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Cancer Research

रैपिड और मात्रात्मक इंट्राविटल चिक कोरियोलाएंटोइक झिल्ली मॉडल का उपयोग करके मेटास्टैटिक नियामकों की खोज

Published: February 3, 2021 doi: 10.3791/62077
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Oncology, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada, 2Department of Cell Biology & Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

यह कैंसर मेटास्टेसिस के दबाने या ड्राइवरों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। कोशिकाओं, एक अभिव्यक्ति पुस्तकालय के साथ स्थानांतरित, मेटास्टैटिक उपनिवेशों के रूप में चिकन कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली वाक्यूलेचर में इंजेक्ट किए जाते हैं। कम या आक्रामकता में वृद्धि करने वाली उपनिवेशों को उत्पादित किया जाता है, विस्तारित किया जाता है, उनके फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए फिर से इंजेक्ट किया जाता है, और अंत में, उच्च थ्रूप अनुक्रमण का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है।

Abstract

कैंसर अनुसंधान में हाल ही में प्रगति कैंसर मेटास्टेसिस की अत्यधिक जटिल प्रकृति सचित्र है । कई जीन या जीन नेटवर्क कैंसर मेटास्टैटिक झरना जीन और जीन कैंसर प्रकार, ऊतक, और व्यक्तिगत रोगी विशेषताओं पर निर्भर उत्पादों को विनियमित करने में शामिल पाया गया है । ये आनुवंशिक चिकित्सा और व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण के लिए संभावित महत्वपूर्ण लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन आनुवंशिक लक्ष्यों की पहचान के लिए रैपिड स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों का विकास जरूरी है ।

लड़की कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली (सीएएम) एक अत्यधिक संवहनी, कोलेजन समृद्ध झिल्ली है जो अंडे के नीचे स्थित है जो विकासशील भ्रूण में गैस विनिमय की अनुमति देती है। सीएएम के स्थान और संवहनीकरण के कारण, हमने इसे एक इंट्राविटल मानव कैंसर मेटास्टेसिस मॉडल के रूप में विकसित किया जो कोलेजन समृद्ध मैट्रिक्स और वैक्यूलेचर के साथ कैंसर सेल इंटरैक्शन के मजबूत मानव कैंसर सेल ज़ेनोबेड़ा और वास्तविक समय इमेजिंग की अनुमति देता है।

इस मॉडल का उपयोग करके, एक मात्रात्मक स्क्रीनिंग मंच को कैंसर मेटास्टेसिस के उपन्यास ड्राइवरों या दमनकर्ताओं की पहचान के लिए डिज़ाइन किया गया था। हम एक पूर्ण मानव जीनोम shRNA जीन पुस्तकालय के साथ सिर और गर्दन HEp3 कैंसर कोशिकाओं के एक पूल स्थानांतरित, तो कोशिकाओं इंजेक्शन, कम घनत्व पर, कैम vasculature में । कोशिकाओं का प्रसार किया और एकल ट्यूमर सेल कालोनियों का गठन किया । व्यक्तिगत उपनिवेश जो कैम ऊतक में आक्रमण करने में असमर्थ थे, एक कॉम्पैक्ट कॉलोनी फेनोटाइप के रूप में दिखाई दे रहे थे और कोशिकाओं में मौजूद ट्रांसड्यूडेड श्रर्ना की पहचान के लिए उत्पादित थे। व्यक्तिगत उपनिवेशों की छवियों का मूल्यांकन उनकी आक्रामकता के लिए किया गया था। झूठी सकारात्मक की दर को कम करने के लिए चयन के कई दौर किए गए। व्यक्तिगत, अलग कैंसर सेल क्लोन या नए इंजीनियर क्लोन है कि ब्याज के जीन व्यक्त प्राथमिक ट्यूमर गठन परख या कैंसर सेल vasculature सह विकल्प विश्लेषण के अधीन थे । संक्षेप में हम एक रैपिड स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म पेश करते हैं जो एंटी-मेटास्टैटिक लक्ष्य पहचान और घटनाओं के गतिशील और जटिल झरना के इंट्राविटल विश्लेषण की अनुमति देता है।

Introduction

मेटास्टेसिस कैंसर रोगी की मृत्यु का मुख्य कारण है1,2,3. मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाएं मेटास्टैटिक झरना के पांच चरणों में कैंसर के प्रकार पर निर्भर, अलग सिग्नलिंग रास्तों का उपयोग करती हैं: स्थानीय आक्रमण, इंट्रावेशन, परिसंचरण में अस्तित्व, अतिवेशीकरण, और दूर मेटास्टैटिक साइटों पर कॉलोनी विस्तार। इस मेटास्टैटिक प्रक्रिया की वर्तमान समझ से पता चलता है कि दो अड़चन कदम हैं, एक प्राथमिक ट्यूमर से कैंसर कोशिका का दिशात्मक आक्रमण है, और दूसरा दूर साइट मेटास्टैटिक घाव4,5,6की स्थापना है। दोनों चरणों में कैंसर कोशिकाओं को प्रारंभिक आक्रमण या दूर मेटास्टैटिक घाव गठन की साइटों पर कोलेजन और वैक्यूलेचर के साथ सक्रिय रूप से बातचीत करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं को कोशिकाओं से जोड़ना, कोलेजन फाइबर को फिर से तैयार करने और दिशात्मक रूप से संवहनी दीवारों के साथ आक्रमण करने में सक्षम होना चाहिए7। स्क्रीनिंग मॉडल है कि तेजी से इन कदमों को पूरा करने से कैंसर की कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए antimetastatic चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान कर सकते है सबसे अधिक महत्व का है । मौजूदा इन विट्रो स्क्रीनिंग मॉडल पूरी तरह से जटिल लाइव ऊतक वातावरण की नकल नहीं करते हैं। माउस मॉडल महंगे और समय लेने वाले होते हैं। इसलिए, इंट्राविटल स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों की तत्काल आवश्यकता है जो जटिल लाइव ऊतक वातावरण और लक्ष्यों की तेजी से पहचान प्रदान करते हैं।

पिछले दशक के भीतर, चिकन भ्रूण को मानव कैंसर मेटास्टेसिस8, 9,10, 11, 12के एक मजबूत और लागत प्रभावी मॉडल के रूप मेंस्थापितकिया गया है। चिक कोरियोलाएंटोइक झिल्ली (सीएएम) ऊतक पतला और पारदर्शी होता है जो इसे प्राथमिक ट्यूमर और/या मेटास्टैटिक साइटों12में कोशिका और कॉलोनी व्यवहार के इंट्राविटल माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के लिए आदर्श बनाता है । कई मानव कैंसर सेल लाइनों से प्राथमिक ट्यूमर विकास शुरू किया जा सकता है और कैम ऊतक में माइक्रोइंजेक्शन के बाद केवल कई दिनों की अवधि के भीतर मेटास्टेसाइज्ड। कैंसर कोशिकाओं को कैम ऊतक में कई तरीकों से प्रशासित किया जा सकता है, जिसमें नसों के साथ, इंट्रा-कैम या कोलेजन ऑनप्लांट्स शामिल हैं, यह लचीलापन शोधकर्ता को कैंसर प्रगति के विशिष्ट चरणों पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, मेटास्टैटिक घाव गठन, प्राथमिक ट्यूमर या एंजियोजेनेसिस से बाहर आक्रमण।

यहां हम एक मात्रात्मक स्क्रीनिंग मंच का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग कैंसर कोशिकाओं की आक्रामक मेटास्टैटिक घावों को स्थापित करने की क्षमता को मापने के लिए किया जा सकता है। कैंसर कोशिकाओं है कि एक अभिव्यक्ति पुस्तकालय के साथ स्थानांतरित किया गया है कम घनत्व पर कैम vasculature में नसों के द्वारा इंजेक्शन हैं । मेटास्टैटिक उपनिवेश 4-5 दिनों के लिए बनते हैं, फिर परिणामी उपनिवेशों की आक्रमण क्षमता और वाक्यूलेचर इंटरैक्शन का मूल्यांकन किया जाता है। व्यक्तिगत उपनिवेशों जो आक्रमण करने में विफल रहते हैं, उन्हें उत्पादित, प्रचारित किया जाता है और उनके फेनोटाइप को सीएएम में कॉलोनी कॉम्पैक्टनेस और कैंसर सेल-रक्त वाहिका संपर्कों के पुनर्जेक्शन और मात्राकरण द्वारा पुष्टि की जाती है। अभिव्यक्ति पुस्तकालय एकल मेटास्टैटिक कॉलोनी उत्परिवर्ती फेनोटाइप के लिए जिम्मेदार निर्माण उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के माध्यम से अलग कॉलोनी जीनोमिक डीएनए से पहचाना जाता है। एक ही मंच का उपयोग जीन और मनाया फेनोटाइप के बीच कारण लिंक को मान्य करने या मनाया फेनोटाइप पर गहराई से मशीनवादी अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोगों के नियमों और अलबर्टा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । एवियन भ्रूण को कई शोध संस्थानों द्वारा जीवित जानवर नहीं माना जाता है और किसी पशु प्रोटोकॉल की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, यह एक स्वीकार्य विचार है कि एवियन भ्रूण दर्द महसूस कर सकते हैं और इसलिए, यथासंभव मानवीय रूप से व्यवहार किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए कि उचित विनियमों का पालन किया जाए, किसी भी अनुसंधान कार्य को शुरू करने से पहले स्थानीय पशु अनुसंधान प्राधिकरण से संपर्क किया जाना चाहिए ।

1. शेल-कम अंडा संस्कृति

  1. स्थानीय प्रदाता से निषेचित चिकन अंडे प्राप्त करें। यह प्रयोग व्हाइट लेगहॉर्न चिकन नस्ल का उपयोग करता है; हालांकि, अन्य नस्लों का उपयोग भी किया जा सकता है।
    नोट: यह 10% अधिक अंडे प्राप्त करने की सिफारिश की है मामले में भ्रूण के कुछ खुर के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे है और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।
  2. अंडे की आवश्यक संख्या को 60% आर्द्रीकृत कमाल के इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। बाकी अंडों को व्यवहार्यता के नुकसान के बिना 12 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. चार दिनों के लिए आर्द्र कमाल इनक्यूबेटर में अंडे इनक्यूबेट।
    नोट: 1 दिन है जब अंडे कमाल इनक्यूबेटर को हस्तांतरित कर रहे हैं ।
  4. खोल-कम अंडा संस्कृति के लिए वजनी व्यंजन और प्लास्टिक के ढक्कन तैयार करें। भ्रूण(चित्रा 1A)के लिए कुशल हवा का उपयोग करने के लिए अनुमति देने के लिए वजन व्यंजनों में से प्रत्येक के कोनों में से एक कट ।
  5. प्रवाह हुड में पंक्तियों में तैयार वजनी व्यंजनों की व्यवस्था करें। (चित्रा 1B)।
  6. एक अलग वजनी डिश में अंडे की रिंसिंग के लिए 70% इथेनॉल तैयार करें।
  7. संक्षेप में 70% इथेनॉल में अंडे डुबकी, तो बिजली रोटरी उपकरण का उपयोग करने के लिए ध्यान से चार 2-3 मिमी अंडे के सबसे बड़े शौचालय व्यास(चित्रा 1C)के समानांतर कटौती करते हैं ।
  8. कटे हुए अंडे को एक वजनी डिश में स्थानांतरित करें और अंडे के नीचे अंडे को धीरे से दबाएं जब तक कि अंडे के शेल(चित्रा 1D)में दरार न हो जाए।
  9. अंडे का शंख आधा खींचो के अलावा भ्रूण वजन पकवान में पर्ची दे । अंडे के खोल को त्यागें और वजनी पकवान को ढक्कन से ढक दें।
  10. भ्रूण को आर्द्रीकृत गैर कमाल इनक्यूबेटर(चित्रा 1E)में स्थानांतरित करें।
    नोट: भ्रूण युक्त वजनी व्यंजन अलग प्लास्टिक कंटेनरों (12 भ्रूण/कंटेनर) में रखा जाता है । यह भ्रूण व्यवहार्यता बढ़ जाती है और प्रयोग विशिष्ट भ्रूण संगठन के लिए अनुमति देता है ।
  11. 6 और दिनों के लिए भ्रूण को इनक्यूबेट करें (10 दिन पुराना तक)। रोजाना मृत या दूषित भ्रूण की जांच करें और उन्हें इनक्यूबेटर से हटा दें।
    नोट: भ्रूण हवाई मोल्ड बीजाणुओं से दूषित किया जा सकता है । मोल्ड संदूषण शुरू में भ्रूण कैम सतह पर सफेद धब्बे के रूप में प्रकट होता है। दूषित भ्रूण को तुरंत हटा दें और प्रदूषण को रोकने के लिए साप्ताहिक आधार पर 70% इथेनॉल के साथ इनक्यूबेटर को मिटा दें। हमारे अनुभव में संदूषण का स्तर बहुत कम ~ 1-3% है।
  12. दिन 10 की सुबह कैंसर सेल इंजेक्शन के लिए इन भ्रूण का उपयोग करें।

2. इंजेक्शन के लिए कैंसर कोशिकाओं की तैयारी

नोट: मेटास्टैटिक कॉलोनी चयन फ्लोरोसेंट कैंसर कोशिकाओं द्वारा स्थापित एक फेनोटाइप पर आधारित है, जो एक अभिव्यक्ति पुस्तकालय या वेक्टर से प्राप्त होता है, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया जाता है (चित्रा 2 एमें पूरी स्क्रीन प्रवाह देखें)। यह कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है जो हृदय गतिमान प्रोटीन से संक्रमित होती है या कैंसर सेल प्रसार और असमान धुंधला होने के कारण संकेत की तेजी से लुप्त होती के कारण कोशिका पारमी फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल की जाती है।

  1. इंजेक्शन के समय 60-70% तक संस्कृति कैंसर कोशिकाएं। उच्च स्तर पर कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करने से उनकी व्यवहार्यता कम हो जाएगी, जिसके परिणामस्वरूप मेटास्टैटिक कॉलोनी गठन की दक्षता कम होगी। सुनिश्चित करें कि उपयोग की जाने वाली कैंसर कोशिकाएं माइकोप्लाज्मा मुक्त हैं क्योंकि माइकोप्लाज्मा संदूषण से चिकन भ्रूण व्यवहार्यता में कमी आ सकती है।
  2. 1x पीबीएस पीएच 7.4 के साथ दो बार कोशिकाओं कुल्ला। शेष पीबीएस को हटा दें, फिर 0.5% ट्राइप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और 2-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि सभी कोशिकाओं को संस्कृति पकवान की सतह से हटा दिया जाता है।
  3. सेल निलंबन को 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कमरे के तापमान पर 15 एमएल शंकु नली और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं में स्थानांतरित करें।
  4. पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ट करें और कोशिकाओं को फिर से स्टेप 2.3 में, ट्राइप्सिन और अन्य संस्कृति मीडिया घटकों जैसे एंटीबायोटिक्स को हटाने के लिए।
    नोट: कैंसर सेल निलंबन में एंटीबायोटिक दवाओं जैसे ट्राइपसिन या सेल कल्चर घटकों की उपस्थिति के परिणामस्वरूप चिकन भ्रूण व्यवहार्यता में कमी आ सकती है।
  5. बर्फ-ठंडे पीबीएस के 1 मिलीएल के साथ सुपरनेट और रिसिम्प कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
  6. एक हीमोसाइटोमीटर या किसी अन्य सेल गिनती उपकरण उपलब्ध का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या गिनती।
    नोट: इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है कि प्रत्येक मेटास्टैटिक कॉलोनी को एक ही सेल द्वारा शुरू किया जाए। कोशिकाओं की गिनती करते समय सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से ट्रिप्सिनाइज्ड किया गया है और एक एकल सेल निलंबन के रूप में मौजूद है (कोई सेल झुरमुट मौजूद नहीं हैं)।
  7. नसों में (चतुर्थ) इंजेक्शन के लिए 0.5 x 106 से 1.0 x 106 कोशिकाओं/ आइस कोल्ड 1x पीबीएस का उपयोग पतला करने के लिए और/या resuspend सेल ध्यान केंद्रित । उम्मीद है कि कोशिकाओं निलंबन के लगभग 1 एमएल हर दस भ्रूण के लिए की जरूरत होगी।
    नोट: निलंबन में आवश्यक सेल निलंबन एकाग्रता मुख्य रूप से प्रयोगकर्ता अनुभव के स्तर से निर्धारित होती है। कृपया अधिक जानकारी के लिए अगला अनुभाग देखें।

3. मेटास्टैटिक कॉलोनी गठन के लिए कैंसर कोशिकाओं के नसों में इंजेक्शन

नोट: इस प्रोटोकॉल के बाद के रूप में कई के रूप में भ्रूण के एक सौ एक दिन के भीतर इंजेक्शन किया जा सकता है । आम तौर पर मेटास्टैटिक उपनिवेशों (चरण 5) को अलग करने में अधिक समय लगता है, फिर कैंसर कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए और, इसलिए, सभी चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय का अनुमान लगाने के लिए एक प्रारंभिक प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। अंतर कैंसर सेल फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करने से पशु संख्या और प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक समय को कम करने में मदद मिलती है। उदाहरण के लिए, नियंत्रण कोशिकाओं को आरएफपी (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ लेबल किया जा सकता है जबकि उत्परिवर्ती ट्यूमर कोशिकाओं को वैकल्पिक रूप से जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ लेबल किया जा सकता है। इस मामले में, प्रत्येक प्रयोग में एक अंतर्निहित नियंत्रण होता है जो अंतर-भ्रूण परिवर्तनशीलता के लिए सही होता है।

  1. चित्रा 2Bपर दिखाए गए इंजेक्शन उपकरण को इकट्ठा करें । पहले सिरिंज पर एक सुई माउंट और फिर ट्यूबिंग के 3-5 सेमी लंबे टुकड़े के साथ सिरिंज सुई का विस्तार।
  2. ठीक संदंश (~ 20-60 μL चौड़ा) का उपयोग कर बंद बोरोसिलिकेट सुई की नोक तोड़ें।
  3. कैंसर सेल निलंबन (50-200 μL) के साथ सिरिंज लोड और टयूबिंग(चित्रा 2B)में बोरोसिलिकेट सुई डालें ।
  4. सेल क्लोजिंग और हवा के बुलबुले के लिए बोरोसिलिकेट सुई का निरीक्षण करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक मेटास्टेटिक कॉलोनी एक एकल कोशिका द्वारा शुरू की जाती है, एक एकल सेल निलंबन के रूप में कोशिकाओं को इंजेक्ट करना महत्वपूर्ण है।
    नोट: कैंसर कोशिकाओं को 1-2 घंटे के भीतर PBS में कुल करने के लिए करते है और इसलिए, इंजेक्शन से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले 1 एमएल सिरिंज (बोरोसिलिकेट सुई के बिना) का उपयोग करके समय-समय पर निलंबित किया जा सकता है।
  5. यदि केशिका के भीतर सेल क्लोजिंग देखी जाती है, तो केशिका को हटा दें, कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और इसे एक नए केशिका के साथ बदलें। किसी भी बुलबुले को बाहर धकेलने के लिए प्लंजर का उपयोग करें। यदि कोई सेल क्लोजिंग या बुलबुले नहीं देखे जाते हैं तो अगले चरण में आगे बढ़ें।
  6. कवर ढक्कन निकालें और भ्रूण को स्टीरियोस्कोप के नीचे स्थानांतरित करें। कैम सतह पर इंजेक्ट किए जाने वाले उपयुक्त नस की पहचान करें। नसें और धमनियां कैम ऊतक(चित्रा 2C)के भीतर जटिल नेटवर्क बनाती हैं। नसों को उज्जवल लाल रंग से अलग किया जाता है क्योंकि वे भ्रूण तक ऑक्सीजन समृद्ध रक्त ले जाते हैं।
    नोट: सामान्य भ्रूण हेरफेर, कैंसर सेल इंजेक्शन और मेटास्टैटिक कॉलोनी उत्तेजना के लिए, 0.8x और 1.5x उद्देश्यों और दृश्य के लिए 10x आईपीस से लैस फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें। उपयोगकर्ताओं के अनुभव स्तर के आधार पर इन प्रक्रियाओं के लिए कम उन्नत माइक्रोस्कोप का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। पाठक अधिक विस्तृत सिफारिशों के लिए लेखकों से संपर्क कर सकते हैं।
  7. कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए आदर्श नस का पता लगाएं जो सामान्य रूप से बोरोसिलिकेट सुई टिप के व्यास की तुलना में केवल थोड़ा व्यापक (10-20%) है और भ्रूण और वजन पकवान दीवार के बीच बीच स्थित है। नस विभाजन के तुरंत निकट बिंदु पर इंजेक्ट करना आम तौर पर आसान होता है।
    नोट: एक बड़ी नस में इंजेक्शन आसान दिखाई दे सकता है, लेकिन अत्यधिक रक्तस्राव और भ्रूण अस्तित्व में कमी करने के लिए नेतृत्व करेंगे ।
  8. रक्त वाहिका की दीवार के खिलाफ सुई की नोक दबाएं और रक्त प्रवाह के समान दिशा में कोमल दबाव लागू करें। यदि आवश्यक हो, तो लंगर में मदद करने या इंजेक्शन दिए जा रहे पोत को स्थिर करने के लिए एक कपास झाड़ू (दूसरे हाथ में आयोजित) का उपयोग करें।
  9. धीरे से सिरिंज प्लंजर दबाना। जब कैंसर सेल निलंबन रक्त प्रवाह में प्रवेश करता है तो रक्त वाहिका के "समाशोधन" को देखकर एक सफल इंजेक्शन की कल्पना कर सकते हैं।
  10. 2-10 एस के लिए सिरिंज प्लंजर निराशाजनक जारी रखें जब तक वांछित निलंबन मात्रा नस के रक्त प्रवाह में इंजेक्ट किया जाता है। सभी एक साथ एक भ्रूण के इंजेक्शन उपयोगकर्ता के अनुभव के स्तर के आधार पर 1-10 मिनट की आवश्यकता हो सकती है । यदि इंजेक्शन साइट पर अत्यधिक रक्तस्राव या स्पष्ट तरल संचय दिखाई देता है, तो भ्रूण को त्याग दें।
    नोट: यह एक भ्रूण "अधिक सुई" करने के लिए आसान है । सामान्य विचार जो ध्यान में रखना चाहिए वह यह है कि मेटास्टैटिक कॉलोनियों को 4-5 दिनों की वृद्धि अवधि के बाद एक दूसरे को नहीं छूना चाहिए। आदर्श रूप से ~ 5-10% टर्मिनल कैम नस केशिकाओं में सफल इंजेक्शन(चित्रा 2डी,ई)के बाद उनमें स्थिर कोशिकाएं होनी चाहिए। जैसा कि चरण 2 में उल्लेख किया गया है, सेल एकाग्रता की एक श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है (0.5 x 106 - 1.0 x10 6 कोशिकाएं/ कम सांद्रता लंबे समय तक इंजेक्शन समय की आवश्यकता होगी, लेकिन सुई clogging कम हो जाएगा । उच्च सांद्रता कम इंजेक्शन समय की आवश्यकता होगी, लेकिन सुई clogging में वृद्धि होगी । एक ऑपरेटर के लिए सबसे आरामदायक है कि खोजने के लिए कई सांद्रता की कोशिश करने की सिफारिश की है। आम तौर पर, उच्च एकाग्रता (1.0 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल) इंजेक्शन समय को कम करने के लिए पसंद कियाजाता है।
  11. कैम से सुई निकालें और किसी भी रक्त या अतिरिक्त कैंसर कोशिकाओं को दूर करने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ इंजेक्शन साइट को धीरे से थपका।
  12. वजनी डिश में भ्रूण को ढक्कन से ढककर इनक्यूबेटर में इंजेक्ट किए गए चिकन भ्रूण को वापस कर दें।
  13. सभी भ्रूण इंजेक्शन हैं जब तक अगले भ्रूण के साथ प्रक्रिया दोहराएं।

4. मेटास्टेटिक कॉलोनी विकास के दौरान भ्रूण रखरखाव

  1. नेत्रहीन भ्रूण का निरीक्षण करें। यदि कोई ऐसा है जो मृत हैं, और/या बैक्टीरिया से दूषित हैं या मोल्ड उन्हें इनक्यूबेटर से हटा देते हैं, तो प्रयोगशाला निपटान प्रक्रियाओं के अनुसार उन्हें ऑटोक्लेव और त्यागें ।
    नोट: यह सिफारिश की जाती है कि मेटास्टैटिक कॉलोनी विकास के लिए हर दूसरे दिन (दिन 1, 3, 5 पोस्ट कैंसर सेल इंजेक्शन) का निरीक्षण किया जाता है। इंजेक्शन भ्रूण अनावश्यक रूप से ले जाने से बचें क्योंकि यह भ्रूण क्षति और/या मौत का कारण हो सकता है ।
  2. यदि कोशिकाएं ओवरग्रोथ प्रदर्शित करती हैं (मेटास्टैटिक उपनिवेश एक दूसरे के साथ ओवरलैप होते हैं) या सीएएम ऊतक के भीतर असमान वितरण (सीएएम सतह के छोटे उपक्षेत्र में स्थित मेटास्टैटिक उपनिवेश) उस भ्रूण को प्रयोग से हटा दें। प्रयोग से हटाने के तुरंत बाद -20 डिग्री सेल्सियस (या किसी अन्य अनुमोदित विधि) पर ठंड से त्यागे गए भ्रूण को इच्छामृत्यु दें। कैम ऊतक के भीतर व्यवहार्य मेटास्टैटिक कोशिकाओं की संख्या शुरू में (दिन 1-2) कम हो जाएगी और फिर (दिन 2-5) में वृद्धि होगी।
    नोट: कुछ भ्रूण कैंसर की कोशिकाओं को "अस्वीकार" कर सकते हैं, यानी, सभी कैंसर कोशिकाओं कैम ऊतक से गायब हो जाएगा । इन भ्रूणों को प्रयोग से हटा देना चाहिए। आम तौर पर, कैंसर सेल कालोनियों वजन पकवान खोलने के बिना फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत पारदर्शी ढक्कन के माध्यम से देखा जा सकता है ।
  3. सुनिश्चित करें कि मेटास्टैटिक उपनिवेश आकार में एक समान दिखाई देते हैं (पहले 1-3 दिन इंजेक्शन के बाद)। 4-5 पोस्ट इंजेक्शन के दिनों में आक्रामक या गैर-आक्रामक मेटास्टैटिक कॉलोनियों की पहचान करें (अधिक जानकारी के लिए धारा 5 देखें)।

5. मेटास्टेटिक कॉलोनियों का अलगाव

  1. दिन में 5 पोस्ट इंजेक्शन इनक्यूबेटर से भ्रूण को हटाने और मेटास्टेटिक कॉलोनी वितरण के लिए भ्रूण CAMs का निरीक्षण । एक समान कॉलोनी वितरण के साथ भ्रूण की पहचान करें जिसमें कॉम्पैक्ट (या पीढ़ी आक्रामक) उपनिवेश मौजूद हैं।
    नोट: चिकन भ्रूण की खेती की प्रक्रिया बाँझ नहीं है, इसलिए, सभी स्क्रीनिंग कदम अत्यधिक स्वच्छ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए भविष्य के ऊतक संस्कृति संदूषण से बचने के लिए । संदूषण यह काफी दुर्लभ है और आसानी से दस्ताने और एक मुखौटा पहनने और सेल इंजेक्शन और कॉलोनी अलगाव प्रक्रियाओं के दौरान केवल बाँझ उपकरणों का उपयोग करके बचा जा सकता है। परिवेश प्रयोगशाला के तापमान के संपर्क में कमी लाने और संदूषण को रोकने के लिए एक-एक करके भ्रूण का निरीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
  2. रुचि की मेटास्टैटिक कॉलोनी का पता लगाएं। एक कॉम्पैक्ट कॉलोनी को सीएएम ऊतक में सीमित क्षेत्र के भीतर स्थित अधिकांश कैंसर कोशिकाओं के साथ वर्णित किया जा सकता है (कोशिकाएं "एक साथ झुरमुट" दिखाई देती हैं)। एक आक्रामक कॉलोनी को कॉलोनी के रूप में वर्णित किया जा सकता है जहां कैम ऊतक(चित्रा 3 ए,बी)में कैंसर कोशिकाएं "तितर-बितर" होती हैं।
    नोट: मेटास्टैटिक कॉलोनी के "कॉम्पैक्टनेस" को कैंसर सेल आक्रमण के अवरोध, कैंसर सेल प्रसार के अवरोध, या दोनों द्वारा समझाया जा सकता है। सभी परिदृश्यों पर ध्यान दिया जाना चाहिए और संपर्क उपनिवेशों को अलग किया जाना चाहिए(चित्र 3 ए,बी)। कॉम्पैक्ट और इनवेसिव मेटास्टैटिक कॉलोनी फेनोटाइप के बीच भेदभाव करने के लिए एक साधारण फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है।
  3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत धीरे से कैम ऊतक है कि ब्याज की मेटास्टैटिक कॉलोनी ठीक संदंश(चित्रा 3C)का उपयोग कर ऊपर की ओर खींच ।
  4. सर्जिकल कैंची का उपयोग कर मेटास्टैटिक कॉलोनी में शामिल सीएएम ऊतक को काट लें।
  5. कैम ऊतक को स्थानांतरित करें जिसमें मेटास्टैटिक कॉलोनी को एक खाली, बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब (बर्फ पर) में शामिल किया गया है और ट्यूब ढक्कन को बंद करें।
    नोट: अलग कालोनियों व्यवहार्यता के नुकसान के बिना 3 घंटे तक के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है ।
  6. जब तक ब्याज की सभी उपनिवेशों को अलग-अलग ट्यूबों में एकत्र नहीं किया जाता है तब तक एक्सिसेशन प्रक्रिया दोहराएं। पशुओं की पीड़ा से बचने के लिए एक भ्रूण से 2-3 कॉलोनियों से ज्यादा एक्साइज न करें। कॉलोनी के उत्तेजन के तुरंत बाद -20 डिग्री सेल्सियस (या किसी अन्य अनुमोदित विधि) पर ठंड से भ्रूण को इच्छामृत्यु दें।
  7. धीरे से एक बाँझ 18 गेज सुई का उपयोग कर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कैम ऊतक कीमा । प्रत्येक कॉलोनी के लिए एक अलग सुई का प्रयोग करें।
  8. 1x कोलेजनेस समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. परिवेश के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं और कैम ऊतक को नीचे स्पिन करें।
  10. कोलेजनेस समाधान को एस्पिरेट करें और रुचि की सेल लाइन के लिए उपयोग किए जाने वाले पूर्ण मीडिया में कोशिकाओं को पुन: र्इंभरता है।
    नोट: आम तौर पर कैम ऊतक कोलेजनस उपचार के बाद पूरी तरह से अलग नहीं होता है और कैंसर कोशिकाएं पहले कैम ऊतक के टुकड़ों के भीतर पैदा होंगी और केवल बाद में ऊतक संस्कृति पकवान पर प्रवास करेंगी।
  11. परिवेश के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं और कैम ऊतक को फिर से स्पिन करें।
  12. पूर्ण मीडिया प्लस चयन कारक (यदि कोई हो) के 1 मिलील में कोशिकाओं और कैम ऊतक टुकड़ों को फिर से उठाया जाता है, फिर एकल 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति पकवान में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
    नोट: चिकन कैम फाइब्रोब्लास्ट क्लोनल विस्तार को बाधित करने वाले कई मार्गों के लिए ऊतक संस्कृति में बने रह सकते हैं। चयन कारक की उपस्थिति में मेटास्टैटिक उपनिवेशों का विस्तार करने की क्षमता (यानी, यदि कैंसर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट को प्रस्तुत करने के लिए उपयोग किया जाने वाला वेक्टर भी स्तनधारी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को एन्कोड करता है) क्लोनल विस्तार को बहुत गति दे सकता है। स्क्रीनिंग से पहले एक किल वक्र प्रयोग किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एंटीबायोटिक की उचित एकाग्रता का उपयोग किया जाए।
  13. अगले 1-3 हफ्तों के लिए विकास और प्रदूषण के लिए दैनिक कैंसर कोशिकाओं की निगरानी।
  14. जब कोशिकाएं एक बड़ी मात्रा संस्कृति पकवान में 70-80% कन्फ्यूशियस ट्रांसफर कोशिकाओं तक पहुंचती हैं।
    नोट: कोशिकाओं का विस्तार करने की सिफारिश की जाती है जब तक कि प्रत्येक क्लोन की कम से कम दो क्रायोजेनिक शीशियों को फ्रीज नहीं किया जा सकता है। ऊतक संस्कृति की बड़ी मात्रा को बनाए रखना श्रमसाध्य और अनावश्यक हो सकता है।
  15. जैसे ही पर्याप्त कैंसर सेल संख्या तक पहुंच जाती है, अनुक्रमण या चयन के अगले दौर में आगे बढ़ें। आम तौर पर, कैंसर कोशिकाओं के 1 x10 6 आधुनिक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों के लिए पर्याप्त हैं।
  16. क्लोन पुनर्जेक्शन और इमेजिंग और कॉलोनी कॉम्पैक्टनेस या कैंसर सेल-ब्लड वेसल कॉन्टैक्ट(चित्रा 2 ए)के परिमाणीकरण के लिए आगे बढ़ें । वैकल्पिक रूप से उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ें या कॉलोनी चयन को दोहराएं।
    नोट: झूठी सकारात्मक की संख्या को कम करने के लिए चयन के कम से कम दो दौर की सिफारिश की है। दो दृष्टिकोणों को सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है । 1) कॉलोनी फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक क्लोन का विस्तार करें और व्यक्तिगत रूप से पुनर्जेक्ट करें। 2) एक 1:1 अनुपात प्रत्येक में सभी विस्तारित क्लोन मिश्रण, एक मिश्रण के रूप में फिर से इंजेक्ट और चयन चक्र दोहराने ।

6. कैम वेक्यूलेचर में फ्लोरोसेंटी टैग किए गए लेक्टिन का इंजेक्शन।

  1. इंजेक्शन लगाने के लिए नस की पहचान करें। ट्यूमर सेल इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल की जाने वाली लेक्टिन के लिए एक ही इंजेक्शन साइट का इस्तेमाल करना आसान है।
  2. तनु फ्लोरोसेंट लेक्टिन स्टॉक समाधान (5 मिलीग्राम/एमएल) 1x पीबीएस के साथ 50-100x और कैंसर सेल इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल के रूप में एक ही इंजेक्शन उपकरण में लोड ।
    नोट: रक्त वाहिका दृश्य के लिए इंजेक्शन (सामान्य रूप से 20-100 μL) की आवश्यकता वाले लेक्टिन की मात्रा माइक्रोस्कोप संवेदनशीलता पर निर्भर है और स्क्रीनिंग से पहले प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित की जानी चाहिए।
  3. ट्यूमर सेल इंजेक्शन के लिए एक ही तकनीक का उपयोग कर लेक्टिन इंजेक्ट (चरण 3.6.-3.10 देखें.) ।
  4. लेक्टिन इंजेक्शन के बाद भ्रूण को 5 मिनट तक ठीक करने के लिए इनक्यूबेटर में रखें। एक समय में केवल एक भ्रूण इंजेक्ट करें और भ्रूण को इमेजिंग करने से तुरंत पहले।
    नोट। भ्रूण है कि 12 दिन या पुराने आम तौर पर लेक्टिन इंजेक्शन से अच्छी तरह से ठीक हो रहे है और अनुक्रमिक इमेजिंग के लिए अगले दिन फिर से लेक्टिन के साथ फिर से इंजेक्ट किया जा सकता है । युवा भ्रूण अधिक संवेदनशील होते हैं और रक्त जमावट प्रदर्शित कर सकते हैं।

7. कैंसर सेल-रक्त वाहिका संपर्कों का दृश्य

  1. इमेजिंग से पहले तापमान-विनियमित माइक्रोस्कोप बाड़े को लगभग 6 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। यह माइक्रोस्कोप तापमान को स्थिर करेगा और इमेजिंग के दौरान XYZ बहाव को कम करने में मदद करेगा।
    नोट। इस प्रयोग के लिए एक विशेष चिकन भ्रूण इमेजिंग कक्ष9,10,11,12,13 का उपयोग किया गया था। कैंसर सेल इंजेक्शन से लेकर क्लोन चयन और क्लोन पुनर्जेक्शन, और कॉलोनी कॉम्पैक्टनेस के मूल्यांकन के लिए शुरू होने वाले सभी चरणों के लिए एक साधारण फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप जो इमेजिंग चैंबर से लैस है, कैंसर सेल-ब्लड वेसल संपर्कों की इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के लिए आवश्यक है। 1 घंटे तक के लिए कोई हीटिंग आवश्यक नहीं है और आम तौर पर भ्रूण कम से कम दो अनुक्रमिक इमेजिंग सत्र जीवित रहते हैं जिसमें उनकी व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।
  2. सुनिश्चित करें कि आवश्यक उद्देश्य लेंस (20x या 25x पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस की सिफारिश की है) स्थापित किया गया है।
  3. कवरस्लिप के साथ एक सुरक्षित सील बनाने के लिए इमेजिंग चैंबर ढक्कन के नीचे वैक्यूम तेल की एक पतली परत लागू करें।
  4. धीरे-धीरे ढक्कन में एक कवरलिप की स्थिति और किसी भी अतिरिक्त वैक्यूम तेल को मिटा दें।
  5. लेक्टिन इंजेक्शन वाले भ्रूण को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और जरूरत पड़ने पर वजनी डिश के रिम्स को काट लें।
  6. कवरस्लिप के साथ इमेजिंग कक्ष में भ्रूण की स्थिति सीधे कैम के क्षेत्र पर कम हो जाती है जहां ब्याज की मेटास्टैटिक उपनिवेश स्थित हैं। धीरे-धीरे भ्रूण पर ढक्कन कम जब तक कवरस्लिप सिर्फ कैम संपर्क करता है। जगह में ढक्कन सुरक्षित करने के लिए शिकंजा कस, सुनिश्चित करें कि ढक्कन समतल है और यह कि कवरलिप कैम पर कोई नीचे दबाव नहीं डाल रहा है ।
  7. कई (5-10) भ्रूण से नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों (10-20) से कई, यादृच्छिक कालोनियों की छवियों को प्राप्त करें।
    नोट। प्रत्येक क्षेत्र से यादृच्छिक 3डी स्टैक (1-5um Z-steps; 50-100um रेंज; 25x) प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है।
  8. उपलब्ध होने पर माइक्रोस्कोप एक्विजिशन सॉफ्टवेयर में फील्ड-सिलाई विकल्प का इस्तेमाल करें। चूंकि मात्राकरण के लिए उपयोग की जाने वाली छवियां प्रकाशन गुणवत्ता नहीं होंगी, इसलिए यदि उपलब्ध हो तो गूंजने वाली स्कैनिंग जैसे तेज़ अधिग्रहण मोड का उपयोग करें। 5-10 माइक्रोन जेड-स्टेप, 100 माइक्रोन कुल रेंज के साथ 25x उद्देश्य और 3 x 3 सिलाई का उपयोग करें। छवि कम से कम 100 कोशिकाओं (~ 20 कालोनियों) प्रति शर्त।

8. कैंसर सेल रक्त वाहिका संपर्कों का मात्राकरण

  1. आवश्यक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जेड-स्टैक के रूप में 3डी फ़ाइल खोलें।
    नोट। कैंसर सेल-ब्लड वेसल संपर्क की मात्रा निर्धारित करने के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाना चाहिए। कई सॉफ्टवेयर पैकेज जो 3डी इमेज एनालिसिस में सक्षम हैं, उपलब्ध हैं। कृपया अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. यदि छवि अधिग्रहण के दौरान महत्वपूर्ण XY आंदोलन हुआ, तो इमेजजे स्टैकरेग प्लगइन (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg) का उपयोग करके जेड-स्टैक को संरेखित करें।
  3. ब्याज की कोशिका (एस) का पता लगाएं।
  4. जेड दिशा में XYZ छवि के माध्यम से स्क्रॉल करें और ऑप्टिकल अनुभाग की पहचान करें जिसमें ब्याज की कोशिका(चित्रा 2E)के लिए कैंसर सेल रक्त वाहिका संपर्क की अधिकतम लंबाई शामिल है।
  5. "मैनुअल लंबाई माप समारोह" का उपयोग करके कैंसर सेल-रक्त वाहिका संपर्क को मापें।
  6. माप को डेटा सॉफ्टवेयर पैकेज में दर्ज करें जिसका उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया जाता है।
    नोट: कैंसर कोशिकाओं की क्षमता रक्त वाहिकाओं को संलग्न करने के लिए या तो कैंसर सेल की लंबाई के रूप में मापा जा सकता है रक्त वाहिका संपर्क या विशेष कैंसर सेल क्लोन (या दोनों) के लिए वाक्यूलेचर के साथ संपर्क में कोशिका का प्रतिशत ।
  7. ब्याज की अगली सेल में आगे बढ़ें।
  8. उत्परिवर्ती क्लोन (एस) की तुलना करने और डेटासेट को नियंत्रित करने के लिए सांख्यिकीय महत्व के लिए डेटा का विश्लेषण करें।

9. कॉलोनी कॉम्पैक्टनेस क्वांटिफिकेशन

  1. चरण 2 में एक ही तकनीक का उपयोग करके विस्तारित क्लोन से कोशिकाओं को फिर से इंजेक्ट करें।
  2. पांच दिन के बाद इंजेक्शन प्रत्येक क्लोन के लिए 10-50 यादृच्छिक मेटास्टेटिक कॉलोनियों की छवियों का अधिग्रहण।
    नोट: मेटास्टैटिक कॉलोनी कॉम्पैक्टनेस क्वांटिफिकेशन के लिए कोई उच्च गुणवत्ता वाली छवियां आवश्यक नहीं हैं। मोनोक्रोमेटिक, स्टीरियो माइक्रोस्कोप (10x आवर्धन) छवियां पर्याप्त हैं। छवि की चमक पर ध्यान दिया जाना चाहिए (कॉलोनी के भीतर अधिकांश कोशिकाओं को देखा जाना चाहिए) और इसके विपरीत (एक या दो कोशिकाओं के बीच अंतर)।
  3. कॉलोनी छवि को डिजिटल रूप से अलग करें (चित्रा 2C,Dदेखें) और स्टैंड-अलोन कॉलोनी कॉम्पैक्टनेस क्वांटिफिकेशन मॉड्यूल या ब्लाइंड स्कोरिंग13का उपयोग करके कॉलोनी कॉम्पैक्टनेस क्वांटिफिकेशन के लिए आगे बढ़ें।
  4. ब्याज की अगली कॉलोनी में आगे बढ़ें।
  5. उत्परिवर्ती क्लोन (एस) और नियंत्रण (यानी हाथापाई shRNA) डेटासेट की तुलना सांख्यिकीय महत्व के लिए डेटा का विश्लेषण करें ।

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Representative Results

कैंसर सेल इंजेक्शन को सफल माना जाता है यदि केशिकाओं में दर्ज की गई अधिकांश कोशिकाएं एकल होती हैं और एक दूसरे (~ 0.05-0.1 सेमी) से महत्वपूर्ण अंतर पर स्थित होती हैं, इसलिए कालोनियों इनक्यूबेशन अवधि(चित्रा 3 ए)के 5-6 दिनों के बाद ओवरलैप नहीं होगा। इंजेक्शन सफल नहीं था अगर कैंसर की कोशिकाओं का एक buildup केशिकाओं के अधिकांश में देखा जा सकता है, यह प्रदर्शित भ्रूण(चित्रा 2E)खारिज कर दिया जाना चाहिए । इंजेक्शन कैंसर कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या इंजेक्शन के 24 घंटे के भीतर नष्ट कुछ भ्रूण बनाने के लिए सभी कैंसर की कोशिकाओं को अस्वीकार दिखाई देते हैं । कैंसर सेल अस्तित्व स्थानीय अंडा आपूर्तिकर्ता के आधार पर भिन्न होगा (यानी, इंजेक्शन लगाए जाने वाली कोशिकाओं की मात्रा भिन्न हो सकती है) और हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले इष्टतम इंजेक्शन की स्थिति (कैंसर सेल एकाग्रता बनाम इंजेक्शन अवधि) निर्धारित की जाती है। हम 0.5 x 106 से 1.0 x 106 कोशिकाओं/ जब इष्टतम कोशिका एकाग्रता और इंजेक्शन की अवधि प्राप्त की जाती है, तो दिन 5 पोस्ट इंजेक्शन ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं को सीएएम ऊतक(चित्रा 3 ए)में बिखरे हुए कैंसर कोशिकाओं द्वारा निर्धारित अधिकांश उपनिवेशों के साथ विभिन्न प्रकार की कॉलोनी फेनोटाइप का उत्पादन करना चाहिए। ध्यान मेटास्टैटिक कालोनियों पर दिया जाना चाहिए जो "कॉम्पैक्ट" दिखाई देते हैं और पड़ोसी उपनिवेशों से काफी दूर स्थित हैं कि उन्हें कैम ऊतक(चित्रा 3सी)के एक टुकड़े में संदंश और कैंची के साथ उत्पादित किया जा सकता है। एक अलग सकारात्मक स्क्रीन हिट (यानी, एक कॉम्पैक्ट कॉलोनी) को पुनर्जेक्शन(चित्रा 3B)पर कॉम्पैक्ट कॉलोनी फेनोटाइप प्रदर्शित करना चाहिए। सेल अस्तित्व (या कॉलोनी के भीतर सेल प्रसार दर) में कमी भी देखी जा सकती है। इसलिए, यह संभव है कि पर्याप्त कॉलोनी नंबर प्राप्त करने के लिए कुछ सकारात्मक स्क्रीन हिट के लिए उच्च सेल नंबर इंजेक्ट करने की आवश्यकता होगी। कैंसर सेल के माप के लिए-रक्त वाहिका संपर्कों पर ध्यान संवहनी दीवार दाग चमक (फ्लोरोसेंट लेक्टिन) के लिए भुगतान किया जाना चाहिए; चित्रा 3 डी,ई)और लेक्टिन की उचित मात्रा उज्ज्वल/कंट्रास्ट वैस्कुलर वॉल सिग्नल के लिए इंजेक्ट की जानी चाहिए । माइक्रोस्कोप-सॉफ्टवेयर अंशांकन किए जाने के बाद क्वांटिफिकेशन चरणों के दौरान किसी भी उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:चिकन भ्रूण खोल-कम संस्कृति अवलोकन। (A)खोल-विहीन संस्कृति के लिए तैयार ढक्कन के साथ एक वजनी पकवान । तीर कट कोने की ओर इशारा करता है। (ख)प्रवाह हुड में पंक्तियों में व्यवस्थित व्यंजन तौलते हैं। (ग)एक इलेक्ट्रिक रोटरी उपकरण के साथ एक अंडे का शंख काटना। (घ)एक अंडे को वजनी डिश में क्रैक करना। (ई)भ्रूण आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत । स्केल बार = 1 सेमी (ए-डी) या 5 सेमी (ई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:कैंसर सेल इंजेक्शन और मेटास्टैटिक कॉलोनी अलगाव की रूपरेखा। (ए)फ्लोचार्ट चिकन भ्रूण स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म चरणों को रेखांकित करता है। 10स्टीरियो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप स्टेज पर स्थापित कैंसर सेल इंजेक्शन। (ग)कैम वेक्यूलेचर में कैंसर कोशिकाओं का इंजेक्शन। (घ)सफल कैंसर सेल इंजेक्शन (स्वीकार्य कैंसर सेल घनत्व) दिखा छवि, इंजेक्शन के तुरंत बाद लिया । (ई)छवि खराब कैंसर सेल इंजेक्शन दिखा, एक से अधिक इंजेक्शन भ्रूण के रूप में देखा । नोट कैंसर सेल रक्त केशिकाओं (सफेद तीर) में निर्माण। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (A)विषम (पुस्तकालय ट्रांसड्यूडेड कैंसर सेल लाइन HEp3 कोशिकाओं), 5 दिनों के बाद इंजेक्शन द्वारा गठित मेटास्टैटिक कालोनियों । लाल तीर कॉम्पैक्ट कॉलोनी (संभावित सकारात्मक हिट) को दिखाता है जिसे उत्पादित किया जाना चाहिए। (ख)इंजेक्शन के बाद अलग स्क्रीन हिट(KIF3B)में से एक द्वारा गठित मेटास्टैटिक कालोनियों, 5 दिनों के बाद इंजेक्शन । इनसेट धराशायी चौकों से मेटास्टैटिक कॉलोनी छवियों को डिजिटल रूप से काटते हुए दिखाते हैं। यह C.I quantification के लिए स्वीकार्य छवि गुणवत्ता है। हिट पुनर्जेक्शन(KIF3B)के लिए औसत C.I. मूल्य दिखाया गया है। (ग)सीएएम टिश्यू से रुचि की मेटास्टैटिक कॉलोनी का अलगाव। (D)एक नियंत्रण कॉलोनी के प्रतिनिधि ऑप्टिकल खंडों, और(ई)एक KIF3B shRNA ओवरएक्सप्रेसिंग कॉलोनी, दोनों कैंसर सेल-रक्त वाहिका संपर्क माप दिखा । कैम वैक्यूलेचर फ्लोरोसेंट लेक्टिन-649 के साथ लेबल किया गया है। स्केल बार = 1 सेमी (ए-सी) या 50 माइक्रोन (डी, ई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम एक तेजी से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित इंट्राविटल स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग आनुवंशिक या दवा उम्मीदवार स्क्रीन जैसे महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। कैंसर कोशिकाओं है कि ब्याज की एक आनुवंशिक पुस्तकालय के साथ स्थानांतरित किया गया है या व्यक्तिगत अभिव्यक्ति के निर्माण के साथ संक्रमित तेजी से जांच की जा सकती है और इस लड़की कैम मॉडल का उपयोग कर ब्याज की फेनोटाइप के रूप में मात्रा निर्धारित । चूंकि ट्रांसडक्शन या ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल काफी भिन्न होते हैं, पुस्तकालय प्रकार के आधार पर, उन्हें इस प्रक्रिया में शामिल नहीं किया जाता है। फेनोटाइपिकल रूप से प्रासंगिक मेटास्टैटिक उपनिवेशों को सीएएम से उत्पादित किया जाता है, विस्तारित किया जाता है, और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए अलग डीएनए को ब्याज की अभिव्यक्ति के निर्माण की पहचान करने के लिए अलग किया जाता है। आम तौर पर, प्रत्येक आनुवंशिक पुस्तकालय प्राइमर दृश्यों और जीनोमिक डीएनए शुद्धिकरण के अनुशंसित तरीकों से सुसज्जित है। हम सर्वोत्तम उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण परिणामों के लिए स्थानीय सुविधा दिशानिर्देशों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

स्क्रीनिंग से पहले पुस्तकालय और सेल लाइन के लिए संक्रमण की इष्टतम बहुलता (M.O.I.) निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है। आदर्श रूप से प्रत्येक कोशिका (और इसलिए भविष्य मेटास्टेटिक कॉलोनी) में केवल एक जीन अभिव्यक्ति का निर्माण होना चाहिए, हालांकि हमारे अनुभव में जो हमेशा प्राप्त नहीं होता है। हम पुस्तकालय निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करने और 1 के करीब प्राप्त करने के लिए M.O.I. (0.01-5) की एक विस्तृत श्रृंखला का परीक्षण करने की सलाह देते हैं। प्रत्येक मेटास्टैटिक कॉलोनी के भीतर कई पुस्तकालय अभिव्यक्ति निर्माण की उपस्थिति कॉलोनी फेनोटाइप विश्लेषण को काफी जटिल बना सकती है। हम लाइब्रेरी निर्माता का उपयोग करने की भी सलाह देते हैं जो आपके प्रयोगों में नकारात्मक नियंत्रण की आपूर्ति करता है (यानी वेक्टर को व्यक्त करने वाली हाथापाई शर्ना जिसे फ्लोरोसेंटली टैग किया गया है)।

हमारा स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल गैर-इनवेसिव फ्लोरोसेंट कॉलोनियों के चयन पर आधारित है; यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली सभी सेल लाइनों में समान फ्लोरेसेंस तीव्रता हो। कोशिकाओं (और मेटास्टैटिक उपनिवेशों) के बीच असमान फ्लोरेसेंस तीव्रता के परिणामस्वरूप आक्रामकता के बजाय सेल या कॉलोनी की चमक के कारण पक्षपातपूर्ण कॉलोनी चयन हो सकता है।

मौजूदा तरीकों की तुलना में हमारा प्रोटोकॉल कई अनूठे फायदे प्रदान करता है जैसे अत्याधुनिक इमेजिंग उपकरण12,13,14की आवश्यकता के बिना इंट्राविटल स्क्रीन चक्र को पूरा करने कीगति,कम लागत और क्षमता। इसके अलावा, पूरे स्क्रीनिंग चक्र को सेल इंजेक्शन से अनुक्रमण चरण तक 3 से 6 सप्ताह के साथ पूरा किया जा सकता है। कैंसर सेल इंजेक्शन या मेटास्टैटिक कॉलोनी अलगाव के लिए कोई उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप की आवश्यकता नहीं है क्योंकि इन चरणों को अधिकांश शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध बुनियादी फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है। अंत में, क्योंकि खोल कम भ्रूण संस्कृति पूरी तरह से आत्म निरंतर है वहां जटिल अनुसंधान पशु आवास या खिला कार्यक्रम के लिए कोई ज़रूरत नहीं है । अधिकांश शोध संस्थान चिकन भ्रूण को जीवित जानवर नहीं मानते हैं जो इस मॉडल से जुड़े लागत और प्रलेखन बोझ को काफी कम कर देते हैं।

हालांकि, शेल-लेस भ्रूण मॉडल से जुड़ी कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, नहीं सभी कैंसर सेल लाइनों इस मॉडल में कुशलता से काम करते हैं । हमारी प्रयोगशाला में हम नियमित रूप से HT1080 (मानव फाइब्रोसारकोमा), HEp3 (सिर और गर्दन) और माउस b16 मेलानोमा और 4T1 स्तन कैंसर सेल लाइनों के रूप में कई कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करते हैं, जो चिकन कैम वेक्यूलेचर में इंजेक्शन लगाने पर मेटास्टेटिक उपनिवेशों को मजबूती से बनाते हैं। स्तन (एमडीए 468), मस्तिष्क (U87 और U118) या अंडाशय (A2780s) जैसे विभिन्न कैंसर प्रकारों वाली अन्य कोशिका रेखाएं कैम में इंजेक्शन दिए जाने पर मेटास्टैटिक कॉलोनियों को आसानी से बनाती हैं और इसलिए इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में12,14,15का उपयोग किया जा सकता है। फिर भी, हमारे अनुभव में आमतौर पर इस्तेमाल किया कैंसर सेल लाइनों जैसे LnCaP और PC3 इस मॉडल (अप्रकाशित टिप्पणियों) में अच्छा प्रदर्शन नहीं करते हैं । एक और सीमा यह है कि 100 से 200 माइक्रोन इमेजिंग रेंज वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए आवश्यक है, जैसे कैंसर सेल रक्त वाहिका संपर्कों का दृश्य, यह उपकरण कई शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक तेजी से इंट्राविटल स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म का वर्णन करता है जिसका उपयोग कैंसर मेटास्टेसिस दमन और ड्राइवरों की खोज के लिए किया जा सकता है। हम दृढ़ता से विश्वास है कि मजबूती और इस मॉडल के आसानी से उपयोग प्रकृति यह कई शोधकर्ताओं के लिए एक आवश्यक स्क्रीनिंग मॉडल बना देगा ।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ नहीं ।

Acknowledgments

इस काम को कनाडा के कैंसर सोसायटी रिसर्च इंस्टीट्यूट ग्रांट #702849 ने जेडीएल और केएस को सपोर्ट किया । डॉ लुईस प्रोस्टेट कैंसर अलबर्टा कैंसर फाउंडेशन द्वारा समर्थित अनुसंधान में फ्रैंक और कार्ला Sojonky कुर्सी रखती है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL disposable syringes BD BD309659
15 mL conical centrifuge tubes. Corning CLS430791-500EA
18 gauge x 1 1/2  BD precision needle BD BD305196 we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred
2.5% Trypsin solution many sources are available
4T1 mouse breast cancer ATCC CRL-2539
B16F10 mouse melanoma cell line ATCC CRL-6475
Benchtop centrifuge. many sources are available Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable
Circular coverslips, 22 mm. Fisher Scientific 12-545-101
Collagenase Sigma C0130-100MG
Confocal microscope We use Nikon A1r
cotton swabs many sources are available must be sterilized before use
Culture media appropriate for the cell lines used many sources are available We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media
Egg incubator many sources are available An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or  Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
eppendor tubes , 1.5ml Sigma T4816-250EA
Fertilized White Leghorn eggs any local supplyer
fine forceps many sources are available must be sterilized begfore use
Hemocytometer  Millipore-Sigma MDH-4N1-50PK
HT1080 human fibrosarcoma cell line ATCC CCL-121
Image analysis software We use Nikon Elements
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine  Vector Laboratories RL-1042, FL-1041 Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening
MDA-MB-468 human breast cancer ATCC HTB-132
PBS (1x) many sources are available
Plastic weighting dishes  Simport CA11006-614 dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available
small surgical scissors  many sources are available must be sterilized before use
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length  Sutter Instrument BF100-58-10
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes).  VWR  CA25378-115  dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available
Stereo fluorescent microscope  We use Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603 laboratory tubing Cole-Parmer AAC00001 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness
U-118 MG human glioblastoma ATCC HTB-15
U-87 MG human glioblastoma ATCC HTB-14
Vertical pipette puller  many sources are available we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720

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References

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Stoletov, K., Willetts, L., Beatty, P. H., Lewis, J. D. Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model. J. Vis. Exp. (168), e62077, doi:10.3791/62077 (2021).

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