Summary
Эта работа представляет собой протокол для изучения эффекта против ожирения двух растений, используемых вместе, в течение 5-недельного периода. Наблюдалось комбинированное введение экстракта и диета с высоким содержанием жиров (HFD) у мышей с ожирением. Метод может способствовать пользе растений при лечении ожирения.
Abstract
Несколько исследований показали, что фитохимическое содержание растений является потенциальным средством против ожирения. В этом исследовании мы изучаем влияние использования комбинации сухих пуговиц из Syzygium aromaticum и семян из Cuminum cyminum (CC) на мышах C57BL6 / J, индуцированных ожирением с помощью диеты с высоким содержанием жиров (HFD). Целью этого исследования является демонстрация того, что метод, предложенный в исследовании, значительно снизил ожирение после нескольких недель экспериментов. Экстракт из обоих растений был извлечен с использованием ультразвука для усиления экстракции фитохимических веществ. Оптимальные условия экстракции были получены с этанолом следующим образом: 50:50 в/об воды с ультразвуковой мощностью 300 Вт и время ультразвука 30 минут. Одновременный прием экстракта КК в HFD в течение 5 недель приводил к регуляции липидного профиля (холестерина и триглицеридов), снижению приема пищи, набору веса, жировой ткани и массы печени. Результаты, полученные этой моделью ожирения, показывают, что экстракт CC может предотвратить ожирение. По сравнению с традиционным 16-недельным методом (8 недель, чтобы потолстеть, и 8 недель, чтобы похудеть), аналогичные результаты были получены в настоящем исследовании модели ожирения за меньшее время экспериментов.
Introduction
Избыточное накопление жира в организме характерно для ожирения. Дисбаланс между потреблением и потреблением энергии приводит к хранению избыточной энергии в адипоцитах, что связано с метаболическими факторами риска гипергликемии и резистентности к инсулину при диабете 2 типа, гипертонии, гиперхолестеринемии и сердечно-сосудистых заболеваниях1,2.
Натуральные продукты с минимальными побочными эффектами и низкой стоимостью получили повышенное внимание, поскольку в предыдущих исследованиях сообщалось о биологически активных фитохимических веществах и потенциальных средствах против ожирения с механизмами, которые обращают вспять или задерживают метаболический синдром и связанные с ним патологии8.
Несколько лекарственных растений были изучены для предотвращения ожирения и связанных с ним заболеваний. Среди них Syzygium aromaticum был исследован на его потенциал против ожирения в лечении in vitro на клетках 3T3-L1 и in vivo на мышах, которых кормили диетой с высоким содержанием жиров11. Кроме того, значительные эффекты против избыточного веса наблюдались в многоцентровом открытом исследовании Cuminum cyminum на чрезвычайно тучных субъектах12. В этом исследовании мыши C57BL6 / J были использованы для исследования экспериментальной быстрой модели для оценки потенциального агента против ожирения с использованием комбинации обоих седобных растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по экспериментам на животных Национальной школы биологических наук (IPN; Протокол No 2732).
1. Приготовление экстракта комбинации гвоздики и тмина
ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты для купе, Syzygium aromaticum (гвоздика) и Cuminum cyminum (тмин) были приобретены у Central de Abastos CDMX, Мексика.
- Измельчите 500 г семян растений и выполните ультразвуковую экстракцию. Обжарьте их ультразвуком (320 Вт; частота 24 кГц, 30 мин) этанолом:водой (60:40 в/об) в диапазоне температур 30 ± 4 °C.13
- Фильтруйте твердые вещества с помощью фильтровальной бумаги Whatman No 2 под вакуумом и концентрируйте экстракт с помощью ротационного испарителя.
- Измерьте УФ-вис спектр экстракта обоих растений (CC).
2. Животные
- Для исследования используйте самцов мышей C57BL6/J шестинедельного возрасте (всего 48, масса тела 24-29 г).
- Размещайте животных группами по восемь человек в стандартных лабораторных условиях: температура (20-22 ± 1 °C), относительная влажность (45-54 ± 2%), освещение (08:00-20:00 ч) с едой и водой до либитума. Акклиматизируете мышей в этих условиях за неделю до эксперимента.
3. Экспериментальная процедура
- Приготовьте диету с высоким содержанием жиров14, как в таблице 1.
- В начале теста подвергая каждую из сформированных групп (n=8) различным методам лечения: Кормовая группа 1 на нормальной диете; 2 группа, на диете с высоким содержанием жиров; Группа 3, на диете с высоким содержанием жиров + 100 мг/кг экстракта КК; Группа 4, на диете с высоким содержанием жиров + 250 мг/кг экстракта КК; Группа 5, на диете с высоким содержанием жиров + 450 мг/кг экстракта КК; Группа 6, на диете с высоким содержанием жиров + фентермин (противопытный препарат, используемый в качестве положительного контроля)15.
- Кормите все группы мышей в течение 5 недель и записывайте количество потребляемой пищи ежедневно.
- В пробирке с пробкой гомогенизировать экстракт или препарат дозой воды, соответствующей группе, в которую вводится лечение. Это делается с помощью вихревого шейкера.
- После гомогенизации добавьте всю соответствующую обработку в поилку каждой группы.
4. Сбор образцов
- Измеряйте как потребление пищи, так и массу тела один раз в неделю. Голодать мышей на ночь в течение 5-недельного периода.
- Приносят их в жертву вывихом шейки матки и некропсией.
- После того, как мыши были принесены в жертву, обездвижьте их в лежачем положении.
- Используя чистые хирургические щипцы и ножницы, найдите и поднимите центральную кожу возле гениталий и сделайте небольшой разрез 0,2 мм.
- Вставьте плоские ножницы горизонтально в разрез и аккуратно отделите кожу живота от брюшной стенки.
- Щипцами поднимите центральную кожу и хирургическими ножницами разрезайте ее на уровне грудной клетки. Затем разрезают кожу над обеими задними конечностями, чтобы облегчить сбор жировой ткани.
- Обеспечьте забор всей жировой ткани из организма тупым рассечением ножницами и щипцами. После сбора поместите жировую ткань в алюминиевую фольгу. Не забывайте собирать жир вокруг репродуктивных органов. Избегайте накопления волос и кожи, чтобы не изменить результаты.
- Чтобы получить доступ к висцеральной жировой ткани, перережьте мышцу живота хирургическими ножницами от гениталий до грудной клетки, сделав разрез в мышцах живота от гениталий к спине мыши.
- Выполните гепатэктомию, чтобы удалить 100% печени. Чтобы экстернализировать печень, удалите ненужные органы и перережьте печеночные вены и артерии, чтобы отделить печень от остальной части тела. В качестве последнего шага точно извлеките желчный пузырь из печени16.
- Измерьте гиперхолестеринемию (холестерин) и гипертриглицеридемию (триглицериды) с помощью коммерческих наборов для анализа в соответствии с показаниями производителя.
5. Статистический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные результаты должны быть репрезентативными из трех независимых анализов, выраженных как среднее ± стандартного отклонения.
- Рассчитайте стандартную погрешность с помощью одностороннего анализа дисперсии ANOVA с последующим испытанием диапазона Туки. Рассмотрим P< 0,05 как статистически значимый.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ультразвуковая экстракция
Оптимальным условием экстракции для экстракции был этанол:вода (50:50, v/v) с ультразвуковой мощностью 300 Вт и временем ультразвуковой работы 30 мин. Таким образом, экстракция происходила быстрее, чем обычными методами экстракции(табл. 2). Экстракт показал интенсивный пик поглощения при 320 нм в УФ-видимых спектрах(рисунок 1).
Прием пищи и масса тела
Изменения массы тела мышей, получившей различные концентрации экстракта (100, 200 и 450 мг/кг) в течение 5 недель, показаны на рисунке 2А. Процент снижения веса в группах 3, 4 и 5 составил 12,2%, 30% и 41% соответственно. Это показывает, что наименьшее увеличение массы тела наблюдалось во всех группах; тем не менее, группа HFD имела увеличение в 2,1 раза по сравнению с группой с нормальной жировой диетой. Эти данные указывают на то, что доза КК 450 мг/кг более эффективна, чем 30 мг/кг фентермина (снижение на 39%) в снижении прироста массы тела.
Среднее потребление пищи в конце эксперимента в HFD + CC (450 мг / мл) было на 31% ниже, чем в группе ожирения (HFD), с уменьшением потребления пищи на 1,3 г по сравнению с группой ожирения(рисунок 2B). Потребление пищи у мышей, получавших HFD, было выше в 1,5 раза, чем в нормальном контроле, таким образом, оно значительно (P<0,05) снизилось во всех группах CC в диапазоне от 7,14% до 31%. Показатель эффективности диеты в группе HFD составил 16%, что значительно отличалось (P< 0,05) от контрольной группы (ND) на уровне 11%. Эти результаты показывают, что CC может уменьшить увеличение массы тела, вызванное HFD.
Жировая ткань и вес печени
Масса придатков яичка WAT, подкожно-жировой клетчатки и жировой клетчатки периренального WAT была выше в группе HFD-, но не в группах HFD-CC(таблица 3). Масса печени достоверно (P<0,05) снижалась в группе КК (от 100 до 450 мг/кг) с диапазоном 15%-28,4% по сравнению с таковыми в группе HFD(таблица 4).
Липиды печени и сыворотка крови
Уровни сывороточного триацилглицерина (ТГ) и общего холестерина (ТС) после 5 недель лечения показаны на рисунках 3А и 3Всоответственно. Уровень триглицеридов и общего холестерина был значительно повышен в 1,32 раза и 1,31 раза соответственно в группах HFD по сравнению с группами ND. Повышенные уровни плазменных ТГ и ТК в рационе HFD были значительно ослаблены введением 200 и 450 мг/кг/сут экстракта CC на 18,18% и 22,7% для TG и 16,41% и 20,61% для TC, соответственно, по сравнению с контрольной (ND).
Рисунок 1. UV-vis спектр экстракта гвоздики и тмина (CC) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Влияние CC на: (A) массу тела (g), (B) потребление пищи у мышей с высоким содержанием жиров C57BL6 / J через 4 недели лечения. Данные представляются в виде среднего ± SD. Для каждой группы n=8. Разные буквы показали существенную разницу (с<0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Влияние КК на: (А) триглицериды, (В) общий холестерин. Все экспериментальные данные были средними ± мышей SD (n = 8). Мышей лечили 100, 200 и 450 мг/кг КК для ежедневного перорального приема с одновременным кормлением HFD в течение 5 недель. Разные буквы указывают на существенные различия между всеми группами (P < 05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| ингредиент | Количество (г/кг) |
| казеин | 140 |
| L-цистеин | 1.8 |
| сало | 120 |
| Соевое масло | 40 |
| Мальтодекстрин 10 | 150 |
| сахароза | 450 |
| целлюлоза | 50 |
| Витамины и минералы | Эквивалент планшета |
| Холин Битартрат | 2.5 |
Таблица 1. Диета с высоким содержанием жиров для мышей C57BL6/J.
| сила | 370 Ватт |
| Температура воды | 30 °C (86 °F) |
| Время извлечения | 30 мин |
| Концентрация растворителя | 50% этанола/50% дистиллированной воды |
| Количество извлечений | 2 извлечения |
Таблица 2. Оптимальные условия ультразвука для приготовления экстракта гвоздики и тмина
| группа | Эпидидимальный WAT (г) | Периренальный WAT (г) | Подкожно-жировая ведра (г) | Жир/Масса тела (г/100) |
| НД | 0.32 ± 0.04a | 0.05 ± 0.06a | 0.08 ± 0.01б | 1.22 ± 0.09a |
| ВЧД | 2.30 ± 0.09б | 0.93 ± 0.07b | 0.15 ± 0.04a | 6.38 ± 1.02б |
| HFD + CC 100 мг/кг | 1.26 ± 0.08b | 0.50 ± 0.05b | 0,12 ± 0,02а,б | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 мг/кг | 0.90 ± 0.05б | 0.35 ± 0.04б | 0.11 ± 0.04a,b | 3.21 ± 0.32b |
| HFD + CC 400 мг/кг | 0,42 ± 0,07а | 0.16 ± 0.02c | 0.09 ± 0.03б | 2.30 ± 0.45c |
| HFD + PHE 30 мг/кг | 0.49 ± 0.05a | 0.19 ± 0.08с | 0.10 ± 0.01б | 2,41 ± 0,18с |
Таблица 3. Влияние КК у мышей с ожирением, вызванных диетой, на вес белой жировой ткани. Каждое значение выражается как среднее ± SD (n = 8). Разные буквы показали значительную разницу (P<0,05) и белую жировую ткань (WAT)
| группа | Масса печени (г) |
| НД | 1.01 ± 0.05a |
| ВЧД | 1.48 ± 0.08б |
| HFD + CC 100 мг/кг | 1.26 ± 0.09b |
| HFD + CC 200 мг/кг | 1.12 ± 0.03б |
| HFD + CC 400 мг/кг | 1.06 ± 0.06a |
| HFD + PHE 30 мг/кг | 1.08 ± 0.07a |
Таблица 4. Влияние КК у мышей с ожирением, вызванных диетой, на массу ткани печени. Каждое значение выражается как среднее ± SD (n = 8). Разные буквы показали значительную разницу (P<0,05) и белую жировую ткань (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы впервые оценили влияние перорального введения комбинации гвоздики и экстракта тмина (CC) на липидные профили и ожирение у мышей, которых кормили диетой с высоким содержанием жиров в течение 5 недель. Результаты показали, что группы HFD показали значительно более высокий прирост массы тела по сравнению с группой ND, которая показала, что индукция ожирения в модели ожирения была успешной. Введенная доза КК (100, 200 и 450 мг/кг/сут) вызывала снижение потребления пищи и массы тела. Следовательно, сокращение потребления пищи должно быть связано со снижением аппетита животных.
Снижение дислипидемии очень важно для предотвращения расстройств, связанных с ожирением. В нашем исследовании общие уровни холестерина и триглицеридов были ниже в группе CC по сравнению с группами HFD и фентермина, используемыми в качестве положительного контроля. Полученные данные свидетельствуют о том, что КК может ингибировать гиперлипидемию и ее осложнения.
Наше исследование показало, что в группе HFD было увеличено количество жира в организме, включая брюшной жир и жир печени, которые были значительно уменьшены добавками экстракта CC. Это показывает, что обработка экстрактом CC на мышах HFD снижает абсорбцию липидов из-за его антиадипогенной активности.
В этом исследовании мы оценили быструю модель для определения анти-ожирения эффекта экстракта из комбинации пищевых растений, Syzygium aromaticum (гвоздика) и Cuminum cyminum (тмин) на мышах C57BL6 / J, у которых быстро развивалось ожирение с диетой с высоким содержанием жиров. Лечение КК значительно предотвратило развитие ожирения и мелиорированной гиперлипидемии, вызванной HFD, назначаемым мышам. В целом, результаты этого исследования предоставляют убедительные доказательства того, что этот быстрый метод продолжительностью 5 недель, разработанный в нашей лаборатории, может быть использован для оценки того, обладает ли растение способностью быть потенциальным агентом для лечения ожирения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
- Singla, P., Bardoloi, A., Parkash, A. A. Metabolic effects of obesity: A review. World Journal of Diabetes. 1 (1), 76-88 (2010).
- Ojulari, O. V., Lee, S. G., Nam, J. O. Beneficial Effects of Natural Bioactive Compounds from Hibiscus sabdariffa L. on Obesity. Molecules. 24 (1), 210 (2019).
- Bahmani, M., et al. Obesity phytotherapy: review of native herbs used in traditional medicine for obesity. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 21 (3), 228-234 (2016).
- Ríos-Hoyo, A., Gutiérrez-Salmeán, G. New Dietary Supplements for Obesity: What We Currently Know. Current Obesity Reports. 5 (2), 262-270 (2016).
- Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B., Abdollahi, M. A systematic review of the efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of obesity. World Journal Gastroenterology. 15 (25), 3073-3085 (2009).
- Hardeman, W., Griffin, S., Johnston, M., Kinmonth, A. L., Wareham, N. J. Interventions to prevent weight gain: a systematic review of psychological models and behaviour change methods. Nternational Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 24 (1), 131-143 (2000).
- Dinda, B., Dinda, M., Roy, A., Dinda, S. Dietary plant flavonoids in prevention of obesity and diabetes. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 120, 159-235 (2020).
- Mayer, M. A., Hocht, C., Puyo, A., Taira, C. A. Recent advances in obesity pharmacotherapy. Current Clinical Pharmacology. 4 (1), 53-61 (2009).
- Rafie, A. Z. M., Syahir, A., Ahmad, W. A. N. W., Mustafa, M. Z., Mariatulqabtiah, A. R. 2018 supplementation of stingless bee honey from heterotrigona itama improves antiobesity parameters in high-fat diet induced obese rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 6371582 (2018).
- Song, J., et al. Anti-obesity effects of the flower of prunus persica in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients. 11, 2176 (2019).
- Jung, C. H., Ahn, J., Jeon, T. -I., Kim, T. W., Ha, T. Y. Syzygium aromaticum ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice through downregulation of adipogenic and lipogenic gene expression. Experimental and Therapeutic Medicine. 4 (3), 409-414 (2012).
- Said, O., Saad, B., Fulder, S., Khalil, K., Kassis, E. Weight Loss in Animals and Humans Treated with "Weigh level", a Combination of Four Medicinal Plants Used in Traditional Arabic and Islamic Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 874538 (2011).
- Anaya-Esparza, L. M., Ramos-Aguirre, D., Zamora-Gasga, V. M., Yahia, E., Montalvo-Gonzalez, E. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Justicia spicigera leaves. Food Science and Biotechnology. 27 (4), 1093-1102 (2018).
- Ayoub, R. M., et al. The effect of anthocyanin-rich purple vegetable diets on metabolic syndrome in obese Zucker. Journal of Medical Food. , (2017).
- Go, R., et al. Effects of anti-obesity drugs, phentermine and mahuang, on the behavioral patterns in Sprague-Dawley rat model. Laboratory of Animals Research. 30 (2), 73-78 (2014).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA analysis. Journal of Visualized Experiments. (13), e57026 (2018).
- Bjorndal, B., Burri, L., Staalesen, V., Skorve, J., Berge, R. K. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of Obesity. 2011, 490650 (2011).
