Summary
Dette er en effektiv metode for å screene for undertrykkere eller drivere av kreftmetastase. Celler, transdusert med et uttrykksbibliotek, injiseres i kylling chorioallantoic membrane vaskulaturen for å danne metastatiske kolonier. Kolonier som har redusert eller økt invasivitet, blir utskilt, utvidet, reinjisert for å bekrefte fenotypen, og til slutt analysert ved hjelp av høy gjennomstrømningssekvensering.
Abstract
Nylige fremskritt innen kreftforskning har illustrert den svært komplekse karakteren av kreftmetastase. Flere gener eller gennettverk har vist seg å være involvert i differensialregulering av kreftmetastatiske kaskadegener og genprodukter avhengig av krefttype, vev og individuelle pasientkarakteristikker. Disse representerer potensielt viktige mål for genetiske terapeutiske og personlige medisintilnærminger. Utviklingen av raske screeningplattformer er avgjørende for identifisering av disse genetiske målene.
Kylling chorioallantoic membranen (CAM) er en svært vaskulær, kollagenrik membran som ligger under eggeskallet som muliggjør gassutveksling i det utviklende embryoet. På grunn av plasseringen og vaskulariseringen av CAM utviklet vi den som en intravital human kreftmetastasemodell som muliggjør robust human kreftcelle xenografting og sanntidsavbildning av kreftcelleinteraksjoner med kollagenrik matrise og vaskulatur.
Ved hjelp av denne modellen ble en kvantitativ screeningplattform designet for identifisering av nye drivere eller undertrykkere av kreftmetastase. Vi transduserte et basseng med hode- og nakke HEp3 kreftceller med et komplett humant genom shRNA genbibliotek, og injiserte deretter cellene, ved lav tetthet, i CAM-vaskulaturen. Cellene spredte seg og dannet ensvulstcellekolonier. Individuelle kolonier som ikke var i stand til å invadere inn i CAM-vevet var synlige som en kompakt kolonifenotype og utskilt for identifisering av den transinduserte shRNA som finnes i cellene. Bilder av individuelle kolonier ble evaluert for deres invasivitet. Flere runder med valg ble utført for å redusere frekvensen av falske positiver. Individuelle, isolerte kreftcellekloner eller nyutviklede kloner som uttrykker gener av interesse, ble utsatt for primær tumordannelsesanalyse eller kreftcellevaskulatur-samarbeidsanalyse. Oppsummert presenterer vi en rask screeningplattform som muliggjør antimetastatisk målidentifikasjon og intravital analyse av en dynamisk og kompleks kaskade av hendelser.
Introduction
Metastase er hovedårsaken til kreftpasientdød1,2,3. Metastatiske kreftceller bruker distinkte signalveier, avhengig av type kreft, gjennom de fem trinnene i den metastatiske kaskaden: lokal invasjon, intravasasjon, overlevelse i sirkulasjonen, ekstravasasjon og koloniutvidelse på fjerne metastatiske steder. Nåværende forståelse av denne metastatiske prosessen antyder at det er to flaskehalstrinn, en er retningsinvasjon av kreftcellen fra den primære svulsten, og den andre er etableringen av det fjerne stedet metastatisk lesjon4,5,6. Begge trinnene krever at kreftceller aktivt samhandler med kollagen og vaskulatur på steder for første invasjon eller fjern metastatisk lesjonsdannelse. Derfor må metastatiske kreftceller kunne feste seg til celler, ombygge kollagenfibre og retningsinntrenge langs vaskulære vegger7. Screeningmodeller som raskt kan identifisere antimetastatiske terapeutiske mål for å blokkere kreftceller fra å fullføre disse trinnene, er av høyeste betydning. Eksisterende in vitro screening modeller etterligner ikke fullt ut det komplekse levende vevsmiljøet. Musemodeller er kostbare og tidkrevende. Derfor er det et presserende behov for intravitale screeningplattformer som gir komplekse levende vevsmiljøer og rask identifisering av mål.
I løpet av det siste tiåret har kyllingembryoet blitt etablert som en robust og kostnadseffektiv modell for human kreftmetastase8,9,10,11,12. Kylling chorioallantoic membrane (CAM) vevet er tynt og gjennomskinnelig som gjør det ideelt for intravital mikroskopisk avbildning av celle- og koloniatferd i primærsvulst og / eller metastatiske steder12. Primær tumorvekst fra flere cellelinjer for human kreft kan initieres og metastaseres i løpet av bare flere dager etter mikroinjeksjon i CAM-vevet. Kreftceller kan administreres i CAM-vevet på flere måter, inkludert intravenøst, intra-CAM eller som kollagen onplanter, denne fleksibiliteten gjør det mulig for forskeren å fokusere på spesifikke stadier av kreftprogresjon, for eksempel metastatisk lesjonsdannelse, invasjon ut av den primære svulsten eller angiogenesen.
Her beskriver vi en kvantitativ screeningplattform som kan brukes til å måle kreftcellens evne til å etablere invasive metastatiske lesjoner. Kreftceller som har blitt transdusert med et uttrykksbibliotek injiseres intravenøst i CAM-vaskulaturen ved lav tetthet. Metastatiske kolonier dannes i 4-5 dager, deretter evalueres invasjonskapasiteten og vaskulaturinteraksjonen av de resulterende koloniene. Individuelle kolonier som ikke invaderer blir utskilt, forplantet og deres fenotype bekreftes i CAM ved reinjeksjon og kvantifisering av kolonikomprimering og kreftcelleblodkarkontakter. Uttrykksbiblioteket som er ansvarlig for den enkle metastatiske kolonimutantfenotypen, identifiseres fra isolert kolonigenomisk DNA via sekvensering med høy gjennomstrømning. Den samme plattformen kan videre brukes til å validere årsakssammenhengen mellom et gen og den observerte fenotypen eller til å utføre dyptgående mekanistiske studier på den observerte fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med regelverket og retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Alberta. Fugleembryoer anses ikke å være levende dyr av mange forskningsinstitutter, og det kreves ingen dyreprotokoller. Det er imidlertid et akseptert syn at fugleembryoer kan føle smerte og derfor må behandles så humant som mulig. Den lokale dyreforskningsmyndigheten må kontaktes før forskningsarbeid påbegynnes for å sikre at forsvarlig regelverk følges.
1. Skallfri eggkultur
- Skaff befruktede kyllingegg fra den lokale leverandøren. Dette eksperimentet bruker White Leghorn kylling rase; Imidlertid kan andre raser også brukes.
MERK: Det anbefales å skaffe 10% flere egg enn nødvendig i tilfelle noen av embryoene blir skadet under sprekkingen og ikke kan brukes i denne protokollen. - Overfør det nødvendige antall egg til en 60% fuktet gyngeinkubator. Resten av eggene kan lagres i opptil to uker ved 12 °C uten tap av levedyktighet.
- Inkuber eggene i den fuktede gyngeinkubatoren i fire dager.
MERK: Dag 1 er når eggene overføres til gyngeinkubatoren. - Forbered veieretter og plastlokk for den skallfrie eggkulturen. Klipp et av hjørnene på hver av veierettene for å gi effektiv lufttilgang til embryoet (Figur 1A).
- Ordne de tilberedte veierettene i rader i strømningshetten. (Figur 1B).
- I en separat veiefat forberede 70% etanol for egg skylling.
- Dypp kort egget i 70% etanol, og bruk deretter det elektriske roterende verktøyet til forsiktig å lage fire 2-3 mm kutt parallelt med eggets største latitudinale diameter (Figur 1C).
- Overfør det kuttede egget til en veiefat og trykk egget forsiktig mot parabolbunnen til det dannes en sprekk i eggeskallet (Figur 1D).
- Trekk eggeskallhalvdelene fra hverandre og la embryoet gli inn i veiefatet. Kast eggeskallet og dekk veiefatet med et lokk.
- Overfør embryoene til fuktet ikke-gyngende inkubator (Figur 1E).
MERK: Veieretter som inneholder embryoene plasseres i separate plastbeholdere (12 embryoer/beholder). Dette øker embryo levedyktigheten og muliggjør eksperimentspesifikk embryoorganisasjon. - Inkuber embryoer i 6 dager (til 10 dager gammel). Se etter døde eller forurensede embryoer daglig og fjern dem fra inkubatoren.
MERK: Embryoer kan forurenses av luftbårne muggsporer. Muggforurensning manifesterer seg i utgangspunktet som hvite flekker på embryoet CAM-overflaten. Fjern de forurensede embryoene umiddelbart og tørk inkubatoren med 70% etanol på ukentlig basis for å forhindre forurensning. Etter vår erfaring er forurensningsnivåene svært lave ~ 1-3%. - Bruk disse embryoene til kreftcelleinjeksjon om morgenen på dag 10.
2. Fremstilling av kreftcellene til injeksjon
MERK: Metastatisk kolonivalg er basert på en fenotype etablert av fluorescerende kreftceller, avledet fra et uttrykksbibliotek eller vektor merket med fluorescerende protein som grønt eller rødt fluorescerende protein (se hele skjermstrømmen i figur 2A). Det anbefales ikke å bruke celler transiently transfektert med fluorescerende proteiner eller merket med cellegjennomtrengelige fluorescerende fargestoffer på grunn av rask falming av signal forårsaket av kreftcelleproliferasjon og ujevn farging.
- Kultur kreftceller til 60-70% samløp på injeksjonstidspunktet. Bruk av kreftceller på høyere nivåer av samløp vil redusere deres levedyktighet, noe som resulterer i lav effektivitet av metastatisk kolonidannelse. Forsikre deg om at kreftcellene som brukes er mykoplasmafrie siden mykoplasmaforurensning kan føre til redusert levedyktighet for kyllingebryoer.
- Skyll cellene to ganger med 1x PBS pH 7.4. Fjern den gjenværende PBS, tilsett deretter 0,5% Trypsin-EDTA og inkuber ved 37 °C i 2-5 minutter til alle cellene løftes fra kulturfatoverflaten.
- Overfør cellefjæringen til 15 ml konisk rør og sentrifugeceller ved romtemperatur ved 200 x g i 5 minutter.
- Resuspend celler i 10 ml PBS til og sentrifuger cellene igjen som i trinn 2.3, for å fjerne trypsin og andre kulturmediekomponenter som antibiotika.
MERK: Tilstedeværelse av trypsin- eller cellekulturkomponenter som antibiotika i kreftcellefjæringen kan føre til redusert levedyktighet for kyllingebryoer. - Aspirer forsiktig de supernatante og resuspendcellene med 1 ml iskald PBS.
- Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer eller annet celletellingsutstyr som er tilgjengelig.
MERK: Denne screeningprotokollen krever at hver metastatiske koloni initieres av en enkelt celle. Når du teller cellene, må du sørge for at cellene er fullstendig prøvet og eksisterer som en enkelt celle suspensjon (ingen celle klumper er til stede). - For intravenøse (IV) injiseringskonsentratceller til 0,5 x 106 til 1,0 x 106 celler/ml. Bruk iskald 1x PBS til å fortynne og/eller resuspend cellekonsentrater. Forvent at ca 1 ml celler suspensjon vil være nødvendig for hver tiende embryoer.
MERK: Nødvendig cellefjæringskonsentrasjon i suspensjon bestemmes hovedsakelig av nivået av eksperimenteringserfaring. Se neste avsnitt for mer informasjon.
3. Intravenøs injeksjon av kreftceller for metastatisk kolonidannelse
MERK: Etter denne protokollen kan så mange som hundre embryoer injiseres innen en dag. Det tar vanligvis lengre tid å isolere de metastatiske koloniene (trinn 5) for deretter å injisere kreftcellene, og derfor anbefales det å utføre et innledende eksperiment for å estimere tiden som trengs for å fullføre alle trinnene. Bruk av differensialkreftcelle fluorescerende etiketter bidrar til å redusere dyretall og tiden som kreves for hvert eksperiment. For eksempel kan kontrollceller merkes med RFP (rødt fluorescerende protein) mens mutante tumorceller alternativt kan merkes med GFP (grønt fluorescerende protein). I dette tilfellet har hvert eksperiment en innebygd kontroll som korrigerer for variasjon mellom embryoer.
- Monter injeksjonsapparatet som vist på figur 2B. Monter først en kanyle på sprøyten og utvid deretter sprøytenålen med 3-5 cm langt rørstykke.
- Bryt spissen av borosilikatnålen av med de fine tangene (~ 20-60 μL bred).
- Last sprøyten med kreftcellefjæringen (50-200 μL) og sett borosilikatnålen inn i slangen (figur 2B).
- Inspiser borosilikatnålen for cellestopping og luftbobler. Det er viktig å injisere celler som en enkelt celle suspensjon for å sikre at hver metastatisk koloni er initiert av en enkelt celle.
MERK: Kreftceller har en tendens til å aggregere i PBS innen 1-2 timer etter prøvespinn, og bør derfor tilberedes umiddelbart før injeksjon. Om nødvendig kan celler resuspenderes regelmessig ved hjelp av 1 ml sprøyte som brukes til injeksjonsvæsker (uten borosilikatnålen). - Hvis celletilstopping observeres i kapillæren, fjern kapillæren, suspender cellene på nytt og erstatt den med en ny kapillær. Bruk stempelet til å skyve ut eventuelle bobler. Hvis ingen cellestopping eller bobler observeres, fortsett til neste trinn.
- Fjern deksellokket og overfør embryoet under stereoskopet. Identifiser riktig vene som skal injiseres på CAM-overflaten. Årer og arterier danner det intrikate nettverket i CAM-vevet (Figur 2C). Vener er preget av den lysere røde fargen fordi de bærer oksygenrikt blod til embryoet.
MERK: For generell embryomanipulering, kreftcelleinjeksjon og metastatisk kolonieksisjon, bruk et fluorescerende stereomikroskop utstyrt med 0,8x og 1,5x mål og 10x okularer for visualisering. Mindre avansert mikroskop kan også brukes til disse prosedyrene, avhengig av brukernes erfaringsnivå. Leserne kan kontakte forfatterne for mer detaljerte anbefalinger. - Finn den ideelle venen for å injisere celler som normalt bare er litt bredere (10-20%) enn diameteren på borosilikatnålspissen og plassert midt mellom embryoet og veiefatveggen. Det er generelt lettere å injisere på punktet rett ved siden av venbifurkasjonen.
MERK: Injeksjon i en større vene kan virke lettere, men vil føre til overdreven blødning og redusert embryooverlevelse. - Trykk nålens spiss mot blodkarveggen og påfør forsiktig trykk i samme retning som blodstrømmen. Bruk eventuelt en bomullspinne (holdt i den andre hånden) for å forankre eller stabilisere karet som injiseres.
- Trykk sprøytestempeet forsiktig ned. Man kan visualisere en vellykket injeksjon ved å observere en "rydding" av blodkaret når kreftcellesuspensjonen kommer inn i blodstrømmen.
- Fortsett å trykke sprøytestempeet i 2-10 s til ønsket suspensjonsvolum injiseres i blodstrømmen på venen. Alt i alt kan injeksjonen av et enkelt embryo kreve 1-10 min avhengig av brukerens erfaringsnivå. Hvis overdreven blødning eller klar væskeakkumulering vises på injeksjonsstedet, kast embryoet.
MERK: Det er lett å "overinjisere" et embryo. Den generelle vurderingen som bør huskes er at metastatiske kolonier ikke skal berøre hverandre etter en vekstperiode på 4-5 dager. Ideelt sett ~ 5-10% av terminal CAM vene kapillærer bør ha celler immobilisert i dem etter en vellykket injeksjon (Figur 2D, E). Som nevnt i trinn 2, kan et område med cellekonsentrasjon brukes (0,5 x 106 - 1,0 x 106 celler / ml). Lavere konsentrasjoner vil kreve lengre injeksjonstid, men vil redusere nålen tilstopping. Høyere konsentrasjoner vil kreve kortere injeksjonstider, men vil øke nålen tilstopping. Det anbefales å prøve flere konsentrasjoner for å finne den som er mest behagelig for en operatør. Generelt foretrekkes høyere konsentrasjon (1,0 x 106 celler/ml) for å redusere injeksjonstiden. - Fjern nålen fra CAM og forsiktig dab injeksjonsstedet med en bomullspinne for å fjerne blod eller overflødige kreftceller.
- Dekk embryoet i veiefatet med et lokk og returner det injiserte kyllingembryoet i inkubatoren.
- Gjenta prosedyren med neste embryo til alle embryoer injiseres.
4. Embryovedlikehold under den metastatiske koloniveksten
- Visuelt inspisere embryoene. Hvis det er noen som er døde, og / eller forurenset med bakterier eller mugg, fjern dem fra inkubatoren, autoklav og kast dem i henhold til laboratorieavhendingsprosedyrer.
MERK: Det anbefales at embryoer inspiseres annenhver dag (dag 1, 3, 5 etter kreftcelleinjeksjon) for metastatisk kolonivekst. Unngå å flytte de injiserte embryoene unødvendig siden det kan forårsake embryoskader og/eller død. - Hvis celler viser overvekst (metastatiske kolonier overlapper med hverandre) eller ujevn fordeling i CAM-vevet (metastatiske kolonier som ligger i små underområder på CAM-overflaten) fjern dette embryoet fra eksperimentet. Avlive kasserte embryoer ved frysing ved -20 °C (eller en annen godkjent metode) umiddelbart etter fjerning fra eksperimentet. Antall levedyktige metastatiske celler i CAM-vevet vil reduseres i utgangspunktet (dager 1-2) og deretter øke (dager 2-5).
MERK: Noen embryoer kan "avvise" kreftcellene, det vil si at alle kreftcellene vil forsvinne fra CAM-vevet. Disse embryoene bør fjernes fra eksperimentet. Normalt kan kreftcellekolonier ses gjennom det gjennomsiktige lokket under det fluorescerende stereomikroskopet uten å åpne veiefatet. - Sørg for at metastatiske kolonier vises ensartede i form (første 1-3 dager etter injeksjon). Identifiser invasive eller ikke-invasive metastatiske kolonier på dag 4-5 etter injeksjon (se avsnitt 5 for mer informasjon).
5. Isolering av metastatiske kolonier
- På dag 5 etter injeksjon fjern embryoer fra inkubatoren og inspiser embryo cams for metastatisk kolonifordeling. Identifiser embryoene med ensartet kolonifordeling der kompakte (eller altfor invasive) kolonier er til stede.
MERK: Prosessen med å dyrke kyllingembryoer er ikke steril, derfor må alle screeningtrinnene utføres under svært rene forhold for å unngå fremtidig vevskulturforurensning. Forurensning Det er ganske sjeldent og kan lett unngås ved å bruke hansker og en maske og bare bruke sterile verktøy under celleinjeksjon og koloniisolasjonsprosedyrer. Det anbefales å inspisere embryoer en etter en for å redusere eksponeringen for omgivelseslaboratoriets temperatur og for å forhindre forurensning. - Finn den metastatiske kolonien av interesse. En kompakt koloni kan beskrives som en med de fleste kreftcellene som ligger innenfor et begrenset område i CAM-vevet (cellene vises "klumpet sammen"). En invasiv koloni kan beskrives som koloni der kreftceller "sprer seg" i CAM-vevet (Figur 3A,B).
MERK: "Kompaktitet" av den metastatiske kolonien kan forklares enten ved hemming av kreftcelleinvasjon, hemming av kreftcelleproliferasjon eller begge deler. Alle scenarier og kontaktkolonier bør isoleres (Figur 3A, B). Et enkelt fluorescerende stereomikroskop kan brukes til å diskriminere mellom kompakte og invasive metastatiske kolonifenotyper. - Under disseksjonsmikroskopet trekker du forsiktig KAM-vevet som inneholder den metastatiske kolonien av interesse oppover ved hjelp av fine tang (Figur 3C).
- Klipp av CAM-vevet som inneholder den metastatiske kolonien ved hjelp av kirurgisk saks.
- Overfør CAM-vevet som inneholder den metastatiske kolonien til et tomt, sterilt 1,5 ml rør (på is) og lukk rørlokket.
MERK: Isolerte kolonier kan holdes på is i opptil 3 timer uten tap av levedyktighet. - Gjenta eksisjonsprosedyren til alle koloniene av interesse samles i separate rør. For å unngå dyrelidelse, ikke sluk mer enn 2-3 kolonier fra ett embryo. Avlive embryoer ved frysing ved -20 °C (eller en annen godkjent metode) umiddelbart etter kolonieksisjonen.
- Hakk CAM-vevet forsiktig i et mikrocentrifugerør ved hjelp av en steril 18 gauge nål. Bruk en separat nål for hver koloni.
- Tilsett 100 μL 1x kollagentinløsning og inkuber i 30 min ved 37 °C.
- Snurr ned cellene og CAM-vevet ved 300 x g i 5 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Aspirer kollagenoppløsningen og resuspendcellene i komplette medier som brukes til cellelinjen av interesse.
MERK: Normalt cam vev er ikke helt dissosiert etter kollagen behandling og kreftceller vil først spre seg i biter av CAM vev og først senere migrere på vev kultur parabolen. - Snurr cellene og CAM-vevet igjen ved 300 x g i 5 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Resuspend celler og CAM vev stykker i 1 ml komplette medier pluss utvalg faktor (hvis noen), deretter overføre til enkelt 12 godt vev kultur parabolen godt.
MERK: Kylling CAM fibroblaster kan vedvare i vevskultur for flere passasjer som hemmer klonal ekspansjon. Evne til å utvide de metastatiske koloniene i nærvær av seleksjonsfaktor (dvs. hvis en vektor som ble brukt til å gjengi kreftceller fluorescerende også koder et pattedyr antibiotikaresistensgen) kan i stor grad fremskynde klonisk ekspansjon. Et drapskurveeksperiment bør utføres før screening for å sikre at riktig konsentrasjon av antibiotika brukes. - I de neste 1-3 ukene overvåke kreftceller daglig for vekst og forurensning.
- Når cellene når 70-80% av samløpsoverføringscellene til en større volumkulturrett.
MERK: Det anbefales å utvide celler til minst to kryogeniske hetteglass av hver klone kan fryses. Å opprettholde store mengder vevskultur kan være arbeidskrevende og unødvendig. - Fortsett til sekvensering eller neste runde med utvelgelse så snart nok kreftcelletall er nådd. Vanligvis er 1 x 106 kreftceller tilstrekkelig for moderne sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning.
- Gå videre til klonereinfeksjon og avbildning og kvantifisering av kolonikomprimering eller kontakt med kreftcelleblodkar (figur 2A). Alternativt kan du gå videre til sekvensering av høy gjennomstrømning eller gjenta kolonivalget.
MERK: Det anbefales å redusere antall falske positiver minst to runder med valg. To tilnærminger har blitt brukt. 1) Utvid hver klone og reinject individuelt for å bekrefte kolonifenotypen. 2) Bland alle de utvidede klonene i et 1:1-forhold hver, reinject som en blanding og gjenta valgsyklusen.
6. Injeksjon av fluorescerende merkede lectins i CAM-vaskulaturen.
- Identifiser venen som skal injiseres. Det er lettere å bruke samme injeksjonssted for lectin som ble brukt til tumorcelleinjeksjon.
- Fortynn fluorescerende lectin lageroppløsning (5 mg / ml) 50-100x med 1x PBS og last den inn i samme injeksjonsapparat som brukes til kreftcelleinjeksjon.
MERK: Mengden lectin som må injiseres (normalt 20-100 μL) for visualisering av blodkar er avhengig av mikroskopfølsomhet og bør bestemmes eksperimentelt før screening. - Injiser lectin ved hjelp av samme teknikk som for tumorcelleinjeksjon (se trinn 3.6.-3.10.).
- Etter lectin injeksjon, plasser embryoet i inkubatoren for å gjenopprette i 5 min. Injiser bare ett embryo om gangen og umiddelbart før du forestiller deg embryoet.
NOTAT. Embryoer som er 12 dager eller eldre, gjenoppretter vanligvis godt fra lectin-injeksjonene og kan injiseres med lectin igjen neste dag for sekvensiell avbildning. Yngre embryoer er mer følsomme og kan vise blodkoagulasjon.
7. Visualisering av kreftcelleblodkarkontakter
- Sett det temperaturregulerte mikroskopkabinettet til 37 °C ca. 6 timer før avbildning. Dette vil stabilisere mikroskoptemperaturen og bidra til å minimere XYZ-drift under avbildning.
NOTAT. Et spesialisert kyllingembryoavbildningskammer9,10,11,12,13 ble brukt til dette eksperimentet. Et enkelt fluorescerende disseksjonsmikroskop kan brukes til alle trinnene som starter fra kreftcelleinjeksjon til klonevalg og klone reinjeksjon, og evaluering av kolonikomprimering. Et konfokalt mikroskop som er utstyrt med et bildekammer er nødvendig for avbildning og kvantifisering av kreftcelleblodkarkontakter. Ingen oppvarming er nødvendig for opptil 1 time, og generelt overlever embryoer minst to sekvensielle bildebehandlingsøkter uten innvirkning på deres levedyktighet. - Kontroller at det nødvendige objektive objektivet (20x eller 25x vann nedsenking objektiv linse anbefales) er installert.
- Påfør et tynt lag med vakuumfett på undersiden av bildekammerlokket for å skape en sikker forsegling med dekslene.
- Plasser forsiktig en deksleslipp i lokket og tørk bort overflødig vakuumfett.
- Ta det injiserte embryoet ut av inkubatoren og kutt felgene på veiefatet om nødvendig.
- Plasser embryoet i bildekammeret med dekslene senket direkte ned på CAM-området der de metastatiske koloniene av interesse ligger. Senk lokket langsomt ned på embryoet til dekslene bare kommer i kontakt med KAM-en. Stram skruene for å feste lokket på plass, sørg for at lokket er nivellert og at dekslene ikke legger noe nedadgående trykk på KAMMEN.
- Hent bilder av flere tilfeldige kolonier fra kontroll- og eksperimentelle grupper (10-20) fra flere (5-10) embryoer.
NOTAT. Det anbefales å anskaffe tilfeldige 3D-stakker (1-5um Z-trinn; 50-100um-område; 25x). - Bruk feltstingsalternativ i mikroskopanskaffelsesprogramvaren hvis tilgjengelig. Siden bilder som brukes til kvantifisering, ikke vil være publikasjonskvalitet, bruker du raske anskaffelsesmoduser som resonansskanning hvis tilgjengelig. Bruk 25x objektiv og 3 x 3 søm med 5-10 μm Z-trinn, 100 μm totalt område. Bilde minst 100 celler (~20 kolonier) per betingelse.
8. Kvantifisering av kreftcelleblodkarkontakter
- Åpne 3D-filen som en Z-stakk ved hjelp av nødvendig programvare.
NOTAT. Spesialisert programvare må brukes til å skaffe og analysere høyoppløselige bilder for å kvantifisere kreftcelle-blodkarkontakt. Flere programvarepakker som er i stand til 3D-bildeanalyse er tilgjengelige. Se Materialliste for mer informasjon. - Hvis det oppstod betydelig XY-bevegelse under bildeanskaffelsen, justerer du Z-stakken ved hjelp av Plugin-modulen ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Finn cellen(e) av interesse.
- Bla gjennom XYZ-bildet i Z-retningen og identifiser den optiske delen som inneholder den maksimale lengden på kreftcellens blodkarkontakt for cellen av interesse (Figur 2E).
- Mål kreftcelleblodkarkontakten ved hjelp av "manuell lengdemålingsfunksjon".
- Angi målene i dataprogramvarepakken som brukes til statistisk analyse.
MERK: Kreftcellens evne til å feste seg til blodårene kan måles enten som lengden på kreftcelleblodkarkontakter eller prosentandelen av cellen i kontakt med vaskulaturen for bestemt kreftcelleklone (eller begge deler). - Fortsett til neste interessecelle.
- Analyser dataene for statistisk signifikans som sammenligner mutant klone(er) og kontrolldatasett.
9. Koloni kompaktitet kvantifisering
- Sett cellene fra den utvidede klonen på nytt ved hjelp av samme teknikk som i trinn 2.
- Fem dager etter injeksjon skaffe bilder av 10-50 tilfeldige metastatiske kolonier for hver klone.
MERK: Ingen bilder av høy kvalitet er nødvendig for metastatisk kolonikompantifisering. Monokromatiske, stereomikroskopbilder (10x forstørrelse) er tilstrekkelige. Oppmerksomhet bør gis til lysstyrken i bildet (de fleste cellene i kolonien skal ses) og kontrast (forskjell mellom en eller to celler). - Isoler kolonibildet digitalt (se figur 2C,D) og fortsett til kolonikompantifisering ved hjelp av den frittstående kolonikomprimeringskvartifiseringsmodulen eller blindscoring13.
- Fortsett til neste koloni av interesse.
- Analyser dataene for statistisk signifikans som sammenligner mutant klone(er) og kontrolldatasett (dvs. scramble shRNA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kreftcelleinjeksjon anses å være vellykket hvis flertallet av cellene som ligger i kapillærene er enkle og ligger med en betydelig forskjell fra hverandre (~ 0,05-0,1 cm) slik at koloniene ikke overlapper etter 5-6 dager inkubasjonsperiode (figur 3A). Injeksjonen var ikke vellykket hvis en opphopning av kreftceller kan ses i de fleste kapillærer, embryoer som viser dette bør kastes (Figur 2E). Et betydelig antall injiserte kreftceller omkommer innen 24 timer etter injeksjon, noe som gjør at noen embryoer ser ut til å avvise alle kreftcellene. Overlevelsen av kreftceller vil variere avhengig av den lokale eggleverandøren (det vil si at mengden celler som skal injiseres kan variere), og vi anbefaler på det sterkeste at optimale injeksjonstilstander (kreftcellekonsentrasjon versus injeksjonsvarighet) bestemmes før du fortsetter med eksperimentet. Vi anbefaler cellekonsentrasjon i området mellom 0,5 x 106 til 1,0 x 106 celler/m. Når den optimale cellekonsentrasjonen og varigheten av injeksjonen oppnås, bør dagen 5 etter injeksjon transinduserte celler produsere et bredt utvalg av kolonifenotyper med de fleste koloniene som virker invasive som bestemt av kreftcellene som vises spredt i CAM-vevet (Figur 3A). Oppmerksomhet bør gis til de metastatiske koloniene som virker "kompakte" og ligger langt nok fra nærliggende kolonier at de kan utskilles med tang og saks i ett stykke CAM-vev (Figur 3C). Et isolert positivt skjermtreff (dvs. en kompakt koloni) skal vise den kompakte kolonifenotypen ved reinjeksjon (Figur 3B). En reduksjon i celleoverlevelse (eller celleproliferasjonshastighet i kolonien) kan også observeres. Derfor er det mulig at høyere celletall må injiseres for noen av de positive skjermtreffene for å oppnå nok kolonitall. For måling av kreftcelleblodkarkontaktene bør det tas hensyn til den vaskulære veggflekkens lysstyrke (fluorescerende lectin; Figur 3D,E) og riktig mengde lectin skal injiseres for det lyse/kontrastvaskulære veggsignalet. All tilgjengelig programvare for bildeanalyse kan brukes under kvantifiseringstrinnene etter at kalibrering av mikroskopprogramvare er utført.
Figur 1: Oversikt over kyllingembryoskallfri kultur. (A) En veiefat med lokk tilberedt for skallfri kultur. Pilen peker mot det kuttede hjørnet. (B) Veiing av retter ordnet i rader i strømningshetten. (C) Kutting av et eggeskall med et elektrisk roterende verktøy. (D) Sprekke et egg i en veiefat. (E) Embryoer dyrket i den fuktede inkubatoren. Skalastenger =1 cm (A-D) eller 5 cm (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Omriss av kreftcelleinjeksjon og metastatisk koloniisolasjon. (A) Flytskjema som skisserer kyllingembryoscreeningsplattformtrinnene. (B) Kreftcelleinjeksjon satt opp på stereo fluorescerende mikroskopstadium. (C) Injeksjon av kreftcellene i CAM-vaskulaturen. (D) Bilde som viser vellykket kreftcelleinjeksjon (akseptabel kreftcelletetthet), tatt umiddelbart etter injeksjon. (E) Bilde som viser dårlig kreftcelleinjeksjon, sett på som et overinjisert embryo. Legg merke til at kreftcellen bygger seg opp i blodkapilene (hvite piler). Skalastenger = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Representative resultater for ulike trinn i screeningprotokollen. (A) Metastatiske kolonier dannet av heterogene (bibliotek transduced kreft celle linje HEp3 celler), 5 dager etter injeksjon. Rød pil viser kompakt koloni (potensiell positiv hit) som bør utskilles. (B) Metastatiske kolonier dannet av en av de isolerte skjermtreffene (KIF3B) etter reinjeksjon, 5 dager etter injeksjon. Innfelt viser digitalt kutte ut metastatiske kolonibilder fra de stiplede firkantene. Dette er akseptabel bildekvalitet for C.I-kvantifisering. Gjennomsnittlig C.I.-verdi for gjeninnføring av treff (KIF3B) vises. (C) Isolering av den metastatiske kolonien av interesse fra CAM-vevet. Representative optiske seksjoner av (D) en kontrollkoloni, og (E) en KIF3B shRNA overekspresserende koloni, som begge viser kontaktmålinger for kreftcelleblodkar. CAM vaskulatur er merket med fluorescerende lectin-649. Skalastenger =1 cm (A-C) eller 50 μm (D, E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en rask fluorescensmikroskopibasert intravital screeningprotokoll som kan brukes til viktige bruksområder som genetiske eller narkotikakandidatskjermer. Kreftceller som har blitt transdusert med et genetisk bibliotek av interesse eller transfektert med individuelle uttrykkskonstruksjoner, kan raskt screenes og kvantifiseres med hensyn til fenotype av interesse ved hjelp av denne chick CAM-modellen. Siden transduksjons- eller transfeksjonsprotokoller varierer betydelig, avhengig av bibliotekstypen, er de ikke inkludert i denne prosedyren. Fenotypisk relevante metastatiske kolonier utskilles fra CAM, utvides og DNA isoleres for sekvensering med høy gjennomstrømning for å identifisere uttrykkskonstruksjonen av interesse. Generelt er hvert genetisk bibliotek utstyrt med primersekvenser og anbefalte metoder for genomisk DNA-rensing. Vi anbefaler at du bruker lokale retningslinjer for å få best mulig sekvenseringsresultat med høy gjennomstrømning.
Det anbefales å bestemme optimal multiplisitet av infeksjon (M.O.I.) for et bibliotek og en cellelinje før screening. Ideelt sett bør hver celle (og derfor fremtidig metastatisk koloni) bare inneholde en genuttrykkskonstruksjon, men i vår erfaring er det ikke alltid oppnåelig. Vi anbefaler at du følger bibliotekprodusentens protokoll og tester et bredt spekter av M.O.I. (0,01-5) for å oppnå så nær 1 som mulig. Tilstedeværelse av flere bibliotekuttrykkskonstruksjoner i hver metastatisk koloni kan komplisere kolonifenotypeanalysen betydelig. Vi anbefaler også at du bruker bibliotekprodusenten med negativ kontroll i eksperimentene dine (dvs. scramble shRNA som uttrykker vektor som er fluorescerende merket).
Vår screeningprotokoll er basert på valg av ikke-invasive fluorescerende kolonier; det er viktig å sikre at alle cellelinjer som brukes i forsøkene har lignende fluorescensintensitet. Ujevn fluorescensintensitet blant cellene (og metastatiske kolonier) kan resultere i et partisk kolonivalg på grunn av celle- eller kolonilysstyrke i stedet for invasivitet.
Sammenlignet med eksisterende metoder gir vår protokoll flere unike fordeler som hastighet, lave kostnader og evne til å fullføre den intravitale skjermsyklusen uten behov for sofistikert bildeutstyr12,13,14. I tillegg kan hele screeningsyklusen fullføres med 3 til 6 uker fra celleinjeksjonen til sekvenseringsstadiet. Ingen høyoppløselig mikroskop er nødvendig for kreftcelleinjeksjon eller metastatisk koloniisolasjon, da disse trinnene kan utføres ved hjelp av grunnleggende fluorescerende stereomikroskop som er tilgjengelig for de fleste forskere. Til slutt, fordi skallfri embryokultur er helt selvforsynt, er det ikke behov for komplisert dyrehus eller fôringsplan. De fleste forskningsinstitusjoner anser ikke kyllingembryoer som levende dyr som reduserer kostnadene og dokumentasjonsbyrden knyttet til denne modellen betydelig.
Det er imidlertid noen begrensninger knyttet til den skallløse embryomodellen. For det første fungerer ikke alle kreftcellelinjer effektivt i denne modellen. I vårt laboratorium bruker vi rutinemessig flere kreftcellelinjer, for eksempel HT1080 (human fibrosarcoma), HEp3 (hode og nakke) og mus b16 melanom og 4T1 brystkreftcellelinjer, som robust danner metastatiske kolonier når de injiseres i kylling CAM-vaskulaturen. Andre cellelinjer med forskjellige krefttyper som bryst (MDA468), hjerne (U87 og U118) eller eggstokk (A2780s) danner lett metastatiske kolonier når de injiseres i CAM og kan derfor brukes i denne screeningprotokollen også12,14,15. Likevel, etter vår erfaring utfører ofte brukte kreftcellelinjer som LnCaP og PC3 ikke bra i denne modellen (upubliserte observasjoner). En annen begrensning er at et konfokalt mikroskop med et bildeområde på 100 til 200 μm kreves for høyoppløselig avbildning, for eksempel visualisering av kreftcelleblodkarkontakter, dette utstyret er kanskje ikke tilgjengelig for mange forskere.
Til sammen beskriver denne protokollen en rask intravital screeningplattform som kan brukes til oppdagelse av kreftmetastasedempere og drivere. Vi har stor tro på at robustheten og brukervennligheten til denne modellen vil gjøre den til en viktig screeningmodell for mange forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 til JDL og KS. Dr. Lewis har Frank og Carla Sojonky Chair i Prostata Cancer Research støttet av Alberta Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).
