque.
    3. Développer pendant 40 s dans un révélateur, dilué dans de l’eau distillée (DW) selon les instructions du fabricant; laver en DW pendant 45 s et sécher avec de l’azote gazeux UHP. Inspectez le motif sous un microscope optique.
  2. Dépôt par pulvérisation
    1. Insérez l’échantillon dans la chambre principale du système de dépôt et attendez la pression de base (~ 5 × 10-8 Torr). Ouvrez le flux de gaz; régler le débit d’argon pour la pulvérisation standard (28 sccm [cm cube standard par min) ici. Enflammer les cibles de pulvérisation, puis régler la pression de pulvérisation à 3 mTorr.
    2. Augmentez la puissance sur chaque cible jusqu’à ce que le taux souhaité soit atteint.
      NOTA : Taux : 0,62 A/s = 1,0 nm en 16 s; Co80Fe20 Taux : 0,32 A/s, 0,2 nm en 6,25 s.
    3. Activez la rotation. Déposez le multicouche FM, en alternance entre les cibles Co80Fe20 et, en ouvrant et en fermant les volets cibles, respectivement. Déposez 14 couches de Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) et terminez par une couche de capsulage supplémentaire de 2 nm.
    4. Décollage: Faire tremper l’échantillon dans de l’acétone pendant 30 min et rincer à l’isopropanol. Ensuite, séchez avec de l’azote UHP et conservez l’échantillon dans un environnement propre et sec jusqu’à son utilisation.

2. Caractérisation d’un dispositif magnétique par des mesures de transport

  1. Utilisez un substrat si ou une lame de verre avec une barre magnétique en forme de croix de 100 μm de largeur, déposée avec des multicouches FM (voir l’encart de la figure 1C). Fixer l’échantillon au support à l’aide de ruban adhésif double face.
  2. À l’aide d’un liant de fil, lions 4 fils à l’échantillon, un sur chaque jambe de l’électrode transversale. Régler le porte-échantillon et l’échantillon à l’intérieur du système de mesure du transport avec un champ magnétique de sorte que le champ magnétique soit perpendiculaire à l’échantillon. Effectuer des mesures à température ambiante.
  3. Effectuer la mesure de la tension transversale (VT)de l’appareil; suivre les marquages de la figure 1C (encart) : appliquer un courant de 1 mA entre les contacts 1 et 3 ; mesurer le VT entre les contacts 2 et 4 ; ensuite, appliquez un courant compris entre 2 et 4, et mesurez la tension entre 1 et 3. Enfin, calculer la différence entre les tensions des deux mesures et diviser par 2 pour obtenir VT. Utilisez un système de commutation pour basculer automatiquement entre les deux configurations de mesure.
  4. Balayer le champ magnétique entre 0,4 T et -0,4 T par pas de 5 mT et mesurer le VT en fonction du champ. Tracer la résistance transversale (VT/I) par rapport au champ magnétique pour déterminer le signal Hall anormal, qui est proportionnel à l’aimantation perpendiculaire dans le film.

3. Caractérisation des MNF et des multicouches magnétiques par des mesures magnétométriques

  1. Mesure magnétométrique pour multicouches FM
    1. Déposer le multicouche FM sur le substrat si (voir section 1.2). Couper l’échantillon en 6 carrés de 4 x 4 mm2 taille. Empilez les échantillons les uns sur les autres et disposez-les dans la capsule perpendiculairement à la direction du champ magnétique (voir figure 1D en médaillon).
    2. Insérez la capsule dans le magnétomètre et mesurez l’aimantation à température ambiante. Balayez le champ magnétique entre -0,4 T et 0,4 T.
    3. Calculer le volume total du matériau magnétique, en tenant compte de l’épaisseur de la couche magnétique, de la taille des échantillons et du nombre de substrats. Divisez l’aimantation par le volume total du matériau magnétique.
    4. Tracer l’aimantation (par unité de volume) par rapport au champ magnétique. Soustrayez le fond diamagnétique du substrat de la réponse à haut champ magnétique et extrapolez l’aimantation de saturation du FM du graphique.
  2. Mesure magnétométrique pour les MNF
    1. Insérer une masse désignée de MLP dans une capsule de polymère synthétique. Envisagez un volume plus important si vous mesurez de petites valeurs de saturation d’aimantation.
    2. Si les MNT sont en suspension dans un solvant, séchez-les en laissant la capsule ouverte pendant la nuit. Insérez la capsule dans le magnétomètre et mesurez l’aimantation à température ambiante. Balayez le champ magnétique entre -0,2 T et 0,2 T.
    3. Calculer la masse totale des MNF en multipliant le volume désigné par la concentration de particules. Normaliser les résultats à 1 g.
    4. Tracer l’aimantation normalisée (par gramme) par rapport au champ magnétique. Extrapoler la saturation d’aimantation des MNF à partir du graphique.

4. Protocole de revêtement de collagène

  1. Revêtement de vaisselle en plastique
    1. Préparer 0,01 M HCl en ajoutant 490 μL de HCl à 500 mL d’eau autoclavée doublement distillée (EDD).
      Remarque : effectuez cette étape uniquement dans le capot chimique.
    2. Diluer le collagène de type 1 (solution de la queue de rat) 1:60-1:80 dans 0,01 M HCl pour obtenir la concentration de travail finale de 50 μg/mL. Placer 1,5 mL de la solution diluée dans une parabole de culture de 35 mm. Laissez le plat dans la hotte pendant 1 h, couvert.
    3. Retirer la solution et laver 3x dans une solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS). Le plat est prêt pour l’ensemencement cellulaire.
  2. Revêtement de lames de verre
    1. Diluer le collagène de type 1 (solution de la queue de rat) 1:50 dans de l’éthanol à 30 % v/v. Pour enduire une capsule de 35 mm, ajouter 20 μL de collagène à 1 mL d’éthanol à 30 %.
    2. Couvrez le plat avec la solution et attendez que toute la solution s’évapore, laissant le plat à découvert pendant quelques heures. Laver 3x dans un PBS stérile 1x; la lame de verre est prête pour l’ensemencement cellulaire.

5. Adoption et viabilité du MNP cellulaire

  1. Adoption du MNP cellulaire
    1. Préparer le milieu de croissance de base pour la culture cellulaire PC12 en ajoutant 10 % de sérum de cheval (SH), 5 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine au milieu du Roswell Park Medical Institute (RPMI), et filtrer à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 μm.
    2. Ajouter 1 % de sérum de cheval (SH), 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine au milieu RPMI pour préparer le milieu de différenciation PC12, et filtrer à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 μm.
    3. Cultiver des cellules dans une fiole de culture non traitée avec 10 mL de milieu de croissance basique; ajouter 10 mL de milieu de croissance basique à la fiole tous les 2-3 jours, et sous-culturer les cellules après 8 jours.
    4. Pour l’absorption cellulaire, centrifuger la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger pendant 8 min à 200 × g et température ambiante, et jeter le surnageant.
    5. Ressusciter les cellules dans 3 mL de milieu de croissance basique frais. Encore une fois, centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 × g et température ambiante, et jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans 3 mL de milieu de différenciation frais.
    6. Aspirer les cellules 10x à l’aide d’une seringue et d’une aiguille pour briser les amas cellulaires. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ensemencez10 6 cellules dans un plat régulier non enrobé de 35 mm.
    7. Ajouter à la boîte le volume calculé de suspension MNP et le volume du milieu de différenciation pour atteindre la concentration MNP souhaitée et le volume total. Mélanger les cellules, les MLP et le milieu de différenciation; incuber la boîte dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C pendant 24 h.
    8. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 × g à température ambiante et jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation frais, et compter les cellules utilisant un hémocytomètre.
  2. Différenciation cellulaire chargée en MNP
    1. Exécuter le protocole d’adoption (section 5.1). Les semences 8 × 104 cellules chargées de MNP sur un plat enrobé de collagène de type l de 35 mm en présence d’un milieu de différenciation (voir protocole d’enrobage de collagène à la section 4.1). Après 24 h, ajoutez 1:100 facteur de croissance murin frais de bêta-nerf (β-NGF) (concentration finale 50 ng/mL).
    2. Renouveler le milieu de différenciation et ajouter du β-NGF murin frais tous les 2 jours. Imagez les cellules tous les 2 jours en utilisant la microscopie optique. Après la formation du réseau (6-8 jours pour les cellules PC12), imagez les cellules à l’aide de la microscopie confocale et observez la fluorescence des particules.
  3. Essai de viabilité pour les cellules chargées de MNP : essai de viabilité cellulaire du 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT).
    1. Préparer le milieu de croissance de base selon l’étape 5.1.1. Cultiver les cellules PC12 avec des MNF à différentes concentrations (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL et 0,5 mg/mL dans le milieu de croissance basique) et également sans MNF pour le contrôle en triple exemplaire dans une plaque plate de 96 puits (volume total de 100 μL/puits). Incuber les cellules pendant 24 h dans un incubateur humidifié à 5% deCO2à 37 °C.
    2. Préparer des puits vierges contenant du milieu sans cellules pour la correction de fond. Décongeler la solution de réactif XTT et la solution de réaction contenant du sulfate de méthyle N-méthyl dibenzopyrazine) dans un bain à 37 °C immédiatement avant l’utilisation. Tourbillonnez doucement jusqu’à ce que des solutions claires soient obtenues.
    3. Pour une plaque de 96 puits, mélanger 0,1 mL de solution d’activation avec 5 mL de réactif XTT. Ajouter 50 μL de la solution réactionnel à chaque puits, agiter légèrement la plaque pour une distribution uniforme du colorant dans les puits, puis incuber la plaque dans un incubateur pendant 5 h.
    4. Mesurer l’absorbance de l’échantillon par rapport aux puits vierges à l’aide d’un lecteur d’immunosorbant lié à des enzymes (ELISA) à une longueur d’onde de 450 nm. Mesurer l’absorbance de référence en utilisant une longueur d’onde de 630 nm et la soustraire de la mesure de 450 nm.
    5. Comme une légère absorbance spontanée se produit dans le milieu de culture incube incubé avec le réactif XTT à 450 nm, soustraire l’absorbance moyenne des puits vierges de celle des autres puits. Soustraire les valeurs de signal d’échantillons parallèles de MNF aux mêmes concentrations testées que les échantillons cellulaires.
  4. Essai de viabilité pour les cellules chargées de MNP : test de viabilité cellulaire à base de réazurine
    1. Préparer le milieu de croissance de base selon l’étape 5.1.1. Cultiver les cellules PC12 avec des MLP à différentes concentrations (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, et 0,5 mg/mL dans le milieu de croissance de base) et sans MNF comme contrôle en triple exemplaire dans une plaque plate de 96 puits pendant 24 h. Incuber les cellules pendant 24 h dans un incubateur à 5 % deCO2 à 37 °C. Préparer des puits vierges contenant du milieu sans cellules.
    2. Lavez les cellules avec 1x PBS. Ajouter le réactif à base de réazurine (10 % p/v) au milieu et incuber pendant 2 h dans un incubateur à 37 °C.
    3. Placer des aliquotes de 150 μL des échantillons dans le lecteur ELISA et mesurer l’absorbance à une longueur d’onde d’excitation de 560 nm et une longueur d’onde d’émission de 590 nm. Soustrayez les valeurs du signal des échantillons parallèles de MNF aux mêmes concentrations testées que les échantillons cellulaires.

6. Caractérisation de la concentration de MNP à l’intérieur des cellules à l’aide de plasma à couplage inductif (ICP)

  1. Préparer le milieu de croissance de base selon l’étape 5.1.1. Cultiver les cellules PC12 avec des MNC à différentes concentrations (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL et 0,5 mg/mL dans le milieu de croissance de base) et sans MNF comme témoin en triple exemplaire dans une plaque plate de 96 puits (volume total de 100 μL/puits). Incuber dans un incubateur humidifié à 5% deCO2à 37°C pendant 24 h.
  2. Transférer la suspension dans un tube de centrifugation (de chaque puits séparément), centrifuger les cellules à 200 × g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation frais, et compter les cellules utilisant un hémocytomètre.
  3. Lyser les cellules par traitement avec 100 μL d’acide nitrique à 70% dans chaque puits séparément pendant au moins 15 min. Ajouter 5 mL de DDW aux cellules lysées et filtrer les solutions.
  4. Mesurer la concentration de fer à l’aide de l’ICP et utiliser le nombre de cellules pour enregistrer la concentration de Fe par cellule.

7. Différenciation et croissance cellulaires sur plate-forme magnétique

  1. Nettoyez le substrat à motifs avec 70% v / v / éthanol et placez le substrat dans un plat de culture de 35 mm dans la hotte. Placez un grand aimant (~ 1500 Oe) sous le substrat à motifs pendant 1 min et retirez l’aimant en déplaçant d’abord la parabole vers le haut et loin de l’aimant, puis retirez l’aimant de la hotte. Allumez la lumière ultraviolette pendant 15 min.
  2. Enrober le substrat de collagène de type 1 conformément à la section 4.2. Suspendre les cellules après absorption cellulaire de MNP (section 5.1), ensemencer10 5 cellules dans une boîte de culture de 35 mm et ajouter 2 mL de milieu de différenciation. Incuber la culture dans un incubateur humidifié à 5% deCO2à 37 °C.
  3. Après 24 h, ajouter 1:100 murin frais β-NGF (concentration finale de 50 ng/mL). Renouveler le milieu de différenciation et ajouter du β-NGF murin frais tous les 2 jours. Imager les cellules tous les 2 jours à l’aide de la photomicroscopie et, après la formation du réseau, effectuer une immunomarquage sur les cellules (section 8.1).

8. Coloration des cellules chargées en MNP

  1. Immunomarquage de la tubuline
    1. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % en mélangeant 10 mL de solution de PFA à 16 % p/v, 4 mL de PBS 10x et 26 mL de DDW. Préparer 50 mL de PBT à 1 % en ajoutant 500 μL d’un tensioactif non ionique à 50 mL de PBS 1x. Préparer 50 mL de PBT à 0,5 % en mélangeant 25 mL de PBT à 1 % avec 25 mL de PBS 1x. Préparer la solution bloquante en mélangeant 1% d’albumine sérique bovine et 1% de sérum d’âne normal dans 0,25% de PBT.
      REMARQUE: Utilisez PFA uniquement à l’intérieur de la hotte chimique.
    2. Retirez le milieu surnageant des cellules. Fixer les cellules chargées de MNP dans 4% PFA pendant 15 min à température ambiante à l’intérieur d’une hotte chimique. Lavez les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage, à l’intérieur d’une hotte chimique.
    3. Perméabiliser les cellules chargées de MNP avec 0,5% pbt pendant 10 min. Incuber les cellules chargées de MNP d’abord dans une solution de blocage pendant 45 min à température ambiante, puis avec de l’anticorps anti-α-tubuline de lapin dans une solution de blocage pendant une nuit à 4 °C. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage.
    4. Incuber les cellules chargées de MNP avec de l’anticorps secondaire anti-lapin d’âne conjugué à Cy2 pendant 45 minutes dans l’obscurité et à température ambiante. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage.
    5. Effectuer une imagerie confocale. Pour la tubuline, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 492 nm et une longueur d’onde d’émission de 510 nm. Pour les MNF (rhodamine), utilisez une longueur d’onde d’excitation de 578 nm et une longueur d’onde d’émission de 613 nm.
  2. Coloration nucléaire avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)
    1. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage. Enlevez l’excès de liquide autour de l’échantillon, ajoutez 1 goutte (~50 μL) de milieu de montage contenant du DAPI pour couvrir une zone de 22 mm x 22 mm, et incuber pendant 5 min dans l’obscurité et à température ambiante.
    2. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage. Effectuer une imagerie confocale. Pour le DAPI, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 358 nm et une longueur d’onde d’émission de 461 nm. Pour les MNF (rhodamine), utilisez une longueur d’onde d’excitation de 578 nm et une longueur d’onde d’émission de 613 nm.

9. Mesures et analyse statistique

  1. Analyse morphométrique de la différenciation cellulaire chargée de MNP
    1. Pour mesurer le nombre d’intersections à différentes distances du corps cellulaire, acquérir des images de phase des cellules cultivées jusqu’à 3 jours après le traitement par NGF.
      Remarque : Si cela est fait plus tard, les cellules peuvent développer des réseaux, empêchant les mesures de résolution de cellule unique.
      1. Ouvrez les images dans le programme de traitement d’image, ImageJ, et utilisez le plug-in NeuronJ, qui permet un traçage de neurite semi-automatique et une mesure de longueur36. À l’aide du plug-in de traceur de neurite, tracez les neurites et convertissez les données en images binaires. Définissez le centre du soma.
      2. Effectuez l’analyse Sholl, disponible dans le plug-in NeuronJ. Définissez le rayon maximal. Répétez l’expérience trois fois. Analyser plus de 100 cellules dans chaque expérience.
  2. Analyse de localisation cellulaire
    1. Pour déterminer le pourcentage de cellules localisées sur la zone magnétique après 3 jours d’incubation, acquérir des images microscopiques confocales de cellules avec et sans absorption de MNP. Utilisez la coloration DAPI (section 8.2).
    2. Comptez manuellement les cellules au sommet ou partiellement au-dessus du motif (cellules touchantes) et les cellules qui ne le sont pas. Répétez l’opération pour trois expériences. Analyser plus de 400 cellules avec MNP et sans absorption.
    3. Calculez la proportion relative des cellules qui se trouvent au sommet des motifs magnétiques sur le nombre total de cellules, avec et sans MNF. En outre, calculez le pourcentage de la surface effective du motif magnétique en ajoutant le diamètre du corps de la cellule à la largeur du motif pour déterminer la probabilité aléatoire que les cellules atterrissent sur un motif magnétique.
    4. Effectuez un seul test Zd’échantillon pour analyser si la distribution cellulaire est le résultat d’un atterrissage de cellules isotropes ou s’il existe un biais préféré au motif magnétique.
  3. Analyse de la directionnalité de la croissance
    1. Pour quantifier l’effet sur la directionnalité de l’excroissance des neurites, acquérir des images microscopiques confocales des cellules avec et sans traitement MNP après 8 jours d’incubation. Effectuer une immuno-coloration (section 8.1).
    2. À l’aide du logiciel ImageJ, mesurez l’angle entre la neurite cellulaire et les bandes magnétiques dans les deux conditions.
      REMARQUE: Analyser uniquement les neurites qui proviennent de somas situés sur les bandes magnétiques.
    3. Tracer la distribution des angles des neurites par rapport à la direction des rayures (Δθ). Effectuer un test du Khi-deux de la distribution de Δθ pour démontrer que la distribution n’est pas normale ou uniforme.

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Representative Results

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Des plates-formes magnétiques de différentes formes géométriques ont été fabriquées(figure 1A). Des motifs magnétiques ont été déposés par pulvérisation : 14 multicouches de Co80Fe20 et, 0,2 nm et 1 nm, respectivement. La microscopie électronique a révélé que la hauteur totale des motifs magnétiques était d’environ 18 nm(figure 1B). Ce dépôt multicouche FM unique crée une plate-forme stable avec une anisotropie d’aimantation perpendiculaire (PMA) par rapport au plan de substrat qui permet l’attraction des cellules chargées de MNP vers l’ensemble du motif magnétique et pas seulement vers les bords22,37. Les paramètres de la structure multicouche FM ont été caractérisés par des mesures de magnéto-transport pour lesquelles un dispositif en forme de croix de multicouches FM a été fabriqué(figure 1C en médaillon), et l’aimantation perpendiculaire au substrat a été mesurée via l’effet hall anormal (AHE)38,où la résistance AHE est proportionnelle à l’aimantation perpendiculaire. La mesure de l’AHE par rapport au champ magnétique a montré une boucle d’hystérésis indiquant des ferro-aimants PMA(figure 1C). L’aimantation résiduelle des multicouches FM (moment magnétique à champ nul) était identique à la saturation d’aimantation (MS)à haut champ. En outre, le champ coercitif des multicouches FM était d’environ 500 Oe, atteignant la saturation à 1 200 Oe, ce qui a permis une aimantation facile de l’appareil et a assuré la stabilité contre l’influence des champs magnétiques involontaires. La valeur MS des multicouches a été mesurée à l’aide d’un magnétomètre(figure 1D),comme décrit au point 3.1. Le MS était de 270 emu/cm3, ce qui est à égalité avec les mesures précédentes de structures similaires.

Les MNF d’oxyde defer fluorescent (γ-Fe2O3)ont été préparés conformément à une publication précédente39. Les MNF ont été synthétisés par nucléation, y compris la conjugaison covalente de films minces à six couches d’oxyde de fer à l’isothiocyanate de rhodamine et le revêtement avec de l’albumine sérique humaine. La taille du diamètre sec des MMP était d’environ 15 nm avec un potentiel zêta de -45, selon la mesure au microscope électronique de transmission. Les mesures magnétométriques des MNF(figure 2A)montrent que la courbe d’aimantation n’avait pas d’hystérésis, indiquant un comportement superparamagnétique des MNF, un faible champ de saturation de 500 Oe, et un MS relativement élevé de 22 emu/g. Pour contrôler la localisation des cellules à l’aide de motifs magnétiques, des cellules PC12 ont été incubées dans un milieu mélangé à des MNF fluorescents d’oxyde de fer pendant 24 h, les transformant en unités magnétiques. La concentration de MNP dans le milieu peut être variée; il était de 0,25 mg/mL dans les expériences de placage. Des images microscopiques confocales ont été prises après la coloration DAPI(figure 2B). Les M. M. Ont été internalisés dans les cellules PC12, mais pas dans les noyaux, qui ont été réfléchis par l’ombre sombre au centre. Les résultats montrent qu’il n’y avait pas de florescence rouge dans les noyaux, ce qui indique que les MLP n’ont pas été internalisés dans les noyaux ou avaient attaché à la surface externe des cellules. En utilisant des mesures ICP, il a été possible de quantifier les quantités de MNT internalisées dans les cellules PC12. La concentration de fer à l’intérieur des cellules augmentait avec l’augmentation de la concentration de MNP dans le milieu(figure 2C).

La viabilité des cellules PC12 MNP-chargées pour différentes concentrations de MNP a été évaluée utilisant des essais XTT- et resazurin-basés. La figure 3A montre des cellules PC12 après un traitement MNP, se développant et se différenciant au sommet d’un plat en plastique enduit de collagène. Pour examiner l’impact des MNF internalisés sur la différenciation, la mesure morphologique de Sholl a été effectuée. Aucune différence significative n’a été observée dans la morphologie cellulaire entre les cellules chargées de MNP et les cellules témoins(test t,p > 0,05, n = 3)(figure 3B). L’activité métabolique des cellules PC12 a été mesurée utilisant des analyses XTT et resazurin-basées après incubation de cellules avec différentes concentrations de MNP. Les résultats ont été normalisés à la mesure de commande des cellules PC12 sans MNPs. Ces concentrations de MLP n’ont montré aucune cytotoxicité significative envers les cellules, évidente dans l’absence de différences significatives dans la viabilité cellulaire pour l’une des préparations (testt,p > 0,05, n = 3)(Figure 3C,D). Les effets des MNP sur le placage et le développement des cellules ont été déterminés en comparant les cellules chargées de MNP aux cellules non chargées, plaquées et cultivées sur des substrats magnétiques identiques. Les cellules ont été ensemencées et laissées pour adhérer au substrat. Tous les 2 jours, les cellules ont été traitées avec un milieu frais et du NGF, comme décrit à la section 7. La figure 4 montre des cellules PC12 avec et sans traitement MNP, se développant et se différenciant sur un substrat magnétique avec des bandes larges de 20 μm et un espacement de 100 μm. Après 3 jours de croissance, les cellules immunostained, DAPI-souillé, et des images ont été prises.

Les cellules magnétisées se sont avérées se fixer aux motifs magnétiques et développer des branches selon les modèles, tandis que les cellules sans traitement MNP se sont développées sans affinité avec les dispositifs magnétiques(Figure 4A,B). La figure 4C présente le positionnement des cellules et la formation du réseau sur un substrat à géométrie hexagonale d’une longueur latérale de 200 μm et d’une largeur de ligne de 50 μm. Des cellules ont été entées après 6 jours. Les cellules magnétisées ont été situées sur le modèle magnétique, avec l’affinité semblable aux substrats rayés. Le positionnement cellulaire a été quantifié en comptant les corps cellulaires situés sur les motifs magnétiques ou attachés à ceux-ci. La proportion relative de cellules a été calculée à partir de la population cellulaire totale. Ceci a été fait pour des cellules avec et sans traitement de MNP. La surface effective de la réponse magnétique a été calculée en ajoutant le diamètre des cellules (~ 10 μm pour les cellules PC12) aux deux bords du motif magnétique. Pour les motifs de bande magnétique, le rapport de surface magnétique effectif était de 33%, ce qui correspondait à la probabilité que les cellules atterrissent au hasard sur les bandes magnétiques. Les résultats ont montré que 75 % des corps cellulaires chargés de MNP étaient en contact avec les bandes magnétiques, alors que seulement 35 % des cellules non aimantées étaient situées sur les bandes (en accord statistique avec une distribution non biaisée) (Figure 4D). L’analyse statistique a indiqué que la mesure n’a pas été dérivée de l’atterrissage cellulaire arbitraire (un échantillon z-test, p < 10-6, n = 430).

En revanche, l’analyse statistique des hexagones magnétiques a révélé que 92 % du soma des cellules chargées de MNP étaient attachés aux motifs magnétiques, comparativement à 38 % pour les cellules sans traitement MNP (Figure 4E). Le rapport effectif de surface des hexagones était 32% du substrat. L’analyse statistique des hexagones a également indiqué que la mesure n’était pas dérivée de l’atterrissage cellulaire arbitraire (test zà un échantillon, p < 10-6, n = 370). Les résultats ont indiqué une préférence claire des cellules MNP-chargées pour le modèle magnétique, alors que les cellules sans MNPs adhéraient aléatoirement au substrat entier. En plus de l’effet de positionnement cellulaire, ces plates-formes magnétiques ont également été trouvées pour contrôler la directionnalité des neurites en croissance. La figure 5A montre des cellules chargées de MNP avec des neurites, alignées en fonction de l’orientation des bandes. En revanche, la mesure de contrôle des cellules sans MNF a montré la croissance de la neurite à travers la plate-forme indépendamment des modèles magnétiques.

Pour évaluer l’effet magnétique sur la directionnalité de la croissance neuronale, l’angle entre les neurites et les bandes magnétiques a été mesuré. Les données ont révélé que 80% des neurites des cellules chargées de MNP présentaient une corrélation avec l’orientation des bandes magnétiques, à l’intérieur de Δθ < 15° par rapport à la direction des bandes. Cependant, seulement 32% des neurites des cellules sans MNF se sont développées dans cette gamme. Les cellules sans traitement MNP n’ont montré aucune corrélation avec les bandes magnétiques et se sont développées selon une distribution d’angle uniforme(figure 5B). L’analyse statistique de la distribution de Δθ a révélé qu’elle n’était ni normale ni uniforme (test du chi carré, p < 0,001). L’effet de la géométrie hexagonale sur la croissance de nez a été démontré aussi bien. La figure 5C montre des images de fluorescence du développement de réseaux neuronaux de cellules PC12 magnétisées et non magnétisées au sommet d’un motif magnétique d’hexagones et de grands cercles entre les bords. La longueur latérale de l’hexagone était de 200 μm et la largeur des lignes était de 10 μm; le diamètre du cercle était de 30 μm. Les somas de cellules ont montré l’affinité élevée pour les cercles et ont développé un réseau neuronal bien orienté le long des contours hexagonaux. Une image zoom avant montre des cellules attachées à un cercle magnétique et des neurites poussant le long de ces contours (Figure 5D).

Figure 1
Figure 1: Caractérisation des dispositifs magnétiques. (A) Images microscopiques optiques de dispositifs magnétiques de formes géométriques diverses. Barre d’échelle = 200 μm.(B)Balayage de l’image au microscope électronique des multicouches Co80Fe20/Pd et d’un schéma des multicouches. La hauteur totale des motifs magnétiques est de 18 nm. Barre d’échelle = 100 nm. (C) Mesure anormale par effet Hall du dispositif magnétique montrant les champs magnétiques coercitifs et résiduels du FM. (D) La magnétométrie du dispositif multicouche montre la valeur de saturation de l’aimantation calculée par volume. Ce chiffre a été modifié à partir de Marcus et al.37. Abréviations : AHE = Effet Hall anormal; FM = ferromagnétique; B = champ magnétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Absorption par les cellules PC12 des MNF. (A)Mesure magnétométrique des MNF à température ambiante. (B) Image confocale de microscopie de la prise de MNP par les cellules PC12. Noyaux colorés avec DAPI; Les MNF marqués avec de la rhodamine pénètrent dans les cellules. Barre d’échelle = 10 μm(C)mesure ICP des MNP d’oxyde de fer internalisés (pg) par les cellules PC12 après 24 h d’incubation avec plusieurs concentrations de MNP. Ce chiffre a été modifié à partir de Marcus et al.37. Abréviations : MLP = nanoparticules magnétiques; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; ICP = plasma à couplage inductif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Viabilité des cellules PC12 chargées en MNP. (A)Images microscopiques confocales de cellules PC12 différenciées incubées avec des MNP. Les flèches montrent des neurites différenciées avec des MNP internalisées. Barres d’échelle = 50 nm. (B) Analyse de Sholl de l’excroissance de la neurite des cellules PC12 après 3 jours de différenciation. (C) essai de viabilité de XTT des cellules PC12 traitées avec des concentrations croissantes de MNF après 24 h d’incubation. Les mesures sont normalisées pour contrôler. (D) Analyse de viabilité basée sur resazurin des cellules PC12 traitées avec des concentrations croissantes de MNF après 24 h d’incubation. Les mesures sont normalisées pour contrôler. Il n’y a pas de signification statistique dans les deux analyses. Ce chiffre a été modifié à partir de Marcus et al.37. Abréviations : MLP = nanoparticules magnétiques; XTT = 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Localisation cellulaire au sommet des dispositifs magnétiques. (A)Images fluorescentes de cellules PC12 chargées de MNF poussant sur les bandes magnétiques : (i) étiquetage α-tubuline, (ii) coloration DAPI, et (iii) image fusionnée. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Images fluorescentes de cellules PC12 sans traitement MNP, poussant au-dessus des bandes magnétiques comme dans (A). (C) Images de fluorescence des cellules PC12, avec et sans MMP, sur le motif magnétique hexagonal. Barre d’échelle = 200 μm. (D) Pourcentage de corps cellulaires, avec et sans MNF, situés sur les bandes magnétiques. Les barres d’erreur représentent l’écart type. La ligne pointillée représente la probabilité que les cellules atterrissent sur les bandes magnétiques. (E) Pourcentage de corps cellulaires, avec et sans MNF, situés sur les hexagones magnétiques. Les barres d’erreur représentent l’écart type. La ligne pointillée représente la probabilité que les cellules atterrissent sur les motifs magnétiques pour une distribution aléatoire. Il n’y a pas de signification statistique dans les deux analyses. Ce chiffre a été modifié à partir de Marcus et al.37. Abréviations : MLP = nanoparticules magnétiques; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Directionnalité du réseau neuronal. (A)Images microscopiques confocales de cellules PC12 marqués à la tubuline α avec traitement MNP (à gauche) et sans traitement MNP (à droite), poussant au sommet de bandes magnétiques. Les rayures sont marquées. (B) Les histogrammes polaires présentent l’effet de directionnalité de neurite sur les cellules PC12 (gauche) avec le traitement de MNP et (droite) sans traitement de MNP. La déviation de l’angle d’orientation est définie comme la différence d’angle entre les neurites et l’orientation de la bande magnétique (bacs de 15°). (C) Images de fluorescence des cellules PC12 cultivées au sommet d’un motif hexagonal magnétique, (à gauche) avec traitement MNP et (à droite) sans traitement MNP. Barre d’échelle = 200 μm. (D) Image zoom avant d’une cellule magnétisée développant des neurites selon le motif magnétique. Barre d’échelle = 30 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Marcus et al.37. Abréviation : MLP = nanoparticules magnétiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Les résultats représentatifs démontrent l’efficacité de la méthodologie présentée pour contrôler et organiser la formation de réseaux neuronaux à l’échelle du micron. Les cellules PC12 chargées de MNP sont restées viables et ont été transformées en unités sensibles magnétiques qui ont été attirées par les forces magnétiques des électrodes FM vers des sites spécifiques. Ceci est mieux démontré dans la figure 5C,où les cellules adhéraient préférentiellement aux plus grands sommets des hexagones et non aux lignes minces. De plus, la ramification des cellules s’est également développée favorablement en suivant les motifs magnétiques. Toutes les expériences de contrôle ont démontré sans ambiguïté que les forces magnétiques dirigeaient la localisation des corps cellulaires et des excroissances. Bien qu’il ait été démontré que des indices topographiques peuvent être utilisés pour diriger l’excroissance des neurs40,41,ce n’est pas le cas ici, car les cellules sans MLP n’ont montré aucune réponse à la forme du motif.

Une approche ascendante a été utilisée pour concevoir les forces magnétiques locales, en utilisant la photolithographie standard et les dépôts par pulvérisation qui sont disponibles dans de nombreuses installations de recherche, facilitant l’adoption de ces techniques par de nombreux chercheurs. L’approche ascendante permet la liberté dans la conception de motifs et de formes complexes en fonction des besoins des chercheurs, avec une résolution à l’échelle du micron pour les zones de longueur de centimètre. Bien que les résultats aient été démontrés sur des lames de verre, en principe, il est possible de préparer les dispositifs sur d’autres matériaux biocompatibles qui conviennent à des applications thérapeutiques in vivo telles que des réseaux d’électrodes flexibles pour l’enregistrement neuronal et la stimulation42,43.

Ces plates-formes PMA uniques, obtenues par dépôt multicouche, produisent un fort champ magnétique le long de l’ensemble du motif magnétique et pas seulement sur les bords, comme observé précédemment22. De plus, les FMs ont été conçus avec une grande saturation d’aimantation résiduelle, c’est-à-dire que même lorsque le champ magnétique externe est supprimé, les électrodes restent entièrement magnétisées et continuent d’attirer les cellules sans avoir besoin d’un aimant externe. Cependant, une force magnétique externe peut aider à magnétiser complètement les MNF dans les cellules, augmentant ainsi la force d’attraction et l’efficacité pendant le placage. Une considération importante dans la conception FM était le nombre de répétitions. Alors que plus de répétition augmentera le moment magnétique total, ce qui est favorable, l’ajout de nombreuses couches augmentera également le mélange des couches, provoquant un PMA moins stable et aboutissant finalement à une aimantation dans le plan44,45 axe facile et attraction vers différents bords des électrodes22,37. Par conséquent, il est nécessaire d’optimiser le nombre FM et la composition des multicouches pour assurer une PMA stable avec des champs magnétiques maximaux.

Les MNF présentés dans les résultats représentatifs n’ont montré presque aucune toxicité envers les cellules PC12 aux concentrations testées, ni n’ont affecté le comportement cellulaire, en dépit d’être en mesure d’entrer dans les cellules et d’avoir un moment magnétique relativement élevé. La force d’attraction sur une cellule dépend du nombre de MNP dans la cellule et de l’aimantation de chaque MNP. Idéalement, les deux devraient être élevés; cependant, il peut y avoir un compromis entre les deux. Avec certains MLP commerciaux, la viabilité cellulaire était bonne, mais le moment magnétique était trop faible. Pour les autres particules fabriquées en laboratoire, le moment magnétique était élevé, mais les MNF avaient tendance à s’agréger et la viabilité cellulaire était faible. Ainsi, il est important de tester la viabilité des cellules et de caractériser leur aimantation lors du choix des MNF. Les MNF utilisés ici sont également fluorescents, ce qui facilite le suivi de leur emplacement dans les cellules. Les résultats montrent que les neurites se développent selon la forme du motif magnétique, et la fluorescence indique la présence de MNF le long des neurites.

Le mécanisme d’internalisation des MLP dans les cellules a été précédemment étudié46. L’absorption cellulaire des MLP se produit par l’intermédiaire de l’endocytosis selon leur taille, forme, et chimie de surface. Des études antérieures ont examiné l’absorption de différents types de MLP dans les neurones24; l’absorption cellulaire des MNF enrobés était meilleure que l’absorption cellulaire des MNF non enrobés. Comme le montre la figure 3A,B,les MNF ont été internalisés dans le cytoplasme, mais sont restés en dehors des noyaux et ont été transférés aux neurites au cours de leur développement. De plus, les MNF conjugués au NGF qui activaient la voie de signalisation du NGF ont également été internalisés en cellules via l’endocytose47,48.

Pour conclure, cet article présente une boîte à outils efficace de manipulation magnétique pour la recherche nécessitant une organisation d’éléments biologiques. L’utilisation de forces magnétiques permet le positionnement des cellules, dirigeant la croissance des nenrites. Cette méthode permet la conception de plates-formes avec des formes géométriques complexes. Les forces d’attraction magnétique peuvent être conçues pour manipuler la formation du réseau neuronal à distance en modifiant le paysage de la force magnétique au fil du temps. Toute cette méthodologie peut être facilement étendue pour contrôler d’autres facteurs ou produits chimiques qui peuvent être couplés aux MLP et les amener à des points d’intérêt prédéfinis, le tout avec une résolution à l’échelle du micron.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par le Ministère de la science et de la technologie, Israël, et par la Fondation israélienne pour la science (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Fabrication de plates-formes magnétiques pour l’organisation à l’échelle du micron de neurones interconnectés
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Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

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