Summary
We hebben een eenvoudig en goedkoop protocol ontwikkeld om Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïnecomplexen in virusachtige deeltjes te laden. Deze deeltjes, genaamd "Nanoblades", maken een efficiënte levering van het Cas9 / sgRNA-complex mogelijk in onsterfelijke en primaire cellen, evenals in vivo.
Abstract
Het geclusterde, regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas-systeem heeft genoombewerking in eukaryote cellen gedemocratiseerd en geleid tot de ontwikkeling van tal van innovatieve toepassingen. De afgifte van het Cas9-eiwit en single-guide RNA (sgRNA) in doelcellen kan echter technisch een uitdaging zijn. Klassieke virale vectoren, zoals die afgeleid van lentivirussen (LVs) of adeno-geassocieerde virussen (AAV's), zorgen voor een efficiënte afgifte van transgenen die coderen voor het Cas9-eiwit en het bijbehorende sgRNA in veel primaire cellen en in vivo. Niettemin kunnen deze vectoren last hebben van nadelen zoals integratie van het transgen in het doelcelgenoom, een beperkte laadcapaciteit en langetermijnexpressie van het Cas9-eiwit en gids-RNA in doelcellen.
Om een aantal van deze problemen te overwinnen, werd een toedieningsvector op basis van het muizenleukemievirus (MLV) ontwikkeld om het Cas9-eiwit en het bijbehorende gids-RNA te verpakken in afwezigheid van een coderend transgen. Door het Cas9-eiwit te fuseren met de C-terminus van het structurele eiwit Gag uit MLV, werden virusachtige deeltjes (VLP's) geladen met het Cas9-eiwit en sgRNA (genaamd "Nanoblades") gevormd. Nanoblades kunnen worden verzameld uit het kweekmedium van productiecellen, gezuiverd, gekwantificeerd en gebruikt om doelcellen te transduceren en het actieve Cas9 / sgRNA-complex af te leveren. Nanoblades leveren hun ribonucleoproteïne (RNP) lading tijdelijk en snel af in een breed scala aan primaire en onsterfelijke cellen en kunnen worden geprogrammeerd voor andere toepassingen, zoals voorbijgaande transcriptionele activering van gerichte genen, met behulp van gemodificeerde Cas9-eiwitten. Nanoblades zijn in staat tot in vivo genoombewerking in de lever van geïnjecteerde volwassen muizen en in eicellen om transgene dieren te genereren. Ten slotte kunnen ze worden gecomplexeerd met donor-DNA voor "transfectievrij" homologiegericht herstel. Nanoblade-voorbereiding is eenvoudig, relatief goedkoop en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in elk celbiologisch laboratorium.
Introduction
In vergelijking met andere programmeerbare nucleasen heeft het CRISPR-Cas-systeem de procedure van sequentiespecifieke genoomtargeting en splitsing in eukaryote cellen drastisch vereenvoudigd en gedemocratiseerd. Door de eenvoudige expressie van een sgRNA kunnen gebruikers het Cas9-eiwit (of geoptimaliseerde varianten) programmeren voor bijna elke cellulaire locus1. In dit scenario wordt de afgifte van het Cas9-eiwit en sgRNA de belangrijkste beperking bij het uitvoeren van locatiegerichte mutagenese. In onsterfelijke cellen kunnen het sgRNA en het Cas-eiwit gemakkelijk tot expressie worden gebracht uit getransfecteerde plasmiden om efficiënte genoomtargeting in de meeste cellen te bereiken. Constitutieve expressie van het Cas9/sgRNA-complex kan echter de off-target activiteit van het Cas9-eiwit verhogen en ongewenste veranderingen in niet-specifieke loci2 introduceren. In primaire cellen kan DNA-transfectie technisch moeilijk te bereiken zijn en leiden tot slechte expressie of een klein percentage getransfecteerde cellen. Alternatieven voor klassieke DNA-transfectie omvatten het gebruik van virale vectoren die een transgeen leveren dat codeert voor het Cas9 en sgRNA of de elektroporatie van recombinant Cas9-eiwit gekoppeld aan een synthetisch sgRNA. Deze benaderingen kunnen echter leiden tot transgene integratie in het celgastheergenoom (zoals het geval is voor klassieke retrovirale en lentivirale expressievectoren), beperking door cellulaire factoren en leiden tot constitutieve expressie van het Cas9-eiwit en sgRNA.
Elektroporatie van het Cas9/sgRNA RNP-complex kan de meeste van deze problemen overwinnen en leiden tot efficiënte en voorbijgaande toediening in primaire cellen en in vivo, evenals een dosisafhankelijke respons mogelijk maken. Niettemin is het meestal afhankelijk van dure apparatuur en reagentia en is het ook moeilijk op te schalen als een groot aantal cellen moet worden behandeld. Als alternatief voor de bovengenoemde technieken hebben deze auteurs "Nanoblades" ontwikkeld - een retrovirale toedieningsvector voor het Cas9-eiwit en sgRNA3 die conceptueel vergelijkbaar is met andere virale afgeleide capsid-eiwitafgiftesystemen4,5,6,7,8. Nanoblades maken gebruik van de natuurlijke capaciteit van het Gag-polyproteïne uit retrovirussen om, wanneer ze alleen in gekweekte cellen tot expressie worden gebracht, VLP's te produceren die vrijkomen in het extracellulaire medium9. Door het Cas9-eiwit te fuseren met het C-terminale uiteinde van het murine leukemievirus (MLV) Gag polyproteïne en het sgRNA en virale envelop glycoproteïnen co-expressie te geven, kan het Cas9-eiwit worden ingekapseld in vrijgegeven VLP's of Nanoblades. Na zuivering kunnen de Nanoblades worden geïncubeerd met doelcellen of in vivo worden geïnjecteerd om te bemiddelen bij snelle, voorbijgaande en dosisafhankelijke toediening van het Cas9/sgRNA RNP-complex3.
Nanoblades kunnen worden geprogrammeerd met meerdere sgRNA's voor gelijktijdige bewerking op verschillende loci of met Cas9-varianten om andere toepassingen uit te voeren, zoals doelspecifieke transcriptionele activering of repressie3. In tegenstelling tot eiwitelektroporatie, die afhankelijk is van recombinante expressie, kunnen nieuw beschreven Cas-varianten uit de literatuur gemakkelijk worden gekloond in de Gag-fusie-expressievector, waardoor het een veelzijdig platform is. Nanoblades kunnen verder worden gecomplexeerd of geladen met enkelstrengs en dubbelstrengs oligodeoxynucleotiden (ssODN's) om homologiegerichte reparatie uit te voeren3. Nanoblade productie is relatief eenvoudig en goedkoop. Bovendien kunnen Nanoblades vele dagen bij 4 °C worden bewaard of bij -80 °C voor langdurige opslag. Doorgaans bemiddelen Nanoblades efficiënte, transgene-vrije genoombewerking in de meeste vereeuwigde en primaire gekweekte cellen. Sommige primaire cellen kunnen echter gevoelig zijn voor de aanwezigheid van virale deeltjes, wat resulteert in verhoogde mortaliteit. Cellen van het aangeboren immuunsysteem kunnen ook reageren op de aanwezigheid van Nanoblades (vanwege hun virale oorsprong) en geactiveerd worden. In deze gevallen moet het transductieprotocol worden geoptimaliseerd om de blootstellingstijd aan Nanoblades te beperken en niet-specifieke effecten te minimaliseren. Nanoblades vormen een levensvatbaar en eenvoudig te implementeren alternatief voor andere beschikbare CRISPR-toedieningsmethoden.
Protocol
1. sgRNA-ontwerp en klonen
OPMERKING: Richtlijnen voor het ontwerp van sgRNA's kunnen worden verkregen uit meerdere bronnen, zoals https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing of van Hanna en Doench10.
- Zodra de 20 nucleotide sgRNA-sequenties zijn ontworpen, bestelt u de volgende enkelstrengs DNA-oligonucleotiden:
- Voorwaarts: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N komt overeen met de beoogde locus zonder de protospacer-aangrenzende motief (PAM) sequentie)
- Achterzijde: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N komt overeen met de omgekeerde aanvulling van de beoogde locus zonder de PAM-sequentie)
OPMERKING: Er zijn geen speciale wijzigingen nodig bij het bestellen van de oligonucleotiden (geen vereiste voor 5'-fosfaat).
- Hybridiseer de twee DNA-oligonucleotiden in een 0,2 ml polymerasekettingreactie (PCR) buis door 5 μL gloeibuffer (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 bij 25 °C), 1 μL van elk DNA-oligonucleotide (100 μM stamoplossing in water) en 42 μL water te mengen.
- Incubeer op een PCR-blok monsters bij 95 °C gedurende 15 s en verlaag vervolgens de temperatuur tot 20 °C met een helling van 0,5 °C/s. Bewaren bij kamertemperatuur of bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Verteer 10 μg blade- of SUPERBLADE-sgRNA-expressieplasmiden met 10 eenheden BsmBI-v2-restrictie-enzym gedurende 3 uur bij 55 °C in een totaal reactievolume van 50 μL.
OPMERKING: De verteerde vector moet een DNA-insert van ~1,9 kb en een tweede DNA-fragment van ~3,3 kb vrijgeven. - Laad de restrictiereactie op een 1% agarosegel gekleurd met 5 μg/ml ethidiumbromide (of een veiliger alternatief DNA-gelvlek).
OPMERKING: Draag geschikte beschermingsmiddelen bij het manipuleren van ethidiumbromide, waarvan wordt vermoed dat het genetische defecten veroorzaakt.- Op een ultraviolette (UV) tafel met een golflengte van 312 nm (om beschadiging van het DNA te voorkomen), knip het 3,3 kb DNA-fragment uit de gel en plaats het in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
OPMERKING: Draag geschikte beschermingsmiddelen (handschoenen en UV-beschermingsbril) bij het manipuleren van ethidiumbromide en het werken op de UV-tafel. - Extraheer DNA uit de gesneden gel met het 3,3 kb DNA-fragment met behulp van een speciale DNA-gelextractiekit (zie de tabel met materialen). Kwantificeer de hoeveelheid gezuiverd DNA met behulp van een spectrofotometer.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
- Op een ultraviolette (UV) tafel met een golflengte van 312 nm (om beschadiging van het DNA te voorkomen), knip het 3,3 kb DNA-fragment uit de gel en plaats het in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Ligaat de gehybridiseerde voorwaartse en omgekeerde DNA-oligonucleotiden van stap 1.2 naar de BsmB1-verteerde, gelgezuiverde BLADES of SUPERBLADE-vector uit stap 1.5.2. Voeg hiervoor 2 μL T4 DNA-ligasebuffer, 50 ng van de gelgezuiverde vector (vanaf stap 1.5.2), 1 μL van de gehybridiseerde DNA-oligonucleotiden (van stap 1.2), water om het volume te vormen tot 19 μL en 1 μL T4 DNA-ligase toe. Incubeer de reactie bij 25 °C gedurende 10 minuten.
- Zet het ligatieproduct om in competente bacteriën (zie de tabel met materialen) zoals beschreven in11. Leg de getransformeerde bacteriën op een ampicilline Luria Bertani agarplaat en incubeer een nacht bij 37 °C.
- Selecteer verschillende geïsoleerde kolonies op de agarplaat om DNA-minivoorbereiding11 uit te voeren (zie de tabel met materialen) en voer Sanger-sequencing uit met behulp van een U6 voorwaartse primer (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') om te controleren op correcte ligatie van de variabele sgRNA-sequentie.
OPMERKING: Andere sgRNA-expressieplasmiden kunnen worden gebruikt als ze niet coderen voor het Cas9-eiwit, wat de productie van Nanoblade zou kunnen verstoren.
2. Plasmide bereiding
- Voer maxipreparatie (zie de tabel met materialen) uit van alle vereiste plasmiden en bereid 10 μg aliquots bij 1 μg /ml om op te slaan bij -20 °C. Vermijd herhaalde vries- / ontdooicycli van de plasmiden; gebruik aliquots twee keer voordat u ze weggooit.
3. Nanoblade voorbereiding
- Op dag 1 zaait u tussen 3,5 en 4 × 106 HEK293T-cellen (zie de tabel met materialen) in 10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) met hoge glucose, natriumpyruvaat, L-glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS) en penicilline / streptomycine in een celkweekschaal van 10 cm. Beweeg de plaat van 10 cm voorzichtig heen en weer, dan van rechts naar links (herhaal deze reeks 5x) om de cellen homogeen over de kweekschaal te verdelen. Incubateer cellen bij 37 °C in een celincubator met 5% CO2.
OPMERKING: Alle procedures met betrekking tot de behandeling van gekweekte cellen en nanobladen moeten worden uitgevoerd onder een celkweek laminaire stroomkap om hun besmetting te voorkomen. - Dag 2: Plasmide transfectie
- Cellen moeten 24 uur na plating 70-80% confluent zijn (figuur 1A). Vervang het medium door 10 ml verse DMEM met hoge glucose, natriumpyruvaat, L-glutamine, 10% FBS (penicilline en streptomycine kunnen worden weggelaten, hoewel het niet verplicht is) vóór transfectie.
OPMERKING: Bij deze stap is het belangrijk dat de cellen niet confluent zijn. Anders zouden de transfectie-efficiëntie en de deeltjesproductie kunnen worden verminderd. - Bereid voor elke plaat van 10 cm de volgende hoeveelheden plasmiden in een buis van 1,5 ml: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg BLADES of SUPERBLADES plasmide dat codeert voor het gekloonde sgRNA (of 2,2 μg elk bij gebruik van twee sgRNA's).
- Voeg 500 μL transfectiebuffer toe (zie de tabel met materialen), vortex gedurende 10 s en centrifugeer vervolgens gedurende 1 s. Voeg 20 μL van het transfectiereagens toe (zie de tabel met materialen), vortex de buis gedurende 1 s en centrifugeer vervolgens gedurende 1 s.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en voeg de volledige oplossing druppelsgewijs toe aan de cellen in DMEM-medium met behulp van een P1000-pipettor. Beweeg de plaat van 10 cm voorzichtig heen en weer, dan van rechts naar links (herhaal deze reeks 5x) om het transfectiereagens gelijkmatig over de cellen te verdelen. Incubeer cellen bij 37 °C gedurende ten minste 40 uur in een celincubator met 5% CO2.
OPMERKING: Indien gewenst kan het medium 4 uur na transfectie worden gewijzigd.
- Cellen moeten 24 uur na plating 70-80% confluent zijn (figuur 1A). Vervang het medium door 10 ml verse DMEM met hoge glucose, natriumpyruvaat, L-glutamine, 10% FBS (penicilline en streptomycine kunnen worden weggelaten, hoewel het niet verplicht is) vóór transfectie.
- Controleer op dag 3 de morfologie van de getransfecteerde cellen onder de microscoop.
OPMERKING: Producentencellen beginnen te fuseren. Dit is een normaal verschijnsel als gevolg van de expressie van fusogene virale enveloppen (figuur 1B, C). - Dag 4: Nanoblades oogsten
OPMERKING: Ten minste 40 uur na transfectie zouden de cellen samengesmolten zijn vanwege de expressie van de fusogene virale enveloppen, en soms zijn de cellen volledig losgekoppeld van de plaatsteun (figuur 1D).- Verzamel 9 ml van het kweekmedium supernatant met behulp van een pipet van 10 ml.
OPMERKING: Nanoblades zijn VLP's die in staat zijn om het Cas9-eiwit en het bijbehorende sgRNA in primaire cellen en in vivo af te leveren. Hoewel ze niet als genetisch gemodificeerde organismen worden beschouwd omdat ze verstoken zijn van genetisch materiaal, kunnen ze genetische veranderingen veroorzaken. Daarom moeten ze met voorzichtigheid worden gemanipuleerd om contact met gebruikers te vermijden (vooral als ze zijn geprogrammeerd om tumorsuppressorgenen te targeten). Gebruikers wordt geadviseerd om hun lokale veiligheidsrichtlijnen voor de manipulatie van retrovirale vectoren te volgen en in een laboratorium op BSL-2-niveau te werken bij het voorbereiden van VLP's en het uitvoeren van transductie-experimenten. Nanoblades kunnen worden geïnactiveerd met 70% ethanol of 0,5% natriumhypochloriet. Het is ook raadzaam om al het plastic afval (pipetpunten, weefselkweekplaten, centrifugatiebuizen) gedurende ten minste 10 minuten te behandelen met 0,5% natriumhypochloriet om de Nanoblades te inactiveren. - Centrifugeer het verzamelde supernatant bij 500 × g gedurende 5 minuten om cellulair afval te verwijderen en het supernatant terug te winnen zonder de celkorrel te verstoren.
OPMERKING: Als nanobladen bedoeld zijn voor gebruik op primaire cellen, filtert u het supernatant met een filter van 0,45 μm of 0,8 μm. Houd er rekening mee dat deze stap de Nanoblade-titer drastisch vermindert, omdat een aanzienlijk deel in het filtermembraan wordt geblokkeerd. - Pellet de Nanoblades 's nachts (12-16 uur) in een zwenkende emmerrotor bij 4.300 × g of bij 209.490 × g in een ultracentrifuge gedurende 75 minuten bij 4 °C (zie de materiaaltabel).
OPMERKING: Als doelcellen in DMEM kunnen groeien, is het mogelijk om ze direct te incuberen met het supernatant dat is verkregen na stap 3.4.2 zonder de Nanoblades te concentreren.
- Verzamel 9 ml van het kweekmedium supernatant met behulp van een pipet van 10 ml.
- Dag 5: Resuspensie en opslag van Nanoblades
- Zuig na het centrifugeren langzaam het medium op en resuspend de witte pellet met 100 μL koude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Bedek de buis met parafilm en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C met voorzichtige agitatie voordat u de pellet resuspendeert door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Een wit viskeus materiaal kan verschijnen bij resuspensie; dit is normaal en heeft geen significante invloed op de efficiëntie van transductie. - Bewaar de Nanoblades bij 4 °C als u van plan bent ze binnen vier weken te gebruiken. Anders vriest u de Nanoblades in vloeibare stikstof in en bewaart u ze bij -80 °C.
OPMERKING: Draag een beschermingsbril en cryogene handschoenen bij het manipuleren van vloeibare stikstof. Snap-freezing en opslag bij -80 °C leidt tot een aanzienlijke afname van de efficiëntie van Nanoblade. Bovendien mogen ontdooide Nanoblades niet opnieuw worden ingevroren. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
- Zuig na het centrifugeren langzaam het medium op en resuspend de witte pellet met 100 μL koude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Bedek de buis met parafilm en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C met voorzichtige agitatie voordat u de pellet resuspendeert door op en neer te pipetteren.
4. Concentratie van Nanoblades op een sucrose-kussen
OPMERKING: Als alternatief voor nachtelijke centrifugatie of ultracentrifugatie (stap 3.4.3), kunnen de Nanoblades worden geconcentreerd op een sucrosekussen. Dit levert een zuiverdere fractie nanobladen op, hoewel de totale teruggewonnen hoeveelheid lager zal zijn.
- Bereid een 10% sucrose-oplossing (gewicht tot volume) in 1x PBS en filtreer deze door een spuitfilter van 0,2 μm (zie de tabel met materialen).
- Begin met het concentreren van de Nanoblades op het sucrosekussen.
- Plaats 9 ml VLP-bevattend monster (vanaf stap 3.4.3) in een ultracentrifugebuis (zie de materiaaltabel). Gebruik een spuit van 3 ml en een canule om langzaam 2,5 ml van de 10% sucrose onder het monster te leggen, in een poging het VLP-bevattende monster en de sucrose-oplossing niet te mengen.
- U kunt ook 2,5 ml 10% sucrose in een ultracentrifugebuis plaatsen (zie de tabel met materialen). Kantel de buis en voeg langzaam de 9 ml VLP-bevattend monster (uit stap 3.4.3) toe met een pipettor met lage snelheid. Til tijdens deze bewerking de buis geleidelijk op in een verticale positie.
- Centrifugeer de monsters bij 209.490 × g in een ultracentrifuge gedurende 90 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Deze techniek kan worden aangepast voor centrifugeren bij lage snelheid (4.300 × g) 's nachts, zoals beschreven in 12. - Verwijder na het centrifugeren het supernatant voorzichtig en plaats de buis ondersteboven op tissuepapier om de resterende vloeistof te verwijderen. Voeg na 1 minuut 100 μL 1x PBS toe en plaats de buis op 4 °C met een parafilmdeksel in een buishouder op een roertafel gedurende 1 uur (zie de tabel met materialen) voordat u de pellet opnieuw opschort door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
5. Monitoring Cas9-belasting in Nanoblades door dot-blot
- Bereid de verdunningsbuffer voor door 1 volume lysisbuffer met een niet-ionische oppervlakteactieve stof (zie de tabel met materialen) toe te voegen in 4 volumes van 1x PBS. Verdun 2 μL geconcentreerde nanobladen in 50 μl verdunningsbuffer, vortex kort en breng 25 μL van dit mengsel over in een nieuwe buis met 25 μL verdunningsbuffer. Herhaal deze bewerking om 4 buisjes Nanoblade-verdunningen te hebben (2-voudige verdunningsstappen).
- Verdun voor de standaardcontroles 2 μL recombinant Cas9-nuclease (zie de tabel met materialen) tot 50 μL verdunningsbuffer, vortex kort en maak acht seriële verdunningen (2-voudige verdunning voor elke stap).
- Plaats voorzichtig 2,5 μL van elke VLP-verdunning en 2,5 μL van elke standaard op een nitrocellulosemembraan met een meerkanaalspipet (een groter volume kan overlappende vlekken veroorzaken).
OPMERKING: Een met methanol behandeld polyvinyldifluoridemembraan kan ook worden gebruikt. - Zodra de deeltjes op het membraan zijn geabsorbeerd, blokkeert u het membraan met 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met een niet-ionische oppervlakteactieve stof (TBS-T) aangevuld met vetvrije droge melk (5% w / v) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en het membraan kan worden opgeslagen bij 4 °C in 1x TBS-T. - Gooi de 1x TBST aangevuld met vetvrije droge melk weg en incubeer het membraan 's nachts bij 4 °C met het Cas9-mierikswortelperoxidase-antilichaam (1/1000 verdunning in 1x TBST, 5% melk). Was het membraan 3x met TBS-T en visualiseer het signaal met behulp van een verbeterde chemiluminescente substraatkit.
- Kwantificeer de puntintensiteit voor de Nanoblades en recombinante Cas9-standaardverdunningen met behulp van de eigen software die bij het gelbeeldvormingsstation of imageJ13 wordt geleverd. Definieer een lineaire curve die de puntintensiteit koppelt aan de Cas9-concentratie. Extrapoleer met behulp van de functie van de verkregen curve het Cas9-gehalte in elk preparaat.
OPMERKING: De hoeveelheid recombinant Cas9-eiwitcontrole kan de aflezing voor de meest geconcentreerde monsters van de standaardverdunningsset verzadigen (figuur 2). Daarom wordt geadviseerd om bij het definiëren van de lineaire curve de aflezing uit de onverdunde monsters (en soms die van de eerste verdunningsstappen) te verwijderen als deze zich niet in het lineaire bereik bevinden ten opzichte van de bekende concentratie van Cas9 die werd waargenomen. Gebruik bij het extrapoleren van de hoeveelheid Cas9 in de Nanoblade-monsters alleen de metingen die binnen het lineaire bereik van de standaardcurve liggen.
6. Transductie van doelcellen met nanobladen (procedure voor transductie in een 12-well plaat)
- Zaai in een 12-well plaat 100.000-200.000 cellen (primaire of onsterfelijke adherentcellen) per put in 1 ml van het juiste celkweekmedium. Laat de cellen zich hechten aan het plaatoppervlak voordat ze transductie ondergaan.
- Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 5-20 μl geconcentreerde nanobladen (vanaf stap 3.5.1 of 4.4) toe aan 500 μl celkweekmedium en meng door op en neer te pipetteren met een P1000-pipettor. Verwijder het medium uit de cellen en vervang het door de 500 μL van dit Nanoblade-mengsel.
OPMERKING: Transductie moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype. Het is belangrijk om een zo klein mogelijk volume medium te gebruiken (terwijl het drogen van de doelcellen wordt vermeden), zodat de Nanoblades sterk geconcentreerd blijven. Hechtende cellen moeten direct worden getransduceerd terwijl ze aan de plaat zijn bevestigd (niet transduceren in suspensie, omdat dit de transductie-efficiëntie aanzienlijk zal verminderen). Sommige cellen verdragen langdurige blootstelling aan Nanoblades (24-48 uur), terwijl andere erg gevoelig zijn en kleine syncytie kunnen vormen. In dit geval moeten Nanoblades slechts gedurende 4-6 uur met cellen worden geïncubeerd voordat het medium wordt vervangen. Spinoculatie14 kan ook de transductie verbeteren voor cellen die in suspensie zijn gekweekt. Adjuvantia zoals kationische polymeren (zie de tabel met materialen) kunnen ook de transductie-efficiëntie in sommige celtypen verbeteren. - Na 4-6 uur celincubatie in een laag volume medium met Nanoblades, verhoogt u het volume van het medium tot de normale hoeveelheid (1 ml bij het werken met een 12-well plaat), of vervangt u het door vers medium als de cellen gevoelig zijn voor VLP's.
OPMERKING: Celmedium dat Nanoblades bevat, moet gedurende 10 minuten worden geïnactiveerd met 0,5% natriumhypochloriet voordat het wordt weggegooid. Gebruik handschoenen en een beschermende bril bij het manipuleren van natriumhypochloriet. Als nanobladen celdood veroorzaken, pas dan de hoeveelheid en de totale tijd van blootstelling aan om de celsterfte te verminderen.
7. Het meten van CRISPR-efficiëntie op de beoogde locus door T7 endonuclease assay
- Ontwerp PCR-primers om een 400-700 base-pair (bp) gebied te versterken dat de CRISPR-splitsingsplaats omvat.
OPMERKING: De splitsingsplaats moet ten minste 200 bp ver van de ampliconrand verwijderd zijn en moet enigszins van het midden van het amplicon worden verschoven, zodat bij T7 endonuclease-decolleté 2 fragmenten van verschillende groottes vrijkomen. - Extract genomisch DNA uit cellen die zijn behandeld met Nanoblades gericht op het gen van belang en uit controlecellen die zijn behandeld met Nanoblades geprogrammeerd met een controle-sgRNA (zie de Tabel met materialen).
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Gebruik 150 ng genomisch DNA als sjabloon en programmeer een PCR-reactie van 30 μL volume (eindvolume) door het protocol van de fabrikant te volgen. Controleer of de PCR-amplificatie een enkel amplicon van de verwachte grootte oplevert door een 2% agarose-gel te laten kleuren met 5 μg / ml ethidiumbromide (of een veiligere alternatieve DNA-gelvlek).
OPMERKING: Draag geschikte beschermingsmiddelen bij het manipuleren van ethidiumbromide, waarvan wordt vermoed dat het genetische defecten veroorzaakt. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Heteroduplex generatie en vertering
- Voeg in een PCR-buis van 0,2 ml 5 μL van de enzymbuffer (geleverd met de T7 endonuclease I), 20 μL water en 24 μL van het PCR-product uit stap 7.3 toe. Laat heteroduplexvorming toe door de monsters gedurende 3 minuten te verhitten tot 94 °C en vervolgens door de temperatuur (2 °C per minuut) te verlagen tot 40 °C.
- Voeg 0,5 μL T7-endonuclease I bij kamertemperatuur toe aan elke heteroduplexbuis, inclusief de controle. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min. Laad de resulterende reactie in een 2,5% (gewicht/volume) agarosegel gekleurd met ethidiumbromide. Breng na de migratie de gel in beeld op een UV-transilluminator.
OPMERKING: Draag geschikte beschermingsmiddelen bij het manipuleren van ethidiumbromide, waarvan wordt vermoed dat het genetische defecten veroorzaakt. Gebruik een UV-beschermende bril bij gebruik van de UV-transilluminator. - Meet de splitsingsefficiëntie door het beeld te analyseren dat het resultaat is van de verteringsreactie om de intensiteit van elke band te kwantificeren met de juiste software (zie de tabel met materialen).
8. Het meten van CRISPR-efficiëntie op de beoogde locatie door Sanger-sequencing en TIDE-analyse
OPMERKING: Als alternatief voor de T7-endonucleasetest kan de CRISPR-efficiëntie worden bewaakt door analyse en deconvolutie van Sanger-sequencingsporen op basis van het TIDE-protocol15.
- Voer Sanger-sequencing van PCR-amplicons uit stap 7.3 uit (inclusief een controlevoorwaarde die overeenkomt met onbehandelde cellen) met behulp van de voor- of achteruit-PCR-primer.
- Analyseer de Sanger-sequencingsporen van de controleconditie (onbehandelde cellen) en met Nanoblade behandelde monsters met behulp van de TIDE-server (https://tide.nki.nl) en volg hun analyserichtlijnen.
9. Nanoblade complex-vorming met ssODN-donoren voor homologie-gerichte reparatie (procedure voor transductie in een 12-well plaat)
OPMERKING: Richtlijnen voor het ontwerp van ssODN voor efficiënte homologie-gerichte reparatie gemedieerde bewerking zijn eerder beschreven16.
- Zaai in een 12-well plaat 100.000-200.000 cellen per put in 1 ml van het juiste celkweekmedium. Laat de cellen zich hechten aan het plaatoppervlak voordat ze transductie ondergaan.
- Bereid 100 μL van een oplossing van het kationisch polymeer (zie de tabel met materialen) bij 8 μg/ml in 1x PBS.
- Meng 19 μL van de kationische polymeeroplossing met 100 pmol van de ssODN-sjabloon. Voeg 20 μL geconcentreerde Nanoblades toe (vanaf stap 3.5.1 of 4.4) en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
- Verwijder de gecomplexeerde Nanoblades/ssODN uit het ijs en voeg 500 μL celkweekmedium toe (bij 37 °C). Verwijder het medium uit doelcellen (uit stap 9.1) en voeg de 500 μL medium toe dat de gecomplexeerde Nanoblades/ssODN bevat. Laat de cellen zich 48 uur vermenigvuldigen voordat ze worden gegenotypeerd.
- Extraheer genomisch DNA uit een fractie van de celpopulatie met behulp van een speciale extractiekit (zie de tabel met materialen).
- Ontwerp PCR-primers om een 400-700 bp-regio te versterken die de knock-in-site omvat.
OPMERKING: PCR-primers mogen niet overlappen met de homologiearmen van de ssODN om vals-positieve resultaten te voorkomen als gevolg van de PCR-amplificatie van resterende ssODN die nog steeds aanwezig is in doelcellen. - Gebruik 150 ng genomische DNA's van controlecellen (onbehandeld) of met Nanoblade behandelde cellen als sjabloon en programmeer een PCR-reactie van 30 μL volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: ssODN-sporen kunnen enkele dagen na transductie met het complex in het celmedium aanwezig zijn. Deze ssODN kan dienen als een gedeeltelijke sjabloon voor PCR-assays die proberen te screenen op de juiste integratie. Daarom is het raadzaam om de cellen minstens twee keer na transductie te passeren, om eventuele vals-positieve testen te voorkomen. - Laad 5 μL van de controle- en met Nanoblade behandelde PCR-reacties in een 1% (gewicht/volume) agarosegel gekleurd met ethidiumbromide. Breng na de migratie de gel in beeld op een UV-transilluminator.
OPMERKING: Als homologierecombinatie succesvol is en overeenkomt met het inbrengen van meer dan 1 bp genetisch materiaal, moet er een verschil zijn in het molecuulgewicht van de PCR-ampliconen tussen de controle en het met Nanoblade behandelde monster. Aangezien de efficiëntie van HDR niet 100% bereikt, moeten twee banden zichtbaar zijn in het met Nanoblade behandelde monster (een van vergelijkbare grootte als het controle-PCR-amplicon dat overeenkomt met het onbewerkte allel en een met een hoger molecuulgewicht dat overeenkomt met het knock-in-allel, zie figuur 3B middenpaneel).
- Ontwerp PCR-primers om een 400-700 bp-regio te versterken die de knock-in-site omvat.
- Voer Sanger-sequencing uit van de met controle en Nanoblade behandelde PCR-amplicons.
- Kwantificeer knock-in efficiëntie met behulp van het TIDER-protocol17.
10. Nanoblade levering in vivo
- Lever tot 25 μL geconcentreerde Nanoblades vanaf stap 3.5.1 via retro-orbitale injectie of tot 100 μL via staartaderinjectie, zoals beschreven in 18, als u met muizen werkt.
OPMERKING: Alle procedures met betrekking tot dierproeven (inclusief Nanoblade-injecties voor genoombewerkingsdoeleinden) vereisen een goedgekeurd protocol van een lokale ethische commissie. - Gebruik voor het genereren van transgene muizen een micro-injector om van 1 pL tot 10 pL geconcentreerde nanobladen vanaf stap 4.4 in de perivitellineruimte van muizenoöcyten af te leveren zoals eerder beschreven18.
OPMERKING: Voor perivitelline-injectie is het essentieel om Nanoblades te zuiveren en te concentreren op een sucrosekussen om verstopping van de micro-injector te voorkomen.
Representative Results
Het protocol voor nanoblade-voorbereiding is vrij eenvoudig en vereist eenvoudige laboratoriumapparatuur naast toegang tot een weefselkweekkap, een CO2-incubator en een zwaaiende emmercentrifuge of een ultracentrifuge. Sommige stappen vereisen echter bijzondere aandacht, zoals de bron en behandeling van productiecellen, evenals transductieomstandigheden. Zoals weergegeven in figuur 1A, is het belangrijk om cellen zo te zaaien dat ze homogeen verdeeld zijn in de plaat en ~ 70-80% samenvloeiing bereiken op de dag van transfectie (vermijd klonten cellen). Vierentwintig uur na transfectie (figuur 1B,C) zullen productiecellen syncytie vormen die leidt tot cellen van grotere omvang met meerdere kernen. Veertig uur na transfectie (figuur 1D) hebben de meeste cellen in de plaat syncytie gevormd en beginnen ze zich los te maken van de plaat.
Dit is volkomen normaal en wordt veroorzaakt door de expressie van het enveloppe glycoproteïne, dat fusie tussen naburige cellen induceert. Bij concentratie door centrifugatie (of zelfs rechtstreeks uit het supernatant van productiecellen) kan de hoeveelheid Cas9 die in Nanoblades wordt geladen op absolute wijze worden gekwantificeerd door dot-blot op een nitrocellulosemembraan met recombinant Cas9 als referentie (figuur 2). Deze stap is belangrijk om de juiste hoeveelheid nanoblades te bepalen die moeten worden gebruikt voor transductie van doelcellen. Bij het uitvoeren van de dot-blot assay is het belangrijk om alleen rekening te houden met de metingen die binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen. Onafhankelijk van de hoeveelheid Cas9 die aanwezig is in Nanoblades, is het echter essentieel om de efficiëntie van genoombewerking rechtstreeks op doelcellen te testen met behulp van de T7-endonuclease-assay (figuur 3) of Sanger-sequencing.
Zoals te zien is in figuur 3, kan de efficiëntie van Nanoblades van batch tot batch verschillen, hoewel deze meestal gecorreleerd is met de hoeveelheid Cas9. In het voorbeeld in figuur 3 leidt de batch van rijstrook 1 tot 20% totale bewerkingsefficiëntie, terwijl de batch van rijstrook 3 leidt tot 60% efficiëntie. In dit geval is het mogelijk om het volume nanoblades dat wordt gebruikt vanaf batch 1 te verhogen om een bewerkingsefficiëntie te bereiken die vergelijkbaar is met die van batch 3. Figuur 4 toont de maximale bewerkingsefficiëntie verkregen met Nanoblades in verschillende soorten primaire cellen. Het is belangrijk op te merken dat de efficiëntie kan variëren, afhankelijk van de volgorde van het gebruikte sgRNA en de toegankelijkheid van het doel.
Figuur 1: Morfologie van productiecellen tijdens nanobladeproductie. (A) HEK293T-cellen bij 70-80% samenvloeiing 24 uur na plating. (B en C) HEK293T celmorfologie 24 uur na transfectie. (D) HEK293T celmorfologie 40 h na transfectie. Schaalbalken = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering van Cas9-belasting in Nanoblades door dot-blot. (A) Recombinant Cas9 of 100x geconcentreerd (door ultracentrifugatie) Nanoblade-monsters (# 1, # 2 en # 3) worden 2-voudig sequentieel verdund en gespot op een nitrocellulosemembraan voordat ze worden geïncubeerd met anti-Cas9 HRP-gekoppelde antilichamen. Signaal wordt onthuld door verbeterde chemiluminescentie. (B) Chemiluminescentiesignaal wordt verkregen en gekwantificeerd voor de recombinante Cas9-verdunningen en signaalintensiteit uitgezet tegen de bekende hoeveelheid Cas9 die op het nitrocellulosemembraan is waargenomen. Een regressiecurve wordt berekend voor de verdunningen die zich binnen het lineaire bereik bevinden (zie blauwe kruisen), met uitzondering van alle concentraties die buiten het lineaire bereik liggen (zie rode kruisen). (C) De Cas9-concentratie (nM) in elk nanobladpreparaat werd geëxtrapoleerd met behulp van de vergelijking van de lineaire regressie verkregen in (B). Hiervoor is het belangrijk om alleen het gekwantificeerde signaal van de Nanoblade-verdunningen te gebruiken die binnen het lineaire bereik van de regressiecurve vallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Monitoring van de bewerkingsefficiëntie bij transductie. (A) T7 endonucleasetest die de splitsingsefficiëntie meet in met nanoblade behandelde cellen. Cellen getransduceerd met Nanoblades gericht op het EMX1-gen werden geanalyseerd door T7 endonuclease assay. Baan 1: Nanoblade voorbereiding batch #1 (20% splitsingsefficiëntie); Rijstrook 2: Controlecellen; Baan 3: Nanoblade voorbereiding batch #2 (60% splitsingsefficiëntie). (B) Knock-in van de Flag-tag-reeks binnen het DDX3 open leesframe. Geconcentreerde nanobladen geprogrammeerd met een sgRNA gericht op de DDX3-locus werden geproduceerd uit verschillende HEK293T-klonen (# 1, # 2) en gecomplexeerd met toenemende doses van een Flag-DDX3 ssODN-sjabloon en de verkregen complexen die worden gebruikt voor de transductie van HEK293T-doelcellen. Na transductie werden cellen gedurende drie dagen gekweekt voordat ze werden verzameld om genomisch DNA en totale eiwitten te extraheren. Flag-DDX3-eiwitten werden immunoprecipiteerd met behulp van anti-Flag agarose kralen gevolgd door western-blot analyse van de teruggewonnen eiwitten met behulp van een anti-Flag antilichaam (bovenste paneel). Site-gerichte invoeging van de Flag-tag in de Ddx3-locus werd ook getest door PCR met behulp van primers die de insertieplaats flankeren (middelste paneel), of met behulp van een voorwaartse primer die de Flag-tag-volgorde herkent en een reverse primer die specifiek is voor de Ddx3-locus stroomafwaarts van de Flag-invoegplaats (onderste paneel). Afkortingen: EMX1 = Empty Spiracles Homeobox 1; DDX3 = DEAD-box RNA helicase 3; PCR = polymerasekettingreactie; ODN = oligodeoxynucleotide; ssODN = sing-stranded ODN; sgRNA = single-guide RNA; IP = immunoprecipitatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bewerkingsefficiëntie bereikt in verschillende primaire celtypen met behulp van Nanoblades. Afkortingen: PGO = perifere bloedlymfocyt; IL = interleukine; CD = cluster van differentiatie; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Nanoblades zorgen voor een snelle en dosisafhankelijke afgifte van het Cas9/sgRNA RNP-complex in cellijnen en primaire cellen. In tegenstelling tot klassieke transfectie en andere virale toedieningsvectoren, maar net als eiwitelektroporatie, hebben Nanoblades het voordeel van voorbijgaande afgifte van de Cas9 / sgRNA RNP op een transgene-vrije manier. Nanoblades bieden een zeer veelzijdig, eenvoudig en goedkoop platform voor eiwitafgifte dat gemakkelijk en snel kan worden aangepast aan de steeds groter wordende familie van CRISPR-varianten. Nanoblades kunnen worden geproduceerd in de HEK293T-cellijn of zijn derivaten. HEK293T-cellijnen die hier worden gebruikt, zijn ontwikkeld om de productie van retrovirale en lentivirale deeltjes te maximaliseren (zie de tabel met materialen). Hoewel andere bronnen van HEK293T-cellen geschikt kunnen zijn, moeten gebruikers HEK293T-cellen uit verschillende bronnen testen en vergelijken, aangezien er grote verschillen in deeltjesproductie zijn waargenomen, afhankelijk van de HEK293T-celbron. Cellen moeten ook regelmatig worden gecontroleerd op Mycoplasma-contaminatie en om de drie dagen worden gepasseerd (klassiek 1/8 verdunning) om overconfluentie te voorkomen, wat een negatieve invloed heeft op de deeltjesproductie.
Cellen mogen niet worden onderhouden voor meer dan 20 passages. DMEM aangevuld met glucose, penicilline/streptomycine, glutamine en 10% gedecomplementeerd foetaal runderserum werd gebruikt voor celkweek. Aangezien de oorsprong van het serum de kwaliteit van het Nanoblade-preparaat kan beïnvloeden, moeten verschillende serumbatches worden getest voordat ze op grote schaal worden geproduceerd. Nanoblades kunnen efficiënt worden geproduceerd in andere media zoals RPMI of serumvrije modificaties van minimaal essentieel medium dat DMEM kan vervangen op de dag na transfectie. Zoals hieronder aangegeven, hoewel mediumvervanging na transfectie met sommige DNA-transfectiereagentia optioneel is, kan het nuttig zijn om het medium waarin de VLP's vrijkomen te wijzigen, met name om serumsporen in het deeltjespreparaat te beperken. Het kweken van cellen in minimaal essentieel medium met verlaagd serum op de dag vóór transfectie is echter nog niet geprobeerd.
Zoals vermeld, nanobladeren worden geproduceerd na overexpressie van een mengsel van plasmiden in productiecellen. De overexpressie lijkt nodig te zijn voor een optimale productie. Inderdaad, dit laboratorium ontwikkelde een producerende cellijn waar de Gag-Pol-expresserende constructie werd gestabiliseerd door antibioticaselectie; dit systeem slaagde er echter niet in om aanzienlijke hoeveelheden Nanoblades te produceren. Een soortgelijke observatie werd gedaan toen het sgRNA-coderende construct stabiel werd geïntegreerd in het genoom van productiecellen. Zoals beschreven voor andere deeltjesproductiesystemen, kan een stabiele cellijn die ten minste enkele constructies tot expressie brengt die betrokken zijn bij de productie van nanoblades nuttig zijn; dit zou echter zeker de verwerking van grote hoeveelheden supernatant en een geschikte techniek om deeltjes te zuiveren vereisen. Het bovenstaande protocol schetst de voorkeursprocedure voor het produceren van nanobladen die gebruikmaken van specifieke transfectiereagentia (zie de tabel met materialen).
Hoewel transfectiereagentia van andere fabrikanten ook met succes zijn getest, volgt de overgrote meerderheid van de resultaten van deze groep met Nanoblades de hierin beschreven procedure. Goedkope transfectie kan worden bereikt met behulp van calciumfosfaatreagentia en levert een goede productie-efficiëntie op; deze methode vereist echter absoluut de vervanging van transfectiemedium op de dag na transfectie en kan calciumfosfaatresiduen achterlaten in het gesedimenteerde deeltjespreparaat. Consistent met de noodzaak van hoge expressieniveaus voor Nanoblade-componenten in productiecellen is de observatie dat de hoeveelheid sgRNA's geassocieerd met het Cas9-eiwit een beperkende factor kan zijn voor efficiënte genoombewerking. Om de sgRNA-belasting te verbeteren, zijn onlangs twee technische benaderingen ontwikkeld door onafhankelijke groepen met behulp van eiwitafgiftevectoren die vergelijkbaar zijn met Nanoblades. Deze zijn afhankelijk van het gebruik van T7 polymerase-afhankelijke cytoplasmatische expressie van sgRNA6 of door de toevoeging van een retroviraal inkapselingssignaal aan de sgRNA-sequentie om binding aan het Gag-polyproteïne6 te bemiddelen. Deze benaderingen kunnen inderdaad de sgRNA-belasting in Nanoblades verbeteren, hoewel ze nog niet zijn getest.
Transductie van doelcellen is een cruciale stap in de procedure. In de meeste vereeuwigde cellijnen heeft transductie met Nanoblades weinig of geen cytopathisch effect. In primaire cellen kan toxiciteit echter een probleem zijn. Transductie moet daarom voor elk celtype worden geoptimaliseerd. Met name de blootstellingstijd aan Nanoblades is een belangrijke factor om aan te passen bij het optimaliseren van het transductieprotocol. Voor gevoelige cellen zoals primaire neuronen of beenmergcellen zorgt 4-6 uur incubatie met Nanoblades voordat het medium wordt vervangen voor een efficiënte afgifte van het Cas9-eiwit terwijl de celtoxiciteit wordt geminimaliseerd. Bovendien kunnen adjuvantia zoals kationische polymeren, onder andere, de efficiëntie van transductie in sommige cellen aanzienlijk verbeteren (zie de tabel met materialen). Het is belangrijk op te merken dat Nanoblades VLP's zijn en een immunogene respons kunnen induceren. Dit kan een beperking zijn bij het werken met bepaalde soorten primaire cellen, zoals macrofagen of dendritische cellen, waarbij incubatie met nanobladen belangrijke veranderingen in genexpressie en het fenotype van de cellen kan veroorzaken. Als macrofagen en dendritische cellen zijn afgeleid van hematopoëtische stamcelvoorlopers (zoals beenmergcellen van muizen), verdient het de voorkeur om cellen te transduceren met de Nanoblades voordat ze volledig worden gedifferentieerd om te voorkomen dat een cellulaire respons tegen de Nanoblades wordt geïnduceerd. Anders zou Cas9-eiwitelektroporatie een levensvatbaar alternatief kunnen zijn bij het werken met gedifferentieerde immuuncellen.
Nanoblades kunnen in vivo worden gebruikt om muizenzygoten of embryo's te transduceren om transgene dieren te genereren. Vergelijkbaar met klassieke retrovirale of lentivirale vectoren, kunnen ze ook rechtstreeks in weefsels van volwassen dieren worden geïnjecteerd. Nanoblades (vergelijkbaar met retrovirale en lentivirale vectoren) kunnen echter worden geïnactiveerd door de immuunrespons van het gastheerdier; daarom moet de te injecteren dosis voor elke toepassing worden geoptimaliseerd. Deze immuunrespons kan ook de verdeling van functionele VLP's naar weefsels dicht bij de injectieplaats beperken. Ten slotte zijn Nanoblades, in tegenstelling tot lentivirale vectoren, transgenvrij en leveren ze de Cas9 in een beperkt tijdsbestek. Daarom kunnen ze niet worden gebruikt om genoombrede functionele screenings uit te voeren die high-throughput sequencing van sgRNA's vereisen bij selectie van cellen. Nanoblades zijn nuttig wanneer snelle, dosisafhankelijke en transgene-vrije genoombewerking vereist is20. Bovendien leiden nanoblades, net als eiwitelektroporatie, tot minder off-target effecten dan langdurige expressie van Cas9 / sgRNA via DNA-transfectie of klassieke virale vectoren3. Toekomstige ontwikkeling van Nanoblades is gericht op het opnemen van Cas9-varianten voor verschillende technologische toepassingen zoals base-editing en RNA-targeting.
Disclosures
Philippe E. Mangeot en Emiliano P. Ricci worden genoemd als uitvinders van een octrooi met betrekking tot de Nanoblades-technologie (octrooiaanvragers: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; aanvraagnummer: WO 2017/068077 Al; octrooistatus: gepubliceerd, 27 april 2017; alle aspecten van het manuscript komen aan bod in de octrooiaanvraag. De overige auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) van de Université de Lyon, binnen het programma Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) beheerd door het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) en door de European Research Council (ERC-StG-LS6-805500 to E.P.R.) in het kader van de Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma's van de Europese Unie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).
- Mangeot, P. E., et al. Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature Communications. 10 (1), 45 (2019).
- Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases. eLife. 3, 01911 (2014).
- Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).
- Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications. 11, 1334 (2020).
- Indikova, I., Indik, S. Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts. Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).
- Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (17), 99 (2019).
- Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell. 59 (1), 103-112 (1989).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing. Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders. Journal of Visualized Experiments. (140), e57609 (2018).
- Montagna, C., et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).
- Marnef, A., et al. A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair. Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).
