Summary
Questo lavoro presenta un protocollo per esplorare l'effetto anti-obesità di due piante utilizzate insieme, per una durata di 5 settimane. C'è stata una somministrazione combinata dell'estratto e della dieta ricca di grassi (HFD) nei topi obesi. Il metodo può promuovere i benefici delle piante nel trattamento dell'obesità.
Abstract
Diversi studi hanno dimostrato che il contenuto fitochimico delle piante sono potenziali agenti anti-obesità. In questo studio esaminiamo l'effetto dell'uso di una combinazione di pulsanti secchi di Syzygium aromaticum e semi di Cuminum cyminum (CC) su topi C57BL6 / J indotti con obesità attraverso la dieta ricca di grassi (HFD). Lo scopo di questo studio è dimostrare che il metodo proposto nello studio ha ridotto significativamente l'obesità dopo diverse settimane di sperimentazione. L'estratto da entrambe le piante è stato estratto utilizzando ultrasuoni per migliorare l'estrazione di fitochimici. Le condizioni ottimali di estrazione sono state ottenute con l'etanolo come segue: 50:50 v /v acqua con una potenza ultrasonica di 300 W e tempo di ultrasonicazione di 30 minuti. La somministrazione simultanea dell'estratto di CC in HFD per 5 settimane ha portato alla regolazione dei profili lipidici (colesterolo e trigliceridi), alla riduzione dell'assunzione di cibo, all'aumento di peso, al tessuto adiposo e al peso del fegato. I risultati ottenuti da questo modello obeso indicano che l'estratto di CC può prevenire l'obesità. Rispetto al metodo tradizionale di 16 settimane (8 settimane per ingrassare e 8 settimane per perdere peso), risultati simili sono stati ottenuti nel presente studio modello obeso in meno tempo di sperimentazione.
Introduction
L'accumulo di grasso corporeo in eccesso è una caratteristica dell'obesità. Lo squilibrio tra assunzione di energia e consumo porta allo stoccaggio di energia in eccesso negli adipociti, che è correlata a fattori di rischio metabolici per l'iperglicemia e la resistenza all'insulina nel diabete di tipo 2, ipertensione, ipercolesterolemia e malattiecardiovascolari 1,2.
I prodotti naturali con effetti collaterali minimi e basso costo hanno ricevuto maggiore attenzione da quando studi precedenti hanno riportato fitochimici bioattivi e potenziali agenti anti-obesità con meccanismi che invertono o ritardano la sindrome metabolica e le patologieassociate 8.
Diverse piante medicinali sono state studiate per prevenire l'obesità e le malattie correlate. Tra questi, il sizigium aromaticum è stato studiato per il suo potenziale anti-obesità nel trattamento in vitro su cellule 3T3-L1 e nel trattamento in vivo su topi nutriti con una dieta ricca di grassi11. Inoltre, significativi effetti anti sovrappeso sono stati osservati in uno studio aperto multi-centro del ciclo cumino su soggetti estremamente obesi12. In questo studio, i topi C57BL6/J sono stati utilizzati per studiare il modello veloce sperimentale per valutare un potenziale agente anti-obesità utilizzando una combinazione di entrambe le piante commestibili.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per l'esperimento animale della Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protocollo n° 2732).
1. Preparazione dell'estratto della combinazione di chiodi di garofano e cumino
NOTA: Le piante commestibili, Syzygium aromaticum (chiodi di garofano) e Cuminum cyminum (cumino) sono state acquistate da Central de Abastos CDMX, Messico.
- Macinare 500 g di semi dalle piante ed eseguire l'estrazione assistita da ultrasuoni. Sonicarli (320 Watt; frequenza 24 kHz, 30 min) con etanolo:acqua (60:40 v/v) ad un intervallo di temperatura di 30 ± 4 °C.13
- Filtrare i solidi utilizzando carta filtrante Whatman numero 2 sotto vuoto e concentrare l'estratto con un evaporatore rotante.
- Misurare lo spettro UV-vis dell'estratto di entrambe le piante (CC).
2. Animali
- Utilizzare topi maschi C57BL6 / J di sei settimane (48 in totale, peso corporeo 24-29 g) per lo studio.
- Ospita gli animali in gruppi di otto in condizioni di laboratorio standard: temperatura (20-22 ± 1 °C), umidità relativa (45-54 ± 2%), illuminazione (08:00-20:00 h) con ad libitum di cibo e acqua. Acclimatare i topi in queste condizioni per una settimana prima dell'esperimento.
3. Procedura sperimentale
- Preparare la dieta ricca digrassi 14 come nella tabella 1.
- All'inizio del test, sottoponi ciascuno dei gruppi formati (n = 8) a diversi trattamenti: Feed Group 1 con una dieta normale; Gruppo 2, con dieta ricca di grassi; Gruppo 3, con dieta ricca di grassi + 100 mg/kg di estratto di CC; Gruppo 4, con dieta ricca di grassi + 250 mg/kg di estratto di CC; Gruppo 5, con dieta ricca di grassi + 450 mg/kg di estratto di CC; Gruppo 6, su dieta ricca di grassi + fentermina (un farmaco antiobesità usato come controllo positivo)15.
- Nutrire tutti i gruppi di topi per 5 settimane e registrare la quantità di cibo consumato quotidianamente.
- In una provetta con tappo, omogeneizzare l'estratto o il farmaco con la dose di acqua corrispondente al gruppo a cui viene somministrato il trattamento. Questo viene fatto con lo shaker vortice.
- Una volta omogeneizzato, aggiungere tutto il trattamento corrispondente nel bevitore di ogni gruppo.
4. Raccolta dei campioni
- Misurare sia l'assunzione di cibo che il peso corporeo una volta alla settimana. Veloci i topi durante la notte per un periodo di 5 settimane.
- Sacrificali per lussazione cervicale e necroscopia.
- Dopo che i topi sono stati sacrificati, immobilizzarli in posizione supina.
- Utilizzando forcep chirurgiche e forbici pulite, individuare e sollevare la pelle centrale vicino ai genitali e fare una piccola incisione di 0,2 mm.
- Inserire le forbici piatte orizzontalmente nell'incisione e separare accuratamente la pelle addominale dalla parete addominale.
- Con le forcep, sollevare la pelle centrale e con le forbici chirurgiche tagliarla a livello della gabbia toracica. Quindi tagliare la pelle sopra entrambi gli arti posteriori per facilitare la raccolta del tessuto adiposo.
- Assicurarsi la raccolta di tutto il tessuto adiposo dal corpo mediante dissezione smussata con forbici e forcelle. Una volta raccolto, posizionare il tessuto adiposo in un foglio di alluminio. Ricorda di raccogliere il grasso intorno agli organi riproduttivi. Evitare l'accumulo di capelli e pelle per non alterare i risultati.
- Per accedere al tessuto adiposo viscerale, tagliare il muscolo addominale con forbici chirurgiche dai genitali alla gabbia toracica, facendo un'incisione nei muscoli addominali dai genitali verso la schiena del topo.
- Eseguire un'epatotectomia per rimuovere il 100% del fegato. Per esternalizzare il fegato, rimuovere gli organi non necessari e tagliare le vene epatiche e le arterie per separare il fegato dal resto del corpo. Come ultimo passo, estrarre con precisione la cistifellea dal fegato16.
- Misurare l'ipercolesterolemia (colesterolo) e l'ipertrigliceridemia (trigliceridi) utilizzando kit di dosaggio commerciali secondo le indicazioni del produttore.
5. Analisi statistica
NOTA: Tutti i risultati sperimentali devono essere rappresentativi di tre saggi indipendenti, espressi come media ± deviazione standard.
- Calcola l'errore standard con un'analisi ANOVA uni-way della varianza seguita dal test dell'intervallo di Tukey. Considera un P< 0,05 come statisticamente significativo.
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Representative Results
Estrazione assistita da ultrasuoni
La condizione di estrazione ottimale per l'estrazione era l'etanolo:acqua (50:50, v/v) con una potenza ultrasonica di 300 W e un tempo di ultrasonicazione di 30 min. In questo modo, l'estrazione è stata più rapida dei metodi di estrazione convenzionali(tabella 2). L'estratto ha mostrato un intenso picco di assorbimento a 320 nm negli spettri visibili ai raggi UV (Figura 1).
Assunzione di cibo e peso corporeo
Le variazioni del peso corporeo dei topi date le diverse concentrazioni dell'estratto (100, 200 e 450 mg/kg) per 5 settimane sono indicate nella figura 2A. Le percentuali di riduzione del peso nei gruppi 3, 4 e 5 erano rispettivamente del 12,2%, del 30% e del 41%. Ciò mostra che l'aumento di peso corporeo più basso è stato osservato in tutti i gruppi; tuttavia, il gruppo HFD ha avuto un aumento di 2,1 volte rispetto al normale gruppo di dieta grassa. Questi dati indicano che una dose di 450 mg/kg di CC è più efficace di 30 mg/kg di fentermina (riduzione del 39%) nella riduzione dell'aumento di peso corporeo.
L'assunzione media di cibo alla fine dell'esperimento nell'HFD + CC (450 mg/mL) era inferiore del 31% a quella del gruppo obeso (HFD), con una riduzione di 1,3 g dell'assunzione di cibo rispetto al gruppo obeso(figura 2B). L'assunzione di cibo nei topi alimentati con HFD è stata superiore di 1,5 volte rispetto al controllo normale, quindi significativamente (P<0,05) è diminuita in tutti i gruppi di CC in un intervallo dal 7,14% al 31%. Il tasso di efficienza della dieta nel gruppo HFD era del 16%, che era significativamente diverso (P< 0,05) da quello del gruppo di controllo (ND) all'11%. Questi risultati dimostrano che cc può ridurre l'aumento di peso corporeo indotto dall'HFD.
Peso del tessuto adiposo e del fegato
Il peso dei tessuti adiposi WAT epididimali, grassi sottocutanei e WAT perirenali era più elevato nel gruppo HFD, ma non nei gruppi HFD-CC(tabella 3). Il peso del fegato è diminuito significativamente (P<0,05) nel gruppo CC (da 100 a 450 mg/kg) con un intervallo del 15-28,4% rispetto a quelli del gruppo HFD(tabella 4).
Lipidi epatici e siero
I livelli di triacilgilcerolo siebro (TG) e colesterolo totale (TC) dopo 5 settimane di trattamento sono mostrati rispettivamente nelle figure 3A e 3B. I trigliceridi e il livello totale di colesterolo sono stati significativamente elevati rispettivamente di 1,32 volte e 1,31 volte, nei gruppi HFD rispetto a quelli dei gruppi ND. L'aumento dei livelli di TG e TC plasmatico nella dieta HFD è stato significativamente attenuato dalla somministrazione di 200 e 450 mg/kg/giorno di estratto di CC del 18,18% e del 22,7% per tg e 16,41% e 20,61% per TC, rispettivamente rispetto al controllo (ND).
Figura 1. Spettro UV-vis di chiodi di garofano ed estratto di cumino (CC) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Effetti del CC su: (A) peso corporeo (g), (B) assunzione di cibo nei topi C57BL6/J dietetici ad alto contenuto di grassi a 4 settimane di trattamento. I dati sono rappresentati come ± SD. Per ogni gruppo, n=8. Lettera diversa ha mostrato una differenza significativa (p<0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Effetti di CC su: (A) Trigliceridi, (B) Colesterolo totale. Tutti i dati sperimentali erano ± topi SD (n = 8). I topi sono stati trattati con 100, 200 e 450 mg/kg di CC per somministrazione orale giornaliera con alimentazione simultanea di HFD per 5 settimane. Lettere diverse indicano differenze significative tra tutti i gruppi (P < 05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| ingrediente | Quantità (g/kg) |
| caseina | 140 |
| L-Cisteina | 1.8 |
| strutto | 120 |
| olio di soia | 40 |
| Maltodestrina 10 | 150 |
| saccarosio | 450 |
| cellulosa | 50 |
| Vitamine e minerali | Equivalente tablet |
| Bitartrato di colina | 2.5 |
La tabella 1. Dieta ricca di grassi per topi C57BL6/ J.
| potenza | 370 Watt |
| Temperatura dell'acqua | 30 °C (86 °F) |
| Tempo di estrazione | 30 min |
| Concentrazione di solventi | 50% etanolo/50% acqua distillata |
| Numero di estrazioni | 2 estrazioni |
La tabella 2. Condizioni ecografiche ottimali per la preparazione dell'estratto di chiodi di garofano e cumino
| gruppo | WAT epididimale (g) | WAT perirenale (g) | Grasso sottocutaneo (g) | Grasso/Peso corporeo (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1.22 ± 0.09a |
| HFD | 2.30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0,15 ± 0,04a | 6.38 ± 1.02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1.26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0,12 ± 0,02a,b | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0,11 ± 0,04a,b | 3.21 ± 0,32 ter |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2.30 ± 0.45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2.41 ± 0.18c |
La tabella 3. Effetto del CC nei topi obesi indotti dalla dieta sul peso del tessuto adiposo bianco. Ogni valore è espresso come la media ± SD (n = 8). Lettera diversa ha mostrato differenze significative (P<0,05) rispetto al tessuto adiposo bianco (WAT)
| gruppo | Peso epatico (g) |
| Nd | 1.01 ± 0.05a |
| HFD | 1.48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1.26 ± 0,09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1.12 ± 0,03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1.06 ± 0.06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1.08 ± 0.07a |
La tabella 4. Effetto del CC nei topi obesi indotti dalla dieta sul peso del tessuto epatico. Ogni valore è espresso come la media ± SD (n = 8). Lettera diversa ha mostrato una differenza significativa (P<0,05) rispetto al tessuto adiposo bianco (WAT).
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Discussion
In questo studio abbiamo valutato, per la prima volta, l'effetto della somministrazione orale di una combinazione di chiodi di garofano ed estratto di cumino (CC) sui profili lipidici e obesità nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi per 5 settimane. I risultati hanno indicato che i gruppi HFD hanno mostrato un aumento di peso corporeo significativamente più elevato rispetto al gruppo ND, che ha mostrato che l'induzione dell'obesità nel modello obeso ha avuto successo. La dose somministrata di CC (100, 200 e 450 mg/kg/giorno) ha prodotto una riduzione dell'assunzione di cibo e del peso corporeo. Di conseguenza, la riduzione dell'assunzione di cibo deve essere dovuta a un calo dell'appetito degli animali.
La riduzione della dislipidemia è molto importante per prevenire i disturbi legati all'obesità. Nel nostro studio, i livelli totali di colesterolo e trigliceridi erano più bassi nel gruppo CC rispetto a quelli nei gruppi HFD e fentermine utilizzati come controllo positivo. I risultati hanno suggerito che il CC può inibire l'iperlipidemia e le sue complicanze.
Il nostro studio ha dimostrato che il gruppo HFD aveva aumentato il grasso corporeo, incluso il grasso addominale e epatico che sono stati significativamente ridotti dal completamento dell'estratto di CC. Ciò dimostra che il trattamento dell'estratto cc sui topi HFD riduce l'assorbimento lipidico a causa della sua attività anti-adipogenica.
In questo studio, abbiamo valutato un modello veloce per determinare l'effetto anti-obesità di un estratto da una combinazione di piante commestibili, Sizigium aromaticum (chiodi di garofano) e Cuminum cyminum (cumino) su topi C57BL6 / J, che hanno rapidamente sviluppato obesità con una dieta ricca di grassi. Il trattamento con CC ha impedito in modo significativo lo sviluppo dell'obesità e dell'iperlipidemia migliorata indotta dall'HFD somministrato ai topi. Complessivamente, i risultati di questa ricerca forniscono prove solide che questo metodo veloce di 5 settimane di durata sviluppato nel nostro laboratorio potrebbe essere utilizzato per valutare se una pianta ha la capacità di essere un potenziale agente per il trattamento dell'obesità.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dall'Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
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