Summary
Dette er en effektiv metode til at screene for undertrykkere eller førere af kræft metastaser. Celler, transduceret med et udtryk bibliotek, injiceres i kylling chorioallantoic membran vaskulatur til at danne metastatiske kolonier. Kolonier, der har nedsat eller øget invasivitet, fjernes, udvides, injiceres igen for at bekræfte deres fænotype og analyseres til sidst ved hjælp af høj gennemløbssekvensering.
Abstract
De seneste fremskridt inden for kræftforskning har illustreret den meget komplekse karakter af kræftmetastase. Flere gener eller gener netværk har vist sig at være involveret i differentialligt regulere kræft metastatiske kaskade gener og genprodukter afhængige af kræft type, væv, og individuelle patientegenskaber. Disse repræsenterer potentielt vigtige mål for genetisk behandling og personlig medicin tilgange. Udviklingen af hurtige screeningsplatforme er afgørende for at identificere disse genetiske mål.
Kyllingen chorioallantoic membran (CAM) er en meget vaskulær, kollagen rig membran placeret under æggeskallen, der giver mulighed for gasudveksling i det udviklende embryo. På grund af placeringen og vaskularisering af CAM, udviklede vi det som en intravital human kræft metastase model, der giver mulighed for robust menneskelig kræft celle xenografting og real-time billeddannelse af kræft celle interaktioner med kollagen rige matrix og vaskulatur.
Ved hjælp af denne model blev en kvantitativ screeningsplatform designet til identifikation af nye drivere eller undertrykkere af kræftmetastase. Vi transduced en pulje af hoved og hals HEp3 kræftceller med en komplet menneskeligt genom shRNA genbibliotek, derefter injiceres cellerne, ved lav densitet, i CAM vaskulatur. Cellerne formeret og dannet enkelt-tumor celle kolonier. Individuelle kolonier, der ikke var i stand til at invadere cam-vævet, var synlige som en kompakt koloniphoenotype og fjernede for at identificere det transducerede shRNA, der var til stede i cellerne. Billeder af individuelle kolonier blev evalueret for deres invasivitet. Flere runder af valg blev udført for at reducere antallet af falske positiver. Individuelle, isolerede kræftcellekloner eller nyudviklede kloner, der udtrykker gener af interesse, blev udsat for primær tumordannelsesanalyse eller kræftcellevakulature co-option analyse. Sammenfattende præsenterer vi en hurtig screeningsplatform, der giver mulighed for antimetastisk målidentifikation og intravital analyse af en dynamisk og kompleks kaskade af begivenheder.
Introduction
Metastase er hovedårsagen til kræftpatientdød1,2,3. Metastatiske kræftceller udnytte forskellige signalering veje, afhængig af typen af kræft, i hele de fem trin i den metastatiske kaskade: lokal invasion, intravasation, overlevelse i omløb, ekstravasation, og koloni ekspansion på fjerne metastatiske steder. Nuværende forståelse af denne metastatiske proces tyder på, at der er to flaskehalstrin, den ene er retningsbestemt invasion af kræftcellen fra den primære tumor, og den anden er etableringen af det fjerne sted metastatisk læsion4,5,6. Begge trin kræver kræftceller til aktivt at interagere med kollagen og vaskulatur på de steder, hvor den første invasion eller fjern metastatisk læsion dannelse. Derfor skal metastatiske kræftceller være i stand til at knytte til celler, remodel kollagenfibre og retningsvis invadere langs vaskulære vægge7. Screening modeller, der hurtigt kan identificere antimetastatic terapeutiske mål for at blokere kræftceller fra at fuldføre disse trin er af største betydning. Eksisterende in vitro-screeningsmodeller efterligner ikke fuldt ud det komplekse levende vævsmiljø. Musemodeller er dyre og tidskrævende. Der er derfor et presserende behov for intravitale screeningsplatforme, der giver komplekse levende vævsmiljøer og hurtig identifikation af mål.
Inden for det sidste årti er kyllingembryoet blevet etableret som en robust og omkostningseffektiv model for human kræftmetastase8,9,10,11,12. Den chick chorioallantoic membran (CAM) væv er tynd og gennemskinnelig, hvilket gør det ideelt til intravital mikroskopisk billeddannelse af celle og koloni adfærd i primær tumor og / eller metastatiske steder12. Primær tumor vækst fra flere menneskelige kræft cellelinjer kan indledes og metastaseres inden for en span på kun flere dage efter microinjection i CAM væv. Kræftceller kan administreres i CAM væv på flere måder, herunder intravenøst, intra-CAM eller som kollagen onplanter, denne fleksibilitet gør det muligt for forskeren at fokusere på specifikke stadier af kræft progression, for eksempel metastatisk læsion dannelse, invasion ud af den primære tumor eller angiogenese.
Her beskriver vi en kvantitativ screeningsplatform, der kan bruges til at måle kræftcellers evne til at etablere invasive metastatiske læsioner. Kræftceller, der er blevet transduceret med et udtryk bibliotek injiceres intravenøst i CAM vaskulatur ved lav densitet. Metastatiske kolonier dannes i 4-5 dage, så evalueres invasionskapaciteten og vasulaturinteraktionen af de resulterende kolonier. Individuelle kolonier, der undlader at invadere er fjernet, formeret og deres fænotype er bekræftet i CAM ved tilbagetjektion og kvantificering af koloni kompakthed og kræft celle-blodkar kontakter. Udtryksbibliotekets konstruktioner, der er ansvarlige for den enkelte metastatiske koloni mutant fænotype, identificeres fra isoleret kolonigenomisk DNA via høj gennemløbssekvensering. Den samme platform kan yderligere anvendes til at validere årsagssammenhængen mellem et gen og den observerede fænotype eller til at udføre dybdegående mekanistiske undersøgelser af den observerede fænotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med reglerne og retningslinjerne i Udvalget for Institutionel Dyrepleje og Brug ved University of Alberta. Fuglefostre betragtes ikke som levende dyr af mange forskningsinstitutter, og der kræves ingen dyreprotokoller. Det er imidlertid et accepteret synspunkt, at fuglefostre kan føle smerte og derfor skal behandles så humant som muligt. Den lokale dyreforskningsmyndighed skal kontaktes, inden der påbegyndes et forskningsarbejde for at sikre, at reglerne overholdes.
1. Shell-mindre æg kultur
- Erhverve befrugtede kyllingæg fra den lokale udbyder. Dette eksperiment bruger White Leghorn kylling race; Dog kan andre racer også bruges.
BEMÆRK: Det anbefales at anskaffe 10% flere æg end nødvendigt, hvis nogle af embryonerne beskadiges under revnerne og ikke kan bruges i denne protokol. - Overfør det nødvendige antal æg til en 60% befugtet vuggende inkubator. Resten af æggene kan opbevares i op til to uger ved 12 °C uden tab af levedygtighed.
- Inkuber æggene i den befugtede vuggeinkubator i fire dage.
BEMÆRK: Dag 1 er, når æggene overføres til gyngeinkubatoren. - Forbered vejeskåle og plastlåg til den skalfri ægkultur. Skær et af hjørnerne af hver af vejeskålene for at give effektiv luftadgang til embryoet (figur 1A).
- Arranger de forberedte vejeretter i rækker i flowhætten. (Figur 1B).
- I en separat vejeskål forberedes 70% ethanol til ægskylning.
- Dyp ægget kortvarigt i 70% ethanol, og brug derefter det elektriske roterende værktøj til omhyggeligt at foretage fire 2-3 mm udskæringer parallelt med æggets største latitudinaldiameter (Figur 1C).
- Overfør det udskårne æg til en vejeplade, og tryk forsigtigt ægget mod opvaskens bund, indtil der dannes en revne i æggeskallen (Figur 1D).
- Træk æggeskal halvdele fra hinanden at lade embryoet glide ind i vejeskålen. Kassér æggeskallen og dæk vejepladen med låg.
- Embryonerne overføres til befugtet ikke-vuggende inkubator(figur 1E).
BEMÆRK: Vejeretter med embryonerne anbringes i separate plastbeholdere (12 embryoner/beholder). Dette øger embryoets levedygtighed og giver mulighed for eksperimentspecifik embryo organisation. - Inkuber embryoner i yderligere 6 dage (indtil 10 dage gamle). Kontroller dagligt, om der er døde eller kontaminerede embryoner, og fjern dem fra inkubatoren.
BEMÆRK: Embryoner kan være forurenet af luftbårne skimmelsporer. Skimmel forurening i første omgang manifesterer sig som hvide pletter på embryoet CAM overflade. Fjern straks de forurenede embryoner, og tør inkubatoren af med 70 % ethanol om ugen for at forhindre kontaminering. Det er vores erfaring forureningsniveauer er meget lave ~ 1-3%. - Brug disse embryoner til kræftcelleinjektion om morgenen på dag 10.
2. Forberedelse af kræftcellerne til injektion
BEMÆRK: Metastatisk kolonivalg er baseret på en fænotype, der er etableret af fluorescerende kræftceller, og som stammer fra et udtryksbibliotek eller en vektor mærket med fluorescerende protein såsom grønt eller rødt fluorescerende protein (se hele skærmstrømmen i figur 2A). Det anbefales ikke at anvende celler, der midlertidigt er transfected med fluorescerende proteiner eller mærket med cellegennemtrængelige fluorescerende farvestoffer på grund af hurtig falmning af signal forårsaget af spredning af kræftceller og ujævn farvning.
- Kultur kræftceller til 60-70% sammenløb på tidspunktet for injektionen. Brug af kræftceller ved højere niveauer af sammenløb vil reducere deres levedygtighed, hvilket resulterer i lav effektivitet af metastatisk kolonidannelse. Sørg for, at de anvendte kræftceller er mycoplasmafri, da mycoplasmaforurening kan føre til nedsat kyllingembryo levedygtighed.
- Celler skylles to gange med 1x PBS pH 7.4. Fjern den resterende PBS, tilsæt derefter 0,5% Trypsin-EDTA og inkuber ved 37 °C i 2-5 minutter, indtil alle celler løftes fra dyrkningsfadoverfladen.
- Celleaffjedringen overføres til 15 mL konisk rør og centrifugeceller ved stuetemperatur ved 200 x g i 5 min.
- Resuspend celler i 10 mL PBS til og centrifuge cellerne igen som i trin 2.3, for at fjerne trypsin og andre kultur medier komponenter såsom antibiotika.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af trypsin eller cellekulturkomponenter såsom antibiotika i kræftcellesuspensionen kan resultere i nedsat kyllingembryo levedygtighed. - Aspirér forsigtigt supernatanten og resuspendcellerne med 1 mL iskold PBS.
- Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer eller andet celletællingsudstyr.
BEMÆRK: Denne screening protokol kræver, at hver metastatisk koloni skal indledes af en enkelt celle. Når cellerne tælles, skal du sørge for, at cellerne er fuldt trypsiniserede og findes som en enkelt celleophængning (der findes ingen celleklumper). - For intravenøse (IV) injektionskoncentratceller til 0,5 x 106 til 1,0 x 106 celler/mL. Brug iskold 1x PBS til fortynding og/eller opsuspen cellekoncentrater. Forvent, at der vil være behov for ca. 1 mL celleredsættelse for hver ti embryoner.
BEMÆRK: Den nødvendige koncentration af celleaffjedring i suspension bestemmes hovedsageligt af forsøgserfaringen. Yderligere oplysninger finder du i næste afsnit.
3. Intravenøs injektion af kræftceller til metastatisk kolonidannelse
BEMÆRK: Efter denne protokol kan så mange som hundrede embryoner injiceres inden for en dag. Det tager generelt længere tid at isolere de metastatiske kolonier (trin 5) og derefter at injicere kræftcellerne, og derfor anbefales det at udføre et indledende eksperiment for at estimere den tid, der er nødvendig for at fuldføre alle trinene. Brug af differentialkræft celle fluorescerende etiketter bidrager til at reducere antallet af dyr og den tid, der kræves for hvert forsøg. For eksempel kan kontrolceller mærkes med RFP (rødt fluorescerende protein), mens mutant tumorceller alternativt kan mærkes med GFP (grønt fluorescerende protein). I dette tilfælde har hvert eksperiment en indbygget kontrol, der korrigerer for variation mellem embryoner.
- Indsprøjtningsapparatet samles, som det fremgår af figur 2B. Monter først en nål på sprøjten, og udvid derefter sprøjtenålen med 3-5 cm langt stykke slange.
- Bryd spidsen af borosilicate nålen af ved hjælp af de fine pincet (~20-60 μL bred).
- Sprøjten fyldes med kræftcelleaffjedringen (50-200 μL), og borosilikatnålen indsættes i slangen(figur 2B).
- Undersøg borosilicate nålen for celle tilstopning og luftbobler. Det er vigtigt at injicere celler som en enkelt celle suspension for at sikre, at hver metastatisk koloni er indledt af en enkelt celle.
BEMÆRK: Kræftceller har tendens til at samle sig i PBS inden for 1-2 timer efter trypsinisering og bør derfor fremstilles umiddelbart før injektion. Om nødvendigt kan cellerne genbruges med jævne mellemrum ved hjælp af den 1 mL sprøjte, der anvendes til injektioner (uden borosilikatnålen). - Hvis celle tilstopning observeres i kapillæren, skal du fjerne kapillæren, suspendere cellerne igen og erstatte den med en ny kapillær. Brug stemplet til at skubbe eventuelle bobler ud. Hvis der ikke observeres cellestop eller bobler, fortsæt til næste trin.
- Fjern dækslets låg og overfør embryoet under stereoskopet. Identificer den relevante vene, der skal injiceres på CAM-overfladen. Vener og arterier danner det indviklede netværk inden for CAM-vævet (Figur 2C). Vener er kendetegnet ved den lysere røde farve, fordi de bærer iltrigt blod til embryoet.
BEMÆRK: For generel embryomanipulation, kræftcelleinjektion og metastatisk koloniudskæring skal du bruge et fluorescerende stereomikroskop udstyret med 0,8x og 1,5x mål og 10x okularer til visualisering. Mindre avanceret mikroskop kan også med succes bruges til disse procedurer, afhængigt af brugernes oplevelsesniveau. Læsere kan kontakte forfatterne for mere detaljerede anbefalinger. - Find den ideelle vene til at injicere celler, som normalt kun er lidt bredere (10-20%) end diameteren af borosilikat nål spids og placeret midtvejs mellem embryoet og vejefad væggen. Det er generelt lettere at injicere på det punkt umiddelbart støder op til venen bifurcation.
BEMÆRK: Injektion i en større vene kan forekomme lettere, men vil føre til overdreven blødning og nedsat embryo overlevelse. - Tryk nålespidsen mod blodkarvæggen og tryk blidt i samme retning som blodgennemstrømningen. Brug om nødvendigt en vatpind (holdt i anden hånd) for at hjælpe med at forankre eller stabilisere den beholder, der injiceres.
- Tryk forsigtigt sprøjtestemplet. Man kan visualisere en vellykket injektion ved at observere en "clearing" af blodkar, når kræft celle suspension ind i blodbanen.
- Fortsæt med at trykke sprøjtedysten i 2-10 s, indtil det ønskede suspensionsvolumen injiceres i blodbanen i venen. Alt i alt kan injektionen af et enkelt foster kræve 1-10 min afhængigt af brugerens oplevelsesniveau. Hvis der forekommer for stor blødning eller klar væskeakkumulering på injektionsstedet, skal embryoet kasseres.
BEMÆRK: Det er nemt at "overinjicere" et foster. Den generelle overvejelse, der bør holdes for øje, er, at metastatiske kolonier ikke bør røre hinanden efter en 4-5 dages vækstperiode. Ideelt ~ 5-10% af terminal CAM vene kapillærer bør have celler immobiliseret i dem efter en vellykket injektion(Figur 2D,E). Som nævnt i trin 2 kan der anvendes et cellekoncentrationsområde (0,5 x 106 - 1,0 x 106 celler/mL). Lavere koncentrationer vil kræve længere injektionstid, men vil reducere nåletilstoppet. Højere koncentrationer vil kræve kortere injektion gange, men vil øge nålen tilstopning. Det anbefales at prøve flere koncentrationer for at finde den, der er mest behagelig for en operatør. Generelt foretrækkes højere koncentration (1,0 x 106 celler/mL) for at reducere injektionstiden. - Fjern nålen fra CAM'en, og dup forsigtigt injektionsstedet med en vatpind for at fjerne blod eller overskydende kræftceller.
- Dæk embryoet i vejeskålen med låg og returner det injicerede kyllingembryo i inkubatoren.
- Gentag proceduren med det næste foster, indtil alle embryoner injiceres.
4. Vedligeholdelse af embryoner under den metastatiske kolonivækst
- Visuelt inspicere embryoner. Hvis der er nogen, der er døde, og / eller forurenet med bakterier eller skimmel fjerne dem fra inkubatoren, så autoklave og kassere dem i henhold til laboratoriet bortskaffelse procedurer.
BEMÆRK: Det anbefales, at embryoner inspiceres hver anden dag (dag 1, 3, 5 efter injektion af kræftceller) for metastatisk kolonivækst. Undgå at flytte de injicerede embryoner unødigt, da det kan forårsage fosterskader og/eller død. - Hvis cellerne viser overvækst (metastatiske kolonier overlapper hinanden) eller ujævn fordeling i CAM-vævet (metastatiske kolonier placeret i små underområde af CAM-overfladen), fjernes embryoet fra forsøget. Udsmidte embryoner aflives ved frysning ved -20 °C (eller en anden godkendt metode) umiddelbart efter, at forsøget er fjernet. Antallet af levedygtige metastatiske celler i CAM-vævet vil falde i første omgang (dag 1-2) og derefter stige (dage 2-5).
BEMÆRK: Nogle embryoner kan "afvise" kræftcellerne, dvs. alle kræftcellerne vil forsvinde fra CAM-vævet. Disse embryoner bør fjernes fra forsøget. Normalt kan kræftcellekolonier ses gennem det gennemsigtige låg under det fluorescerende stereomikroskop uden at åbne vejeskålen. - Sørg for, at metastatiske kolonier fremstår ensartede i form (første 1-3 dage efter injektionen). Identificer invasive eller ikke-invasive metastatiske kolonier i dag 4-5 efter injektionen (se afsnit 5 for yderligere oplysninger).
5. Isolering af metastatiske kolonier
- På dag 5 efter injektionen fjernes embryoner fra inkubatoren, og embryon-CAMs inspiceres for metastatisk kolonifordeling. Identificere embryoner med ensartet koloni distribution, hvor kompakte (eller alt for invasive) kolonier er til stede.
BEMÆRK: Processen med dyrkning af kyllingembryoner er ikke steril, derfor skal alle screeningstrin udføres under meget rene forhold for at undgå fremtidig vævskulturforurening. Forurening det er ret sjældent og kan let undgås ved at bære handsker og en maske og kun bruge sterile værktøjer under celleinjektion og koloniisolationsprocedurer. Det anbefales at inspicere embryoner en efter en for at mindske deres eksponering for den omgivende laboratorietemperatur og for at forhindre kontaminering. - Find den metastatiske koloni af interesse. En kompakt koloni kan beskrives som en med de fleste af de kræftceller placeret inden for et begrænset område i CAM væv (celler synes "klumpet sammen"). En invasiv koloni kan beskrives som koloni, hvor kræftceller "scatter" i CAM væv(Figur 3A,B).
BEMÆRK: "Kompakthed" af den metastatiske koloni kan forklares enten ved hæmning af kræftcelleinvasion, hæmning af kræftcellespredning eller begge dele. Der bør lægges vægt på alle scenarier, og kontaktkolonier bør isoleres (figur 3A, B). Et simpelt fluorescerende stereomikroskop kan bruges til at skelne mellem kompakte og invasive metastatiske koloniphoenotyper. - Under dissektion mikroskop forsigtigt trække CAM væv, der indeholder metastatiske koloni af interesse opad ved hjælp af fine pincet (Figur 3C).
- Afskær CAM-vævet, der indeholder den metastatiske koloni, ved hjælp af kirurgisk saks.
- Overfør CAM-vævet, der indeholder den metastatiske koloni, til et tomt, sterilt 1,5 mL rør (på is) og luk rørlåget.
BEMÆRK: Isolerede kolonier kan opbevares på is i op til 3 timer uden tab af levedygtighed. - Gentag excision procedure, indtil alle kolonier af interesse er indsamlet i separate rør. For at undgå dyresygdomme må der ikke lægges mere end 2-3 kolonier fra ét foster. Aflive embryoner ved frysning ved -20 °C (eller en anden godkendt metode) umiddelbart efter koloniens udskæring.
- Læg forsigtigt CAM-vævet i et mikrocentrifugerør ved hjælp af en steril 18-gauge nål. Brug en separat nål til hver koloni.
- Der tilsættes 100 μL 1x kollagenopløsning, og der inkuberes i 30 min ved 37 °C.
- Spin ned celler og CAM væv ved 300 x g i 5 min ved omgivelsestemperatur.
- Aspirér kollagenopløsningen og genbrugte celler i komplette medier, der bruges til cellelinjen af interesse.
BEMÆRK: Normalt CAM væv er ikke helt dissociated efter kollagen behandling og kræftceller vil først formere sig i stykker af CAM væv og først senere migrere på vævskultur parabol. - Drej cellerne og CAM-vævet igen ved 300 x g i 5 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Resuspend celler og CAM væv stykker i 1 mL af komplette medier plus udvælgelse faktor (hvis nogen), derefter overføre til enkelt 12 godt væv kultur parabol godt.
BEMÆRK: Kylling CAM fibroblaster kan vare ved i vævskulturen i flere passager, der hæmmer klonisk ekspansion. Evnen til at udvide de metastatiske kolonier i nærværelse af udvælgelse faktor (dvs. hvis en vektor, der blev brugt til at gøre kræftceller fluorescerende også koder en pattedyr antibiotikaresistens gen) kan i høj grad fremskynde klonisk ekspansion. Der bør udføres et forsøg med aflivekurve før screeningen for at sikre, at der anvendes korrekt koncentration af antibiotika. - For de næste 1-3 uger overvåge kræftceller dagligt for vækst og forurening.
- Når cellerne når 70-80% af sammenløbet overføre celler i en større volumen kultur parabol.
BEMÆRK: Det anbefales at udvide cellerne, indtil mindst to kryogene hætteglas af hver klon kan fryses. Opretholdelse af store mængder vævskultur kan være besværlig og unødvendig. - Fortsæt til sekventering eller næste runde af udvælgelsen, så snart nok kræft cellenumre er nået. Generelt, 1 x 106 af kræftceller er tilstrækkelige til moderne høj-gennemløb sekventering teknikker.
- Gå videre til klon reinjection og billeddannelse og kvantificering af koloni kompakthed eller kræft celle-blodkar kontakt (Figur 2A). Alternativt kan du gå videre til høj gennemløbssekvensering eller gentage kolonivalget.
BEMÆRK: Det anbefales at reducere antallet af falske positiver mindst to runder valg. To tilgange er blevet anvendt med succes. 1) Udvid hver klon og genintegrer individuelt for at bekræfte kolonifænotypen. 2) Bland alle de udvidede kloner i et 1:1-forhold hver, genintegrer som en blanding og gentag udvælgelsescyklussen.
6. Injektion af lysstofrør, der er mærket lectins ind i CAM-vaskulaturen.
- Identificer den vene, der skal injiceres. Det er lettere at bruge det samme injektionssted til lectin, der blev brugt til tumorcelleinjektion.
- Fluorescerende lectin-stamopløsning (5 mg/mL) fortyndes 50-100x med 1x PBS, og det indlæses i det samme injektionsapparat som det, der anvendes til injektion af kræftceller.
BEMÆRK: Den mængde lectin, der skal injiceres (normalt 20-100 μL) til visualisering af blodkarrene, afhænger af mikroskopfølsomheden og bør bestemmes eksperimentelt inden screening. - Indsprøjtning af lectin ved hjælp af samme teknik som til tumorcelleinjektion (se trin 3.6.-3.10.).
- Efter lectin injektion, placere embryoet i inkubatoren for at inddrive i 5 min. Indsprøjt kun ét foster ad gangen og umiddelbart før billeddannelse af embryoet.
SEDDEL. Embryoner, der er 12 dage eller ældre generelt inddrive godt fra lectin injektioner og kan injiceres med lectin igen næste dag for sekventiel billeddannelse. Yngre embryoner er mere følsomme og kan vise blodkoagulation.
7. Visualisering af kontakter mellem kræftcelle-blodkar
- Det temperaturregulerede mikroskopkabinet indstilles til 37 °C ca. 6 timer før billeddannelse. Dette vil stabilisere mikroskoptemperaturen og hjælpe med at minimere XYZ drift under billeddannelse.
SEDDEL. En specialiseret kylling embryo billeddannelse kammer9,10,11,12,13 blev brugt til dette eksperiment. En simpel fluorescerende dissektion mikroskop kan bruges til alle trin fra kræft celle injektion til klon udvælgelse og klon reinjection, og evaluering af kolonien kompakthed. En confocal mikroskop, der er udstyret med en billeddannelse kammer er nødvendig for billeddannelse og kvantificering af kræft celle-blodkar kontakter. Ingen opvarmning er nødvendig for op til 1 time, og generelt overlever embryoner mindst to sekventielle billedbehandlingssessioner uden indvirkning på deres levedygtighed. - Sørg for, at den nødvendige objektive linse (20x eller 25x vand nedsænkning objektiv linse anbefales) er blevet installeret.
- Påfør et tyndt lag vakuumfedt på undersiden af billedkammerlåget for at skabe en sikker forsegling med coverlipet.
- Placer forsigtigt et coverlip i låget og tør overskydende vakuumfedt væk.
- Tag det lectin-injicerede foster ud af inkubatoren og skær fælgene på vejeskålen om nødvendigt.
- Placer embryoet i billedkammeret med coverlip sænket ned direkte på det område af CAM, hvor de metastatiske kolonier af interesse er placeret. Sænk langsomt låget på fosteret, indtil coverlipet bare kommer i kontakt med CAM'en. Skruerne strammes for at fastgøre låget, sørg for, at låget er jævnet med jorden, og at coverlipet ikke presser CAM'en nedad.
- Få billeder af flere tilfældige kolonier fra kontrol- og eksperimentelle grupper (10-20) fra flere (5-10) embryoner.
SEDDEL. Det anbefales at anskaffe tilfældige 3D-stakke (1-5um Z-trin; 50-100um rækkevidde; 25x) fra hvert felt. - Brug felt-syning mulighed i mikroskop erhvervelse software, hvis de er tilgængelige. Da billeder, der bruges til kvantificering, ikke vil være publikationskvalitet, skal du bruge hurtige anskaffelsestilstande, f.eks. Brug 25x mål og 3 x 3 syninger med 5-10 μm Z-trin, 100 μm samlet rækkevidde. Billede mindst 100 celler (~20 kolonier) pr. betingelse.
8. Kvantificering af kontakt med kræftcelleblodbeholder
- Åbn 3D-filen som en Z-stak ved hjælp af den nødvendige software.
SEDDEL. Specialiseret software skal bruges til at erhverve og analysere billeder i høj opløsning for at kvantificere kræftcelle-blodkar kontakt. Flere softwarepakker, der er i stand til 3D-billedanalyse, er tilgængelige. Yderligere oplysninger finder du i Materialeoversigten. - Hvis der opstod en betydelig XY-bevægelse under billederhvervelsen, skal du justere Z-stakken ved hjælp af ImageJ StackReg-plug-in'en (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Find de (e) celler, der er af interesse.
- Rul gennem XYZ-billedet i Z-retningen og identificer det optiske afsnit, der indeholder den maksimale længde af kræftcelle blodkarkontakten for den pågældende celle (Figur 2E).
- Mål kræftcelle-blodkar kontakt ved hjælp af "manuel længde måling funktion".
- Angiv målingerne i den datasoftwarepakke, der bruges til statistisk analyse.
BEMÆRK: Kræftcellernes evne til at fastgøre sig til blodkarrene kan måles enten som længden af kontakt mellem kræftcelle-blodkar eller procentdelen af cellen, der er i kontakt med vaskulaturen for bestemt kræftcelleklon (eller begge dele). - Fortsæt til den næste celle af interesse.
- Analyser dataene for statistisk signifikans ved sammenligning af mutantklon (er) og kontroldatasæt.
9. Koloni kompakthed kvantificering
- Genintegrer cellerne fra den udvidede klon ved hjælp af den samme teknik som i trin 2.
- Fem dage efter injektion erhverve billeder af 10-50 tilfældige metastatiske kolonier for hver klon.
BEMÆRK: Ingen billeder i høj kvalitet er nødvendige for metastatisk kolonikomprimering. Monokromatiske, stereomikroskopbilleder (10x forstørrelse) er tilstrækkelige. Der skal lægges vægt på billedets lysstyrke (de fleste celler i kolonien skal ses) og kontrast (forskel mellem en eller to celler). - Isoler kolonibilledet digitalt (se figur 2C, D), og fortsæt til kolonikomprimering ved hjælp af det enkeltstående kolonikomprimeringsmodul eller blind scoring13.
- Fortsæt til den næste koloni af interesse.
- Analyser dataene for statistisk signifikans ved sammenligning af mutantklon (r) og kontroldatasæt (dvs. scramble shRNA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kræftcelleinjektion anses for at være vellykket, hvis størstedelen af de celler, der er indgivet i kapillærerne, er enkeltstående og placeret med en betydelig forskel fra hinanden (~ 0,05-0,1 cm), så kolonierne ikke overlapper hinanden efter 5-6 dages inkubationsperiode (Figur 3A). Injektionen var ikke vellykket, hvis en ophobning af kræftceller kan ses i de fleste kapillærer, embryoner viser dette bør kasseres (Figur 2E). Et betydeligt antal injicerede kræftceller omkommer inden for 24 timer efter injektion gør nogle embryoner synes at afvise alle kræftceller. Kræftcelleoverlevelse vil variere afhængigt af den lokale ægleverandør (dvs. mængden af celler, der skal injiceres, kan variere), og vi anbefaler på det kraftigste, at der bestemmes optimale injektionsbetingelser (kræftcellekoncentration versus injektionsvarighed), før du fortsætter med forsøget. Vi anbefaler cellekoncentration i området mellem 0,5 x 106 til 1,0 x 106 celler/m. Når den optimale cellekoncentration og varighed af injektionen er opnået, bør dagen 5 efter injektion transducerede celler producere en bred vifte af koloni fænotyper, hvor størstedelen af kolonierne vises invasive som bestemt af kræftcellerne, der vises spredt i CAM-vævet (Figur 3A). Opmærksomheden skal rettes mod de metastatiske kolonier, der vises "kompakte" og er placeret langt nok fra nabokolonier, at de kan fjernes med pincet og saks i et stykke CAM-væv (Figur 3C). Et isoleret positivt skærmhit (dvs. en kompakt koloni) skal vise den kompakte koloniphoenotype ved tilbagetjektion (Figur 3B). Et fald i celle overlevelse (eller cellespredning sats i kolonien) kan observeres så godt. Derfor er det muligt, at højere cellenumre skal injiceres for nogle af de positive skærmhits for at opnå nok koloninumre. Til måling af kræftcelle-blodkar kontakter opmærksomheden bør rettes mod den vaskulære væg plet lysstyrke (fluorescerende lectin; Figur 3D,E) og den passende mængde lectin skal injiceres for det lyse/kontrast vaskulære vægsignal. Alle tilgængelige billedanalyse software kan bruges under kvantificering trin efter mikroskop-software kalibrering er blevet udført.
Figur 1:Oversigt over kyllingembryoner uden kultur. Pilen peger på det afskårne hjørne. (B) Vejeretter arrangeret i rækker i flowhætten. (C) Skæring af en æggeskal med et elektrisk roterende værktøj. D)Revner i et æg i en vejeskål. (E)Embryoner dyrket i den befugtede inkubator. Skalastænger =1 cm (A-D) eller 5 cm (E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over kræftcelleinjektion og metastatisk koloniisolation. (B) Kræftcelleinjektion, der er oprettet på stereofluorescerende mikroskopstadie. (C) Injektion af kræftcellerne i CAM-vaskulaturen. (D) Billede, der viser vellykket kræftcelleinjektion (acceptabel kræftcelletæthed), taget umiddelbart efter injektionen. (E) Billede, der viser dårlig kræftcelleinjektion, set som et overindsprøjtet foster. Bemærk kræft celle opbygge i blodet kapillærer (hvide pile). Skalalinjer = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater for forskellige trin i screeningprotokollen. (A) Metastatiske kolonier dannet af heterogene (bibliotek transduced kræft celle linje HEp3 celler), 5 dage efter injektion. Rød pil viser kompakt koloni (potentielt positivt hit), der skal fjernes. (B) Metastatiske kolonier dannet af et af de isolerede skærmhits (KIF3B) efter tilbagetjektion, 5 dage efter injektionen. Insets viser digitalt skåret ud metastatiske koloni billeder fra de stiplede firkanter. Dette er acceptabel billedkvalitet for C.I kvantificering. Den gennemsnitlige C.I. værdi for hit reinjection (KIF3B) vises. (C) Isolering af den metastatiske koloni af interesse fra CAM-vævet. Repræsentative optiske dele af (D) en kontrolkoloni, og (E) en KIF3B shRNA overekspresserende koloni, der begge viser kontaktmålinger af kræftcelle-blodkar. CAM vaskulatur er mærket med fluorescerende lectin-649. Skalastænger =1 cm (A-C) eller 50 μm (D, E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en hurtig fluorescensmikroskopi baseret intravital screening protokol, der kan bruges til vigtige applikationer såsom genetiske eller lægemiddelkandidat skærme. Kræftceller, der er blevet transduceret med et genetisk bibliotek af interesse eller transfected med individuelle udtryk konstruktioner kan hurtigt screenes og kvantificeres med hensyn til fænotype af interesse ved hjælp af denne chick CAM model. Da transduktions- eller transinfektionsprotokoller varierer betydeligt, afhængigt af bibliotekstypen, er de ikke inkluderet i denne procedure. Fænotypisk relevante metastatiske kolonier fjernes fra CAM, udvides og DNA isoleres for rækkefølge med høj gennemløb for at identificere udtrykskonstruktionen af interesse. Generelt er hvert genetisk bibliotek udstyret med primersekvenser og anbefalede metoder til genomisk DNA-rensning. Vi anbefaler, at du bruger lokale facilitetsretningslinjer til de bedste resultater af rækkefølgen af høj overførselshastighed.
Det anbefales at bestemme den optimale mangfoldighed af infektion (M.O.I.) for et bibliotek og cellelinje før screening. Ideelt set hver celle (og derfor fremtidige metastatiske koloni) bør kun indeholde én genekspression konstruere, men i vores erfaring, der ikke altid er opnåeligt. Vi anbefaler, at du følger biblioteksproducentens protokol og tester en lang række M.O.I. (0.01-5) for at opnå så tæt på 1 som muligt. Tilstedeværelsen af flere biblioteksudtrykskonstruktioner inden for hver metastatisk koloni kan i væsentlig grad komplicere koloniphoenotypeanalysen. Vi anbefaler også, at du bruger den biblioteksproducent, der har fået negativ kontrol i dine eksperimenter (dvs. forvrænge shRNA- udtryk for vektor, der er fluorescerende mærket).
Vores screeningsprotokol er baseret på udvælgelse af ikke-invasive fluorescerende kolonier; det er afgørende at sikre, at alle cellelinjer, der anvendes i forsøgene, har samme fluorescensintensitet. Ujævn fluorescensintensitet blandt cellerne (og metastatiske kolonier) kan resultere i en partisk kolonivalg på grund af celle- eller kolonilysitet i stedet for invasivitet.
Sammenlignet med eksisterende metoder giver vores protokol flere unikke fordele såsom hastighed, lave omkostninger og evne til at fuldføre den intravitale skærmcyklus uden behov for sofistikeret billedbehandlingsudstyr12,13,14. Derudover kan hele screeningscyklussen afsluttes med 3 til 6 uger fra celleinjektionen til sekventeringsstadiet. Ingen høj opløsning mikroskop er nødvendig for kræft celle injektion eller metastatisk koloni isolation, da disse trin kan udføres ved hjælp af grundlæggende fluorescerende stereo mikroskop, der er tilgængelig for de fleste forskere. Endelig er der ikke behov for komplicerede dyrestald eller fodringsplaner, fordi dyrkning af embryoner uden skal er fuldstændig selvbærende. De fleste forskningsinstitutioner betragter ikke kyllingembryoner som levende dyr, hvilket reducerer omkostningerne og dokumentationsbyrden i forbindelse med denne model betydeligt.
Der er dog nogle begrænsninger forbundet med den shell-mindre embryo model. For det første, ikke alle kræft celle linjer arbejde i denne model effektivt. I vores laboratorium bruger vi rutinemæssigt flere kræftcellelinjer, såsom HT1080 (human fibrosarcoma), HEp3 (hoved &neck) og mus b16 melanom og 4T1 brystkræftcellelinjer, der robust danner metastatiske kolonier, når de injiceres i kylling CAM-vaskulaturen. Andre cellelinjer med forskellige kræfttyper såsom bryst (MDA468), hjerne (U87 og U118) eller æggestokke (A2780s) danner let metastatiske kolonier, når de injiceres i CAM og kan derfor bruges i denne screeningsprotokol samt12,14,15. Men i vores erfaring almindeligt anvendte kræft cellelinjer som LnCaP og PC3 ikke klarer sig godt i denne model (ikke-offentliggjorte observationer). En anden begrænsning er, at en confocal mikroskop med en 100 til 200 μm billeddannelse område er påkrævet for høj opløsning billeddannelse, såsom visualisering af kræft celle blodkar kontakter, dette udstyr kan ikke være til rådighed for mange forskere.
Alt i alt beskriver denne protokol en hurtig intravital screening platform, der kan bruges til opdagelse af kræft metastaser undertrykkere og drivere. Vi er overbeviste om, at robustheden og brugervenligheden af denne model vil gøre den til en vigtig screeningsmodel for mange forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 til JDL og KS. Dr. Lewis har Frank og Carla Sojonky Chair i Prostatakræft Forskning støttet af Alberta Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).
