Summary
Este trabalho apresenta um protocolo para explorar o efeito antiobesidade de duas plantas utilizadas juntas, durante uma duração de 5 semanas. Houve uma administração combinada do extrato e da dieta rica em gordura (HFD) nos camundongos obesos. O método pode promover os benefícios das estações no tratamento da obesidade.
Abstract
Vários estudos demonstraram que o conteúdo fitoquímico das plantas são potenciais agentes anti-obesidade. Neste estudo, examinamos o efeito do uso de uma combinação de botões secos do Aromático Syzygium e sementes de Cuminum cyminum (CC) em camundongos C57BL6/J induzidos pela obesidade via dieta rica em gordura (HFD). O objetivo deste estudo é demonstrar que o método proposto no estudo reduziu significativamente a obesidade após várias semanas de experimentação. O extrato de ambas as plantas foi extraído por meio de ultrassom para melhorar a extração de fitoquímicos. As condições de extração ideais foram obtidas com etanol da seguinte forma: 50:50 v/v de água com uma potência de ultrassom de 300 W, e tempo de ultrassônica de 30 minutos. A administração simultânea do extrato cc em HFD por 5 semanas levou à regulação de perfis lipídes (colesterol e triglicérides), redução da ingestão alimentar, ganho de peso, tecido adiposo e peso hepático. Achados obtidos por este modelo obeso indicam que o extrato de CC pode prevenir a obesidade. Em comparação com o método tradicional de 16 semanas (8 semanas para engordar e 8 semanas para perder peso), resultados semelhantes foram obtidos no modelo obeso do presente estudo em menos tempo de experimentação.
Introduction
O excesso de acúmulo de gordura corporal é uma característica da obesidade. O desequilíbrio entre consumo de energia e consumo leva ao armazenamento do excesso de energia em adipócitos, que está relacionado a fatores de risco metabólicos para hiperglicemia e resistência à insulina no diabetes tipo 2, hipertensão, hipercolesterolemia e doenças cardiovasculares1,2.
Produtos naturais com efeitos colaterais mínimos e baixo custo têm recebido maior atenção desde que estudos anteriores relataram fitoquímicos bioativos e potenciais agentes anti-obesidade com mecanismos que revertem ou retardam a síndrome metabólica e patologias associadas8.
Várias plantas medicinais têm sido estudadas para prevenir a obesidade e doenças relacionadas. Entre eles, o Aromático Syzygium tem sido investigado por seu potencial anti-obesidade em tratamento in vitro em células 3T3-L1 e tratamento in vivo em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura11. Além disso, efeitos anti-sobrepeso significativos foram observados em um ensaio aberto multicêntrico de cuminum cyminum sobre indivíduos extremamente obesos12. Neste estudo, os camundongos C57BL6/J foram utilizados para investigar o modelo experimental rápido para avaliar um potencial agente antiobesidade usando uma combinação de ambas as plantas comestíveis.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentos Com Animais da Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protocolo nº 2732).
1. Preparação do extrato da combinação de cravo e cominho
NOTA: As plantas comestíveis, Syzygium aromaticum (cravo) e cuminum cyminum (cominho) foram compradas da Central de Abastos CDMX, México.
- Triture 500 g de sementes das plantas e realize extração ultrassônica assistida. Sonicate-los (320 Watts; frequência de 24 kHz, 30 min) com etanol:água (60:40 v/v) a uma faixa de temperatura de 30 ± 4 °C.13
- Filtre os sólidos usando o papel filtro Whatman número 2 sob vácuo e concentre o extrato com um evaporador rotativo.
- Meça o espectro UV-vis do extrato de ambas as plantas (CC).
2. Animais
- Use camundongos C57BL6/J machos de seis semanas de idade (48 no total, peso corporal 24-29 g) para o estudo.
- Abrigar os animais em grupos de oito em condições laboratoriais padrão: temperatura (20-22 ± 1 °C), umidade relativa (45-54 ± 2%), iluminação (08:00-20:00 h) com alimentos e água ad libitum. Aclimes os ratos nestas condições por uma semana antes do experimento.
3. Procedimento Experimental
- Prepare a dieta de alta gordura14 como na Tabela 1.
- No início do teste, cada um dos grupos se formou (n = 8) a diferentes tratamentos: Grupo de Alimentação 1 em uma dieta normal; Grupo 2, em dieta rica em gordura; Grupo 3, em dieta rica em gordura + 100 mg/kg de extrato cc; Grupo 4, em dieta rica em gordura + 250 mg/kg de extrato cc; Grupo 5, em dieta rica em gordura + 450 mg/kg de extrato cc; Grupo 6, em dieta rica em gordura + fentermina (um medicamento antiobesidade usado como controle positivo)15.
- Alimente todos os grupos de camundongos por 5 semanas e regise a quantidade de alimentos consumidos diariamente.
- Em um tubo de ensaio com rolha, homogeneize o extrato ou a droga com a dose de água correspondente ao grupo ao qual o tratamento está sendo administrado. Isso é feito com shaker de vórtice.
- Uma vez homogeneizado, adicione todo o tratamento correspondente ao bebedor de cada grupo.
4. Coleta de amostras
- Meça tanto a ingestão de alimentos quanto o peso corporal uma vez por semana. Acelere os ratos durante a noite por um período de 5 semanas.
- Sacrifique-os por luxação cervical e necropsia.
- Depois que os ratos foram sacrificados, imobilize-os em uma posição supina.
- Usando fórceps cirúrgicos limpos e tesouras, localize e levante a pele central perto dos genitais e faça uma pequena incisão de 0,2 mm.
- Insira a tesoura plana horizontalmente na incisão e separe cuidadosamente a pele abdominal da parede abdominal.
- Com as fórceps, levante a pele central e com a tesoura cirúrgica corte-a ao nível da caixa torácica. Em seguida, corte a pele acima de ambos os membros traseiros para facilitar a coleta de tecido adiposo.
- Certifique-se da coleta de todo tecido adiposo do corpo por dissecção contundente com tesoura e fórceps. Uma vez coletado, coloque o tecido adiposo em papel alumínio. Lembre-se de coletar a gordura ao redor dos órgãos reprodutivos. Evite o acúmulo de cabelo e pele para não alterar os resultados.
- Para acessar o tecido adiposo visceral, corte o músculo abdominal com uma tesoura cirúrgica dos genitais até a caixa torácica, fazendo uma incisão nos músculos abdominais dos genitais em direção às costas do camundongo.
- Faça uma hepatectomia para remover 100% do fígado. Para externalizar o fígado, remova órgãos desnecessários e corte as veias e artérias hepáticas para separar o fígado do resto do corpo. Como último passo, extraia precisamente a vesícula biliar do fígado16.
- Medir hipercolesterolemia (colesterol) e hipertriglicenciemia (triglicerídeos) utilizando kits de ensaio comercial de acordo com as indicações do fabricante.
5. Análise estatística
NOTA: Todos os resultados experimentais devem ser representativos de três ensaios independentes, expressos como ± desvio padrão.
- Calcule o erro padrão com uma análise de variância ANOVA unidirecional seguida do teste de alcance de Tukey. Considere um P< 0,05 como estatisticamente significante.
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Representative Results
Extração assistida por ultrassônico
A condição ideal de extração para a extração foi etanol:água (50:50, v/v) com uma potência de ultrassom de 300 W e um tempo de ultrassônica de 30 min. Dessa forma, a extração foi mais rápida que os métodos convencionais de extração(Tabela 2). O extrato mostrou um pico de absorção intenso de 320 nm em espectros visíveis UV(Figura 1).
Ingestão de alimentos e peso corporal
As alterações no peso corporal dos camundongos dadas diferentes concentrações do extrato (100, 200 e 450 mg/kg) durante 5 semanas são mostradas na Figura 2A. Os percentuais de redução de peso nos grupos 3, 4 e 5 foram de 12,2%, 30% e 41%, respectivamente. Isso mostra que o menor ganho de peso corporal foi observado em todos os grupos; no entanto, o grupo HFD teve um aumento de 2,1x em relação ao grupo normal de dieta de gordura. Esses dados indicam que uma dose de 450 mg/kg de CC é mais eficaz do que 30 mg/kg de fentermina (redução de 39%) na redução do ganho de peso corporal.
A ingestão média de alimentos ao final do experimento no HFD + CC (450 mg/mL) foi 31% menor que a do grupo obeso (HFD), com redução de 1,3 g na ingestão de alimentos em relação ao grupo obeso(Figura 2B). A ingestão de alimentos nos camundongos alimentados pelo HFD foi maior em 1,5 vezes do que no controle normal, diminuindo significativamente (P<0,05) em todos os grupos cc em uma faixa de 7,14% a 31%. A taxa de eficiência alimentar no grupo HFD foi de 16%, o que foi significativamente diferente (P< 0,05) do grupo controle (ND) em 11%. Esses resultados demonstram que a CC pode reduzir o ganho de peso corporal induzido pelo HFD.
Tecido adiposo e peso hepático
O peso do WAT epidídímico, gordura subcutânea e tecidos adiposos WAT perirenal foi maior no grupo HFD, mas não nos grupos HFD-CC(Tabela 3). O peso hepático foi significativamente (P<0,05) diminuiu no grupo CC (100 a 450 mg/kg) com intervalo de 15%-28,4% em relação aos do grupo HFD(Tabela 4).
Lipídios hepáticos e soro
Os níveis de triaciglicerol sérico (TG) e colesterol total (TC) após 5 semanas de tratamento são mostrados nas Figuras 3A e 3B, respectivamente. Os triglicérides e o nível total de colesterol foram significativamente elevados em 1,32 vezes e 1,31 vezes, respectivamente, em grupos de HFD em comparação com os dos grupos ND. Os níveis elevados de TG plasmá plasma e TC na dieta HFD foram significativamente atenuados pela administração do extrato cc de 200 e 450 mg/kg/dia em 18,18% e 22,7% para TG e 16,41% e 20,61% para TC, respectivamente em comparação com o controle (ND).
Figura 1. Espectro UV-vis de extrato de cravo e cominho (CC) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Efeitos de CC on: (A) peso corporal (g), (B) ingestão alimentar em camundongos de Dieta rica em gordura C57BL6/J em 4 semanas de tratamento. Os dados são representados como ± SD. Para cada grupo, n=8. Letras diferentes apresentaram diferença significativa (p<0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Efeitos da CC em: (A) Triglicérides, (B) Colesterol total. Todos os dados experimentais foram médios ± camundongos SD (n = 8). Os camundongos foram tratados com 100, 200 e 450 mg/kg de CC para administração oral diária com alimentação simultânea de HFD por 5 semanas. Diferentes letras indicam diferenças significativas entre todos os grupos (P < 05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| ingrediente | Quantidade (g/kg) |
| caseína | 140 |
| L-Cysteine | 1.8 |
| banha | 120 |
| óleo de soja | 40 |
| Maltodextrina 10 | 150 |
| sacarose | 450 |
| celulose | 50 |
| Vitaminas e Minerais | Equivalente a tablet |
| Bitartrate de colina | 2.5 |
Mesa 1. Dieta rica em gordura para camundongos C57BL6/J.
| poder | 370 Watts |
| Temperatura da água | 30 °C (86 °F) |
| Tempo de extração | 30 min. |
| Concentração de solventes | 50% de etanol/50% água destilada |
| Número de extrações | 2 extrações |
Mesa 2. Condições ideais de ultrassom para a preparação do extrato de cravo e cominho
| grupo | WAT epidídmico (g) | Wat perirenal (g) | Gordura subcutânea (g) | Peso gordo/corporal (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1.22 ± 0,09a |
| HFD | 2.30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0.15 ± 0,04a | 6.38 ± 1,02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0.12 ± 0,02a,b | 5.12 ± 1,93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0.11 ± 0,04a,b | 3.21 ± 0.32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0.16 ± 0,02c | 0.09 ± 0,03b | 2.30 ± 0,45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0.19 ± 0,08c | 0.10 ± 0,01b | 2.41 ± 0,18c |
Mesa 3. Efeito de CC em camundongos obesos induzidos pela dieta no peso do tecido adiposo branco. Cada valor é expresso como a média ± SD (n = 8). Letras diferentes mostraram diferença significativa (P<0,05) vs tecido adiposo branco (WAT)
| grupo | Peso hepático (g) |
| Nd | 1.01 ± 0,05a |
| HFD | 1,48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1.26 ± 0,09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1.12 ± 0,03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1.06 ± 0,06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1.08 ± 0,07a |
Mesa 4. Efeito de CC em camundongos obesos induzidos pela dieta no peso do tecido hepático. Cada valor é expresso como a média ± SD (n = 8). Letras diferentes mostraram diferença significativa (P<0,05) vs tecido adiposo branco (WAT).
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Discussion
Neste estudo, avaliamos, pela primeira vez, o efeito da administração oral de uma combinação de dentes de cravo e cominho (CC) em perfis lipídes e obesidade em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura por 5 semanas. Os achados indicaram que os grupos de HFD apresentaram um ganho de peso corporal significativamente maior em relação ao grupo ND, que mostrou que a indução da obesidade no modelo obeso foi bem sucedida. A dose administrada de CC (100, 200 e 450 mg/kg/dia) produziu uma redução na ingestão de alimentos e no peso corporal. Consequentemente, a redução do consumo alimentar deve-se ao declínio do apetite dos animais.
A redução da dislipidemia é muito importante para prevenir transtornos relacionados à obesidade. Em nosso estudo, os níveis totais de colesterol e triglicérides foram menores no grupo CC em comparação com os dos grupos de HFD e fentermina utilizados como controle positivo. Os achados sugerem que a CC pode inibir a hiperlipidemia e suas complicações.
Nosso estudo mostrou que o grupo HFD teve aumento da gordura corporal, incluindo gordura abdominal e hepática que foram significativamente reduzidas pela suplementação do extrato cc. Isso mostra que o tratamento de extrato de CC nos camundongos HFD reduz a absorção lipídica devido à sua atividade anti-adipogênica.
Neste estudo, avaliamos um modelo rápido para determinar o efeito antiobesidade de um extrato de uma combinação de plantas comestíveis, aromático Syzygium (cravo) e cuminum cyminum (cominho) em camundongos C57BL6/J, que rapidamente desenvolveram obesidade com uma dieta rica em gordura. O tratamento cc impediu significativamente o desenvolvimento da obesidade e da hiperlipidemia amentrada induzida pelo HFD dada aos camundongos. Ao todo, os achados desta pesquisa fornecem evidências sólidas de que esse método rápido de 5 semanas de duração desenvolvido em nosso laboratório poderia ser usado para avaliar se uma planta tem a capacidade de ser um agente potencial para o tratamento da obesidade.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Esta pesquisa contou com o apoio do Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
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