Summary
Ce travail présente un protocole pour explorer l’effet anti-obésité de deux plantes utilisées ensemble, pour une durée de 5 semaines. Il y avait une administration combinée de l’extrait et du haut-fat-diet (HFD) chez les souris obèses. La méthode peut promouvoir les avantages des plantes dans le traitement de l’obésité.
Abstract
Plusieurs études ont démontré que le contenu phytochimique des plantes sont des agents anti-obésité potentiels. Dans cette étude nous examinons l’effet d’utiliser une combinaison de boutons secs de Syzygium aromaticum et de graines de Cuminum cyminum (CC) sur des souris C57BL6/J induites avec l’obésité par l’intermédiaire du haut-fat-diet (HFD). Le but de cette étude est de démontrer que la méthode proposée dans l’étude a réduit l’obésité de manière significative après plusieurs semaines d’expérimentation. L’extrait des deux plantes a été extrait à l’aide d’ultrasons pour améliorer l’extraction de composés phytochimiques. Des conditions d’extraction optimales ont été obtenues avec de l’éthanol comme suit: 50:50 v /v d’eau avec une puissance ultrasonore de 300 W et un temps d’ultrasons de 30 minutes. L’administration simultanée de l’extrait de CC dans HFD pendant 5 semaines a mené à la régulation des profils lipidiques (cholestérol et triglycérides), à la réduction de la prise de nourriture, au gain de poids, au tissu adipeux et au poids de foie. Les résultats obtenus par ce modèle obèse indiquent que l’extrait de CC peut empêcher l’obésité. Par rapport à la méthode traditionnelle de 16 semaines (8 semaines pour grossir et 8 semaines pour perdre du poids), des résultats similaires ont été obtenus dans le modèle obèse de la présente étude en moins de temps d’expérimentation.
Introduction
L’accumulation excessive de graisse corporelle est une caractéristique de l’obésité. Le déséquilibre entre l’apport énergétique et la consommation conduit au stockage de l’excès d’énergie dans les adipocytes, qui est lié aux facteurs de risque métaboliques d’hyperglycémie et de résistance à l’insuline dans le diabète de type 2, l’hypertension, l’hypercholestérolémie et les maladiescardiovasculaires 1,2.
Les produits naturels avec un minimum d’effets secondaires et un faible coût ont reçu une attention accrue depuis que des études précédentes ont rapporté des composés phytochimiques bioactifs et des agents anti-obésité potentiels avec des mécanismes qui inversent ou retardent le syndrome métabolique et les pathologies associées8.
Plusieurs plantes médicinales ont été étudiées pour prévenir l’obésité et les maladies connexes. Parmi eux, Syzygium aromaticum a été étudié pour son potentiel anti-obésité dans un traitement in vitro sur des cellules 3T3-L1 et un traitement in vivo sur des souris nourries avec un régime riche en graisses11. En outre, des effets anti-surpoids significatifs ont été observés dans un essai ouvert multicentrique de Cuminum cyminum sur des sujets extrêmement obèses12. Dans cette étude, des souris C57BL6/J ont été utilisées pour étudier le modèle rapide expérimental afin d’évaluer un agent anti-obésité potentiel en utilisant une combinaison des deux plantes comestibles.
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Protocol
Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d’expérimentation animale de l’Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protocole no 2732).
1. Préparation de l’extrait de la combinaison de clous de girofle et de cumin
REMARQUE: Les plantes comestibles, Syzygium aromaticum (clou de girofle) et Cuminum cyminum (cumin) ont été achetées auprès de Central de Abastos CDMX, au Mexique.
- Broyer 500 g de graines des plantes et effectuer une extraction assistée par ultrasons. Soniquez-les (320 Watts; fréquence 24 kHz, 30 min) avec de l’éthanol: eau (60:40 v / v) à une plage de températures de 30 ± 4 ° C.13
- Filtrez les solides à l’aide de papier filtre Whatman numéro 2 sous vide et concentrez l’extrait avec un évaporateur rotatif.
- Mesurer le spectre UV-vis de l’extrait des deux plantes (CC).
2. Animaux
- Utilisez des souris C57BL6/J mâles âgées de six semaines (48 au total, poids corporel 24-29 g) pour l’étude.
- Loger les animaux en groupes de huit dans des conditions de laboratoire standard: température (20-22 ± 1 °C), humidité relative (45-54 ± 2%), éclairage (08:00-20:00 h) avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Acclimater les souris dans ces conditions pendant une semaine avant l’expérience.
3. Procédure expérimentale
- Préparez le régime riche en graisses14 comme dans le tableau 1.
- Au début du test, soumettre chacun des groupes formés (n = 8) à différents traitements: Groupe d’alimentation 1 sur un régime normal; Groupe 2, sur un régime riche en graisses; Groupe 3, sur un régime riche en graisses + 100 mg/kg d’extrait de CC; Groupe 4, sur un régime riche en graisses + 250 mg/kg d’extrait de CC; Groupe 5, sur le régime riche en graisses + 450 mg/kg d’extrait de CC ; Groupe 6, sur le régime riche en graisses + phentermine (un médicament antiobésity utilisé comme contrôle positif)15.
- Nourrissez tous les groupes de souris pendant 5 semaines et enregistrez la quantité de nourriture consommée quotidiennement.
- Dans un tube à essai avec bouchon, homogénéiser l’extrait ou le médicament avec la dose d’eau correspondant au groupe auquel le traitement est administré. Cela se fait avec vortex shaker.
- Une fois homogénéisé, ajoutez tout le traitement correspondant dans le buveur de chaque groupe.
4. Prélèvement d’échantillons
- Mesurer à la fois l’apport alimentaire et le poids corporel une fois par semaine. Jeûne les souris pendant la nuit pendant une période de 5 semaines.
- Sacrifiez-les par luxation cervicale et nécropsie.
- Une fois que les souris ont été sacrifiées, immobilisez-les en décubitus dorsal.
- À l’aide d’une pince chirurgicale propre et de ciseaux, localisez et soulevez la peau centrale près des organes génitaux et faites une petite incision de 0,2 mm.
- Insérez les ciseaux plats horizontalement dans l’incision et séparez soigneusement la peau abdominale de la paroi abdominale.
- Avec la pince, soulevez la peau centrale et avec les ciseaux chirurgicaux, coupez-la au niveau de la cage thoracique. Ensuite, coupez la peau au-dessus des deux membres postérieurs pour faciliter la collecte du tissu adipeux.
- Assurer la collecte de tout le tissu adipeux du corps par dissection émoussé avec des ciseaux et des pinces. Une fois recueilli, placez le tissu adipeux dans du papier d’aluminium. N’oubliez pas de recueillir la graisse autour des organes reproducteurs. Évitez l’accumulation de cheveux et de peau pour ne pas altérer les résultats.
- Pour accéder au tissu adipeux viscéral, coupez le muscle abdominal avec des ciseaux chirurgicaux des organes génitaux à la cage thoracique, en faisant une incision dans les muscles abdominaux des organes génitaux vers le dos de la souris.
- Effectuer une hépatectomie pour enlever 100 % du foie. Pour extérioriser le foie, retirez les organes inutiles et coupez les veines et les artères hépatiques pour séparer le foie du reste du corps. Comme dernière étape, extraire précisément la vésicule biliaire du foie16.
- Mesurer l’hypercholestérolémie (cholestérol) et l’hypertriglycéridémie (triglycérides) à l’aide de trousses d’analyse commerciales selon les indications du fabricant.
5. Analyse statistique
NOTA : Tous les résultats expérimentaux doivent être représentatifs de trois essais indépendants, exprimés en moyenne ±'écart type.
- Calculer l’erreur type à l’aide d’une analyse ANOVA à sens unique de la variance suivie du test de portée de Tukey. Considérez un P< 0,05 comme statistiquement significatif.
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Representative Results
Extraction assistée par ultrasons
La condition d’extraction optimale pour l’extraction était éthanol:eau (50:50, v/v) avec une puissance ultrasonore de 300 W et un temps d’ultrasons de 30 min. De cette façon, l’extraction était plus rapide que les méthodes d’extraction conventionnelles(tableau 2). L’extrait a montré un pic d’absorption intense à 320 nm dans les spectres UV-visibles(Figure 1).
Apport alimentaire et poids corporel
Les changements dans le poids corporel des souris étant donné différentes concentrations de l’extrait (100, 200 et 450 mg/kg) pendant 5 semaines sont représentés à la figure 2A. Les pourcentages de réduction de poids dans les groupes 3, 4 et 5 étaient de 12,2%, 30%, et 41%, respectivement. Ceci montre que le gain de poids corporel le plus bas a été observé dans tous les groupes ; cependant, le groupe de HFD a eu une augmentation de 2.1x comparé au gros groupe normal de régime. Ces données indiquent qu’un 450 mg/kg dose de CC est plus efficace que 30 mg/kg phentermine (39% réduction) dans la réduction du gain de poids corporel.
L’apport alimentaire moyen à la fin de l’expérience dans le HFD + CC (450 mg/mL) était inférieur de 31 % à celui du groupe obèse (HFD), avec une réduction de 1,3 g de l’apport alimentaire par rapport au groupe obèse(figure 2B). La prise de nourriture chez les souris HFD-alimentées était plus haute par 1,5 fois que dans le contrôle normal, ainsi elle a diminué de manière significative (P<0,05) dans tous les groupes de CC dans une gamme de 7,14% à 31%. Le taux d’efficacité de régime dans le groupe de HFD était 16%, qui était sensiblement différent (P< 0,05) de celui du groupe témoin (ND) à 11%. Ces résultats démontrent que le CC peut réduire le gain de poids corporel induit par HFD.
Tissu adipeux et poids du foie
Le poids du WAT épididymaire, de la graisse sous-cutanée et des tissus adipeux du WAT périménal était plus élevé dans le groupe HFD-, mais pas dans les groupes HFD-CC(tableau 3). Le poids du foie était sensiblement (P<0,05) diminué dans le groupe cc (100 à 450 mg/kg) avec une gamme de 15%-28,4% comparé à ceux du groupe HFD (tableau 4).
Lipides hépatiques et sérum
Les taux sériques de triacylglycérol (TG) et de cholestérol total (TC) après 5 semaines de traitement sont représentés sur les figures 3A et 3B,respectivement. Les triglycérides et le taux de cholestérol total ont été sensiblement élevés par le fois 1,32 et le fois 1,31, respectivement, dans les groupes de HFD comparés à ceux dans les groupes de ND. Les plus élevés niveaux du plasma TG et du comité technique dans le régime de HFD ont été sensiblement atténués par l’administration de 200 et de 450 extrait de CC de mg/kg/jour de 18,18% et de 22,7% pour le TG et de 16,41% et de 20,61% pour le comité technique, respectivement comparés au contrôle (ND).
Figure 1. Spectre UV-vis de clou de girofle et extrait de cumin (CC) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Effets de CC sur : (A) poids corporel (g), (B) prise de nourriture chez les souris de régime riche en graisses C57BL6/J à 4 semaines de traitement. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± et. Pour chaque groupe, n=8. Une lettre différente a montré une différence significative (p<0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Effets de CC sur: (A) Triglycérides, (B) Cholestérol total. Toutes les données expérimentales étaient des souris sd ± moyennes (n = 8). Des souris ont été traitées avec 100, 200 et 450 mg/kg de CC pour l’administration orale quotidienne avec l’alimentation simultanée de HFD pendant 5 semaines. Des lettres différentes indiquent des différences significatives entre tous les groupes (P < 05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| ingrédient | Quantité (g/kg) |
| caséine | 140 |
| L-cystéine | 1.8 |
| saindoux | 120 |
| huile de soja | 40 |
| Maltodextrine 10 | 150 |
| saccharose | 450 |
| cellulose | 50 |
| Vitamines et minéraux | Équivalent tablette |
| Choline Bitartrate | 2.5 |
Tableau 1. Régime riche en graisses pour les souris C57BL6/J.
| pouvoir | 370 watts |
| température de l’eau | 30 °C (86 °F) |
| Temps d’extraction | 30 min |
| Concentration en solvants | 50 % d’éthanol/50 % d’eau distillée |
| Nombre d’extractions | 2 extractions |
Tableau 2. Conditions ultrasonores optimales pour la préparation de l’extrait de clou de girofle et de cumin
| groupe | WAT épididymique (g) | WAT périrénal (g) | Graisse sous-cutanée (g) | Graisse/poids corporel (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1,22 ± 0,09a |
| HFD | 2,30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0,15 ± 0,04a | 6,38 ± 1,02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0,12 ± 0,02a,b | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0,11 ± 0,04a,b | 3,21 ± 0,32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2,30 ± 0,45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2,41 ± 0,18c |
Tableau 3. Effet de CC chez les souris obèses régime-induites sur le poids blanc de tissu adipeux. Chaque valeur est exprimée comme la moyenne ± et (n = 8). La lettre différente a montré la différence significative (P<0,05) contre le tissu adipeux blanc (WAT)
| groupe | Poids du foie (g) |
| Nd | 1,01 ± 0,05a |
| HFD | 1,48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1,12 ± 0,03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1,06 ± 0,06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1,08 ± 0,07a |
Tableau 4. Effet du CC chez les souris obèses induites par le régime sur le poids des tissus hépatiques. Chaque valeur est exprimée comme la moyenne ± et (n = 8). La lettre différente a montré la différence significative (P<0,05) contre le tissu adipeux blanc (WAT).
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Discussion
Dans cette étude nous avons évalué, pour la première fois, l’effet de l’administration orale d’une combinaison de clous de girofle et d’extrait de cumin (CC) sur des profils lipidiques et l’obésité chez les souris alimentées avec un régime à haute teneur en graisses pendant 5 semaines. Les résultats ont indiqué que les groupes HFD ont montré un gain de poids corporel significativement plus élevé comparé au groupe ND, qui a prouvé que l’induction de l’obésité dans le modèle obèse était réussie. La dose administrée de CC (100, 200 et 450 mg/kg/jour) a produit une réduction de l’apport alimentaire et du poids corporel. Par conséquent, la réduction de l’apport alimentaire doit être due à une diminution de l’appétit des animaux.
La réduction de la dyslipidémie est très importante pour prévenir les troubles liés à l’obésité. Dans notre étude, les niveaux de cholestérol total et les triglycérides étaient plus faibles dans le groupe CC par rapport à ceux dans les groupes HFD et phentermine utilisés comme contrôle positif. Les résultats ont suggéré que le CC puisse empêcher l’hyperlipidémie et ses complications.
Notre étude a prouvé que le groupe de HFD avait augmenté la graisse corporelle, y compris la graisse abdominale et de foie qui ont été sensiblement réduites par la supplémentation d’extrait de CC. Ceci prouve que le traitement d’extrait de CC sur les souris HFD réduit l’absorption de lipide en raison de son activité anti-adipogenic.
Dans cette étude, nous avons évalué un modèle rapide pour déterminer l’effet anti-obésité d’un extrait d’une combinaison de plantes comestibles, Syzygium aromaticum (clou de girofle) et Cuminum cyminum (cumin) sur des souris C57BL6/J, qui ont rapidement développé l’obésité avec un régime riche en graisses. Le traitement de CC a empêché de manière significative le développement de l’obésité et de l’hyperlipidémie améliorée induite par HFD donné aux souris. Dans l’ensemble, les résultats de cette recherche fournissent des preuves solides que cette méthode rapide d’une durée de 5 semaines développée dans notre laboratoire pourrait être utilisée pour évaluer si une plante a la capacité d’être un agent potentiel pour traiter l’obésité.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par l’Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
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