Summary
我们开发了一种简单且廉价的方案，可在病毒样颗粒中加载Cas9 /单向导RNA（sgRNA）核糖核蛋白复合物。这些被称为"纳米刀片"的颗粒允许在不朽和原代细胞以及体内有效地递送Cas9 / sgRNA复合物。
Abstract
簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）-Cas系统使真核细胞中的基因组编辑民主化，并导致了许多创新应用的发展。然而，将Cas9蛋白和单向导RNA（sgRNA）递送到靶细胞中在技术上可能是一个挑战。经典的病毒载体，例如来自慢病毒（LVs）或腺相关病毒（AAV）的载体，允许在许多原代细胞和体内有效地递送编码Cas9蛋白及其相关sgRNA的转基因。然而，这些载体可能遭受缺点，例如转基因在靶细胞基因组中的整合，有限的载货容量以及Cas9蛋白和指导RNA在靶细胞中的长期表达。
为了克服其中一些问题，开发了一种基于小鼠白血病病毒（MLV）的递送载体，以在没有任何编码转基因的情况下包装Cas9蛋白及其相关的引导RNA。通过将Cas9蛋白融合到MLV结构蛋白Gag的C端，形成了加载了Cas9蛋白和sgRNA（称为"纳米刀片"）的病毒样颗粒（VLP）。可以从生产者细胞的培养基中收集纳米片，纯化，定量，并用于转导靶细胞并递送活性Cas9 / sgRNA复合物。纳米刀片在各种原代和不朽细胞中瞬时和快速地传递其核糖核蛋白（RNP）货物，并且可以针对其他应用进行编程，例如使用修饰的Cas9蛋白对靶基因的瞬时转录激活进行编程。纳米刀片能够在注射的成年小鼠的肝脏和卵母细胞中进行体内基因组编辑，以产生转基因动物。最后，它们可以与供体DNA复合，以实现"无转染"的同源性定向修复。纳米叶片制备简单，成本相对较低，可以在任何细胞生物学实验室中轻松进行。
Introduction
与其他可编程核酸酶相比，CRISPR-Cas系统极大地简化和民主化了真核细胞中序列特异性基因组靶向和切割的过程。通过sgRNA的简单表达，用户可以为几乎任何细胞位点编程Cas9蛋白（或优化的变体1）。在这种情况下，Cas9蛋白和sgRNA的递送成为进行位点导向诱变时的主要限制。在永生化细胞中，sgRNA和Cas蛋白可以很容易地从转染的质粒中表达，从而在大多数细胞中实现有效的基因组靶向。然而，Cas9/sgRNA复合物的本构表达可以增加Cas9蛋白的脱靶活性，并在非特异性位点2中引入不希望的变化。在原代细胞中，DNA转染在技术上可能难以实现，并导致表达不良或转染细胞的一小部分。经典DNA转染的替代方案包括使用病毒载体，提供Cas9和sgRNA的转基因编码或与合成sgRNA偶联的重组Cas9蛋白的电穿孔。然而，这些方法可导致细胞宿主基因组内的转基因整合（如经典的逆转录病毒和慢病毒表达载体的情况），受细胞因子的限制，并导致Cas9蛋白和sgRNA的本构表达。
Cas9 / sgRNA RNP复合物的电穿孔可以克服大多数这些问题，并导致原代细胞和体内的有效和瞬时递送，并允许剂量依赖性反应。然而，它通常依赖于昂贵的设备和试剂，并且如果必须处理大量细胞，也很难升级。作为上述技术的替代方案，这些作者开发了"Nanoblades"——一种用于Cas9蛋白和sgRNA3的逆转录病毒递送载体，在概念上与其他病毒衍生的衣壳蛋白递送系统相似4，5，6，7，8。纳米刀片利用逆转录病毒中Gag多蛋白的天然能力，当在培养细胞中单独表达时，产生在细胞外培养基中释放的VLP9。通过将Cas9蛋白融合到小鼠白血病病毒（MLV）Gag多蛋白的C端并共表达sgRNA和病毒包膜糖蛋白，Cas9蛋白可以封装在释放的VLP或纳米片内。纯化后，纳米片可以与靶细胞一起孵育或注射到体内，以介导Cas9 / sgRNA RNP复合物的快速，瞬态和剂量依赖性递送3。
纳米刀片可以使用多个sgRNA进行编程，以便在不同位点同时进行编辑，也可以使用Cas9变体进行编程以执行其他应用，例如靶标特异性转录激活或抑制3。与依赖于重组表达的蛋白质电穿孔相反，文献中新描述的Cas变体可以很容易地克隆到Gag融合表达载体中，使其成为一个多功能平台。纳米叶片可以进一步络合或装载单链和双链寡脱氧核苷酸（ssODN）以执行同源定向修复3。纳米刀片生产相对简单且便宜。此外，纳米叶片可以在4°C下储存多年，或在-80°C下长期储存。通常，纳米刀片在大多数永生化和原代培养的细胞中介导高效，无转基因的基因组编辑。然而，一些原代细胞可能对病毒颗粒的存在敏感，导致死亡率增加。先天免疫系统的细胞也可以对纳米叶片的存在做出反应（因为它们的病毒来源）并被激活。在这些情况下，必须优化转导方案，以限制纳米叶片的暴露时间并最大限度地减少非特异性影响。纳米刀片代表了其他可用CRISPR递送方法的可行且易于实施的替代方案。
Protocol
1. sgRNA设计与克隆
注意：sgRNA的设计指南可以从多个来源获得，例如 https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing 或Hanna和Doench10。
- 一旦设计了20个核苷酸sgRNA序列，就订购以下单链DNA寡核苷酸：
- 前向：5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' （N 对应于没有原始间隔相邻基序 （PAM） 序列的目标位点）
- 反向：5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' （N 对应于没有 PAM 序列的目标位点的反补）
注意：订购寡核苷酸时不需要特殊修饰（不需要5'磷酸盐）。
- 通过混合5μL退火缓冲液（500mM NaCl;100mM Tris-HCl;100mM MgCl2;10 mM DTT;25°C时pH 7.9），每个DNA寡核苷酸1μL（水中100μM储备溶液）和42μL水，将两个DNA寡核苷酸杂交到0.2mL聚合酶链反应（PCR）管中。
- 在PCR模块上，将样品在95°C下孵育15 s，然后将温度降低到20°C，斜升0.5°C / s。保存在室温下或储存在-20°C。
注意：协议可以在此处暂停。 - 在55°C下用10单位BsmBI-v2限制性内切酶在55°C下消化10μgBLADE或SUPERBLADE sgRNA表达质粒3小时，总反应体积为50μL。
注意：消化的载体应释放~1.9 kb的DNA插入片段和~3.3 kb的第二个DNA片段。 - 将限制性反应加载到用5μg/ mL溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上（或更安全的替代DNA凝胶染色剂）。
注意：在操作溴化乙锭时，请戴上适当的防护装备，溴化乙锭被怀疑会导致遗传缺陷。- 在波长为312nm的紫外线（UV）台上（以避免损坏DNA），从凝胶中切割3.3 kb DNA片段，并将其置于1.5mL微量离心管中。
注意：在操作溴化乙锭和在紫外线工作台上工作时，请佩戴适当的防护装备（手套和紫外线防护镜）。 - 使用专用的DNA凝胶提取试剂盒从含有3.3 kb DNA片段的切片凝胶中提取DNA（见 材料表）。使用分光光度计量化纯化DNA的量。
注意：协议可以在此处暂停。
- 在波长为312nm的紫外线（UV）台上（以避免损坏DNA），从凝胶中切割3.3 kb DNA片段，并将其置于1.5mL微量离心管中。
- 将步骤1.2中杂交的正向和反向DNA寡核苷酸从步骤1.5.2中Ligate到BSmB1消化，凝胶纯化的刀片或SUPERLADE载体。为此，加入2μLT4 DNA连接酶缓冲液，50ng凝胶纯化载体（来自步骤1.5.2），1μL杂交DNA寡核苷酸（来自步骤1.2），水以构成体积至19μL，以及1μL T4 DNA连接酶。将反应在25°C孵育10分钟。
- 将结扎产物转化为感性细菌（见 材料表），如11中所述。将转化后的细菌平放在氨苄西林Luria Bertani琼脂平板上，并在37°C下孵育过夜。
- 在琼脂平板上选择几个分离的菌落进行DNA微量制备11 （见 材料表），并使用U6前向引物（5'GACTATCATATGCTTACCGT 3'）进行Sanger测序，以检查sgRNA可变序列的正确连接。
注意：如果其他sgRNA表达质粒不编码Cas9蛋白，则可以使用它们，Cas9蛋白可能会干扰纳米叶片的产生。
2. 质粒制备
- 对所有必需的质粒进行最大制备（见 材料表），并以1μg/ mL制备10μg等分试样以储存在-20°C。 避免质粒的重复冷冻/解冻循环;在丢弃之前使用等分试样两次。
3. 纳米刀片制备
- 在第1天，在10 cm细胞培养皿中，将3.5至4×106 个HEK293T细胞（见 材料表）接种在10 mL含有高葡萄糖，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素的Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）中。轻轻地前后移动10厘米的板，然后从右到左（重复此序列5x）以均匀地将细胞分布在培养皿上。将细胞在37°C下孵育在具有5%CO 2的细胞培养箱中。
注意：与处理培养细胞和纳米刀片相关的所有程序均应在细胞培养层流罩下进行，以避免其污染。 - 第2天：质粒转染
- 接种后24小时，细胞应融合70-80%（图1A）。在转染之前，用10mL含有高葡萄糖，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，10%FBS（可以省略青霉素和链霉素，尽管不是强制性的）代替培养基。
注意：在此步骤中，重要的是细胞不融合。否则，转染效率和颗粒生产可能会降低。 - 对于每个10厘米的板，在1.5 mL管中制备以下量的质粒：0.3μgpCMV-VSV-G，0.7μgpBaEVRless，2.7μgMLV Gag / Pol，1.7μgBIC-Gag-Cas9，4.4μgBLADES或SUPERLADES质粒编码克隆的sgRNA（如果使用两个sgRNA，则每个2.2μg）。
- 加入500μL转染缓冲液（见 材料表），涡旋10秒，然后离心1秒。加入20μL转染试剂（见 材料表），涡旋管1秒，然后离心1秒。
- 在室温下孵育10分钟，并使用P1000移液器将整个溶液滴加到DMEM培养基中的细胞中。轻轻地前后移动10cm板，然后从右到左（重复此序列5x），以将转染试剂均匀分布在细胞上。将细胞在37°C下在具有5%CO 2的细胞培养箱中孵育至少40小时。
注意：如果需要，可以在转染后4小时更换培养基。
- 接种后24小时，细胞应融合70-80%（图1A）。在转染之前，用10mL含有高葡萄糖，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，10%FBS（可以省略青霉素和链霉素，尽管不是强制性的）代替培养基。
- 第3天，在显微镜下检查转染细胞的形态。
注：生产者电池将开始融合。这是由于梭原病毒包膜的表达而发生的正常情况（图1B，C）。 - 第4天：收获纳米刀片
注意：转染后至少40小时，由于梭原病毒包膜的表达，细胞会融合在一起，有时，细胞完全脱离板支撑物（图1D）。- 使用10 mL移液器收集9mL培养基上清液。
注意：纳米刀片是VLP，能够将Cas9蛋白及其相关的sgRNA递送到原代细胞和体内。虽然它们不被认为是转基因生物，因为它们没有遗传物质，但它们可以诱导遗传变化。因此，必须谨慎操作它们以避免与使用者的任何接触（特别是如果它们被编程为靶向肿瘤抑制基因）。建议用户在制备VLP和执行转导实验时，遵循当地操作逆转录病毒载体的安全性指南，并在BSL-2级实验室工作。纳米叶片可以用70%乙醇或0.5%次氯酸钠灭活。还建议用0.5%次氯酸钠处理所有塑料废物（移液器尖端，组织培养板，离心管）至少10分钟以灭活纳米刀片。 - 将收集的上清液以500× g 离心5分钟以除去细胞碎片并回收上清液而不干扰细胞沉淀。
注意：如果纳米刀片用于原代细胞，请使用0.45μm或0.8μm过滤器过滤上清液。请注意，此步骤会大大降低纳米刃滴度，因为过滤膜中将阻塞大量。 - 在4，300× g 或209，490×g的摆动斗形转 子中将 纳米叶片沉淀过夜（12-16小时），在4°C下超速离心75分钟（见 材料表）。
注意：如果靶细胞可以在DMEM中生长，则可以直接用步骤3.4.2后获得的上清液孵育它们，而无需浓缩纳米叶片。
- 使用10 mL移液器收集9mL培养基上清液。
- 第5天：纳米刀片的重悬和储存
- 离心后，缓慢吸出培养基并用100μL冷1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬白色沉淀。用parafilm覆盖管子，并在4°C下孵育1小时，轻轻搅拌，然后通过上下移液重新悬浮沉淀。
注意：重悬时可能会出现白色粘稠材料;这是正常的，不会显著影响转导效率。 - 如果计划在四周内使用它们，请将纳米刀片储存在4°C。否则，将纳米叶片在液氮中快速冷冻，并将其储存在-80°C。
注意：操作液氮时，请戴上护目镜和低温手套。在-80°C下卡扣冷冻和储存导致纳米叶片效率显着降低。此外，解冻的纳米刀片不应该再次冷冻。该协议可以在此处暂停。
- 离心后，缓慢吸出培养基并用100μL冷1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬白色沉淀。用parafilm覆盖管子，并在4°C下孵育1小时，轻轻搅拌，然后通过上下移液重新悬浮沉淀。
4. 纳米叶片在蔗糖垫上的浓度
注意：作为过夜离心或超速离心（步骤3.4.3）的替代方案，纳米片可以浓缩在蔗糖垫上。这会产生更纯净的纳米叶片，尽管回收的总量会更低。
- 在1x PBS中制备10%蔗糖溶液（重量体积），并通过0.2μm注射器过滤器过滤（见 材料表）。
- 开始将纳米刀片集中在蔗糖垫上的过程。
- 将9 mL含VLP的样品（从步骤3.4.3开始）放入超速离心管中（见 材料表）。使用3 mL注射器和套管，在样品下方缓慢分层2.5 mL的10%蔗糖，尽量不要混合含VLP的样品和蔗糖溶液。
- 或者，将2.5mL的10%蔗糖放入超速离心管中（见 材料表）。倾斜试管，用低速移液器缓慢加入9mL含VLP的样品（从步骤3.4.3开始）。在此操作过程中，逐渐将管子提升到垂直位置。
- 将样品在4°C下以209，490× g 在超速离心机中离心90分钟。
注意：该技术可以适用于低速离心（4，300 × g）过夜，如 12中所述。 - 离心后，小心地取出上清液，并将管倒置在薄纸上以除去任何残留的液体。1分钟后，加入100μL1x PBS，并将管置于4°C，用parafilm盖将管放在搅拌台上1小时（见 材料表），然后通过上下移液重新使用沉淀。
注意：协议可以在此处暂停。
5. 通过点印迹监测纳米刀片内的Cas9负载
- 通过在4体积的1x PBS中加入1体积的含有非离子表面活性剂的裂解缓冲液（见 材料表）来制备稀释缓冲液。将2μL浓缩的纳米片稀释在50μL稀释缓冲液中，短暂涡旋，并将25μL该混合物转移到含有25μL稀释缓冲液的新管中。重复此操作以获得4管纳米刀片稀释液（2倍稀释步骤）。
- 对于标准对照，将2μL重组Cas9核酸酶（见材料表）稀释到50μL稀释缓冲液中，短暂涡旋，然后进行8次连续稀释（每步2倍稀释）。
- 小心地将每个VLP稀释液的2.5μL和每种标准品的2.5μL点入具有多通道移液管的硝酸纤维素膜上（体积较大可能导致斑点重叠）。
注意：也可以使用甲醇处理的聚二氟乙烯膜。 - 一旦颗粒被吸收到膜上，用1x Tris缓冲盐水阻断膜，其中含有非离子表面活性剂（TBS-T），并在室温下补充脱脂奶粉（5%w / v）45分钟。
注意：实验方案可以在这里暂停，膜在4°C下储存在1x TBS-T中。 - 丢弃补充了脱脂奶粉的1x TBST，并用Cas9-辣根过氧化物酶抗体（1/1000稀释在1x TBST，5%牛奶中）在4°C下孵育膜过夜。用TBS-T洗涤膜3x，并使用增强的化学发光底物试剂盒可视化信号。
- 使用凝胶成像站或 imageJ13 提供的专有软件量化纳米片和重组 Cas9 标准稀释液的点强度。定义将点强度与 Cas9 浓度联系起来的线性曲线。利用所得曲线的函数，推断出各制剂中的Cas9含量。
注意：重组Cas9蛋白的量控制可以饱和标准稀释组中最浓缩样品的读数（图2）。因此，建议在定义线性曲线时，如果未稀释样品的读数（有时是第一个稀释步骤的读数）不在相对于发现的已知Cas9浓度的线性范围内，则将其删除。同样，当推断Nanoblade样品中Cas9的量时，仅使用标准曲线线性范围内的读数。
6.用纳米片转导靶细胞（在12孔板中转导的程序）
- 在12孔板中，将每孔100，000-200，000个细胞（原代或永生贴壁细胞）接种在1mL适当的细胞培养基中。在转导之前，让细胞粘附在板表面。
- 在1.5mL微量离心管中，加入5-20μL浓缩纳米片（从步骤3.5.1或4.4）到500μL细胞培养基，并通过用P1000移液器上下移液进行混合。从细胞中取出培养基，并用500μL的纳米刀片混合物代替。
注意：转导必须针对每种细胞类型进行优化。重要的是使用尽可能小体积的培养基（同时避免靶细胞干燥），以使纳米刀片保持高度浓缩。贴壁细胞在附着在板上时必须直接转导（不要在悬浮液中转导，因为这会显着降低转导效率）。一些细胞可以忍受长时间暴露于纳米叶片（24-48小时），而另一些细胞则非常敏感，可能形成小合胞体。在这种情况下，在更换培养基之前，Nanoblades必须仅与细胞一起孵育4-6小时。旋转接种14 还可以改善悬浮生长细胞的转导。阳离子聚合物等佐剂（见 材料表）也可以提高某些细胞类型的转导效率。 - 在含有Nanoblades的低体积培养基中孵育4-6小时后，将培养基的体积增加至正常量（如果使用12孔板，则为1mL），或者如果细胞对VLP敏感，则用新鲜培养基代替。
注意：含有纳米刀片的细胞培养基必须用0.5%次氯酸钠灭活10分钟，然后丢弃。操作次氯酸钠时，请使用手套和护目镜。如果纳米刀片诱导细胞死亡，请调整暴露量和总时间以降低细胞死亡率。
7. 通过T7内切酶测定法测量靶位点的CRISPR效率
- 设计PCR引物以扩增包含CRISPR裂解位点的400-700碱基对（bp）区域。
注意：裂解部位应与扩增子边缘保持至少200 bp的距离，并且应从扩增子的中心稍微移位，以便在T7内切酶裂解时，释放2个不同大小的片段。 - 从用纳米刀片处理的细胞中提取基因组DNA，靶向目标基因，并从用对照sgRNA编程的纳米刀片处理的对照细胞中提取基因组DNA（见 材料表）。
注意：协议可以在此处暂停。 - 使用150 ng基因组DNA作为模板，按照制造商的方案对30μL体积（最终体积）的PCR反应进行编程。通过运行用5μg/ mL溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶（或更安全的替代DNA凝胶染色剂），检查PCR扩增是否产生预期大小的单个扩增子。
注意：在操作溴化乙锭时，请戴上适当的防护装备，溴化乙锭被怀疑会导致遗传缺陷。该协议可以在此处暂停。 - 异质双链体生成和消解
- 在0.2mL PCR管中，从步骤7.3中加入5μL酶缓冲液（提供T7内切酶I），20μL水和24μLPCR产物。通过将样品加热到94°C超过3分钟，然后通过降低温度（每分钟2°C）以达到40°C，允许异质双相体的形成。
- 在室温下向每个杂双链管（包括对照管）中加入0.5μL T7-内切酶I。在37°C孵育15分钟。将所得反应物倒入用溴化乙锭染色的2.5%（重量/体积）琼脂糖凝胶中。迁移后，在UV透射仪上对凝胶进行成像。
注意：在操作溴化乙锭时，请戴上适当的防护装备，溴化乙锭被怀疑会导致遗传缺陷。使用紫外线透射器时，请使用紫外线防护镜。 - 通过分析消化反应产生的图像来测量切割效率，以使用适当的软件量化每个条带的强度（参见 材料表）。
8. 通过桑格测序和TIDE分析测量目标位点的CRISPR效率
注意：作为T7核酸内切酶测定的替代方案，CRISPR效率可以通过基于TIDE协议的Sanger测序痕迹的分析和解卷积来监测15。
- 使用正向或反向PCR引物对步骤7.3中的PCR扩增子（包括对应于未处理细胞的对照条件）进行Sanger测序。
- 使用TIDE服务器（https://tide.nki.nl）并遵循其分析指南分析对照条件（未处理的细胞）和Nanoblade处理样品的Sanger测序痕迹。
9.使用ssODN供体形成纳米叶片复合物，用于同源定向修复（在12孔板中转导的程序）
注：前面已经介绍了 ssODN 设计指南，以便进行有效的同源定向修复介导编辑16。
- 在12孔板中，在1mL适当的细胞培养基中每孔接种100，000-200，000个细胞。在转导之前，让细胞粘附在板表面。
- 在1x PBS中以8μg/ mL制备100μL阳离子聚合物溶液（见 材料表）。
- 将19μL阳离子聚合物溶液与100 pmol的ssODN模板混合。加入20μL浓缩的纳米片（从步骤3.5.1或4.4开始），并在冰上孵育15分钟。
- 从冰中取出络合的纳米片/ ssODN，并加入500μL细胞培养基（在37°C下）。从靶细胞中除去培养基（从步骤9.1开始），并加入含有复合纳米片/ ssODN的500μL培养基。在基因分型之前，让细胞增殖48小时。
- 使用专用的提取试剂盒从细胞群的一部分中提取基因组DNA（见 材料表）。
- 设计PCR引物以扩增包含敲入位点的400-700 bp区域。
注意：PCR 引物不应与 ssODN 的同源臂重叠，以避免 PCR 扩增仍存在于靶细胞内的任何残留 ssODN 导致假阳性结果。 - 使用来自对照细胞（未处理）或纳米刀片处理细胞的150ng基因组DNA作为模板，按照制造商的方案程序程序进行30μL PCR反应。
注意：ssODN痕量可能在与复合物转导后几天存在于细胞培养基中。该 ssODN 可用作 PCR 检测的部分模板，尝试筛选正确的整合。因此，建议在转导后至少传代两次细胞，以避免最终的假阳性测定。 - 在用溴化乙锭染色的1%（重量/体积）琼脂糖凝胶中加载5μL对照和纳米刀片处理的PCR反应。迁移后，在UV透射仪上对凝胶进行成像。
注意：如果同源重组成功并且对应于插入超过1 bp的遗传物质，则对照组和纳米刀片处理样品之间的PCR扩增子的分子量应存在差异。由于HDR的效率未达到100%，因此在纳米刀片处理的样品中应可以看到两个条带（一个与对应于未编辑等位基因的对照PCR扩增子大小相似，另一个与敲入等位基因相对应的较高分子量条带，见 图3B中间图）。
- 设计PCR引物以扩增包含敲入位点的400-700 bp区域。
- 对对照组和纳米刀片处理的PCR扩增子进行Sanger测序。
- 使用 TIDER 协议量化敲入效率17。
10. 纳米叶片在体内递送
- 如果与小鼠一起工作，则从步骤3.5.1通过后眶注射提供多达25μL浓缩纳米片，或通过尾静脉注射提供高达100μL的浓缩纳米片，如18中所述。
注意：所有涉及动物实验的程序（包括用于基因组编辑目的的Nanoblade注射）都需要当地伦理委员会批准的协议。 - 对于转基因小鼠的产生，使用微量注射器将步骤4.4中浓缩的纳米片从1 pL递送到小鼠卵母细胞的周维丝碱空间中18。
注意：对于周维特林注射液，必须将纳米叶片纯化和浓缩在蔗糖垫上，以避免微注射器堵塞。
Representative Results
纳米刀片制备方案相当简单，除了使用组织培养罩，CO2 培养箱和摆动桶离心机或超速离心机外，还需要简单的实验室设备。然而，有些步骤需要特别注意，例如生产者细胞的来源和处理，以及转导条件。如图 1A所示，重要的是接种细胞，使它们均匀地分布在板中，并在转染当天达到~70-80%的汇合（避免有细胞团块）。转染后24小时（图1B，C），生产者细胞将形成合胞体，导致具有多个细胞核的更大尺寸的细胞。转染后四十小时（图1D），板中的大多数细胞将形成合胞体并开始与板分离。
这是完全正常的，是由包膜糖蛋白的表达引起的，其诱导相邻细胞之间的融合。通过离心（甚至直接从生产细胞的上清液）浓缩后，可以使用重组Cas9作为参考，通过硝酸纤维素膜上的点印，以绝对的方式定量纳米片中载的Cas9的量（图2）。该步骤对于确定用于靶细胞转导的正确纳米片量非常重要。在进行点印测定时，重要的是只考虑标准曲线线性范围内的读数。然而，无论纳米片中存在的Cas9的量如何，使用T7内切酶测定法（图3）或Sanger测序直接在靶细胞上测试基因组编辑的效率至关重要。
如图3所示，纳米叶片的效率可能因批次而异，尽管它通常与Cas9的量相关。在图 3 所示的示例中，通道 1 中的批处理可提高 20% 的总体编辑效率，而通道 3 中的批处理可提高 60% 的效率。在这种情况下，可以从批次1增加使用的纳米刀片的体积，以实现与第3批相似的编辑效率。图4显示了在不同类型的原代细胞中使用Nanoblades获得的最大编辑效率。重要的是要注意，效率可能因所用sgRNA的序列和靶标可及性而异。
图1：纳米叶片生产过程中生产者细胞的形态学。 （A）电镀后24小时70-80%汇合的HEK293T细胞。（B 和 C）转染后24小时HEK293T细胞形态。（D）转染后40小时HEK293T细胞形态。比例尺 = 400 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
（A）重组Cas9或100倍浓缩（通过超速离心）纳米叶片样品（#1，#2和#3）依次稀释2倍，并在硝酸纤维素膜上发现，然后与抗Cas9 HRP偶联抗体一起孵育。信号通过增强的化学发光来揭示。（B）获取化学发光信号并将其量化为重组Cas9稀释液和信号强度，与硝酸纤维素膜上发现的已知数量的Cas9形成对比图。为线性范围内的稀释度计算回归曲线（参见蓝色十字），排除线性范围之外的所有浓度（参见红叉）。（C）使用从（B）中获得的线性回归方程推断每个纳米叶片制备中的Cas9浓度（nM）。为此，重要的是仅使用来自Nanoblade稀释的量化信号，该信号落在回归曲线的线性范围内。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：监测转导时的编辑效率。 （A）T7内切酶测定测量纳米叶片处理细胞中的裂解效率。用纳米刀片转导的靶向 EMX1 基因的细胞通过T7内切酶测定法进行分析。泳道1：纳米刀片制备批次#1（20%切割效率）;通道2：对照单元;泳道3：纳米叶片制备批次#2（60%切割效率）。（B） 在 DDX3 开放阅读框架内敲入标志标签序列。用靶向 DDX3 位点的sgRNA编程的浓缩纳米片从不同的HEK293T克隆（#1，#2）中产生，并与增加剂量的Flag-DDX3 ssODN模板和用于HEK293T靶细胞转导的获得复合物复合。转导后，细胞生长三天，然后收集它们以提取基因组DNA和总蛋白。使用抗旗琼脂糖微球对Flag-DDX3蛋白进行免疫沉淀，然后使用抗旗抗体（上图）对回收的蛋白质进行蛋白质印迹分析。PCR还使用 插入位点 两侧的引物（中间图）或使用识别Flag标签序列的前向引物和特定于Flag插入位点下游 的Ddx3 位点的反向引物（底部图）通过PCR测定Ddx3位点的位点定向插入。缩写： EMX1 = 空螺旋同胚盒 1;DDX3 = 死盒RNA解旋酶3;PCR =聚合酶链反应;ODN = 寡脱氧核苷酸;ssODN = sing-stranded ODN;sgRNA = 单向导链;IP = 免疫沉淀。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：使用纳米刀片在不同原代细胞类型中实现的编辑效率。 缩写： PBL = 外周血淋巴细胞;IL = 白细胞介素;CD = 分化簇;iPSC = 诱导多能干细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
纳米刀片允许在细胞系和原代细胞中快速和剂量依赖性地递送Cas9 / sgRNA RNP复合物。与经典转染和其他病毒递送载体相比，但与蛋白质电穿孔一样，Nanoblades具有以无转基因方式瞬时递送Cas9 / sgRNA RNP的优势。Nanoblades为蛋白质递送提供了一个高度通用，简单且廉价的平台，可以轻松快速地适应不断扩大的CRISPR变体家族。纳米刀片可以在HEK293T细胞系或其衍生物中生产。这里使用的HEK293T细胞系已被开发用于最大限度地提高逆转录病毒和慢病毒颗粒的产生（见 材料表）。然而，尽管HEK293T电池的其他来源可能适用，但用户必须测试和比较来自不同来源的HEK293T电池，因为根据HEK293T电池来源，已经观察到颗粒产生的主要差异。细胞还必须经常检查支原体污染，并每三天传代一次（通常为1/8稀释），以避免过度融合，这对颗粒产生产生负面影响。
细胞不应维持超过20次传代。补充葡萄糖、青霉素/链霉素、谷氨酰胺和10%分解胎牛血清的DMEM用于细胞培养。由于血清来源可能会影响纳米刀片制剂的质量，因此在大规模生产之前应测试不同批次的血清。纳米片可以在其他培养基中有效生产，例如RPMI或最小必需培养基的无血清修饰，可以在转染后的第二天取代DMEM。如下所述，尽管用某些DNA转染试剂转染后替代培养基是可选的，但修饰VLP释放到的培养基中可能是有益的，特别是为了限制颗粒制备中的血清痕量。然而，尚未尝试在转染前一天在低血清最低必需培养基中培养细胞。
如前所述，纳米片是在生产者细胞中质粒混合物过表达时产生的。过度表达似乎是最佳生产所必需的。事实上，该实验室开发了一种生产者细胞系，其中Gag-Pol表达构建体通过抗生素选择稳定;然而，该系统未能产生大量的纳米叶片。当sgRNA编码构建体稳定地整合到生产者细胞的基因组中时，也进行了类似的观察。如其他颗粒生产系统所述，表达至少一些参与纳米叶片生产的构建体的稳定细胞系可能是有用的;然而，这肯定需要处理大量的上清液和适当的技术来纯化颗粒。上述方案概述了利用特定转染试剂生产纳米片的首选程序（见 材料表）。
尽管来自其他制造商的转染试剂也已成功测试，但该组使用纳米刀片的绝大多数结果都遵循本文所述的程序。使用磷酸钙试剂可实现低成本转染，产生良好的生产效率;然而，这种方法绝对需要在转染后的第二天更换转染培养基，并可能在沉淀颗粒制备中留下磷酸钙残留物。与生产者细胞内纳米刃组分高表达水平的必要性相一致的是，与Cas9蛋白相关的sgRNA的量可能是有效基因组编辑的限制因素。为了改善sgRNA负载，独立小组最近开发了两种技术方法，使用类似于Nanoblades的蛋白质递送载体。这些依赖于使用sgRNA6的T7聚合酶依赖性细胞质表达或通过向sgRNA序列添加逆转录病毒封装信号来介导与Gag多蛋白6的结合。这些方法确实可以改善Nanoblades内的sgRNA负载，尽管它们尚未经过测试。
靶细胞的转导是该过程的关键步骤。在大多数永生化细胞系中，用纳米刀片转导具有很少或没有细胞病变作用。然而，在原代细胞中，毒性可能是一个问题。因此，转导必须针对每种细胞类型进行优化。具体而言，在优化转导协议时，纳米刀片的暴露时间是需要修改的重要因素。对于敏感细胞，如原代神经元或骨髓细胞，在更换培养基之前用纳米刀片孵育4-6小时可以有效地递送Cas9蛋白，同时最大限度地减少细胞毒性。此外，阳离子聚合物等佐剂可以显着提高某些电池的转导效率（见 材料表）。重要的是要注意，纳米刀片是VLP，可以诱导免疫原性反应。如果与某些类型的原代细胞（例如巨噬细胞或树突状细胞）一起工作，这可能是一个限制，其中与Nanoblades的孵育可以诱导基因表达和细胞表型的重要变化。如果巨噬细胞和树突状细胞来自造血干细胞前体（如小鼠骨髓细胞），则优选在它们完全分化之前用纳米片转导细胞，以避免诱导对纳米叶片的细胞反应。否则，Cas9蛋白电穿孔在处理分化的免疫细胞时可能是一种可行的替代方案。
纳米刀片可以在体内用于转导小鼠受精卵或胚胎以产生转基因动物。与经典的逆转录病毒或慢病毒载体类似，它们也可以直接注射到成年动物的组织中。然而，纳米刀片（类似于逆转录病毒和慢病毒载体）可以被宿主动物的免疫反应灭活;因此，必须针对每种应用优化注射剂量。这种免疫反应还可以限制功能性VLP在靠近注射部位的组织中的分布。最后，与慢病毒载体不同，Nanoblades是无转基因的，并且在有限的时间范围内递送Cas9。因此，它们不能用于进行全基因组功能筛选，这些筛选需要在选择细胞时对sgRNA进行高通量测序。当需要快速、剂量依赖性和无转基因基因组编辑时，纳米刀片是有用的20。此外，与蛋白质电穿孔类似，与通过DNA转染或经典病毒载体延长表达Cas9 / sgRNA相比，纳米片的脱靶效应更少3。Nanoblades的未来发展重点是将Cas9变体整合到不同的技术应用中，例如碱基编辑和RNA靶向。
Disclosures
Philippe E. Mangeot和Emiliano P. Ricci被任命为与Nanoblades技术相关的专利的发明人（专利申请人：国家卫生和医学研究研究所（INSERM），国家科学研究中心（CNRS），里昂高等师范学院，克劳德·伯纳德·里昂1号大学，维勒班·塞德克斯;申请号：WO 2017/068077 Al;专利状态： 出版于2017年4月27日;专利申请涵盖了手稿的各个方面。其余作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作由里昂大学的Labex Ecofect（ANR-11-LABX-0048）资助，由法国国家研究机构（ANR），FINOVI基金会，国家研究机构和病毒研究基金会（ANRS-ECTZ3306）和欧洲研究理事会（ERC-StG-LS6-805500至E.P.R.）根据欧盟的地平线2020研究和创新计划运营。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
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