Summary
Detta är en effektiv metod för att screena för suppressorer eller förare av cancermetastas. Celler, transduced med ett uttryck bibliotek, injiceras i kyckling chorioallantoic membran vaskulatur för att bilda ögonbevarande kolonier. Kolonier som har minskat eller ökat invasivitet är strukna, expanderade, återinsprutade för att bekräfta sin fenotyp och slutligen analyseras med hög genomströmningssekvensering.
Abstract
Den senaste tidens framsteg inom cancerforskningen har illustrerat cancermetastasens mycket komplexa karaktär. Flera gener eller gener nätverk har visat sig vara inblandade i differentiellt reglera cancer ögonbevarande kaskad gener och genprodukter beroende på cancer typ, vävnad och enskilda patient egenskaper. Dessa representerar potentiellt viktiga mål för genetiska terapier och personliga medicinska metoder. Utvecklingen av plattformar för snabb screening är avgörande för att identifiera dessa genetiska mål.
Chick chorioallantoic membranet (CAM) är ett mycket vaskulariserat, kollagenrikt membran beläget under äggskalet som möjliggör gasutbyte i det utvecklande embryot. På grund av camens placering och kärlbildning utvecklade vi den som en intravital human cancermetastasmodell som möjliggör robust human cancercells xenografting och realtidsavbildning av cancercellsinteraktioner med den kollagenrika matrisen och vaskulaturen.
Med hjälp av denna modell utformades en kvantitativ screeningplattform för identifiering av nya förare eller suppressorer av cancermetastas. Vi transduced en pool av huvud och hals HEp3 cancerceller med ett komplett mänskliga genom shRNA genbibliotek, sedan injicerade cellerna, med låg densitet, i CAM vaskulatur. Cellerna proliferated och bildade entumör cell kolonier. Enskilda kolonier som inte kunde invadera i CAM vävnaden var synliga som en kompakt koloni fenotyp och strukits för identifiering av transduced shRNA finns i cellerna. Bilder av enskilda kolonier utvärderades för deras invasivitet. Flera valomgångar utfördes för att minska andelen falska positiva identifieringar. Enskilda, isolerade cancercellskloner eller nykonstruerade kloner som uttrycker gener av intresse utsattes för primära tumörbildningsanalyser eller cancercellsvaskulatur medalternativanalys. Sammanfattningsvis presenterar vi en snabb screeningplattform som möjliggör antimetastatisk målidentifiering och intravital analys av en dynamisk och komplex kaskad av händelser.
Introduction
Metastasering är den främsta orsaken till cancerpatientdöd1,2,3. Metastaserande cancerceller använder distinkta signalvägar, beroende på typen av cancer, under de fem stegen i den metastaserade kaskaden: lokal invasion, intravasation, överlevnad i cirkulationen, extravasation och koloniexpansion på avlägsna metastaserade platser. Nuvarande förståelse av denna ögonbevarande process tyder på att det finns två flaskhalssteg, en är riktad invasion av cancercellen från den primära tumören, och den andra är upprättandet av den avlägsna platsen ögonbevarande lesion4,5,6. Båda stegen kräver cancerceller att aktivt interagera med kollagen och vaskulatur på platserna för inledande invasion eller avlägsna ögonbevarande lesion bildas. Därför måste metastaserade cancerceller kunna fästa på celler, bygga om kollagenfibrer och invadera längs kärlväggar7. Screeningmodeller som snabbt kan identifiera antimetastatiska terapeutiska mål för att blockera cancerceller från att slutföra dessa steg är av högsta vikt. Befintliga in vitro-screeningmodeller efterliknar inte helt den komplexa levande vävnadsmiljön. Musmodeller är kostsamma och tidskrävande. Därför finns det ett akut behov av intravitala screeningplattformar som ger komplexa levande vävnadsmiljöer och snabb identifiering av mål.
Under det senaste decenniet har kycklingembryon etablerats som en robust och kostnadseffektiv modell av human cancermetastas8,9,10,11,12. Chick chorioallantoic membran (CAM) vävnaden är tunn och genomskinlig vilket gör den idealisk för intravital mikroskopisk avbildning av cell- och kolonibeteenden i primära tumör- och/eller metastaserandeplatser 12. Primär tumör tillväxt från flera mänskliga cancer cellinjer kan initieras och metastaseras inom ett spann av bara flera dagar efter microinjection i CAM vävnaden. Cancerceller kan administreras i CAM-vävnaden på flera sätt, inklusive intravenöst, intra-CAM eller som kollagen onplanter, gör denna flexibilitet det möjligt för forskaren att fokusera på specifika stadier av cancerprogression, till exempel metastaserad lesionsbildning, invasion av primärtumör eller angiogenes.
Här beskriver vi en kvantitativ screeningplattform som kan användas för att mäta cancercellernas förmåga att etablera invasiva metastaserade lesioner. Cancerceller som har transduced med ett uttryck bibliotek injiceras intravenöst i CAM vaskulatur med låg densitet. Metastaserade kolonier bildas i 4-5 dagar, då utvärderas invasionskapaciteten och vaskulaturinteraktionen av de resulterande kolonierna. Enskilda kolonier som inte invaderar är strukna, förökade och deras fenotyp bekräftas i CAM genom återinsättning och kvantifiering av kolonikompbilitet och cancercells-blodkärlskontakter. Uttrycksbiblioteket konstruktioner som ansvarar för den enda ögonbevarande koloni mutant fenotyp identifieras från isolerade koloni genomisk DNA via hög genomströmning sekvensering. Samma plattform kan användas vidare för att validera orsakssambandet mellan en gen och den observerade fenotypen eller för att utföra djupgående mekanistiska studier på den observerade fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med bestämmelserna och riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Alberta. Fågelembryon anses inte vara levande djur av många forskningsinstitut och inga djurprotokoll krävs. Det är dock en accepterad uppfattning att fågelembryon kan känna smärta och därför måste behandlas så humant som möjligt. Den lokala djurforskningsmyndigheten måste kontaktas innan något forskningsarbete påbörjas för att säkerställa att lämpliga föreskrifter följs.
1. Skalfri äggkultur
- Införskaffa befruktade kycklingägg från den lokala leverantören. Detta experiment använder White Leghorn kycklingras; Men andra raser kan också användas.
OBS: Det rekommenderas att skaffa 10% fler ägg än nödvändigt om några av embryona skadas under sprickbildningen och inte kan användas i detta protokoll. - Överför det önskade antalet ägg till en 60% fuktad gunginkubator. Resten av äggen kan lagras i upp till två veckor vid 12 °C utan förlust av livskraft.
- Inkubera äggen i den fuktade gunginkubatorn i fyra dagar.
OBS: Dag 1 är när äggen överförs till den gungande inkubatorn. - Förbered vägningsfat och plastlock för den skalfria äggkulturen. Skär ett av hörnen på var och en av vägningsfaten för att möjliggöra effektiv luftåtkomst till embryot(figur 1A).
- Ordna de förberedda vägningsfaten i rader i flödeshuven. (Figur 1B).
- I en separat vägningsskål bered 70% etanol för äggsköljning.
- Doppa ägget kort i 70% etanol och använd sedan det elektriska roterande verktyget för att försiktigt göra fyra 2-3 mm skär parallellt med äggets största latitudindiameter (Figur 1C).
- Överför det skurna ägget till en vågskål och tryck försiktigt ägget mot skålbotten tills en spricka bildas i äggskalet (Figur 1D).
- Dra isär äggskalshalvorna och låt embryot glida in i vägningsskålen. Kassera äggskalet och täck vägningsskålen med lock.
- Överför embryona till fuktad icke-gungande inkubator (figur 1E).
OBS: Vägningsfat som innehåller embryona placeras i separata plastbehållare (12 embryon/behållare). Detta ökar embryots livskraft och möjliggör experimentspecifik embryoorganisation. - Inkubera embryon i ytterligare 6 dagar (tills de är 10 dagar gamla). Kontrollera om det finns döda eller kontaminerade embryon dagligen och ta bort dem från inkubatorn.
OBS: Embryon kan kontamineras av luftburna mögelsporer. Mögelförorening manifesteras ursprungligen som vita fläckar på embryot CAM-ytan. Avlägsna de kontaminerade embryona omedelbart och torka inkubatorn med 70% etanol varje vecka för att förhindra föroreningen. Enligt vår erfarenhet är föroreningsnivåerna mycket låga ~ 1-3%. - Använd dessa embryon för injektion av cancerceller på morgonen dag 10.
2. Beredning av cancercellerna för injektion
OBS: Valet av metastaserad koloni baseras på en fenotyp som fastställts av fluorescerande cancerceller, härledd från ett uttrycksbibliotek eller vektor märkt med fluorescerande protein som grönt eller rött fluorescerande protein (se hela skärmflödet i figur 2A). Det rekommenderas inte att använda celler som är transientt transfekterade med fluorescerande proteiner eller märkta med cellpermeabla fluorescerande färgämnen på grund av snabb blekning av signal orsakad av cancercellsproliferation och ojämn färgning.
- Kultur cancerceller till 60-70% confluency vid tidpunkten för injektion. Att använda cancerceller vid högre nivåer av sammanflöde kommer att minska deras livskraft, vilket resulterar i låg effektivitet av metastaserad kolonibildning. Se till att de cancerceller som används är mykoplasmafria eftersom mykoplasmaförorening kan leda till minskad kycklingembryon livskraft.
- Skölj cellerna två gånger med 1x PBS pH 7.4. Ta bort den återstående PBS, tillsätt sedan 0,5% Trypsin-EDTA och inkubera vid 37 °C i 2-5 min tills alla celler lyfts från odlingsskålens yta.
- Överför cellfjädringen till 15 ml koniskt rör och centrifugeringsceller vid rumstemperatur vid 200 x g i 5 minuter.
- Återanvänd celler i 10 ml PBS för att och centrifugera cellerna igen som i steg 2.3, för att ta bort trypsin och andra odlingsmediekomponenter som antibiotika.
OBS: Förekomst av trypsin- eller cellkulturkomponenter såsom antibiotika i cancercellsupphängningen kan leda till minskad kycklingembryon livskraft. - Aspirera försiktigt de supernata och återanvända cellerna med 1 ml iskallt PBS.
- Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer eller annan cellräkningsutrustning som finns tillgänglig.
Obs: Detta screeningprotokoll kräver att varje metastaserad koloni initieras av en enda cell. När du räknar cellerna, se till att cellerna är helt trypsiniserade och finns som en enda cellupphängning (inga cellklumpar finns). - För intravenösa (IV) injektionskoncentratceller till 0, 5 x 106 till 1, 0 x 106 celler/ml. Använd iskallt 1x PBS för att späda ut och/eller återanvända cellkoncentrat. Räkna med att cirka 1 ml cellers suspension kommer att behövas för vart tionde embryo.
OBS: Nödvändig cellupphängningskoncentration i suspension bestäms huvudsakligen av nivån på experimenterarupplevelsen. Se nästa avsnitt för mer information.
3. Intravenös injektion av cancerceller för metastaserad kolonibildning
OBS: Enligt detta protokoll kan så många som hundra embryon injiceras inom en dag. Det tar i allmänhet längre tid att isolera de metastaserade kolonierna (steg 5) för att sedan injicera cancercellerna och därför rekommenderas att utföra ett första experiment för att uppskatta den tid som behövs för att slutföra alla steg. Att använda differentiella cancercellsfluorescerande etiketter bidrar till att minska antalet djur och den tid som krävs för varje experiment. Till exempel kan kontrollceller märkas med RFP (rött fluorescerande protein) medan mutanta tumörceller alternativt kan märkas med GFP (grönt fluorescerande protein). I det här fallet har varje experiment en inbyggd kontroll som korrigerar för variabilitet mellan embryon.
- Montera injektionsapparaten enligt figur 2B. Montera först en nål på sprutan och förläng sedan sprutnålen med 3-5 cm lång rörbit.
- Bryt av spetsen på borosilikatnålen med hjälp av de fina tångarna (~ 20-60 μL bred).
- Ladda sprutan med cancercellsupphängningen (50-200 μL) och för in borosilikatnålen i slangen (figur 2B).
- Inspektera borosilikatnålen för cellpropp och luftbubblor. Det är viktigt att injicera celler som en enda cell suspension för att säkerställa att varje metastaserad koloni initieras av en enda cell.
OBS: Cancerceller tenderar att aggregeras i PBS inom 1-2 timmar efter trypsinisering och bör därför beredas omedelbart före injektion. Vid behov kan celler återanvändas regelbundet med hjälp av 1 ml sprutan som används för injektioner (utan borosilikatnålen). - Om cellproppar observeras inom kapillären, ta bort kapillären, suspendera cellerna igen och ersätt den med ett nytt kapillär. Använd kolven för att trycka ut eventuella bubblor. Om ingen cell igensättning eller bubblor observeras går du vidare till nästa steg.
- Ta bort locket och överför embryot under stereoskopet. Identifiera lämplig ven som ska injiceras på CAM-ytan. Vener och artärer bildar det invecklade nätverket iCAM-vävnaden (figur 2C). Vener utmärks av den ljusare röda färgen eftersom de bär syrerikt blod till embryot.
OBS: För allmän embryomanipulation, cancercellsinjektion och metastaserad koloniexcision, använd ett fluorescerande stereomikroskop utrustat med 0, 8x och 1,5x mål och 10x okular för visualisering. Mindre avancerat mikroskop kan också användas framgångsrikt för dessa procedurer, beroende på användarnas upplevelsenivå. Läsare kan kontakta författarna för mer detaljerade rekommendationer. - Hitta den idealiska venen för att injicera celler som normalt bara är något bredare (10-20%) än diametern på borosilikatnålspetsen och ligger halvvägs mellan embryot och vågskålväggen. Det är i allmänhet lättare att injicera vid den punkt som ligger omedelbart intill venbifurcationen.
OBS: Injektion i en större ven kan verka lättare men leder till överdriven blödning och minskad embryoöverlevnad. - Tryck nålens spets mot blodkärlsväggen och tryck försiktigt i samma riktning som blodflödet. Använd vid behov en bomullspinne (som hålls i andra handen) för att hjälpa till att förankra eller stabilisera kärlet som injiceras.
- Tryck försiktigt ner sprutkolven. Man kan visualisera en framgångsrik injektion genom att observera en "clearing" av blodkärlet när cancercellsupphängningen kommer in i blodet.
- Fortsätt att trycka in sprutkolven i 2-10 s tills önskad suspensionsvolym injiceras i venens blodflöde. Sammantaget kan injektionen av ett enda embryo kräva 1-10 min beroende på användarens erfarenhetsnivå. Om överdriven blödning eller klar vätskeackumulering uppträder på injektionsstället, kassera embryot.
OBS: Det är lätt att "överinjicering" ett embryo. Det allmänna övervägandet som bör hållas i åtanke är att metastaserade kolonier inte bör röra varandra efter en tillväxtperiod på 4-5 dagar. Helst ~ 5-10% av terminal CAM vein kapillärer bör ha celler immobiliserade i dem efter en framgångsrik injektion (Figur 2D,E). Som nämnts i steg 2 kan ett cellkoncentrationsområde användas (0,5 x 106 - 1,0 x 106 celler/ml). Lägre koncentrationer kommer att kräva längre injektionstid men kommer att minska nålproppen. Högre koncentrationer kommer att kräva kortare injektionstider men kommer att öka nålproppen. Det rekommenderas att prova flera koncentrationer för att hitta den som är mest bekväm för en operatör. Generellt sett föredras högre koncentration (1,0 x10 6 celler/ml) för att minska injektionstiden. - Ta bort nålen från CAM och doppa försiktigt injektionsstället med en bomullspinne för att avlägsna blod eller överflödiga cancerceller.
- Täck embryot i vägningsskålen med lock och sätt tillbaka det injicerade kycklingembryon i inkubatorn.
- Upprepa proceduren med nästa embryo tills alla embryon injiceras.
4. Embryounderhåll under metastaserad kolonitillväxt
- Inspektera embryona visuellt. Om det finns några som är döda, och /eller förorenade med bakterier eller mögel ta bort dem från inkubatorn, autoklav och kassera dem enligt laboratorieavlägande förfaranden.
OBS: Det rekommenderas att embryon inspekteras varannan dag (dag 1, 3, 5 efter cancercellsinjektion) för metastaserad kolonitillväxt. Undvik att flytta de injicerade embryona i onödan eftersom det kan orsaka embryoskador och/eller dödsfall. - Om celler uppvisar överväxt (metastaserade kolonier överlappar varandra) eller ojämn fördelning inom CAM-vävnaden (metastaserade kolonier belägna i små delområde av CAM-ytan) tar du bort embryot från experimentet. Avliva kasserade embryon genom att frysa vid -20 °C (eller annan godkänd metod) omedelbart efter det att försöket avlägsnats. Antalet livskraftiga metastaserade celler i CAM-vävnaden kommer att minska initialt (dag 1-2) och sedan öka (dag 2-5).
OBS: Vissa embryon kan "avvisa" cancercellerna, dvs alla cancerceller kommer att försvinna från CAM-vävnaden. Dessa embryon bör avlägsnas från experimentet. Normalt kan cancercellskolonier ses genom det genomskinliga locket under det fluorescerande stereomikroskopet utan att öppna vägningsskålen. - Se till att metastaserade kolonier verkar enhetliga i form (de första 1-3 dagarna efter injektionen). Identifiera invasiva eller icke-invasiva metastaserade kolonier vid dagar 4-5 efter injektion (se avsnitt 5 för mer information).
5. Isolering av metastaserade kolonier
- Vid dag 5 efter injektionen ta bort embryon från inkubatorn och inspektera embryot CAMs för metastaserad kolonifördelning. Identifiera embryona med enhetlig kolonifördelning där kompakta (eller alltför invasiva) kolonier förekommer.
OBS: Odlingsprocessen för kycklingembryon är inte steril, därför måste alla screeningsteg utföras under mycket rena förhållanden för att undvika framtida vävnadskulturförorening. Kontaminering Det är ganska sällsynt och kan lätt undvikas genom att bära handskar och en mask och endast använda sterila verktyg under cellinjektion och koloniisoleringsprocedurer. Det rekommenderas att inspektera embryon en efter en för att minska deras exponering för laboratorietemperaturen i omgivningen och för att förhindra kontaminering. - Leta reda på den metastaserade kolonin av intresse. En kompakt koloni kan beskrivas som en med de flesta cancercellerna belägna inom ett begränsat område i CAM-vävnaden (cellerna verkar "klumpade ihop"). En invasiv koloni kan beskrivas som koloni där cancerceller "sprider sig" i CAM-vävnaden (Figur 3A,B).
OBS: "Kompaktitet" av den metastaserade kolonin kan förklaras antingen av hämning av cancercellsinvasion, hämning av cancercellsproliferation eller båda. Alla scenarier och kontaktkolonier bör isoleras ( figur3A,B). Ett enkelt fluorescerande stereomikroskop kan användas för att diskriminera mellan kompakta och invasiva metastaserande koloni fenotyper. - Dra försiktigt cam-vävnaden som innehåller den metastaserade kolonin av intresse uppåt med hjälp av fina tångar (figur 3C) under dissekeringsmikroskopet.
- Skär av CAM-vävnaden som innehåller den metastaserade kolonin med hjälp av kirurgisk sax.
- Överför CAM-vävnaden som innehåller den metastaserade kolonin till ett tomt, sterilt 1,5 ml-rör (på is) och stäng rörlocket.
OBS: Isolerade kolonier kan hållas på is i upp till 3 timmar utan förlust av livskraft. - Upprepa excisionproceduren tills alla intressekolonier samlas in i separata rör. För att undvika djurs lidande, punktskatt inte mer än 2-3 kolonier från ett embryo. Avliva embryon genom att frysa vid -20 °C (eller annan godkänd metod) omedelbart efter kolonins excision.
- Hacka försiktigt CAM-vävnaden i ett mikrocentrifugrör med en steril 18 gauge nål. Använd en separat nål för varje koloni.
- Tillsätt 100 μL 1x kollagenlösning och inkubera i 30 min vid 37 °C.
- Snurra ner cellerna och CAM-vävnaden vid 300 x g i 5 min vid omgivningstemperatur.
- Aspirera kollagenlösningen och återanvända celler i kompletta medier som används för celllinjen av intresse.
OBS: Normalt är CAM-vävnad inte helt dissocierad efter kollagenasbehandling och cancerceller kommer först att föröka sig i bitarna av CAM-vävnad och först senare migrera till vävnadskulturrätten. - Snurra cellerna och CAM-vävnaden igen vid 300 x g i 5 min vid omgivningstemperatur.
- Återanvända celler och CAM-vävnadsbitar i 1 ml komplett media plus urvalsfaktor (om någon), överför sedan till en enda 12 brunns vävnadskulturrätt väl.
OBS: Kyckling CAM fibroblaster kan kvarstå i vävnadskulturen för flera passager som hämmar klonurför expansion. Förmåga att expandera de metastaserande kolonierna i närvaro av urvalsfaktor (dvs. om en vektor som användes för att göra cancerceller fluorescerande också kodar en däggdjurs antibiotikaresistensgen) kan kraftigt påskynda klonurvalet expansion. Ett kill curve-experiment bör utföras före screeningen för att säkerställa att korrekt koncentration av antibiotika används. - Under de kommande 1-3 veckorna övervaka cancerceller dagligen för tillväxt och förorening.
- När celler når 70-80% av confluency överföra celler till en större volym kultur skål.
OBS: Det rekommenderas att expandera celler tills minst två kryogena injektionsflaskar av varje klon kan frysas. Att upprätthålla stora mängder vävnadskultur kan vara mödosamt och onödigt. - Fortsätt till sekvensering eller nästa urvalsomgång så snart tillräckligt många cancerceller har uppnåtts. I allmänhet är 1 x 106 av cancercellerna tillräckliga för moderna sekvenseringstekniker med hög genomströmning.
- Fortsätt till klonåterinflektion och avbildning och kvantifiering av kolonikomplikitet eller kontakt med cancerceller och blodkärl (figur 2A). Alternativt fortsätta till hög genomströmningssekvensering eller upprepa kolonivalet.
OBS: För att minska antalet falska positiva identifieringar rekommenderas minst två valomgångar. Två tillvägagångssätt har använts framgångsrikt. 1) Expandera varje klon och återject individuellt för att bekräfta koloni fenotyp. 2) Blanda alla expanderade kloner i ett 1:1-förhållande vardera, återject som en blandning och upprepa urvalscykeln.
6. Injektion av fluorescerande märkta ditiner i CAM-vaskulaturen.
- Identifiera venen som ska injiceras. Det är lättare att använda samma injektionsställe för tektin som användes för tumörcellsinjektion.
- Späd fluorescerande lectinbuljonglösning (5 mg/ml) 50-100x med 1x PBS och ladda den i samma injektionsapparat som används för cancercellsinjektion.
OBS: Mängden indikering av tektin som behöver injiceras (normalt 20-100 μL) för blodkärlsvisualisering är beroende av mikroskopkänslighet och bör bestämmas experimentellt före screening. - Injicera tektin med samma teknik som för tumörcellsinjektion (se steg 3.6.-3.10.).
- Efter injektinationen, placera embryot i inkubatorn för att återhämta sig i 5 minuter. Injicera endast ett embryo i taget och omedelbart innan embryot avbildas.
NOT. Embryon som är 12 dagar eller äldre återhämtar sig i allmänhet väl från injektionerna av tektin och kan åter injiceras med tektin nästa dag för sekventiell avbildning. Yngre embryon är känsligare och kan visa blodkoagulering.
7. Visualisering av kontakter mellan cancerceller och blodkärl
- Ställ in det temperaturreglerade mikroskophöljet på 37 °C cirka 6 timmar före avbildning. Detta stabiliserar mikroskoptemperaturen och hjälper till att minimera XYZ-drift under avbildning.
NOT. En specialiserad kyckling embryo imagingkammare 9,10,11,12,13 användes för detta experiment. Ett enkelt fluorescerande dissekeringsmikroskop kan användas för alla steg från cancercellsinjektion till klonval och klon reinjection och utvärdering av kolonins kompaktitet. Ett konfokalt mikroskop som är utrustat med en bildkammare är nödvändigt för avbildning och kvantifiering av kontakterna mellan cancerceller och blodkärl. Ingen uppvärmning är nödvändig för upp till 1 timme och i allmänhet överlever embryon minst två sekventiella avbildningssessioner utan inverkan på deras livskraft. - Se till att den nödvändiga objektivlinsen (20x eller 25x vattensänkningsmållins rekommenderas) har installerats.
- Applicera ett tunt lager vakuumfett på undersidan av bildkammarens lock för att skapa en säker tätning med täckslipen.
- Placera försiktigt ett lock i locket och torka bort eventuellt överflödigt vakuumfett.
- Ta ut det injicerade embryot ur inkubatorn och skär vid behov vägningsskålens fälgar.
- Placera embryot i bildkammaren med täckglaset sänkt direkt mot det område i CAM där de metastaserade kolonierna av intresse finns. Sänk långsamt locket på embryot tills täckglaset bara kommer i kontakt med CAM. Dra åt skruvarna för att fästa locket på plats, se till att locket är utjämnat och att täckglaset inte sätter något nedåttryck på kammen.
- Förvärva bilder av flera, slumpmässiga kolonier från kontroll- och experimentgrupper (10-20) från flera (5-10) embryon.
NOT. Att skaffa slumpmässiga 3D-staplar (1-5um Z-steg; 50-100um-intervall; 25x) från varje fält rekommenderas. - Använd fältsömningsalternativet i programvaran för mikroskopförvärv om det finns tillgängligt. Eftersom bilder som används för kvantifiering inte kommer att vara publiceringskvalitet, använd snabba anskaffningslägen som resonansskanning om tillgängligt. Använd 25x objektiv och 3 x 3 sömmar med 5-10 μm Z-steg, 100 μm totalt intervall. Avbilda minst 100 celler (~20 kolonier) per villkor.
8. Kvantifiering av kontakterna med cancercellsblodkärlet
- Öppna 3D-filen som en Z-stack med nödvändig programvara.
NOT. Specialiserad programvara måste användas för att förvärva och analysera högupplösta bilder för att kvantifiera kontakt med cancerceller och blodkärl. Flera programvarupaket som kan 3D-bildanalys är tillgängliga. Mer information finns i Materialförteckningen. - Om betydande XY-förflyttningar inträffade under bildförvärvet justerar du Z-stacken med plugin-programmet ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Leta reda på de celler som är av intresse.
- Bläddra igenom XYZ-bilden i Z-riktningen och identifiera den optiska sektionen som innehåller cancercellsblodkärlets maximala längd för den cell som är av intresse (figur 2E).
- Mät kontakt med cancerceller och blodkärl med hjälp av den "manuella längdmätningsfunktionen".
- Ange mätningarna i dataprogrampaketet som används för statistisk analys.
OBS: Cancercellernas förmåga att fästa på blodkärlen kan mätas antingen som längden på kontakterna mellan cancerceller och blodkärl eller procentandelen av cellen som kommer i kontakt med vaskulaturen för en viss cancercellsklon (eller båda). - Fortsätt till nästa intressecell.
- Analysera data för statistisk signifikans som jämför mutanta kloner och kontrolldatamängder.
9. Kvantifiering av kolonikomprimering
- Återject cellerna från den expanderade klonen med samma teknik som i steg 2.
- Fem dagar efter injektion förvärva bilder av 10-50 slumpmässiga ögonbevarande kolonier för varje klon.
OBS: Inga högkvalitativa bilder är nödvändiga för metastaserad kolonikomprimering. Monokromatiska bilder av stereomikroskop (10x förstoring) är tillräckliga. Uppmärksamhet bör ägnas åt bildens ljusstyrka (de flesta cellerna i kolonin bör ses) och kontrast (skillnad mellan en eller två celler). - Isolera kolonibilden digitalt (se figur 2C,D)och fortsätt till kolonikomprimering med hjälp av den fristående kolonikomprimeringsmodulen eller blindbedömning13.
- Fortsätt till nästa intressekoloni.
- Analysera data för statistisk signifikans som jämför mutanta klon- och kontrolldatamängder (dvs. förvrängning shRNA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cancercellsinjektion anses vara framgångsrik om majoriteten av de celler som sitter i kapillärerna är enstaka och ligger vid en betydande skillnad från varandra (~ 0,05-0,1 cm) så att kolonierna inte överlappar varandra efter 5-6 dagars inkubationstid (figur 3A). Injektionen lyckades inte om en ansamling av cancerceller kan ses i de flesta kapillärer, embryon som visar detta bör kasseras (figur 2E). Ett betydande antal injicerade cancerceller förgås inom 24 timmar efter injektionen, vilket gör att vissa embryon verkar avvisa alla cancerceller. Cancercellens överlevnad varierar beroende på den lokala äggleverantören (dvs. mängden celler som ska injiceras kan variera) och vi rekommenderar starkt att optimala injektionsförhållanden (cancercellskoncentration kontra injektionstid) bestäms innan experimentet fortsätter. Vi rekommenderar cellkoncentration i intervallet mellan 0,5 x 106 till 1,0 x 106 celler/m. När den optimala cellkoncentrationen och injektionstiden uppnås bör de transinducerade cellerna dag 5 efter injektionen producera en mängd olika koloni fenotyper där majoriteten av kolonierna verkar invasiva enligt de cancerceller som uppträder utspridda iCAM-vävnaden ( figur 3A). Uppmärksamhet bör ägnas åt de metastaserade kolonier som verkar "kompakta" och ligger tillräckligt långt från närliggande kolonier för att de kan strukas med tång och sax i en bit CAM-vävnad (Figur 3C). En isolerad positiv skärmträff (dvs. en kompakt koloni) ska visa den kompakta kolonins fenotyp vid återinjektion (figur 3B). En minskning av cellöverlevnaden (eller cellproliferationshastigheten inom kolonin) kan också observeras. Därför är det möjligt att högre cellnummer måste injiceras för några av de positiva skärmträffarna för att få tillräckligt med koloninummer. För mätning av cancercells-blodkärlskontakterna bör uppmärksamhet ägnas åt vaskulär väggfläckens ljusstyrka (fluorescerande ljulin; Figur 3D,E)och lämplig mängd tektin ska injiceras för den ljusa/kontrasterade kärlväggssignalen. Alla tillgängliga bildanalysprogram kan användas under kvantifieringsstegen efter att mikroskop-programvarukalibrering har utförts.
Bild 1:Kycklingembryonskalsfri kulturöversikt. Pilen pekar mot det skurna hörnet. B)Vägningsrätter ordnade i rader i flödeshuven. (C) Skärning av ett äggskal med ett elektriskt roterande verktyg. D)Knäckning av ett ägg i en vägningsskål. E)Embryon odlade i den fuktade inkubatorn. Skalstänger =1 cm (A-D) eller 5 cm (E). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Kontur av cancercellsinjektion och metastaserad koloniisolering. B)Cancercellsinjektion som ställts in på stereofluorescerande mikroskopstadiet. C)Injektion av cancercellerna i CAM-vaskulaturen. (D) Bild som visar framgångsrik cancercellsinjektion (acceptabel cancercellstäthet), tagen omedelbart efter injektionen. (E) Bild som visar dålig cancercellsinjektion, ses som ett överinsprutat embryo. Observera att cancercellen byggs upp i blodkarillärerna (vita pilar). Skalstänger = 1 cm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3. Representativa resultat för olika steg i screeningprotokollet. (A) Metastaserade kolonier bildade av heterogena (bibliotekstransducerad cancercelllinje HEp3-celler), 5 dagar efter injektion. Röd pil visar kompakt koloni (potentiell positiv träff) som ska strukas. (B) Metastaserade kolonier som bildas av en av de isolerade skärmträffarna(KIF3B)efter omval, 5 dagar efter injektionen. Insets visar digitalt utklippta metastaserade kolonibilder från de streckade rutorna. Detta är acceptabel bildkvalitet för C.I kvantifiering. Genomsnittligt C.I.-värde för träff omval (KIF3B) visas. C)Isolering av den metastaserade kolonin av intresse från CAM-vävnaden. Representativa optiska delarav ( D) en kontrollkoloni, och (E) en KIF3B shRNA överuttryckande koloni, som båda visar kontaktmätningar av cancerceller och blodkärl. CAM vaskulatur är märkt med fluorescerande lectin-649. Skalstänger =1 cm (A-C) eller 50 μm (D, E). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett snabbt fluorescensmikroskopibaserat intravitalt screeningprotokoll som kan användas för viktiga applikationer som genetiska eller läkemedelskandidatskärmar. Cancerceller som har transduced med ett genetiskt bibliotek av intresse eller transfected med individuella uttryck konstruktioner kan snabbt screenas och kvantifieras om fenotyp av intresse med hjälp av denna chick CAM modell. Eftersom transduktions- eller transfectionprotokoll varierar avsevärt, beroende på bibliotekstyp, ingår de inte i den här proceduren. Fenotypiskt relevanta metastaserade kolonier är strukna från CAM, expanderas och DNA isoleras för hög genomströmning sekvensering för att identifiera uttrycket konstruktion av intresse. I allmänhet är varje genetiskt bibliotek utrustat med primersekvenser och rekommenderade metoder för genomisk DNA-rening. Vi rekommenderar att du använder lokala anläggnings riktlinjer för de bästa resultaten av sekvensering med högt genomströmning.
Det rekommenderas att bestämma den optimala multipliciteten av infektion (M.O.I.) för ett bibliotek och en cellinje före screening. Helst bör varje cell (och därmed framtida metastaserad koloni) endast innehålla en genuttryckskonstruktion, men enligt vår erfarenhet är det inte alltid möjligt att uppnå. Vi rekommenderar att du följer bibliotekstillverkarens protokoll och testar ett brett utbud av M.O.I. (0,01-5) för att uppnå så nära 1 som möjligt. Förekomsten av flera bibliotek uttryck konstruktioner inom varje ögonbevarande koloni kan avsevärt komplicera koloni fenotyp analys. Vi rekommenderar också att du använder bibliotekstillverkaren som medföljer negativ kontroll i dina experiment (dvs. förvrängning shRNA uttrycker vektor som är fluorescerande taggad).
Vårt screeningprotokoll är baserat på urval av icke-invasiva fluorescerande kolonier; Det är viktigt att se till att alla cellinjer som används i experimenten har liknande fluorescensintensitet. Ojämn fluorescensintensitet bland cellerna (och metastaserade kolonier) kan resultera i en partisk kolonival på grund av cell- eller kolonins ljusstyrka istället för invasivitet.
Jämfört med befintliga metoder ger vårt protokoll flera unika fördelar som hastighet, låg kostnad och förmåga att slutföra den intravitala skärmcykeln utan behov av sofistikeradbildbehandlingsutrustning 12,13,14. Dessutom kan hela screeningcykeln slutföras med 3 till 6 veckor från cellinjektionen till sekvenseringsstadiet. Inget högupplöst mikroskop krävs för cancercellsinjektion eller metastaserad koloniisolering eftersom dessa steg kan utföras med hjälp av grundläggande fluorescerande stereomikroskop som är tillgängligt för de flesta forskare. Slutligen, eftersom skalfri embryoodling är helt självförsörjande finns det inget behov av komplicerade djurhem för forskning eller utfodringsscheman. De flesta forskningsinstitutioner anser inte att kycklingembryon är levande djur, vilket avsevärt minskar kostnaderna och dokumentationsbördan i samband med denna modell.
Det finns dock vissa begränsningar förknippade med den skalfria embryomodellen. För det första fungerar inte alla cancercelllinjer effektivt i denna modell. I vårt laboratorium använder vi rutinmässigt flera cancercelllinjer, såsom HT1080 (human fibrosarcoma), HEp3 (huvud & nacke) och mus b16 melanom och 4T1 bröstcancer cellinjer, som robust bildar metastaserande kolonier när de injiceras i kyckling CAM vaskulatur. Andra cellinjer med olika cancertyper som bröst (MDA468), hjärna (U87 och U118) eller äggstock (A2780s) bildar lätt metastaserade kolonier när de injiceras i CAM och kan därför användas i detta screeningprotokoll samt12,14,15. Men enligt vår erfarenhet fungerar ofta använda cancercelllinjer som LnCaP och PC3 inte bra i denna modell (opublicerade observationer). En annan begränsning är att ett konfokalt mikroskop med ett bildområde på 100 till 200 μm krävs för högupplöst avbildning, såsom visualisering av cancercellsblodkärlskontakter, denna utrustning kanske inte är tillgänglig för många forskare.
Sammantaget beskriver detta protokoll en snabb intravital screeningplattform som kan användas för upptäckt av cancermetastasuppressorer och förare. Vi är övertygade om att modellens robusthet och användarvänlighet kommer att göra den till en viktig screeningmodell för många forskare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 till JDL och KS. Dr. Lewis innehar Frank och Carla Sojonky-stolen i prostatacancerforskning med stöd av Alberta Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).
