Summary
Este trabajo presenta un protocolo para explorar el efecto anti-obesidad de dos plantas utilizadas juntas, durante una duración de 5 semanas. Había una administración combinada del extracto y de la alto-grasa-dieta (HFD) en los ratones obesos. El método puede promover los beneficios de las plantas en el tratamiento de la obesidad.
Abstract
Varios estudios han demostrado que el contenido fitoquímico de las plantas son potenciales agentes contra la obesidad. En este estudio examinamos el efecto del uso de una combinación de botones secos de Syzygium aromaticum y semillas de Cuminum cyminum (CC) en ratones C57BL6/J inducidos con obesidad a través de dieta alta en grasas (HFD). El objetivo de este estudio es demostrar que el método propuesto en el estudio redujo significativamente la obesidad después de varias semanas de experimentación. El extracto de ambas plantas se extrajo mediante ultrasonido para mejorar la extracción de fitoquímicos. Las condiciones óptimas de extracción se obtuvieron con etanol de la siguiente manera: agua de 50:50 v / v con una potencia de ultrasonido de 300 W y tiempo de ultrasonido de 30 minutos. La administración simultánea del extracto de CC en HFD durante 5 semanas llevó a la regulación de los perfiles lipídicos (colesterol y triglicéridos), reducción de la ingesta de alimentos, aumento de peso, tejido adiposo y peso hepático. Los hallazgos obtenidos por este modelo obeso indican que el extracto del CC puede prevenir obesidad. Comparado con el método tradicional de 16 semanas (8 semanas para engordar, y 8 semanas para perder peso), se obtuvieron resultados similares en el modelo obeso del presente estudio en menos tiempo de experimentación.
Introduction
El exceso de acumulación de grasa corporal es una característica de la obesidad. El desequilibrio entre la ingesta y el consumo de energía conduce al almacenamiento del exceso de energía en los adipocitos, que se relaciona con los factores de riesgo metabólicos para la hiperglucemia y la resistencia a la insulina en la diabetes tipo 2, hipertensión, hipercolesterolemia y enfermedades cardiovasculares1,2.
Los productos naturales con efectos secundarios mínimos y de bajo costo han recibido mayor atención ya que estudios anteriores han reportado fitoquímicos bioactivos y potenciales agentes antiobesidad con mecanismos que revierten o retrasan el síndrome metabólico y las patologías asociadas8.
Varias plantas medicinales han sido estudiadas para prevenir la obesidad y enfermedades relacionadas. Entre ellos, Syzygium aromaticum ha sido investigado por su potencial contra la obesidad en el tratamiento in vitro en células 3T3-L1 y el tratamiento in vivo en ratones alimentados con una dieta alta en grasas11. Además, se observaron efectos significativos contra el sobrepeso en un ensayo abierto multicéntrico de Cuminum cyminum en sujetos extremadamente obesos12. En este estudio, los ratones de C57BL6/J fueron utilizados para investigar el modelo rápido experimental para evaluar un agente potencial de la anti-obesidad usando una combinación de ambas plantas comestibles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (IPN; Protocolo Nº 2732).
1. Preparación del extracto de la combinación de clavo y comino
NOTA: Las plantas comestibles, Syzygium aromaticum (clavo) y Cuminum cyminum (comino) fueron compradas a Central de Abastos CDMX, México.
- Moler 500 g de semillas de las plantas y realizar la extracción asistida por ultrasonidos. Sonicarlos (320 Vatios; frecuencia de 24 kHz, 30 min) con etanol: agua (60:40 v / v) en un rango de temperatura de 30 ± 4 ° C.13
- Filtre los sólidos utilizando papel de filtro Whatman número 2 al vacío y concentre el extracto con un evaporador rotatorio.
- Medir el espectro UV-vis del extracto de ambas plantas (CC).
2. Animales
- Utilice ratones machos C57BL6/J de seis semanas de edad (48 en total, peso corporal 24-29 g) para el estudio.
- Albergar a los animales en grupos de ocho en condiciones estándar de laboratorio: temperatura (20-22 ± 1 °C), humedad relativa (45-54 ± 2%), iluminación (08:00-20:00 h) con alimentos y agua ad libitum. Aclimate a los ratones en estas condiciones durante una semana antes del experimento.
3. Procedimiento Experimental
- Preparar la dieta alta en grasas14 como en la Tabla 1.
- Al inicio de la prueba, someter cada uno de los grupos formados (n = 8) a diferentes tratamientos: Grupo de alimentación 1 en una dieta normal; Grupo 2, en dieta alta en grasas; Grupo 3, en dieta alta en grasas + 100 mg/kg de extracto del CC; Grupo 4, en dieta alta en grasas + 250 mg/kg de extracto del CC; Grupo 5, en dieta alta en grasas + 450 mg/kg de extracto del CC; Grupo 6, en dieta alta en grasas + fentermina (un medicamento contra la obesidad utilizado como control positivo)15.
- Alimente a todos los grupos de ratones durante 5 semanas y registre la cantidad de alimentos consumidos diariamente.
- En un tubo de ensayo con tapón, homogeneizar el extracto o el fármaco con la dosis de agua correspondiente al grupo al que se está administrando el tratamiento. Esto se hace con agitador de vórtice.
- Una vez homogeneizado, añadir todo el tratamiento correspondiente al bebedor de cada grupo.
4. Recogida de muestras
- Mida tanto la ingesta de alimentos como el peso corporal una vez por semana. Ayuno los ratones durante la noche durante un período de 5 semanas.
- Sacrificarlos por luxación cervical y necropsia.
- Después de que los ratones han sido sacrificados, inmovilizarlos en una posición supina.
- Usando fórceps y tijeras quirúrgicas limpias, localice y levante la piel central cerca de los genitales y haga una pequeña incisión de 0,2 mm.
- Inserte las tijeras planas horizontalmente en la incisión y separe cuidadosamente la piel abdominal de la pared abdominal.
- Con las antesceps, levanta la piel central y con las tijeras quirúrgicas la corta a la altura de la caja torácica. Luego corte la piel por encima de las dos extremidades posteriores para facilitar la recolección de tejido adiposo.
- Asegurar la recolección de todo el tejido adiposo del cuerpo mediante disección contundente con tijeras y fórceps. Una vez recogido, coloque el tejido adiposo en papel de aluminio. Recuerde recoger la grasa alrededor de los órganos reproductivos. Evitar la acumulación de pelo y piel para no alterar los resultados.
- Para acceder al tejido adiposo visceral, corte el músculo abdominal con tijeras quirúrgicas desde los genitales hasta la caja torácica, haciendo una incisión en los músculos abdominales desde los genitales hacia la espalda del ratón.
- Realizar una hepatectomía para extirpar el 100% del hígado. Para exteriorizar el hígado, extirpar órganos innecesarios y cortar las venas hepáticas y arterias para separar el hígado del resto del cuerpo. Como último paso, extraer con precisión la vesícula biliar del hígado16.
- Mida la hipercolesterolemia (colesterol) y la hipertrigliceridemia (triglicéridos) utilizando kits de ensayo comerciales de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
5. Análisis estadístico
NOTA: Todos los resultados experimentales deben ser representativos de tres ensayos independientes, expresados como media ± desviación estándar.
- Calcule el error estándar con un análisis de varianza ANOVA unidireccional seguido de la prueba de rango de Tukey. Considere un P< 0.05 como estadísticamente significativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Extracción asistida por ultrasonidos
La condición óptima de extracción para la extracción fue etanol: agua (50:50, v / v) con una potencia de ultrasonido de 300 W y un tiempo de ultrasonido de 30 min. De esta manera, la extracción fue más rápida que los métodos de extracción convencionales (Tabla 2). El extracto mostró un pico de absorción intenso a 320 nm en espectros uv-visibles (Figura 1).
Ingesta de alimentos y peso corporal
Los cambios en el peso corporal de los ratones dados diferentes concentraciones del extracto (100, 200 y 450 mg/kg) durante 5 semanas se muestran en la Figura 2A. Los porcentajes de reducción de peso en los grupos 3, 4 y 5 fueron de 12,2%, 30% y 41%, respectivamente. Esto muestra que el aumento de peso corporal más bajo se observó en todos los grupos; sin embargo, el grupo de HFD tenía un aumento de 2,1x comparado al grupo gordo normal de la dieta. Estos datos indican que un 450 dosis de mg/kg de CC es más eficaz que 30 mg/kg de fentermina (39% reducción) en la reducción de aumento de peso corporal.
La ingesta media de alimentos al final del experimento en la HFD + CC (450 mg/mL) fue un 31% menor que la del grupo obeso (HFD), con una reducción de 1,3 g en la ingesta de alimentos en comparación con el grupo obeso(Figura 2B). La toma de comida en los ratones HFD-alimentados era más alta por el doblez 1,5 que en el control normal, así (P<0,05) disminuyó perceptiblemente en todos los grupos del cc en una gama de 7,14% a el 31%. La tasa de eficacia de la dieta en el grupo de HFD era el 16%, que era perceptiblemente diferente (P< 0,05) de la del grupo de control (ND) en el 11%. Estos resultados demuestran que el CC puede reducir aumento de peso corporal HFD-inducido.
Tejido adiposo y peso hepático
El peso de los tejidos adiposos epididimales wat, grasa subcutánea y perirrenal WAT fue mayor en el grupo HFD-, pero no en los grupos HFD-CC (Tabla 3). El peso hepático fue significativamente (P<0,05) disminuido en el grupo CC (100 a 450 mg/kg) con un rango de 15%-28,4% en comparación con los del grupo HFD(Tabla 4).
Lípidos hepáticos y suero
Los niveles séricos de triacilglicerol (TG) y colesterol total (TC) tras 5 semanas de tratamiento se muestran en las Figuras 3A y 3B,respectivamente. Los triglicéridos y el nivel de colesterol total fueron elevados perceptiblemente por el doblez 1,32 y el doblez 1,31, respectivamente, en los grupos de HFD comparados a ésos en los grupos del ND. Los niveles crecientes de TG y de TC del plasma en la dieta de HFD fueron atenuados perceptiblemente por la administración del extracto del cc de 200 y 450 mg/kg/día por 18,18% y 22,7% para el TG y 16,41% y 20,61% para el TC, respectivamente comparados al control (ND).
Figura 1. Espectro UV-vis de clavo y extracto de comino (CC) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Efectos del cc sobre: (A) peso corporal (g), (b) toma de comida en ratones de alto contenido de grasa C57BL6/J de la dieta en 4 semanas del tratamiento. Los datos se representan como ± de la DE. Para cada grupo, n=8. Diferentes letras mostraron diferencia significativa (p<0,05). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3. Efectos del CC sobre: (A) Triglicéridos, (B) Colesterol total. Todos los datos experimentales fueron ± ratones SD (n = 8). Los ratones fueron tratados con 100, 200 y 450 mg/kg de CC para la administración oral diaria con la alimentación simultánea de HFD por 5 semanas. Diversas letras indican diferencias significativas entre todos los grupos (P < 05). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| ingrediente | Cantidad (g/kg) |
| caseína | 140 |
| L-cisteína | 1.8 |
| manteca | 120 |
| aceite de soja | 40 |
| Maltodextrina 10 | 150 |
| sacarosa | 450 |
| celulosa | 50 |
| Vitaminas y Minerales | Equivalente de tableta |
| Bitartrato de colina | 2.5 |
Tabla 1. Dieta alta en grasas para ratones C57BL6/J.
| poder | 370 vatios |
| Temperatura del agua | °C 30 (°F 86) |
| Tiempo de extracción | 30 minutos |
| Concentración de disolventes | 50% etanol/50% agua destilada |
| Número de extracciones | 2 extracciones |
Tabla 2. Condiciones óptimas de ultrasonido para la preparación del clavo y el extracto de comino
| grupo | Wat epidídimo (g) | WAT perirreno (g) | Grasa subcutánea (g) | Grasa/Peso corporal (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1,22 ± 0,09a |
| HFD | 2,30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0,15 ± 0,04a | 6,38 ± 1,02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0,12 ± 0,02a,b | 5,12 ± 1,93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0,11 ± 0,04a,b | 3,21 ± 0,32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2,30 ± 0,45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2,41 ± 0,18c |
Tabla 3. Efecto del cc en ratones obesos dieta-inducidos sobre peso blanco del tejido adiposo. Cada valor se expresa como la media ± DE (n = 8). Diversa letra mostró la diferencia significativa (P<0,05) contra el tejido adiposo blanco (WAT)
| grupo | Peso hepático (g) |
| Nd | 1,01 ± 0,05a |
| HFD | 1,48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1,12 ± 0,03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1,06 ± 0,06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1,08 ± 0,07a |
Tabla 4. Efecto del cc en ratones obesos dieta-inducidos sobre peso del tejido del hígado. Cada valor se expresa como la media ± DE (n = 8). Diversa letra mostró la diferencia significativa (P<0,05) contra el tejido adiposo blanco (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este estudio evaluamos, por primera vez, el efecto de la administración oral de una combinación de clavo de olor y extracto de comino (CC) sobre los perfiles lipídicos y la obesidad en ratones alimentados con una dieta alta en grasas durante 5 semanas. Los hallazgos indicaron que los grupos de HFD mostraron un aumento de peso corporal significativamente mayor en comparación con el grupo de DE, que mostró que la inducción de la obesidad en el modelo obeso fue exitosa. La dosis administrada de CC (100, 200 y 450 mg/kg/día) produjo una reducción en la ingesta de alimentos y el peso corporal. En consecuencia, la reducción en la ingesta de alimentos debe deberse a una disminución en el apetito de los animales.
La reducción de la dislipidemia es muy importante para prevenir los trastornos relacionados con la obesidad. En nuestro estudio, los niveles de colesterol total y triglicéridos fueron más bajos en el grupo CC en comparación con los de HFD y grupos de fentermina utilizados como control positivo. Los resultados sugirieron que el cc pueda inhibir hiperlipidemia y sus complicaciones.
Nuestro estudio mostró que el grupo de HFD había aumentado las grasas de cuerpo, incluyendo la grasa abdominal y del hígado que fueron reducidas perceptiblemente por la suplementación del extracto del CC. Esto muestra que el tratamiento del extracto del CC en los ratones de HFD reduce la absorción del lípido debido a su actividad anti-adipogenic.
En este estudio, evaluamos un modelo rápido para determinar el efecto anti-obesidad de un extracto de una combinación de plantas comestibles, Syzygium aromaticum (clavo) y Cuminum cyminum (comino) en ratones C57BL6/J, que desarrollaron rápidamente obesidad con una dieta alta en grasas. El tratamiento del cc previno perceptiblemente el desarrollo de la obesidad y mejoró la hiperlipidemia inducida por HFD dado a los ratones. En conjunto, los hallazgos de esta investigación proporcionan pruebas sólidas de que este método rápido de 5 semanas de duración desarrollado en nuestro laboratorio podría utilizarse para evaluar si una planta tiene la capacidad de ser un agente potencial para el tratamiento de la obesidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
- Singla, P., Bardoloi, A., Parkash, A. A. Metabolic effects of obesity: A review. World Journal of Diabetes. 1 (1), 76-88 (2010).
- Ojulari, O. V., Lee, S. G., Nam, J. O. Beneficial Effects of Natural Bioactive Compounds from Hibiscus sabdariffa L. on Obesity. Molecules. 24 (1), 210 (2019).
- Bahmani, M., et al. Obesity phytotherapy: review of native herbs used in traditional medicine for obesity. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 21 (3), 228-234 (2016).
- Ríos-Hoyo, A., Gutiérrez-Salmeán, G. New Dietary Supplements for Obesity: What We Currently Know. Current Obesity Reports. 5 (2), 262-270 (2016).
- Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B., Abdollahi, M. A systematic review of the efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of obesity. World Journal Gastroenterology. 15 (25), 3073-3085 (2009).
- Hardeman, W., Griffin, S., Johnston, M., Kinmonth, A. L., Wareham, N. J. Interventions to prevent weight gain: a systematic review of psychological models and behaviour change methods. Nternational Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 24 (1), 131-143 (2000).
- Dinda, B., Dinda, M., Roy, A., Dinda, S. Dietary plant flavonoids in prevention of obesity and diabetes. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 120, 159-235 (2020).
- Mayer, M. A., Hocht, C., Puyo, A., Taira, C. A.
- Rafie, A. Z. M., Syahir, A., Ahmad, W. A. N. W., Mustafa, M. Z., Mariatulqabtiah, A. R. 2018 supplementation of stingless bee honey from heterotrigona itama improves antiobesity parameters in high-fat diet induced obese rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 6371582 (2018).
- Song, J., et al. Anti-obesity effects of the flower of prunus persica in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients. 11, 2176 (2019).
- Jung, C. H., Ahn, J., Jeon, T. -I., Kim, T. W., Ha, T. Y. Syzygium aromaticum ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice through downregulation of adipogenic and lipogenic gene expression. Experimental and Therapeutic Medicine. 4 (3), 409-414 (2012).
- Said, O., Saad, B., Fulder, S., Khalil, K., Kassis, E. Weight Loss in Animals and Humans Treated with "Weigh level", a Combination of Four Medicinal Plants Used in Traditional Arabic and Islamic Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 874538 (2011).
- Anaya-Esparza, L. M., Ramos-Aguirre, D., Zamora-Gasga, V. M., Yahia, E., Montalvo-Gonzalez, E. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Justicia spicigera leaves. Food Science and Biotechnology. 27 (4), 1093-1102 (2018).
- Ayoub, R. M., et al. The effect of anthocyanin-rich purple vegetable diets on metabolic syndrome in obese Zucker. Journal of Medical Food. , (2017).
- Go, R., et al. Effects of anti-obesity drugs, phentermine and mahuang, on the behavioral patterns in Sprague-Dawley rat model. Laboratory of Animals Research. 30 (2), 73-78 (2014).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA analysis. Journal of Visualized Experiments. (13), e57026 (2018).
- Bjorndal, B., Burri, L., Staalesen, V., Skorve, J., Berge, R. K. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of Obesity. 2011, 490650 (2011).
