Summary
우리는 바이러스와 같은 입자 내에서 Cas9/단일 가이드 RNA(sgRNA) 리보뉴클레오단백질 복합체를 로드하기 위한 간단하고 저렴한 프로토콜을 개발했습니다. "나노 블레이드"라고 불리는 이러한 입자는 생체 내에서뿐만 아니라 불멸의 및 1 차 세포에서 Cas9 / sgRNA 복합체를 효율적으로 전달 할 수 있습니다.
Abstract
클러스터된 짧은 palindromic 반복(CRISPR)-Cas 시스템은 진핵 세포에서 게놈 편집을 민주화하고 수많은 혁신적인 응용 분야의 개발로 이어졌습니다. 그러나, 표적 세포로 Cas9 단백질 및 단하나 가이드 RNA(sgRNA)를 전달하는 것은 기술적으로 도전이 될 수 있다. 렌티바이러스(LV) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 유래된 것과 같은 고전적인 바이러스 벡터는 Cas9 단백질및 그 관련 sgRNA를 위한 코딩된 트랜스게놈의 효율적인 전달을 허용하며, 많은 1차 세포및 생체내에서. 그럼에도 불구하고, 이들 벡터는 표적 세포 게놈내의 트랜스진의 통합, 제한된 화물 용량, 표적 세포에서 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 장기 발현 과 같은 단점을 겪을 수 있다.
이러한 문제 중 일부를 극복하기 위해, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)를 기반으로 한 전달 벡터는 임의의 코딩 트랜스진이 없는 경우 Cas9 단백질 및 그 관련 가이드 RNA를 포장하기 위해 개발되었다. Cas9 단백질을 MLV로부터 구조 단백질 개그의 C-종자에 융합시킴으로써, Cas9 단백질과 sgRNA("나노블레이드"라는 이름으로 명명된)로 적재된 바이러스와 같은 입자(VLP)가 형성되었다. 나노 블레이드는 생산자 세포의 배양 배지로부터 수집될 수 있고, 정제, 정량화, 표적 세포를 변환하고 활성 Cas9/sgRNA 복합체를 전달하는 데 사용될 수 있다. 나노 블레이드는 광범위한 원차 및 불멸의 세포에서 리보뉴클레오단백질(RNP) 화물을 일시적이고 빠르게 전달하며 수정된 Cas9 단백질을 사용하여 표적 유전자의 일시적인 전사 활성화와 같은 다른 응용 분야에 프로그래밍될 수 있습니다. 나노 블레이드는 주입 된 성인 마우스의 간및 우발 동물에서 생체 내 게놈 편집을 통해 형질 전환 동물을 생성 할 수 있습니다. 마지막으로, 그들은 "트랜스트랜스프리" 동성애 지향 수리를 위한 기증자 DNA로 복잡해질 수 있습니다. 나노 블레이드 제제는 간단하고 상대적으로 저렴한 비용으로 모든 세포 생물학 실험실에서 쉽게 수행 할 수 있습니다.
Introduction
다른 프로그래밍 가능한 뉴클레아제와 비교하여 CRISPR-Cas 시스템은 진핵 세포에서 서열 특이적 게놈 표적화 및 분열 의 절차를 극적으로 단순화하고 민주화시켰습니다. sgRNA의 간단한 발현을 통해 사용자는 거의 모든 세포 궤적1에 대해 Cas9 단백질(또는 최적화된 변형)을 프로그래밍할 수 있습니다. 이 시나리오에서, Cas9 단백질과 sgRNA의 전달은 사이트 지향 돌연변이 발생을 수행할 때 주요 한계가 됩니다. 불멸의 세포에서, sgRNA와 Cas 단백질은 대부분의 세포에서 효율적인 게놈 표적을 달성하기 위하여 전과된 플라스미드에서 쉽게 발현될 수 있습니다. 그러나, Cas9/sgRNA 복합체의 구성발현은 Cas9 단백질의 오프타겟 활성을 증가시키고 비특이적 loci2에서 원치 않는 변화를 도입할 수 있다. 1 차 적인 세포에서, DNA 형질은 달성하고 가난한 발현 또는 전형된 세포의 작은 백분율로 이끌어 내는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 고전적인 DNA 형질전환에 대한 대안은 합성 sgRNA에 결합된 재조합 Cas9 단백질의 Cas9 및 sgRNA 또는 전기포기용 트랜스진 코딩을 전달하는 바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 그러나, 이들 접근법은 세포 숙주 게놈 내의 유전자 통합(고전적인 레트로바이러스 및 렌티바이러스 발현 벡터의 경우와 같이), 세포 요인에 의한 제한, Cas9 단백질 및 sgRNA의 구성발현으로 이어질 수 있다.
Cas9/sgRNA RNP 복합체의 전기포공은 이러한 문제의 대부분을 극복하고 1차 세포및 생체 내에서 효율적이고 일시적인 전달로 이어질 뿐만 아니라 용량 의존적 반응을 허용할 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 일반적으로 비싼 장비 및 시약에 의존 하 고 또한 많은 수의 세포를 치료 해야 하는 경우 고급 화 하기 어렵다. 전술한 기술에 대한 대안으로, 이들 저자는 다른 바이러스 유래 캡시드 단백질 전달 시스템과 개념적으로 유사한 Cas9 단백질 및 sgRNA3를 위한 레트로바이러스 전달 벡터인 "Nanoblades"를 개발하였다4,5,6,7,8. 나노 블레이드는 소세포 배지9에서 방출되는 배양 세포, VLP에서 단독으로 발현될 때 레트로 바이러스로부터 개그 폴리 프로틴의 자연적인 용량을 이도합니다. Murine 백혈병 바이러스(MLV)의 C-말단 끝에 Cas9 단백질을 융합하고 sgRNA 및 바이러스 봉투 당단백질을 공동 발현함으로써, Cas9 단백질은 방출된 VLP 또는 나노블레이드 내에서 캡슐화될 수 있다. 정화 시, 나노블레이드는 표적 세포로 배양되거나 생체 내에서 주입되어 Cas9/sgRNA RNP 콤플렉스3의 신속하고 일시적이며 용량 의존적 전달을 중재할 수 있다.
나노 블레이드는 다른 loci또는 Cas9 변형으로 동시에 편집하기 위해 여러 sgRNA로 프로그래밍하여 대상별 전사 활성화 또는 억압3과 같은 다른 응용 프로그램을 수행할 수 있습니다. 재조합 발현에 의존하는 단백질 전기포레이션과는 달리, 문헌에서 새로 설명된 Cas 변종은 개그 융합 발현 벡터로 쉽게 복제되어 다재다능한 플랫폼이 될 수 있다. 나노 블레이드는 더 복잡하거나 편성 지향 수리를 수행하기 위해 단일 좌초 및 이중 좌초 올리고열뉴클레오티드 (ssODNs)로로드 될 수 있습니다3. 나노 블레이드 생산은 상대적으로 간단하고 저렴합니다. 또한 나노 블레이드는 며칠 동안 4 °C 또는 장기 저장을 위해 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 전형적으로, 나노 블레이드는 대부분의 불멸과 1 차 배양 세포에서 효율적이고 유전자없는 게놈 편집을 중재합니다. 그러나, 몇몇 1 차적인 세포는 증가한 사망의 결과로 바이러스성 입자의 존재에 민감할 지도 모릅니다. 타고난 면역 계통의 세포는 또한 나노 블레이드의 존재에 반응할 수 있습니다 (그들의 바이러스 기원 때문에) 활성화 될 수 있습니다. 이러한 경우 트랜스듀션 프로토콜은 나노블레이드에 대한 노출 시간을 제한하고 비특이적 효과를 최소화하도록 최적화되어야 합니다. 나노 블레이드는 다른 사용 가능한 CRISPR 전달 방법에 대한 실행 가능하고 구현하기 쉬운 대안을 나타냅니다.
Protocol
1. sgRNA 설계 및 복제
참고: sgRNAs 설계에 대한 지침은 https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing 또는 한나 및 Doench10과 같은 여러 소스에서 얻을 수 있습니다.
- 일단 20 개의 뉴클레오티드 sgRNA 서열이 설계되면 다음 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 주문하십시오.
- 앞으로: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3' (N은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열이 없는 표적 궤적에 대응한다.
- 역: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N은 PAM 서열 없이 표적 궤적의 역보완에 해당)
참고: 올리고뉴클레오티드(5' 인산염에 대한 요구 사항 없음)를 주문할 때 특별한 수정이 필요하지 않습니다.
- 2개의 DNA 올리고뉴클레오티드를 0.2mL 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 튜브에 혼성화하여 5μL의 아닐링 버퍼(500 mM NaCl)를 혼합한다. 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10mM DTT; pH 7.9 at 25°C), 각 DNA 올리고뉴클레오티드(물 속 100μM 스톡 용액) 및 42 μL의 물.
- PCR 블록에서 샘플을 95°C에서 15s로 배양한 다음 0.5°C/s의 경사로로 온도를 20°C로 낮춥시다. 실온에서 보관하거나 -20 °C에 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 블레이드 또는 SUPERBLADE sgRNA 발현 플라스미드의 10 μg를 50 μL의 총 반응 부피에서 55°C에서 3시간 동안 BsmBI-v2 제한 효소 10단위로 소화한다.
참고: 소화된 벡터는 ~1.9 kb의 DNA 삽입과 ~3.3 kb의 두 번째 DNA 단편을 방출해야 한다. - 에티듐 브로마이드의 5 μg/mL (또는 더 안전한 대체 DNA 젤 얼룩)로 염색된 1% 아가로즈 젤에 제한 반응을 적재합니다.
참고: 유전적 결함을 유발하는 것으로 의심되는 에디튬 브로마이드를 조작할 때 적절한 보호 장비를 착용하십시오.- 312nm의 파장에 설정된 자외선(UV) 테이블(DNA 손상 방지)에서 젤에서 3.3 kb DNA 조각을 자르고 1.5mL 마이크로센트심리후지 튜브에 놓습니다.
참고: 에디듐 브로마이드를 조작하고 UV 테이블에서 작업할 때 적절한 보호 장비(장갑 및 자외선 보호 고글)를 착용하십시오. - 전용 DNA 젤 추출 키트를 사용하여 3.3 kb DNA 단편을 포함하는 슬라이스 젤에서 DNA를 추출 합니다(재료표 참조). 분광광계를 사용하여 정제된 DNA의 양을 정량화합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 312nm의 파장에 설정된 자외선(UV) 테이블(DNA 손상 방지)에서 젤에서 3.3 kb DNA 조각을 자르고 1.5mL 마이크로센트심리후지 튜브에 놓습니다.
- 1.5.2단계에서 BsmB1 소화, 젤 정제 블레이드 또는 슈퍼블레이드 벡터로 혼성화된 전방 및 역DNA 올리고뉴클레오티드를 리게이트한다. 이를 위해, T4 DNA 리개세 버퍼 2μL, 겔 정제 벡터의 50 ng(단계 1.5.2), 혼성 DNA 올리고뉴클레오티드의 1μL(1단계 1.2단계), 물을 19 μL로, T4 DNA 리게아제의 1μL을 추가한다. 10 분 동안 25 °C에서 반응을 배양한다.
- 에 설명된 바와 같이 결찰 생성물을 유능한 박테리아( 재료표 참조)로 변환합니다11. 암피실린 루리아 베르타니 가판판에 변형 된 박테리아를 접시와 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 한천판에서 여러 개의 격리된 콜로니를 선택하여 DNA minipreparation11 ( 재료표 참조)을 수행하고, U6 포워드 프라이머(5'GACTATCATATGCTTACCGT 3')를 사용하여 Sanger 시퀀싱을 수행하여 sgRNA 변수 서열의 올바른 결찰을 확인한다.
참고: 다른 sgRNA 발현 플라스미드는 나노 블레이드 생산을 방해 할 수있는 Cas9 단백질에 대한 코딩을하지 않으면 사용될 수 있습니다.
2. 플라스미드 준비
- 필요한 모든 플라스미드의 맥시제제( 재료표 참조)를 수행하고 -20°C에 보관하려면 1 μg/mL에서 10μg 알리코트10을 준비합니다. 플라스미드의 반복된 동결/해동 주기를 피하십시오. 알리코를 버리기 전에 두 번 사용하십시오.
3. 나노 블레이드 준비
- 1일 차에는 3.5~4× 106HEK293T 세포(재료표 참조)가 높은 포도당, 피루바테 나트륨, L-글루타민, 10% 태아 소 혈청(FBS), 그리고 페니실린/strepin-strepinc 10cm를 함유하고 있습니다. 10cm 플레이트를 부드럽게 앞뒤로 이동한 다음 오른쪽에서 왼쪽으로 이동(이 시퀀스 5x 반복)을 배양 접시 위로 균질하게 분배합니다. 세포 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO2로 세포를 배양한다.
참고: 배양된 세포 및 나노블레이드의 취급과 관련된 모든 절차는 오염을 피하기 위해 세포 배양 라미나르 흐름 후드하에서 수행되어야 합니다. - 2일차: 플라스미드 트랜스펙트
- 세포는 도금 후 70-80% 컨서크 24시간이어야 한다(도 1A). 배지를 고당점, 피루바테 나트륨, L-글루타민, 10% FBS(페니실린 및 연쇄절제술은 반드시 생략할 수 있음)를 함유한 신선한 DMEM 10mL로 배지를 교체한다.
참고: 이 단계에서는 세포가 컨실트되지 않는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 입자 생산뿐만 아니라 트랜스페션 효율이 감소될 수 있습니다. - 각 10cm 플레이트에 대해, 1.5mL 튜브에서 플라스미드의 다음 수량을 준비: 0.3 μg pCMV-VSV-G, 0.7 μg pBaEVRless, 2.7 μg MLV 개그/폴, 1.7 μg BIC-Gag-Cas9, 4.4 μg 의 블레이드 또는 SUPERBLADES 플라스미드는 복제된 sgRNA(또는 2개의 sgRNA를 사용하는 경우 각각 2.2 μg).
- 500 μL의 형광 버퍼( 재료 표 참조), 10초용 소용돌이, 원심분리기를 1초로 추가합니다. 트랜스펙트 시약의 20 μL을 추가( 재료의 표 참조), 튜브를 1초 동안 소용돌이, 원심분리기는 1초로 한다.
- 실온에서 10분 동안 배양하고 P1000 피펫터를 사용하여 DMEM 배지의 셀에 전체 용액을 드롭와이즈로 추가합니다. 10cm 플레이트를 부드럽게 앞뒤로 이동한 다음 오른쪽에서 왼쪽으로 이동(이 시퀀스 5x 반복)을 사용하여 세포 에 대한 트랜스펙트 시약을 균일하게 분배합니다. 세포인큐베이터에서 최소 40시간 동안 37°C에서 세포를 5% CO2로 배양한다.
참고: 원하는 경우, 배지는 형질 전환 후 4시간 후에 변경할 수 있습니다.
- 세포는 도금 후 70-80% 컨서크 24시간이어야 한다(도 1A). 배지를 고당점, 피루바테 나트륨, L-글루타민, 10% FBS(페니실린 및 연쇄절제술은 반드시 생략할 수 있음)를 함유한 신선한 DMEM 10mL로 배지를 교체한다.
- 3일째에, 현미경의 밑에 전과된 세포의 형태를 확인하십시오.
참고: 생산자 셀이 융합되기 시작합니다. 이것은 fusogenic 바이러스 봉투의 발현에 기인한 일반적인 발생입니다 (도 1B, C). - 4일차: 나노블레이드 수확
참고: 적어도 40 h의 형질 전환 후, 세포는 fusogenic 바이러스 봉투의 발현 때문에 함께 융합했을 것이고, 때로는 세포가 플레이트 지지대에서 완전히 분리됩니다(도 1D).- 10mL 파이펫을 사용하여 배양 배지 상류체 9mL를 수집합니다.
참고: 나노 블레이드는 Cas9 단백질과 그 관련 sgRNA를 1 차 세포및 생체 내로 전달할 수 있는 VLP입니다. 그들은 유전 물질이 없기 때문에 유전자 변형 된 유기체로 간주되지 않지만 유전 적 변화를 유도 할 수 있습니다. 따라서, 그(것)들은 사용자와어떤 접촉을 피하기 위하여 주의해서 조작되어야 합니다 (특히 종양 억제유전자를 표적으로 하기 위하여 프로그램되는 경우에). 사용자는 VLP를 준비하고 트랜스듀션 실험을 수행할 때 레트로바이러스 벡터 조작에 대한 현지 안전 지침을 따르고 BSL-2 레벨 실험실에서 작업하는 것이 좋습니다. 나노 블레이드는 70 % 에탄올 또는 0.5 % 하이포염소산 나트륨으로 비활성화 될 수 있습니다. 또한 모든 플라스틱 폐기물(파이펫 팁, 조직 배양 플레이트, 원심분리 관)을 0.5% 나트륨 고가염소산염으로 10분 이상 치료하여 나노블레이드를 비활성화하는 것이 좋습니다. - 수집된 상체를 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 이물질을 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 회수합니다.
참고: 나노블레이드가 1차 세포에 사용되는 경우 0.45 μm 또는 0.8 μm 필터를 사용하여 상체를 필터링합니다. 이 단계는 필터 멤브레인에서 상당한 분획이 차단될 때 나노 블레이드 티터를 크게 감소시킨다는 점에 유의하십시오. - 4,30 ×0g의 스윙 버킷 로터에서 나노블레이드(12-16h)를 펠릿하거나 4°C에서 75분 동안 초센성심분리기에서 209,490g×(재료표 참조).
참고: 표적 세포가 DMEM에서 성장할 수 있는 경우, 나노블레이드를 집중하지 않고 3.4.2단계 이후에 얻은 상체로 직접 배양할 수 있다.
- 10mL 파이펫을 사용하여 배양 배지 상류체 9mL를 수집합니다.
- 5일차: 나노블레이드의 재서스펜션 및 보관
- 원심분리 후, 매체를 천천히 흡인시키고 차가운 1x 인산염 완충식식염(PBS)의 100μL로 백색 펠릿을 재연한다. 파라필름으로 튜브를 덮고 4°C에서 1시간 동안 배양한 후 펠릿을 위아래로 피펫으로 재보냅니다.
참고: 백색 점성 물질이 재서스펜션 시 나타날 수 있습니다. 이것은 정상이며 트랜스듀션의 효율성에 크게 영향을 미치지 않습니다. - 4주 이내에 나노블레이드를 사용할 계획이라면 나노블레이드를 4°C로 저장합니다. 그렇지 않으면 나노 블레이드를 액체 질소에 스냅 동결하고 -80 °C에 저장하십시오.
참고: 액체 질소를 조작할 때 보호 고글과 극저온 장갑을 착용하십시오. -80°C에서 스냅 동결 및 저장은 나노 블레이드 효율이 현저하게 감소합니다. 또한 해동된 나노 블레이드는 다시 얼어 붙어서는 안됩니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 원심분리 후, 매체를 천천히 흡인시키고 차가운 1x 인산염 완충식식염(PBS)의 100μL로 백색 펠릿을 재연한다. 파라필름으로 튜브를 덮고 4°C에서 1시간 동안 배양한 후 펠릿을 위아래로 피펫으로 재보냅니다.
4. 자당 쿠션에 나노 블레이드의 농도
참고: 하룻밤 원심분리 또는 초원심분리(단계 3.4.3)의 대안으로 나노블레이드는 자당 쿠션에 집중할 수 있다. 이는 회수된 총 금액이 낮지만 나노블레이드의 더 순수한 부분을 산출합니다.
- 1x PBS에서 10% 자당 용액(중량 대 부피)을 준비하고 0.2 μm 주사기 필터를 통해 필터링 합니다(재료표 참조).
- 자당 쿠션에 나노 블레이드를 집중하는 과정을 시작합니다.
- VLP 함유 샘플 9mL(3.4.3단계부터)을 초원심분리기 튜브에 넣 습니다(재료표 참조). 3 mL 주사기 및 캐뉼라를 사용하여, 천천히 층 2.5 mL 샘플 아래 10% 자당, VLP 함유 샘플 및 자당 용액을 혼합하지 않으려고.
- 또는, 10%의 자당 2.5mL을 초원심분리기 튜브에 넣습니다( 재료표 참조). 튜브를 기울이고 저속 피펫터로 VLP 함유 샘플(3.4.3 단계에서)의 9mL를 천천히 추가합니다. 이 작업 중에 튜브를 수직 위치로 점진적으로 올립니다.
- 4°C에서 90분 동안 초원심분리기에서 209,49 ×0 g 의 샘플을 원심분리합니다.
참고: 이 기술은 12에 설명된 바와 같이 하룻밤 사이에 저속 원심분리기(4,300 × g)에 적응할 수 있다. - 원심 분리 후, 상체를 조심스럽게 제거하고 튜브를 티슈 페이퍼에 거꾸로 놓고 남은 액체를 제거하십시오. 1분 후, 1x PBS의 100 μL을 추가하고 튜브를 4°C에 넣고 교반 테이블에 있는 튜브 홀더에 파라필름 덮개를 1시간( 재료 표 참조)한 후 위아래로 파이프팅하여 펠릿을 다시 차단합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
5. 도트 블롯에 의해 나노 블레이드 내에서 Cas9 로딩 모니터링
- 비이온 계면활성제를 포함하는 1부량의 용해 버퍼를 1x PBS 4부에서 추가하여 희석 버퍼를 준비한다. 농축 나노블레이드의 2μL을 희석 완충제 50μL로 희석하고, 소용돌이를 간략하게 희석 버퍼 25μL을 포함하는 새로운 튜브로 이송한다. 이 작업을 반복하여 나노 블레이드 희석 튜브 4 개 (2 배 희석 단계)를 갖습니다.
- 표준 컨트롤의 경우, 재조합 Cas9 뉴클레아제 2μL(재료표 참조)을 희석 완충제의 50 μL로 희석하고, 소용돌이를 잠시 간략하게 희석하고, 8개의 직렬 희석(각 단계에 대해 2배 희석)을 진행한다.
- 각 VLP 희석의 2.5 μL과 각 표준의 2.5 μL을 멀티채널 파이프가 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 조심스럽게 발견합니다(더 큰 부피가 겹치는 반점이 발생할 수 있음).
참고: 메탄올 처리된 폴리비닐디플루오라이드 멤브레인도 사용될 수 있다. - 입자가 멤브레인에 흡수되면 실온에서 45 분 동안 비 지방 건조 우유 (5 % w / v)로 보충된 비 이온 계면활성제 (TBS-T)를 포함하는 1 x Tris 버퍼식 식염수로 멤브레인을 차단하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며, 멤브레인은 1x TBS-T에서 4°C에 저장됩니다. - 비지방 건조 우유로 보충된 1x TBST를 버리고, Cas9-고추냉이 과산화항체(1x TBST에서 1/1000 희석, 우유 5%)로 4°C에서 밤새 멤브레인을 배양한다. TBS-T로 멤브레인 3배를 세척하고 향상된 화학발광 기판 키트를 사용하여 신호를 시각화합니다.
- 젤 이미징 스테이션 또는 imageJ13과 함께 제공되는 독점 소프트웨어를 사용하여 나노 블레이드 및 재조합 Cas9 표준 희석제에 대한 도트 강도를 정량화합니다. 점 강도를 Cas9 농도에 연결하는 선형 곡선을 정의합니다. 획득된 곡선의 기능을 사용하여 각 준비에서 Cas9 콘텐츠를 추정합니다.
참고: 재조합 Cas9 단백질 제어의 양은 표준 희석 세트의 가장 농축된 시료에 대한 판독값을 포화시킬 수 있다(도 2). 따라서 선형 곡선을 정의할 때, 발견된 Cas9의 공지된 농도와 관련하여 선형 범위에 있지 않은 경우 희석되지 않은 샘플(및 때로는 첫 번째 희석 단계의 판독값)에서 판독값을 제거하는 것이 좋습니다. 마찬가지로 Nanoblade 샘플 내에서 Cas9의 양을 추정할 때는 표준 곡선의 선형 범위 내에 있는 판독값만 사용합니다.
6. 나노 블레이드와 대상 셀의 변환 (12 웰 플레이트에서 변환하는 절차)
- 12웰 플레이트에서, 적절한 세포 배양 배지의 1mL에서 잘 당 100,000-200,000 세포(1차 또는 불멸의 신봉자 세포)를 종자. 세포가 변환 하기 전에 플레이트 표면에 부착 할 수 있습니다.
- 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브에서 농축 나노블레이드(3.5.1 또는 4.4단계)를 세포 배양 배지의 500 μL에 5-20 μL을 추가하고 P1000 pipettor로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 세포에서 배지를 제거하고 이 나노 블레이드 혼합물의 500 μL로 대체하십시오.
참고: 트랜스듀션은 각 셀 유형에 맞게 최적화되어야 합니다. 나노 블레이드가 고농축 상태로 유지되도록 (표적 세포의 건조를 피하면서) 중간의 가장 작은 부피를 사용하는 것이 중요합니다. 부착 된 세포는 플레이트에 부착된 상태에서 직접 변환되어야합니다 (이것은 트랜스 유도 효율을 크게 감소시키기 때문에 서스펜션에서 변환하지 마십시오). 몇몇 세포는 나노 블레이드에 장기간 노출을 용납 (24-48 h) 다른 매우 민감한 하 고 작은 syncytia 형성수 있습니다 하는 동안. 이 경우 나노 블레이드는 배지를 교체하기 전에 4-6 h에 대해서만 세포로 배양해야합니다. 척추 분비14 는 또한 현탁액에서 자란 세포에 대한 변환을 향상시킬 수 있습니다. 양이온 폴리머( 재료표 참조)와 같은 보조제는 일부 세포 유형의 트랜스포션 효율을 향상시킬 수 있습니다. - 나노블레이드를 함유하는 낮은 양의 세포 배양 후, 중간체의 부피를 정상 양(12웰 플레이트로 작업하는 경우 1mL)으로 증가하거나, 세포가 VLP에 민감하다면 신선한 배지로 교체한다.
참고: 나노블레이드를 함유한 세포 배지는 폐기하기 전에 10분 동안 0.5%의 하이포염소산나트륨으로 비활성화되어야 합니다. 저염나트륨을 조작할 때 장갑과 보호 고글을 사용하십시오. 나노 블레이드세포 사망을 유도하는 경우, 세포 사망률을 줄이기 위해 노출의 양과 총 시간을 조정합니다.
7. T7 엔도누클레스 분석에 의해 표적 궤적에서 CRISPR 효율 측정
- CRISPR-분열 부위를 아우르는 400-700베이스 페어(bp) 영역을 증폭시키는 PCR 프라이머를 설계한다.
참고: 분열 부위는 앰플리코 가장자리에서 적어도 200bp 이상 떨어져 있어야 하며, T7 엔도누클리스 분열시, 다른 크기의 2개의 단편이 방출되도록 앰플리코온의 중심에서 약간 이동해야 한다. - 나노 블레이드로 치료 된 세포에서 유전체 DNA를 추출하고 관심있는 유전자를 대상으로하고 제어 sgRNA로 프로그래밍 된 나노 블레이드로 치료 된 제어 세포로부터 ( 재료의 표 참조).
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 유전체 DNA 의 150 ng를 템플릿으로 사용하여 제조업체의 프로토콜을 따라 30 μL 부피 (최종 부피)의 PCR 반응을 프로그래밍합니다. PCR 증폭이 에티듐 브로마이드의 5 μg/mL(또는 더 안전한 대체 DNA 젤 얼룩)로 염색된 2% 아가로즈 젤을 실행하여 예상 크기의 단일 앰플리턴을 생성한다는 것을 확인하십시오.
참고: 유전적 결함을 유발하는 것으로 의심되는 에디튬 브로마이드를 조작할 때 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 헤테로두플렉스 생성 및 소화
- 0.2 mL PCR 튜브에서 효소 완충제의 5 μL(T7 엔도누셀 I제공), 20μL, PCR 제품의 24μL을 7.3단계에서 추가한다. 시료를 3분 이상 94°C로 가열한 다음 온도(분당 2°C)를 감소시켜 40°C에 도달하여 이테로두플렉스 형성을 허용한다.
- 제어를 포함하여 각 헤테로업플렉스 튜브에 실온에서 T7-endonuclease I의 0.5 μL을 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 에티듐 브로마이드에 의해 염색된 아가로즈 젤을 2.5%(중량/부피)로 하여금한다. 마이그레이션 후 UV 트랜실루미나이터에서 젤을 이미지합니다.
참고: 유전적 결함을 유발하는 것으로 의심되는 에디튬 브로마이드를 조작할 때 적절한 보호 장비를 착용하십시오. UV 트랜틸루미나이터를 사용할 때는 자외선 차단 고글을 사용하십시오. - 소화 반응으로 인한 이미지를 분석하여 각 대역의 강도를 적절한 소프트웨어로 정량화하여 골짜기 의 효율성을 측정 합니다(재료표 참조).
8. Sanger 시퀀싱 및 TIDE 분석에 의한 표적 궤적에서 CRISPR 효율 측정
참고: T7 엔도누클레스 분석법의 대안으로 CRISPR 효율은 TIDE 프로토콜15에 따라 Sanger 시퀀싱 추적의 분석 및 분착에 의해 모니터링될 수 있습니다.
- 전방 또는 역PCR 프라이머를 사용하여 7.3 단계 (처리되지 않은 세포에 대응하는 제어 조건을 포함)에서 PCR 증폭기의 Sanger 시퀀싱을 수행합니다.
- TIDE 서버(https://tide.nki.nl)를 이용하여 분석 지침에 따라 제어 조건(처리되지 않은 셀) 및 나노블레이드 처리 샘플의 Sanger 시퀀싱 흔적을 분석합니다.
9. 상동성 지향 수리를위한 ssODN 기증자와 나노 블레이드 복합 형성 (12 웰 플레이트에서 의 전관 절차)
참고: 효율적인 homology 지향 수리 중재 편집을 위한 ssODN 설계에 대한 지침은 이전에 설명되어 있습니다16.
- 12웰 플레이트에서, 적절한 세포 배양 배지의 1mL에서 잘 100,000-200,000 개의 세포를 잘 한다. 세포가 변환 하기 전에 플레이트 표면에 부착 할 수 있습니다.
- 1x PBS에서 8 μg/mL에서 양이온 폴리머용 용액 100 μL( 재료표 참조)을 준비한다.
- ssODN 템플릿의 100 pmol과 양이온 폴리머 용액의 19 μL을 혼합합니다. 농축 된 나노 블레이드 20 μL (단계 3.5.1 또는 4.4에서)을 추가하고 얼음에 15 분 동안 배양하십시오.
- 복잡한 나노 블레이드 / ssODN을 얼음에서 제거하고 세포 배양 배지의 500 μL (37 °C)을 추가하십시오. 표적 셀에서 배지를 제거하고(9.1단계에서) 복잡한 나노블레이드/ssODN을 포함하는 배지의 500 μL을 추가한다. 젤노티핑 전에 세포가 48 시간 동안 증식하도록 허용합니다.
- 전용 추출 키트를 사용하여 세포 집단의 일부에서 게놈 DNA를 추출 합니다(재료표 참조).
- 노크 인 사이트를 포괄하는 400-700 bp 영역을 증폭하려면 PCR 프라이머를 설계합니다.
참고: PCR 프라이머는 여전히 대상 세포 내에 존재하는 잔류 ssODN의 PCR 증폭으로 인한 거짓 양성 결과를 피하기 위해 ssODN의 상동성 팔과 겹치지 않아야합니다. - 제어 세포(처리되지 않은) 또는 나노블레이드 처리 세포로부터 150ng의 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 30 μL PCR 반응을 프로그래밍합니다.
참고: ssODN 흔적은 복합체와 의전 후 며칠 동안 세포 배지에 존재할 수 있다. 이 ssODN은 올바른 통합을 위해 화면을 시도하는 PCR 어세메이터의 부분 템플릿역할을 할 수 있습니다. 따라서, 최종 거짓 양성 분석서를 피하기 위해, 변환 후 적어도 두 번 세포를 통과하는 것이 좋습니다. - 에디듐 브로마이드에 의해 염색된 아가로즈 젤을 1%(중량/부피)로 제어 및 나노블레이드 처리 PCR 반응의 5 μL로드. 마이그레이션 후 UV-transilluminator에 젤을 이미지합니다.
참고: 상동성 재조합이 성공하고 1bp 이상의 유전 물질의 삽입에 대응하는 경우, 대조군과 나노블레이드 처리 샘플 간의 PCR 앰플리콘의 분자량에 차이가 있어야 한다. HDR의 효율이 100%에 도달하지 않으므로 나노블레이드 처리 샘플에서 두 개의 밴드가 표시되어야 합니다(편집되지 않은 진상골에 대응하는 제어 PCR 앰플리콘과 유사한 크기 중 하나 및 노크인 알레에 대응하는 더 높은 분자량 중 하나, 도 3B 중간 패널 참조).
- 노크 인 사이트를 포괄하는 400-700 bp 영역을 증폭하려면 PCR 프라이머를 설계합니다.
- 제어 및 나노 블레이드 처리 PCR 앰플리콘의 Sanger 시퀀싱을 수행합니다.
- TIDER 프로토콜17을 사용하여 녹아웃 효율을 정량화합니다.
10. 생체 내에서 나노 블레이드 납품
- 마우스와 함께 작업하는 경우 18년에 설명된 바와 같이, 레트로 궤도 주입을 통해 3.5.1 단계 또는 최대 100 μL의 농축 나노 블레이드를 최대 25 μL을 전달한다.
참고: 동물 실험과 관련된 모든 절차(게놈 편집 목적으로 나노블레이드 주사 포함)는 현지 윤리 위원회의 승인된 프로토콜이 필요합니다. - 형질전환마우스의 생성을 위해, 마이크로 인젝터를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 마우스 난모세포의 인식 공간으로 단계 4.4에서 농축 나노 블레이드의 1 pL내지 10 pL를 전달한다.
참고: 인식 주입의 경우 나노 블레이드를 자당 쿠션에 정화하고 농축하여 마이크로 인젝터의 막힘을 피하는 것이 필수적입니다.
Representative Results
Nanoblade 준비를 위한 프로토콜은 매우 간단하며 조직 배양 후드, CO2 인큐베이터 및 스윙 버킷 원심분리기 또는 초원심분리기에 대한 액세스 외에 간단한 실험실 장비가 필요합니다. 그러나, 일부 단계는 생산자 세포의 소스 및 처리뿐만 아니라 변환 조건과 같은 특별한주의를 필요로한다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 종자 세포는 플레이트에 균질하게 분포되어 경질 당일 ~70-80%의 합류에 도달할 수 있도록 종자 세포를 종자세포에 도달하는 것이 중요하다(세포의 덩어리가 없는 것을 피함). 24시간 후(도 1B,C), 생산자 세포는 여러 핵을 가진 더 큰 크기의 세포로 이어지는 싱크로시아를 형성할 것이다. 성형 후 40시간(도 1D) 플레이트의 대부분의 세포가 싱크성을 형성하고 플레이트에서 분리하기 시작합니다.
이것은 완벽하게 정상이며 이웃 세포 간의 융합을 유도하는 봉투 당단백질의 발현에 의해 발생합니다. 원심분리에 의한 농도(또는 생산자 세포의 상부로부터도 똑바로) 나노블레이드 내에 적재된 Cas9의 양은 재조합 Cas9를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 도트 블롯에 의해 절대적인 방식으로 정량화될 수 있다(도 2). 이 단계는 표적 세포의 변환에 사용할 나노 블레이드의 정확한 양을 결정하는 것이 중요합니다. 도트 블롯 분석기를 수행할 때는 표준 곡선의 선형 범위에 속하는 판독값만 고려하는 것이 중요합니다. 그러나, 나노블레이드 내에 존재하는 Cas9의 양과는 별개로, T7 엔도누셀 분석(그림 3) 또는 Sanger 시퀀싱을 사용하여 표적 세포에 직접 게놈 편집의 효율을 테스트하는 것이 필수적이다.
그림 3에 도시된 바와 같이 나노블레이드의 효율성은 일반적으로 Cas9의 양과 상관관계가 있지만 배치마다 다를 수 있습니다. 그림 3에 도시된 예에서 레인 1의 배치는 전체 편집 효율이 20%로 이어지는 반면 레인 3의 배치는 60%의 효율로 이어집니다. 이 경우 배치 1에서 사용되는 나노 블레이드의 부피를 증가시키고 배치 3과 유사한 편집 효율을 달성할 수 있다. 도 4는 다른 유형의 기본 셀에서 Nanoblades를 사용하여 얻은 최대 편집 효율을 나타낸다. 사용되는 sgRNA의 서열과 대상 접근성에 따라 효율성이 달라질 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
도 1: 나노블레이드 생산 중 생산자 세포의 형태학. (A) HEK293T 세포에서 70-80% 인플루엔자 24 h. (B 및 C) HEK293T 세포 형태학 24 h 의 형질 후. (D) HEK293T 세포 형태학 40 시간 후 형질. 스케일 바 = 400 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: 점 블롯에 의해 나노 블레이드 내의 Cas9 로딩을 정량화. (A) 재조합 Cas9 또는 100x 농축 (초원심 분리에 의해) 나노 블레이드 샘플 (#1, #2, 및 #3) 희석 및 항 Cas9P 커플로 인큐베이팅하기 전에 니트로 셀룰로오스 막에서 발견. 신호는 향상된 화학 발광에 의해 드러난다. (B) 화학발광 신호는 니트로셀룰로오스 멤브레인에서 발견된 Cas9의 공지된 양에 대하여 플롯된 재조합 Cas9 희석및 신호 강도에 대해 획득 및 정량화된다. 회귀 곡선은 선형 범위(파란색 십자가 참조)에 있는 희석제에 대해 계산되며 선형 범위 외부의 모든 농도를 제외합니다(적십자가 참조). (C) 각 나노블레이드 제제에서 Cas9 농도(nM)는 (B)에서 얻은 선형 회귀로부터의 방정식을 사용하여 추정하였다. 이를 위해 회귀 곡선의 선형 범위 내에 속하는 나노 블레이드 희석으로부터 정량화된 신호만 사용하는 것이 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 트랜스듀션 시 편집 효율 모니터링. (A) T7 엔도누셀 분석 분석이 나노블레이드 처리 된 세포의 절단 효율을 측정합니다. EMX1 유전자를 표적으로 하는 나노블레이드로 유도된 세포는 T7 엔도노클레스 분석에 의해 분석되었다. 레인 1: 나노 블레이드 준비 배치 #1 (20% 분열 효율); 레인 2: 제어 셀; 레인 3: 나노 블레이드 준비 배치 #2 (60% 분열 효율). (B) DDX3 오픈 판독 프레임 내에서 플래그 태그 시퀀스의 노크인. DDX3 궤적을 대상으로 하는 sgRNA로 프로그래밍된 농축 나노블레이드는 다른 HEK293T 클론(#1, #2)에서 생산되었으며, 플래그-DDX3 ssODN 템플릿과 HEK293T 표적 세포의 트랜스듀션에 사용되는 획득된 복합체의 용량증가로 복잡하게 생성되었다. 트랜스듀션 시, 세포는 게놈 DNA와 총 단백질을 추출하기 위해 수집하기 전에 3일 동안 재배되었다. 플래그-DDX3 단백질은 항플래그 아가로즈 구슬을 사용하여 면역침전이되었고, 이어서 항플래그 항체(top panel)를 사용하여 회수된 단백질의 웨스턴 블롯 분석이 뒤따랐다. Ddx3 메구에서 플래그 태그의 사이트 지향 삽입은 삽입 부위(가운데 패널)를 측면으로 하는 프라이머를 사용하거나 플래그 삽입 사이트(아래쪽 패널)의 Ddx3 로큐 하류에 특정한 플래그 태그 시퀀스와 역프라이머를 사용하는 프리머를 사용하여 PCR에 의해 분석되었다. 약어: EMX1 = 빈 스파이클 호모박스 1; DDX3 = 데드 박스 RNA 헬리케이스 3; PCR = 중합효소 연쇄 반응; ODN = 올리고디옥시뉴클레오티드; ssODN = 노래 좌초 ODN; sgRNA = 단일 가이드 RNA; IP = 면역 침전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 나노블레이드를 사용하여 다른 1차 세포 유형에서 달성된 편집 효율. 약어: PBL = 말초 혈액 림프구; IL = 인터류빈; CD = 차별화 클러스터; iPSC = 유도 만능 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
나노 블레이드는 세포주 및 1 차 세포에서 Cas9/sgRNA RNP 복합체의 신속하고 복용량 의존적인 납품을 허용합니다. 고전적인 트랜스페션 및 기타 바이러스 성 전달 벡터와는 달리 단백질 전기화와 마찬가지로 나노 블레이드는 트랜스진이없는 방식으로 Cas9 /sgRNA RNP의 일시적인 전달의 이점이 있습니다. 나노 블레이드는 CRISPR 변종의 계속 확장 제품군에 쉽고 빠르게 적응 할 수있는 단백질 전달을위한 매우 다재다능하고 간단하며 저렴한 플랫폼을 제공합니다. 나노 블레이드는 HEK293T 세포주 또는 그 유도체에서 생성될 수 있다. 여기에 사용되는 HEK293T 세포주 레트로 바이러스 및 렌즈바이러스 입자 생산을 극대화하기 위해 개발되었습니다 ( 재료의 표 참조). 그러나 HEK293T 세포의 다른 공급원이 적합할 수 있지만, 사용자는 HEK293T 세포원에 따라 입자 생산의 주요 차이점이 관찰됨에 따라 다양한 소스에서 HEK293T 세포를 테스트하고 비교해야 한다. 세포는 또한 입자 생산에 부정적인 영향을 미치는 과응영향을 피하기 위해 Mycoplasma 오염을 자주 검사하고 3 일마다 통과 (고전적으로 1/8 희석) 통과.
세포는 20개 이상의 구절을 위해 유지관리해서는 안 됩니다. 포도당, 페니실린/연쇄절제술, 글루타민, 10% 보완된 태아 소 혈청으로 보충된 DMEM은 세포 배양에 사용되었다. 혈청 원점은 나노 블레이드 준비의 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 혈청의 다른 배치는 대규모 생산 전에 테스트되어야한다. 나노 블레이드는 RPMI 또는 혈청없는 최소 필수 매체의 수정과 같은 다른 매체에서 효율적으로 생성 할 수 있으며, 이는 전환 후 당일 DMEM을 대체 할 수 있습니다. 아래에 표시된 바와 같이, 일부 DNA-transfection 시약과의 트랜스페션 후 중간 교체가 선택 사항이지만, 특히 입자 제제에서 혈청 흔적을 제한하는 것이 도움이 될 수 있다. 그러나, 감산의 최소 필수 배지에서 세포의 재배는 아직 시도되지 않았습니다.
언급했듯이, 나노 블레이드는 생산자 세포에서 플라스미드혼합물의 과발현시 생산된다. 최적의 생산에 과식이 필요한 것으로 보입니다. 실제로, 이 실험실은 개그폴 표현 구조가 항생제 선택에 의해 안정화된 생산자 세포줄을 개발했습니다. 그러나 이 시스템은 상당한 양의 나노 블레이드를 생성하지 못했습니다. 유사한 관찰은 sgRNA 코딩 구조가 생산자 세포의 게놈에 안정적으로 통합되었을 때 이루어졌다. 다른 입자 생산 시스템에 설명된 바와 같이, 나노블레이드 생산에 관여하는 적어도 일부 구조물을 발현하는 안정적인 세포주; 그러나, 이것은 확실히 입자를 정화하기 위하여 대량의 상체그리고 적당한 기술의 처리가 필요합니다. 위의 프로토콜은 특정 형질 전환 시약을 악용하는 나노 블레이드를 생성하는 기본 절차를 간략하게 설명 합니다(재료 표 참조).
다른 제조 업체에서 트랜스페션 시약도 성공으로 테스트되었지만, 나노 블레이드와이 그룹의 결과의 대부분은 여기에 설명 된 절차를 따릅니다. 저비용 트랜스페션은 칼슘 인산염 시약을 사용하여 달성되고 좋은 생산 효율을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 절대적으로 형질 전환 후 당일에 형질계의 교체가 필요하며 퇴적입자 제제에 칼슘 인산염 잔류물을 남길 수 있다. 생산자 세포 내의 나노 블레이드 성분에 대한 높은 발현 수준의 필요성과 일치하여 Cas9 단백질과 관련된 sgRNA의 양이 효율적인 게놈 편집을 위한 제한 인자가 될 수 있다는 관측이 있다. sgRNA 로딩을 개선하기 위해, 최근 나노 블레이드와 유사한 단백질 전달 벡터를 사용하여 독립적 인 그룹에 의해 두 가지 기술적 인 접근 이 개발되었습니다. 이들은 SgRNA6의 T7 폴리머라제 의존세포형 발현의 사용또는 개그 폴리프로틴6에 결합을 중재하기 위해 sgRNA 서열에 레트로바이러스 캡슐화 신호를 첨가함으로써 의존한다. 이러한 접근 방식은 아직 테스트되지 않았지만 나노 블레이드 내의 sgRNA 로딩을 실제로 향상시킬 수 있습니다.
표적 세포의 변환은 절차에서 중요한 단계입니다. 대부분의 불멸의 세포주에서 나노 블레이드와의 트랜스포션은 세포 병증 효과가 거의 또는 전혀 없습니다. 그러나, 1 차적인 세포에서, 독성은 문제가 될 수 있습니다. 따라서 트랜스유도는 각 셀 유형에 최적화되어야 합니다. 특히, 나노블레이드에 대한 노출 시간은 트랜스듀션 프로토콜을 최적화할 때 수정하는 중요한 요소입니다. 1차 뉴런 이나 골수 세포와 같은 민감한 세포의 경우, 매체를 교체하기 전에 나노 블레이드와 인큐베이션의 4-6 h는 세포 독성을 최소화하면서 Cas9 단백질의 효율적인 전달을 허용합니다. 더욱이, 양이온 폴리머와 같은 보조제는, 그 외의 사이에서, 몇몇 세포에 있는 전도의 효율성을 현저하게 향상할 수 있습니다 ( 재료의 표 참조). 나노 블레이드는 VLP이며 면역 원성 반응을 유도 할 수 있음을 주목하는 것이 중요합니다. 이것은 나노 블레이드와 함께 잠복이 유전자 발현및 세포의 표현형에 있는 중요한 변경을 유도할 수 있는 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 1 차적인 세포의 특정 모형으로 일하는 경우에 제한일 수 있습니다. 대식세포와 수지상 세포가 조혈 줄기 세포 전구체(예: 마우스 골수 세포)로부터 유래되는 경우 나노블레이드에 대한 세포 반응을 유도하지 않도록 완전히 분화되기 전에 나노블레이드로 세포를 전도하는 것이 바람직하다. 그렇지 않으면, Cas9 단백질 전기 화는 분화 된 면역 세포와 함께 작업 할 때 실행 가능한 대안을 나타낼 수 있습니다.
나노 블레이드는 형질 전환 동물을 생성하기 위해 마우스 zygotes 또는 배아를 변환하는 생체 내에서 사용할 수 있습니다. 고전적인 레트로 바이러스 또는 렌즈 바이러스 벡터와 유사, 그들은 또한 성인 동물에서 조직에 직접 주입 될 수 있습니다. 그러나, 나노블레이드(레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 유사)는 숙주 동물의 면역 반응에 의해 비활성화될 수 있다. 따라서, 주입되는 복용량은 각 응용 프로그램에 대해 최적화되어야한다. 이러한 면역 반응은 또한 주사 부위에 가까운 조직에 기능적인 VLP의 분포를 제한할 수 있다. 마지막으로, 렌즈피바이러스 벡터와 달리 나노블레이드는 트랜스진이 없으며 제한된 기간 내에 Cas9를 제공합니다. 따라서, 그(것)들은 세포의 선택에 sgRNAs의 높은 처리량 순서를 요구하는 게놈 전체 기능 검열을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 없습니다. 나노 블레이드는 급속한 경우 유용, 복용량 의존, 및 트랜스 유전자없는 게놈 편집이 필요한 20. 더욱이, 단백질 전기화와 유사하게, 나노블레이드는 DNA 트랜스페션 또는 고전적인 바이러스 벡터3를 통해 Cas9/sgRNA의 장기간 발현보다 더 적은 오프 타겟 효과로 이끌어 내는다3. 나노 블레이드의 미래 개발은 베이스 편집 및 RNA 타겟팅과 같은 다양한 기술 응용 분야에 대한 Cas9 변종을 통합하는 데 초점을 맞추고 있습니다.
Disclosures
필립 E. 만조와 에밀리아노 P. 리치는 나노 블레이드 기술에 관한 특허에 발명가로 선정된다 (특허 출원자: Institut 국립 드 라 산테 에 드 라 Recherche Médicale (INSERM), 센터 국립 드 라 레체체 시엔티피크 (CNRS), 에콜 사범 슈퍼 어르 드 리옹, 유니버시테 클로드 버나드 리옹 1, 빌반 Cexed 번호; 2 068077 0 특허 출원; 게시, 27 4 월 2017; 원고의 모든 측면은 특허 출원에 의해 적용됩니다. 나머지 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 후원 FINOVI, 응용 프로그램 인베세멘트 다베니르 (ANR-11-IDEX-0007) 내에서, 대학 드 리옹의 라벡스 에코펙트 (ANR-11-LABX-0048)에 의해 투자되었다 기관 내셔널 데 Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) 및 유럽 연구 위원회 (ERC-StG-LS6-805500 to E.P.R.) 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
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