Summary
Diese Arbeit präsentiert ein Protokoll, um die Anti-Adipositas-Wirkung von zwei Pflanzen zu untersuchen, die zusammen für eine Dauer von 5 Wochen verwendet werden. Es gab eine kombinierte Verabreichung des Extrakts und der fettreichen Diät (HFD) bei den fettleibigen Mäusen. Die Methode kann die Vorteile von Pflanzen bei der Behandlung von Fettleibigkeit fördern.
Abstract
Mehrere Studien haben gezeigt, dass die phytochemischen Inhaltsstoffe von Pflanzen potenzielle Mittel gegen Fettleibigkeit sind. In dieser Studie untersuchen wir die Wirkung einer Kombination aus trockenen Knöpfen aus Syzygium aromaticum und Samen aus Cuminum cyminum (CC) auf C57BL6 / J-Mäuse, die mit Fettleibigkeit über fettreiche Diät (HFD) induziert werden. Ziel dieser Studie ist es zu zeigen, dass die in der Studie vorgeschlagene Methode die Fettleibigkeit nach mehreren Wochen des Experimentierens signifikant reduziert. Der Extrakt aus beiden Pflanzen wurde mit Ultraschall extrahiert, um die Extraktion von sekundären Pflanzenstoffen zu verbessern. Optimale Extraktionsbedingungen wurden mit Ethanol wie folgt erreicht: 50:50 v/v Wasser mit einer Ultraschallleistung von 300 W und Ultraschallzeit von 30 Minuten. Die gleichzeitige Verabreichung des CC-Extrakts in HFD für 5 Wochen führte zur Regulierung von Lipidprofilen (Cholesterin und Triglyceride), Verringerung der Nahrungsaufnahme, Gewichtszunahme, Fettgewebe und Lebergewicht. Die Ergebnisse dieses fettleibigen Modells deuten darauf hin, dass CC-Extrakt Fettleibigkeit verhindern kann. Im Vergleich zur traditionellen 16-Wochen-Methode (8 Wochen, um fett zu werden und 8 Wochen, um Gewicht zu verlieren), wurden ähnliche Ergebnisse im vorliegenden Studien-Fettleibigenmodell in kürzerer Zeit des Experimentierens erzielt.
Introduction
Überschüssige Körperfettansammlung ist ein Merkmal von Fettleibigkeit. Das Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und -verbrauch führt zur Speicherung überschüssiger Energie in Adipozyten, die mit metabolischen Risikofaktoren für Hyperglykämie und Insulinresistenz bei Typ-2-Diabetes, Bluthochdruck, Hypercholesterinämie und Herz-Kreislauf-Erkrankungen zusammenhängt1,2.
Natürliche Produkte mit minimalen Nebenwirkungen und niedrigen Kosten haben erhöhte Aufmerksamkeit erhalten, seit frühere Studien bioaktive Phytochemikalien und potenzielle Anti-Adipositas-Mittel mit Mechanismen berichtet haben, die das metabolische Syndrom und die damit verbundenen Pathologien umkehren oder verzögern8.
Mehrere Heilpflanzen wurden untersucht, um Fettleibigkeit und verwandte Krankheiten zu verhindern. Unter ihnen wurde Syzygium aromaticum auf sein Anti-Adipositas-Potenzial in der In-vitro-Behandlung an 3T3-L1-Zellen und in vivo-Behandlung an Mäusen untersucht, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden11. Darüber hinaus wurden signifikante Anti-Übergewichts-Effekte in einer multizentrischen offenen Studie mit Cuminum cyminum bei extrem fettleibigen Probanden beobachtet12. In dieser Studie wurden C57BL6 / J-Mäuse verwendet, um das experimentelle schnellmodell zu untersuchen, um ein potenzielles Anti-Adipositas-Mittel mit einer Kombination beider essbarer Pflanzen zu bewerten.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Tierversuchskomitee der Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protokoll Nr. 2732).
1. Herstellung des Extrakts aus der Kombination von Nelken und Kreuzkümmel
HINWEIS: Die essbaren Pflanzen Syzygium aromaticum (Nelke) und Cuminum cyminum (Kreuzkümmel) wurden von Central de Abastos CDMX, Mexiko, gekauft.
- Mahlen Sie 500 g Samen aus den Pflanzen und führen Sie eine ultraschallunterstützte Extraktion durch. Beschallen Sie sie (320 Watt; 24 kHz Frequenz, 30 min) mit Ethanol:Wasser (60:40 v/v) in einem Temperaturbereich von 30 ± 4 °C.13
- Filtern Sie die Feststoffe mit Whatman Nummer 2 Filterpapier unter Vakuum und konzentrieren Sie den Extrakt mit einem Rotationsverdampfer.
- Messen Sie das UV-Vis-Spektrum des Extrakts beider Pflanzen (CC).
2. Tiere
- Verwenden Sie männliche C57BL6 / J-Mäuse im Alter von sechs Wochen (insgesamt 48, Körpergewicht 24-29 g) für die Studie.
- Unterbringung der Tiere in Achtergruppen unter Standardlaborbedingungen: Temperatur (20-22 ± 1 °C), relative Luftfeuchtigkeit (45-54 ± 2%), Beleuchtung (08:00-20:00 h) mit Futter und Wasser ad libitum. Akklimatisieren Sie die Mäuse unter diesen Bedingungen für eine Woche vor dem Experiment.
3. Experimentelles Vorgehen
- Bereiten Sie die fettreiche Diät14 wie in Tabelle 1vor.
- Zu Beginn des Tests wird jede der gebildeten Gruppen (n = 8) verschiedenen Behandlungen unterzogen: Futtergruppe 1 bei normaler Ernährung; Gruppe 2, auf fettreicher Diät; Gruppe 3, auf fettreicher Diät + 100 mg / kg CC-Extrakt; Gruppe 4, auf fettreicher Diät + 250 mg / kg CC-Extrakt; Gruppe 5, auf fettreicher Diät + 450 mg / kg CC-Extrakt; Gruppe 6, auf fettreiche Diät + Phentermin (ein Medikament gegen Fettleibigkeit, das als Positivkontrolle verwendet wird)15.
- Füttern Sie alle Gruppen von Mäusen für 5 Wochen und notieren Sie die Menge an Nahrung, die täglich konsumiert wird.
- Homogenisieren Sie in einem Reagenzglas mit Stopfen den Extrakt oder das Medikament mit der Wasserdosis, die der Gruppe entspricht, der die Behandlung verabreicht wird. Dies geschieht mit einem Wirbelschüttler.
- Nach der Homogenisierung alle entsprechenden Behandlungen in den Trinker jeder Gruppe geben.
4. Probenentnahme
- Messen Sie sowohl die Nahrungsaufnahme als auch das Körpergewicht einmal pro Woche. Fasten Sie die Mäuse über Nacht für einen Zeitraum von 5 Wochen.
- Opfern Sie sie durch zervikale Dislokation und Nekropsie.
- Nachdem die Mäuse geopfert wurden, immobilisieren Sie sie in Rückenlage.
- Mit einer sauberen chirurgischen Zette und Schere die zentrale Haut in der Nähe der Genitalien lokalisieren und anheben und einen kleinen 0,2-mm-Schnitt machen.
- Führen Sie die flache Schere horizontal in den Schnitt ein und trennen Sie die Bauchhaut vorsichtig von der Bauchdecke.
- Mit der Ziffe die zentrale Haut anheben und mit der chirurgischen Schere auf Höhe des Brustkorbs schneiden. Schneiden Sie dann die Haut über beiden Hintergliedmaßen ab, um die Sammlung von Fettgewebe zu erleichtern.
- Sorgen Sie für die Entnahme des gesamten Fettgewebes aus dem Körper durch stumpfe Dissektion mit Schere und Zette. Nach dem Sammeln das Fettgewebe in Aluminiumfolie legen. Denken Sie daran, das Fett um die Fortpflanzungsorgane zu sammeln. Vermeiden Sie die Ansammlung von Haaren und Haut, um die Ergebnisse nicht zu verändern.
- Um auf das viszerale Fettgewebe zuzugreifen, schneiden Sie den Bauchmuskel mit einer chirurgischen Schere von den Genitalien bis zum Brustkorb und machen Sie einen Schnitt in die Bauchmuskeln von den Genitalien in Richtung des Rückens der Maus.
- Führen Sie eine Hepatektomie durch, um 100% der Leber zu entfernen. Um die Leber zu externalisieren, entfernen Sie unnötige Organe und schneiden Sie die Lebervenen und Arterien, um die Leber vom Rest des Körpers zu trennen. Als letzten Schritt extrahieren Sie genau die Gallenblase aus der Leber16.
- Messen Sie Hypercholesterinämie (Cholesterin) und Hypertriglyceridämie (Triglyceride) mit kommerziellen Assay-Kits gemäß den Angaben des Herstellers.
5. Statistische Auswertung
HINWEIS: Alle experimentellen Ergebnisse sollten repräsentativ aus drei unabhängigen Assays sein, ausgedrückt als Mittelwert ± Standardabweichung.
- Berechnen Sie den Standardfehler mit einer einseitigen ANOVA-Varianzanalyse, gefolgt von Tukeys Reichweitentest. Betrachten Sie eine P< 0,05 als statistisch signifikant.
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Representative Results
Ultraschallgestützte Extraktion
Optimale Extraktionsbedingung für die Extraktion war Ethanol:Wasser (50:50, v/v) mit einer Ultraschallleistung von 300 W und einer Ultraschallzeit von 30 min. Auf diese Weise war die Extraktion schneller als herkömmliche Extraktionsmethoden (Tabelle 2). Der Extrakt zeigte einen intensiven Absorptionspeak bei 320 nm in UV-sichtbaren Spektren (Abbildung 1).
Nahrungsaufnahme und Körpergewicht
Die Veränderungen des Körpergewichts der Mäuse, die 5 Wochen lang unterschiedliche Konzentrationen des Extrakts (100, 200 und 450 mg/kg) erhielten, sind in Abbildung 2Adargestellt. Die Prozentsätze der Gewichtsreduktion in den Gruppen 3, 4 und 5 betrugen 12,2%, 30% bzw. 41%. Dies zeigt, dass die niedrigste Körpergewichtszunahme in allen Gruppen beobachtet wurde; Die HFD-Gruppe hatte jedoch einen Anstieg von 2,1x im Vergleich zur normalen Fettdiät-Gruppe. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine Dosis von 450 mg/kg CC wirksamer ist als 30 mg/kg Phentermin (39% Reduktion) bei der Verringerung der Körpergewichtszunahme.
Die mittlere Nahrungsaufnahme am Ende des Experiments in der HFD + CC (450 mg / ml) war 31% niedriger als in der fettleibigen Gruppe (HFD), mit 1,3 g Verringerung der Nahrungsaufnahme im Vergleich zur fettleibigen Gruppe (Abbildung 2B). Die Nahrungsaufnahme bei den HFD-gefütterten Mäusen war um das 1,5-fache höher als in der normalen Kontrolle, so dass sie signifikant (P<0,05) in allen CC-Gruppen in einem Bereich von 7,14% bis 31% abnahm. Die Diäteffizienzrate in der HFD-Gruppe betrug 16%, was sich signifikant von der der Kontrollgruppe (ND) mit 11% unterschied (P< 0,05). Diese Ergebnisse zeigen, dass CC die HFD-induzierte Körpergewichtszunahme reduzieren kann.
Fettgewebe und Lebergewicht
Das Gewicht von nebenhodymalem WAT, subkutanem Fett und perirenalem WAT Fettgewebe war in der HFD-Gruppe höher, nicht jedoch in den HFD-CC-Gruppen (Tabelle 3). Das Lebergewicht war in der CC-Gruppe (100 bis 450 mg/kg) signifikant (P<0,05) mit einem Bereich von 15%-28,4% im Vergleich zur HFD-Gruppe(Tabelle 4)erniedrigt.
Leberlipide und Serum
Die Spiegel von Serumtriacylglycerin (TG) und Gesamtcholesterin (TC) nach 5-wöchiger Behandlung sind in den Abbildungen 3A bzw. 3Bdargestellt. Die Triglyceride und der Gesamtcholesterinspiegel waren in HFD-Gruppen im Vergleich zu denen in den ND-Gruppen signifikant um das 1,32-fache bzw. das 1,31-fache erhöht. Die erhöhten Plasma-TG- und TC-Spiegel in der HFD-Diät wurden durch die Verabreichung von 200 und 450 mg/kg/Tag CC-Extrakt signifikant um 18,18% bzw. 22,7% für TG und 16,41% bzw. 20,61% für TC im Vergleich zur Kontrolle (ND) abgeschwächt.
Abbildung 1. UV-Vis-Spektrum von Nelken- und Kreuzkümmelextrakt (CC) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Auswirkungen von CC auf: (A) Körpergewicht (g), (B) Nahrungsaufnahme bei fettreichen C57BL6 / J-Mäusen nach 4 Wochen Behandlung. Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Für jede Gruppe n=8. Verschiedene Buchstaben zeigten einen signifikanten Unterschied (S<0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Auswirkungen von CC auf: (A) Triglyceride, (B) Gesamtcholesterin. Alle experimentellen Daten waren Mittlere ± SD-Mäusen (n = 8). Mäuse wurden mit 100, 200 und 450 mg/kg CC zur täglichen oralen Verabreichung bei gleichzeitiger Fütterung von HFD für 5 Wochen behandelt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede zwischen allen Gruppen hin (P < 05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Bestandteil | Menge (g/kg) |
| Casein | 140 |
| L-Cystein | 1.8 |
| Schmalz | 120 |
| Sojaöl | 40 |
| Maltodextrin 10 | 150 |
| Saccharose | 450 |
| Zellulose | 50 |
| Vitamine und Mineralstoffe | Tablet-Äquivalent |
| Cholinbitartrat | 2.5 |
Tabelle 1. Fettreiche Diät für C57BL6 / J-Mäuse.
| Macht | 370 Watt |
| Wassertemperatur | 86 °F (30 °C) |
| Extraktionszeit | 30 Min. |
| Lösungsmittelkonzentration | 50% Ethanol/50% destilliertes Wasser |
| Anzahl der Extraktionen | 2 Extraktionen |
Tabelle 2. Optimale Ultraschallbedingungen für die Herstellung des Nelken- und Kreuzkümmelextrakts
| Gruppe | Nebenhoden WAT (g) | Perirenal WAT (g) | Subkutanes Fett (g) | Fett/Körpergewicht (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1,22 ± 0,09a |
| HFD | 2,30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0,15 ± 0,04a | 6.38 ± 1.02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0,12 ± 0,02a,b | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0,11 ± 0,04a,b | 3,21 ± 0,32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2.30 ± 0.45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2.41 ± 0.18c |
Tabelle 3. Wirkung von CC bei diätinduzierten fettleibigen Mäusen auf das Gewicht des weißen Fettgewebes. Jeder Wert wird als Mittelwert ± SD (n = 8) ausgedrückt. Verschiedene Buchstaben zeigten einen signifikanten Unterschied (P<0,05) gegenüber weißem Fettgewebe (WAT)
| Gruppe | Lebergewicht (g) |
| Nd | 1,01 ± 0,05a |
| HFD | 1,48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1,12 ± 0,03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1.06 ± 0.06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1,08 ± 0,07a |
Tabelle 4. Wirkung von CC bei diätinduzierten fettleibigen Mäusen auf das Lebergewebegewicht. Jeder Wert wird als Mittelwert ± SD (n = 8) ausgedrückt. Verschiedene Buchstaben zeigten einen signifikanten Unterschied (P<0,05) gegenüber weißem Fettgewebe (WAT).
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Discussion
In dieser Studie untersuchten wir zum ersten Mal die Wirkung der oralen Verabreichung einer Kombination aus Nelken und Kreuzkümmelextrakt (CC) auf Lipidprofile und Fettleibigkeit bei Mäusen, die 5 Wochen lang mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die HFD-Gruppen im Vergleich zur ND-Gruppe eine signifikant höhere Körpergewichtszunahme zeigten, was zeigte, dass die Induktion von Fettleibigkeit im fettleibigen Modell erfolgreich war. Die verabreichte Dosis von CC (100, 200 und 450 mg/kg/Tag) führte zu einer Verringerung der Nahrungsaufnahme und des Körpergewichts. Folglich muss die Verringerung der Nahrungsaufnahme auf eine Abnahme des Appetits der Tiere zurückzuführen sein.
Die Verringerung der Dyslipidämie ist sehr wichtig, um Adipositas-bedingte Störungen zu verhindern. In unserer Studie waren der Gesamtcholesterinspiegel und die Triglyceride in der CC-Gruppe niedriger als in den HFD- und Phentermin-Gruppen, die als Positivkontrolle verwendet wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CC Hyperlipidämie und ihre Komplikationen hemmen kann.
Unsere Studie zeigte, dass die HFD-Gruppe erhöhtes Körperfett hatte, einschließlich Bauch- und Leberfett, die durch die CC-Extrakt-Supplementierung signifikant reduziert wurden. Dies zeigt, dass die CC-Extraktbehandlung an den HFD-Mäusen die Lipidabsorption aufgrund ihrer anti-adipogenen Aktivität reduziert.
In dieser Studie haben wir ein schnelles Modell ausgewertet, um die Anti-Adipositas-Wirkung eines Extrakts aus einer Kombination von essbaren Pflanzen, Syzygium aromaticum (Nelke) und Cuminum cyminum (Kreuzkümmel) an C57BL6 / J-Mäusen zu bestimmen, die mit einer fettreichen Diät schnell Fettleibigkeit entwickelten. Die CC-Behandlung verhinderte signifikant die Entwicklung von Fettleibigkeit und verbesserte die Hyperlipidämie, die durch HFD an die Mäuse induziert wurde. Insgesamt liefern die Ergebnisse dieser Forschung solide Beweise dafür, dass diese schnelle Methode von 5 Wochen Dauer, die in unserem Labor entwickelt wurde, verwendet werden könnte, um zu beurteilen, ob eine Pflanze die Fähigkeit hat, ein potenzieller Wirkstoff zur Behandlung von Fettleibigkeit zu sein.
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Disclosures
Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Instituto Politécnico Nacional México unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
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