Summary
Cas9/tek kılavuzlu RNA (sgRNA) ribonucleoprotein komplekslerini virüs benzeri parçacıklar içine yüklemek için basit ve ucuz bir protokol geliştirdik. "Nanoblades" adı verilen bu parçacıklar, Cas9/sgRNA kompleksinin ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerin yanı sıra in vivo olarak verimli bir şekilde teslimini sağlar.
Abstract
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)-Cas sistemi ökaryotik hücrelerde genom düzenlemeyi demokratikleştirmiş ve çok sayıda yenilikçi uygulamanın geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, Cas9 proteininin ve tek kılavuzlu RNA'nın (sgRNA) hedef hücrelere teslimi teknik olarak zor olabilir. Lentivirüsler (LV'ler) veya adeno ilişkili virüslerden (AAV' ler) elde edilenler gibi klasik viral vektörler, Cas9 proteini ve ilişkili sgRNA için transgenes kodlamasının birçok birincil hücrede ve in vivoda verimli bir şekilde sunulmasını sağlar. Bununla birlikte, bu vektörler transjenin hedef hücre genomuna entegrasyonu, sınırlı bir kargo kapasitesi ve Cas9 proteininin uzun süreli ekspresyoyup rna'yı hedef hücrelerde yönlendirmesi gibi dezavantajlardan muzdarip olabilir.
Bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için, herhangi bir kodlama transgene yokluğunda Cas9 proteinini ve ilişkili kılavuz RNA'yı paketlemek için murine Lösemi virüsüne (MLV) dayanan bir doğum vektörü geliştirilmiştir. Cas9 proteininin MLV'den Gag yapısal proteininin C-terminusuna kaynaştırılarak, Cas9 proteini ve sgRNA ("Nanoblades" olarak adlandırılır) ile yüklü virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) oluştu. Nanoblades, üretici hücrelerin kültür ortamından toplanabilir, saflaştırılabilir, ölçülebilir ve hedef hücreleri transdüse etmek ve aktif Cas9/sgRNA kompleksini sağlamak için kullanılabilir. Nanoblades, ribonikleoprotein (RNP) yüklerini çok çeşitli birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücrelerde geçici ve hızlı bir şekilde sunar ve değiştirilmiş Cas9 proteinleri kullanılarak hedeflenen genlerin geçici transkripsiyonal aktivasyonu gibi diğer uygulamalar için programlanabilir. Nanoblades, transgenik hayvanlar üretmek için enjekte edilen yetişkin farelerin karaciğerinde ve oositlerde in vivo genom düzenleme yeteneğine sahiptir. Son olarak, "transfection içermeyen" homolojiye yönelik onarım için donör DNA'sı ile karmaşıklanabilirler. Nanoblade hazırlama basit, nispeten düşük maliyetlidir ve herhangi bir hücre biyolojisi laboratuvarında kolayca gerçekleştirilebilir.
Introduction
Crispr-Cas sistemi, diğer programlanabilir nükleaslarla karşılaştırıldığında, ökaryotik hücrelerde diziye özgü genom hedefleme ve bölünme prosedürünü önemli ölçüde basitleştirdi ve demokratikleştirdi. Bir sgRNA'nın basit ifadesiyle, kullanıcılar Cas9 proteinini (veya optimize edilmiş varyantları) hemen hemen her hücresel lokus için programlayabilir1. Bu senaryoda, Cas9 proteini ve sgRNA'nın teslimatı, bölgeye yönelik mutajensis yapılırken ana sınırlama haline gelir. Ölümsüzleştirilmiş hücrelerde, sgRNA ve Cas proteini, çoğu hücrede verimli genom hedeflemesi elde etmek için transfected plazmidlerden kolayca ifade edilebilir. Bununla birlikte, Cas9/sgRNA kompleksinin kesin ifadesi Cas9 proteininin hedef dışı aktivitesini artırabilir ve spesifik olmayan loci2'de istenmeyen değişikliklere neden olabilir. Birincil hücrelerde, DNA transfeksiyonunun elde edilmesi teknik olarak zor olabilir ve zayıf ifadeye veya transktaklı hücrelerin küçük bir yüzdesine yol açabilir. Klasik DNA transfeksiyonuna alternatifler, Cas9 ve sgRNA için transgene kodlaması sağlayan viral vektörlerin kullanımını veya sentetik bir sgRNA ile birleştirilmiş rekombinant Cas9 proteininin elektroporasyonunu içerir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar hücre konak genomu içinde transgene entegrasyonuna (klasik retroviral ve lentiviral ekspresyon vektörlerinde olduğu gibi), hücresel faktörler tarafından kısıtlanmaya ve Cas9 proteini ve sgRNA'nın constitutive ekspresyonuna yol açabilir.
Cas9/sgRNA RNP kompleksinin elektroporasyonunun bu sorunların çoğunun üstesinden gelerek birincil hücrelerde ve in vivoda verimli ve geçici teslimata yol açabileceği gibi doza bağlı bir yanıta da izin verebilir. Bununla birlikte, genellikle pahalı ekipmanlara ve reaktiflere dayanır ve çok sayıda hücrenin tedavi edilmesi gerekiyorsa ölçeklenilmesi de zordur. Yukarıda belirtilen tekniklere alternatif olarak, bu yazarlar Cas9 proteini ve sgRNA3 için kavramsal olarak diğer viral türetilmiş kapsid protein dağıtım sistemlerine benzer bir retroviral iletim vektörü olan "Nanoblades"i geliştirmiştir4,5,6,7,8. Nanoblades, gag poliproteinin doğal kapasitesini retrovirüslerden yararlanarak, kültürlü hücrelerde tek başına ifade edildiğinde, hücre dışı ortamda salınan VLP'leri üretir9. Cas9 proteinini murine lösemi virüsünün (MLV) Gag poliproteinin C-terminal ucuna kaynaştırarak ve sgRNA ve viral zarf glikoproteinlerini birlikte ifade ederek, Cas9 proteini serbest bırakılan VLP'ler veya Nanoblades içinde kapsüllenebilir. Saflaştırmadan sonra, Nanoblades hedef hücrelerle inkübe edilebilir veya Cas9 / sgRNA RNP kompleksinin hızlı, geçici ve doza bağlı teslimatına aracılık etmek için vivo enjekte edilebilir3.
Nanoblades, farklı loci'de eşzamanlı düzenleme için birden fazla sgRNA ile veya hedefe özgü transkripsiyonal aktivasyon veya baskı3 gibi diğer uygulamaları gerçekleştirmek için Cas9 varyantlarıyla programlanabilir. Rekombinant ifadeye dayanan protein elektroporasyonunun aksine, literatürden yeni tanımlanan Cas varyantları Gag füzyon ifade vektörüne kolayca klonlanabilir ve bu da onu çok yönlü bir platform haline getirir. Nanoblades daha da karmaşık hale getirilebilir veya homolojiye yönelik onarım yapmak için tek telli ve çift telli oligodeoksinükleotidler (ssODN'ler) ile yüklenebilir3. Nanoblade üretimi nispeten basit ve ucuzdur. Ayrıca, Nanoblades günlerce 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir. Tipik olarak, Nanoblades çoğu ölümsüzleştirilmiş ve birincil kültürlü hücrelerde verimli, transgene içermeyen genom düzenlemeye aracılık eder. Bununla birlikte, bazı birincil hücreler viral parçacıkların varlığına duyarlı olabilir ve bu da mortalitenin artmasına neden olabilir. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin hücreleri de Nanoblades varlığına (viral kökenleri nedeniyle) tepki verebilir ve aktive olabilir. Bu durumlarda, transdüksiyon protokolü Nanoblades maruz kalma süresini sınırlamak ve spesifik olmayan etkileri en aza indirmek için optimize edilmelidir. Nanoblades, mevcut diğer CRISPR teslimat yöntemlerine uygulanabilir ve uygulanması kolay bir alternatifi temsil eder.
Protocol
1. sgRNA Tasarım ve klonlama
NOT: SgRNA'ların tasarımına ilişkin yönergeler https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing veya Hanna ve Doench10 gibi birden fazla kaynaktan elde edilebilir.
- 20 nükleotid sgRNA dizisi tasarlandıktan sonra, aşağıdaki tek iplikli DNA oligonükleotidlerini sipariş edin:
- İleri: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N, protospacer bitişik motif (PAM) dizisi olmadan hedeflenen lokusa karşılık gelir)
- Ters: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N, PAM dizisi olmadan hedeflenen lokusun ters tamamlayıcısına karşılık gelir)
NOT: Oligonükleotidleri sipariş ederken özel bir değişiklik gerekmez (5' fosfat için gereklilik yoktur).
- 5 μL tavlama tamponunu (500 mM NaCl) karıştırarak iki DNA oligonükleotidini 0,2 mL polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpünde melezleştirin; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; 25 °C'de pH 7.9), her DNA oligonükleotidinin 1 μL'si (suda 100 μM stok çözeltisi) ve 42 μL su.
- Bir PCR bloğunda, numuneleri 15 s için 95 °C'de kuluçkaya yatırın ve ardından 0,5 °C/s'lik bir rampa ile sıcaklığı 20 °C'ye düşürin. Oda sıcaklığında tutun veya -20 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Toplam reaksiyon hacmi 50 μL'de 55 °C'de 3 saat boyunca 10 birim BsmBI-v2 kısıtlama enzimi ile BLADE veya SUPERBLADE sgRNA ekspresyon plazmidlerinin 10 μg'sını sindirin.
NOT: Sindirilen vektör ~ 1.9 kb'lık bir DNA ekini ve ~3.3 kb'lık ikinci bir DNA parçasını serbest bırakmalıdır. - Kısıtlama reaksiyonunu 5 μg/mL ethidium bromür (veya daha güvenli bir alternatif DNA jeli lekesi) ile boyanmış% 1 agarose jel üzerine yükleyin.
NOT: Genetik kusurlara neden olduğundan şüphelenilen ethidium bromürü manipüle ederken uygun koruma ekipmanlarını giyin.- 312 nm dalga boyunda ayarlanmış bir ultraviyole (UV) tablasında (DNA'ya zarar vermemek için), jelden 3,3 kb DNA parçasını kesin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Ethidyum bromürü manipüle ederken ve UV tablası üzerinde çalışırken uygun koruma donanımlarını (eldivenler ve UV koruma gözlükleri) giyin. - Özel bir DNA jeli çıkarma kiti kullanarak 3,3 kb DNA parçasını içeren dilimlenmiş jelden DNA çıkarın ( Bkz. Malzeme Tablosu). Spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış DNA miktarını ölçün.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- 312 nm dalga boyunda ayarlanmış bir ultraviyole (UV) tablasında (DNA'ya zarar vermemek için), jelden 3,3 kb DNA parçasını kesin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- Melezlenmiş ileri ve ters DNA oligonükleotidlerini adım 1.5.2'den BsmB1 sindirilmiş, jelle arındırılmış BLADES veya SUPERBLADE vektörüne kadar bir kenara alın. Bunun için 2 μL T4 DNA ligaz tamponu, jelle arındırılmış vektörün 50 ng'si (adım 1.5.2'den itibaren), melezleştirilmiş DNA oligonükleotidlerinin 1 μL'si (adım 1.2'den itibaren), hacmi 19 μL'ye çıkarmak için su ve 1 μL T4 DNA ligase ekleyin. Reaksiyonun 25 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır.
- Ligasyon ürününü 11'de açıklandığı gibi yetkin bakterilere dönüştürün (Malzeme Tablosuna bakın). Dönüştürülmüş bakterileri ampisilin Luria Bertani agar plakasına koyun ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- DNA mini hazırlık11 gerçekleştirmek için agar plakasında birkaç izole koloni seçin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve sgRNA değişken dizisinin düzeltilmesini kontrol etmek için bir U6 ileri astarı (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') kullanarak Sanger dizilimini gerçekleştirin.
NOT: Diğer sgRNA ekspresyon plazmidleri, Nanoblade üretimini engelleyebilecek Cas9 proteini için kod yapmazlarsa kullanılabilir.
2. Plazmid hazırlığı
- Gerekli tüm plazmidlerin maksipreparasyonunu gerçekleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'de saklamak için 1 μg/ mL'de 10 μg aliquot hazırlayın. Plazmidlerin tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının; aliquots'u atmadan önce iki kez kullanın.
3. Nanoblade hazırlığı
- 1. Günde, 3,5 ila 4 × arasında tohum 106 HEK293T hücre (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 mL'de Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) yüksek glikoz, sodyum piruvat, L-glutamin, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10 cm hücreli kültür çanağı içinde penisilin/streptomisin bulunur. Hücreleri kültür çanağı üzerinde homojen bir şekilde dağıtmak için 10 cm plakayı hafifçe geriye ve ileriye, ardından sağdan sola doğru hareket ettirin (bu sırayı 5x tekrarlayın). %5 CO2'li bir hücre inkübatöründe hücreleri 37 °C'de kuluçkaya yatır.
NOT: Kültürlü hücrelerin ve Nanobladeslerin kullanımı ile ilgili tüm prosedürler, kirlenmelerini önlemek için bir hücre kültürü laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. - 2. Gün: Plazmid transfeksiyon
- Hücreler kaplamadan sonra %70-80 birikmeli 24 saat olmalıdır (Şekil 1A). Transeksiyondan önce ortamı yüksek glikoz, sodyum piruvat, L-glutamin, %10 FBS (penisilin ve streptomisin zorunlu olmasa da atlanabilir) içeren 10 mL taze DMEM ile değiştirin.
NOT: Bu adımda, hücrelerin bir arada olmaması önemlidir. Aksi takdirde, transfeksiyon verimliliği ve partikül üretimi azaltılabilir. - Her 10 cm plaka için, 1,5 mL'lik bir tüpte aşağıdaki miktarda plazmid hazırlayın: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg BLADES veya SUPERBLADES plazmid klonlanmış sgRNA'yı (veya iki sgRNA kullanıyorsanız her biri 2,2 μg) kodlar.
- 500 μL transfeksiyon tamponu ekleyin ( Bkz. Malzeme Tablosu), 10 sn için girdap ve ardından 1 sn için santrifüj. Transfeksiyon reaktifinin 20 μL'sini ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın), tüpü 1 sn boyunca girdap ve ardından 1 s için santrifüj.
- Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslanın ve P1000 pipetörü kullanarak tüm çözeltiyi DMEM ortamındaki hücrelere damla yönünde ekleyin. Transfeksiyon reaktifini hücreler üzerinde düzgün bir şekilde dağıtmak için 10 cm plakayı hafifçe geriye ve ileriye, ardından sağdan sola doğru hareket ettirin (bu sırayı 5x tekrarlayın). %5 CO2'li bir hücre inkübatöründe hücreleri en az 40 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: İstenirse, transfeksiyondan 4 saat sonra orta değiştirilebilir.
- Hücreler kaplamadan sonra %70-80 birikmeli 24 saat olmalıdır (Şekil 1A). Transeksiyondan önce ortamı yüksek glikoz, sodyum piruvat, L-glutamin, %10 FBS (penisilin ve streptomisin zorunlu olmasa da atlanabilir) içeren 10 mL taze DMEM ile değiştirin.
- 3. günde, mikroskop altında transfected hücrelerin morfolojisini kontrol edin.
NOT: Üretici hücreler kaynaşmaya başlayacaktır. Bu, fsojenik viral zarfların ekspresyasyonu nedeniyle normal bir durumdur (Şekil 1B,C). - 4. Gün: Nanoblades Hasadı
NOT: Transfeksiyondan en az 40 saat sonra, hücreler fsojenik viral zarfların ekspresyonu nedeniyle kaynaşmış ve bazen hücreler plaka desteğinden tamamen ayrılırdı (Şekil 1D).- 10 mL pipet kullanarak kültür orta supernatant 9 mL toplamak.
NOT: Nanoblades, Cas9 proteinini ve ilişkili sgRNA'sını birincil hücrelere ve in vivoya teslim edebilen VLP'lerdir. Genetik materyalden yoksun oldukları için genetiği değiştirilmiş organizmalar olarak kabul edilmemeseler de genetik değişikliklere neden olabilirler. Bu nedenle, kullanıcılarla herhangi bir temastan kaçınmak için dikkatli bir şekilde manipüle edilmelidirler (özellikle tümör baskılayıcı genleri hedeflemek için programlanmışlarsa). Kullanıcıların retroviral vektörlerin manipülasyonu için yerel güvenlik yönergelerine uymaları ve VLP'leri hazırlarken ve transdüksiyon deneyleri yaparken BSL-2 seviyesinde bir laboratuvarda çalışmaları önerilir. Nanoblades% 70 etanol veya sodyum hipoklorit% 0.5 ile inaktive edilebilir. Nanoblades'i devre dışı bırakmak için tüm plastik atıkların (pipet uçları, doku kültürü plakaları, santrifüj tüpleri) en az 10 dakika boyunca% 0,5 sodyum hipoklorit ile muamele edilmesi de tavsiye edilir. - Toplanan süpernatantı hücresel kalıntıları gidermek ve hücre peletini bozmadan süpernatantı kurtarmak için 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin.
NOT: Nanoblades birincil hücrelerde kullanılmak üzerese, süpernatantı 0,45 μm veya 0,8 μm filtre kullanarak filtreleyin. Bu adımın Nanoblade titerini önemli ölçüde azalttığını unutmayın, çünkü filtre zarında önemli bir fraksiyon engellenecektir. - Nanoblades'i bir gecede (12-16 saat) 4.300 × g'da sallanan kova rotorunda veya 4 °C'de 75 dakika boyunca ultracentrifuge'da 209.490 × g'da pelet ( Bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Hedef hücreler DMEM'de büyüyebiliyorsa, Nanoblades'i konsantre etmeden 3.4.2 adımından sonra elde edilen süpernatant ile doğrudan kuluçkaya yatırmak mümkündür.
- 10 mL pipet kullanarak kültür orta supernatant 9 mL toplamak.
- 5. Gün: Nanoblades'in yeniden doğuşu ve depolanması
- Santrifüjlemeden sonra, ortamı yavaşça emiş edin ve beyaz peleti 100 μL soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden depolayın. Tüpü parafilm ile örtün ve yukarı ve aşağı borulayarak peleti yeniden canlandırmadan önce hafif ajitasyonla 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Resüspensyon sırasında beyaz viskoz bir malzeme görünebilir; bu normaldir ve transdüksiyonun verimliliğini önemli ölçüde etkilemez. - Nanoblades'i dört hafta içinde kullanmayı planlıyorsanız 4 °C'de saklayın. Aksi takdirde, Nanoblades'i sıvı nitrojende dondurun ve -80 °C'de saklayın.
NOT: Sıvı nitrojeni manipüle ederken koruma gözlükleri ve kriyojenik eldivenler giyin. -80 °C'de çıtçıt dondurma ve depolama, Nanoblade verimliliğinde önemli bir düşüşe yol açar. Ayrıca, çözülmüş Nanoblades tekrar dondurulmamalıdır. Protokol burada duraklatılabilir.
- Santrifüjlemeden sonra, ortamı yavaşça emiş edin ve beyaz peleti 100 μL soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden depolayın. Tüpü parafilm ile örtün ve yukarı ve aşağı borulayarak peleti yeniden canlandırmadan önce hafif ajitasyonla 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
4. Bir sakkaroz minderinde Nanoblades konsantrasyonu
NOT: Gece santrifüjleme veya ultracentrifugation'a (adım 3.4.3) alternatif olarak, Nanoblades bir sakkaroz yastığı üzerinde yoğunlaştırılabilir. Bu, Nanoblades'in daha saf bir kısmını verir, ancak kurtarılan toplam miktar daha düşük olacaktır.
- 1x PBS'de %10 sakkaroz çözeltisi (ağırlıktan hacme) hazırlayın ve 0,2 μm şırıng filtresinden filtreleyin ( Bkz. Malzeme Tablosu).
- Nanoblades'i sakkaroz yastığına konsantre etme işlemine başlayın.
- 9 mL VLP içeren numuneyi (adım 3.4.3'ten itibaren) ultra merkezi bir tüpe yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu). 3 mL şırınna ve kanül kullanarak, numunenin altındaki% 10 sakkarozun 2,5 mL'sini yavaşça katmanlayın, VLP içeren numuneyi ve sakkaroz çözeltisini karıştırmamaya çalışın.
- Alternatif olarak, %10 sakkarozun 2,5 mL'sini ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu). Tüpü eğin ve düşük hızlı pipettör ile 9 mL VLP içeren numuneyi (adım 3.4.3'ten itibaren) yavaşça ekleyin. Bu işlem sırasında, tüpü kademeli olarak dikey bir konuma yükseltin.
- Numuneleri 209.490 × g'da 4 °C'de 90 dakika boyunca ultra merkezirifuge santrifüj.
NOT: Bu teknik, 12'de açıklandığı gibi bir gecede düşük hızlı santrifüjleme (4.300 × g) için uyarlanabilir. - Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve kalan sıvıyı çıkarmak için tüpü kağıt mendilin üzerine baş aşağı yerleştirin. 1 dakika sonra, 100 μL 1x PBS ekleyin ve yukarı ve aşağı borulama yaparak peleti yeniden canlandırmadan önce tüpü 1 saat boyunca bir ajitasyon masasındaki bir tüp tutucusuna parafilm kapağı ile 4 °C'ye yerleştirin (Malzeme Masasına bakın).
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
5. Nanoblades içinde Cas9 yüklemesi nokta-blot ile izleme
- 1x PBS'nin 4 hacminde iyonik olmayan bir yüzey aktif madde içeren 1 birim lizis arabelleği ekleyerek seyreltme tamponunu hazırlayın ( Bkz. Malzeme Tablosu). 2 μL konsantre Nanoblades'i 50 μL seyreltme tamponunda, girdapta kısaca seyreltin ve bu karışımın 25 μL'lik kısmını 25 μL seyreltme tamponu içeren yeni bir tüpe aktarın. 4 tüp Nanoblade seyreltme (2 kat seyreltme adımları) olması için bu işlemi tekrarlayın.
- Standart kontroller için, 2 μL rekombinant Cas9 çekirdeğini seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın) 50 μL seyreltme tamponuna seyreltin, kısaca girdap yapın ve sekiz seri seyreltme (her adım için 2 kat seyreltme) yapmaya devam edin.
- Her VLP seyreltmenin 2,5 μL'sine ve her standardın 2,5 μL'sine çok kanallı pipetli bir nitroselüloz membran üzerine dikkatlice tespit edin (daha büyük bir hacim üst üste binen noktalara neden olabilir).
NOT: Metanol ile işlenmiş polivinyldifluorid membran da kullanılabilir. - Parçacıklar zara emildikten sonra, membranı oda sıcaklığında 45 dakika boyunca yağsız kuru süt (%5 w/v) ile desteklenmiş iyonik olmayan bir yüzey aktif madde (TBS-T) içeren 1x Tris tamponlu salin ile engelleyin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve membran 1x TBS-T'de 4 °C'de depolanabilir. - Yağsız kuru sütle desteklenmiş 1x TBST'yi atın ve membranı cas9-yaban turpu peroksidaz antikoru (1x TBST'de 1/1000 seyreltme, % 5 süt) ile 4 °C'de bir gecede kuluçkaya bırakın. Membran 3x'i TBS-T ile yıkayın ve gelişmiş bir kemimümünsan substrat kiti kullanarak sinyali görselleştirin.
- Jel görüntüleme istasyonu veya imageJ13 ile sağlanan tescilli yazılımı kullanarak Nanoblades ve rekombinant Cas9 standart seyreltmeleri için nokta yoğunluğunu ölçün. Nokta yoğunluğunu Cas9 konsantrasyonuna bağlayan doğrusal bir eğri tanımlayın. Elde edilen eğrinin işlevini kullanarak, her hazırlıkta Cas9 içeriğini tahmin edin.
NOT: Rekombinant Cas9 protein kontrolü miktarı, standart seyreltme kümesinin en konsantre numuneleri için okumayı doyurabilir (Şekil 2). Bu nedenle, doğrusal eğriyi tanımlarken, tespit edilen cas9'un bilinen konsantrasyonu ile ilgili doğrusal aralıkta değillerse, seyreltilmemiş örneklerden (ve bazen ilk seyreltme adımlarından) okumayı kaldırmaları önerilir. Benzer şekilde, Nanoblade örnekleri içindeki Cas9 miktarını tahmin ederken, yalnızca standart eğrinin doğrusal aralığındaki okumaları kullanın.
6. Nanoblades ile hedef hücrelerin transdüksiyon (12 kuyu plakasında transdüksiyon prosedürü)
- 12 kuyulu bir tabakta, uygun hücre kültürü ortamının 1 mL'sinde kuyu başına 100.000-200.000 hücre (birincil veya ölümsüzleştirilmiş yapışık hücreler) tohumu. Transdüksiyondan önce hücrelerin plaka yüzeyine yapışmasına izin verin.
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde, 5-20 μL konsantre Nanoblades (adım 3,5,1 veya 4,4'ten) ila 500 μL hücre kültürü ortamı ekleyin ve bir P1000 pipetörü ile yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın. Ortamı hücrelerden çıkarın ve bu Nanoblade karışımının 500 μL'si ile değiştirin.
NOT: Transdüksiyon her hücre tipi için en iyi duruma getirilmelidir. Nanoblades'in yüksek oranda konsantre kalması için mümkün olan en küçük orta hacmini (hedef hücrelerin kurumasını önlerken) kullanmak önemlidir. Yapışık hücreler plakaya bağlıyken doğrudan transdüklenmelidir (transdüksiyon verimliliğini önemli ölçüde azaltacağından süspansiyonda transdüksiyon yapmayın). Bazı hücreler Nanoblades'e (24-48 h) uzun süre maruz kalmayı tolere ederken, diğerleri çok hassastır ve küçük senkripsi oluşturabilir. Bu durumda, Nanoblades ortamı değiştirmeden önce sadece 4-6 saat boyunca hücrelerle inkübe edilmelidir. Spinoculation14 ayrıca süspansiyonda yetişen hücreler için transdüksiyonu artırabilir. Katyonik polimerler gibi adjuvanlar ( Bkz. Malzeme Tablosu) bazı hücre tiplerinde transdüksiyon verimliliğini de artırabilir. - Nanoblades içeren düşük hacimli bir ortamda 4-6 saat hücre inkübasyonundan sonra, ortamın hacmini normal miktara çıkarın (12 kuyulu bir plaka ile çalışıyorsanız 1 mL) veya hücreler VLP'lere duyarlıysa taze ortamla değiştirin.
NOT: Nanoblades içeren hücre ortamı, atılmadan önce 10 dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit ile inaktive edilmelidir. Sodyum hipokloritleri manipüle ederken eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Nanoblades hücre ölümünü teşvik ederse, hücre mortalitesini azaltmak için maruz kalma miktarını ve toplam süresini uyarlar.
7. Hedeflenen lokusta CRISPR verimliliğinin T7 endonuclease test ile ölçülmesi
- CRISPR-dekolte bölgesini kapsayan 400-700 baz çifti (bp) bölgesini güçlendirmek için PCR astarları tasarlayın.
NOT: Dekolte bölgesi amplicon kenarından en az 200 bp uzakta olmalı ve ampliconun merkezinden hafifçe kaydırılmalıdır, böylece T7 endonuclease dekoltesi üzerine farklı boyutlarda 2 parça serbest bırakılacaktır. - İlgi genini hedef alan Nanoblades ile tedavi edilen hücrelerden ve bir kontrol sgRNA ile programlanmış Nanoblades ile tedavi edilen kontrol hücrelerinden genomik DNA çıkarın ( bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Şablon olarak 150 ng genomik DNA kullanarak, üreticinin protokolünü izleyerek 30 μL hacimli (son hacim) bir PCR reaksiyon programı. 5 μg/mL ethidium bromür (veya daha güvenli bir alternatif DNA jel lekesi) ile boyanmış% 2 agarose jel çalıştırarak PCR ampliconunun beklenen boyutta tek bir amplicon verdiğini kontrol edin.
NOT: Genetik kusurlara neden olduğundan şüphelenilen ethidium bromürü manipüle ederken uygun koruma ekipmanlarını giyin. Protokol burada duraklatılabilir. - Heteroduplex üretimi ve sindirimi
- 0,2 mL PCR tüpüne, 7,3 adımdan 5 μL enzim tamponu (T7 endonuclease I ile birlikte verilir), 20 μL su ve 24 μL PCR ürünü ekleyin. Numuneleri 3 dakika boyunca 94 °C'ye ısıtarak ve ardından sıcaklığı (dakikada 2 °C) azaltarak 40 °C'ye ulaşarak heteroduplex oluşumuna izin verin.
- Kontrol de dahil olmak üzere her heteroduplex tüpüne oda sıcaklığında 0,5 μL T7-endonuclease I ekleyin. 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. Elde edilen reaksiyonun ethidium bromür ile lekelenmiş% 2,5 (ağırlık / hacim) agarose jelini yükleyin. Göç ettikten sonra, jeli bir UV transilluminator üzerinde görüntüleyin.
NOT: Genetik kusurlara neden olduğundan şüphelenilen ethidium bromürü manipüle ederken uygun koruma ekipmanlarını giyin. UV transilluminator kullanırken UV koruma gözlükleri kullanın. - Her bandın yoğunluğunu uygun yazılımla ölçmek için sindirim reaksiyonundan kaynaklanan görüntüyü analiz ederek bölünme verimliliğini ölçün (Bkz. Malzeme Tablosu).
8. Sanger dizilimi ve TIDE analizi ile hedeflenen lokusta CRISPR verimliliğinin ölçülmesi
NOT: T7 endonuclease testine alternatif olarak CRISPR verimliliği, TIDE protokolüne dayalı Sanger dizileme izlerinin analizi ve dekonvolüasyonu ile izlenebilir15.
- İleri veya ters PCR astarını kullanarak PCR ampliconlarının 7.3 adımından (işlenmemiş hücrelere karşılık gelen bir kontrol koşulu dahil) Sanger dizilimini gerçekleştirin.
- Tide sunucusunu (https://tide.nki.nl) kullanarak ve analiz yönergelerini izleyerek kontrol durumunun (işlenmemiş hücreler) ve Nanoblade ile işlenmiş örneklerin Sanger dizileme izlerini analiz edin.
9. Homolojiye yönelik onarım için ssODN donörleri ile nanoblade kompleks oluşumu (12 kuyulu bir plakada transdüksiyon prosedürü)
NOT: Verimli homolojiye yönelik onarım aracılı düzenleme için ssODN tasarımına ilişkin yönergeler daha önce açıklanmıştır16.
- 12 kuyulu bir tabakta, uygun hücre kültürü ortamının 1 mL'sinde kuyu başına 100.000-200.000 hücre tohumu. Transdüksiyondan önce hücrelerin plaka yüzeyine yapışmasına izin verin.
- 1x PBS'de 8 μg/mL'de 100 μL katyonik polimer çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Katyonik polimer çözeltisinin 19 μL'sini ssODN şablonunun 100 pmol ile karıştırın. 20 μL konsantre Nanoblades ekleyin (adım 3.5.1 veya 4.4'ten itibaren) ve buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Karmaşık Nanoblades/ssODN'yi buzdan çıkarın ve 500 μL hücre kültürü ortamı ekleyin (37 °C'de). Ortamı hedef hücrelerden çıkarın (adım 9.1'den) ve karmaşık Nanoblades/ssODN içeren 500 μL ortamı ekleyin. Genotiplemeden önce hücrelerin 48 saat boyunca çoğalmasına izin verin.
- Özel bir ekstraksiyon kiti kullanarak hücre popülasyonunun bir kısmından genomik DNA çıkarın ( Bkz. Malzeme Tablosu).
- Darbe bölgesini kapsayan 400-700 bp'lik bir bölgeyi güçlendirmek için PCR astarları tasarlayın.
NOT: PCR astarları, hedef hücrelerde hala mevcut olan herhangi bir kalıntı ssODN'nin PCR amplifikasyonundan kaynaklanan yanlış-pozitif sonuçları önlemek için ssODN'nin homoloji kollarıyla çakışmamalıdır. - Kontrol hücrelerinden (tedavi edilmemiş) veya Nanoblade ile işlenmiş hücrelerden şablon olarak 150 ng genomik DNA kullanarak, üreticinin protokolünü takiben 30 μL PCR reaksiyon programı yapın.
NOT: ssODN izleri, kompleksle transdüksiyondan birkaç gün sonra hücre ortamında bulunabilir. Bu ssODN, doğru tümleştirmeyi taramaya çalışan PCR tahlilleri için kısmi bir şablon görevi görebilir. Bu nedenle, nihai yanlış-pozitif tahlillerden kaçınmak için transdüksiyondan sonra hücrelerin en az iki kez geçirilmesi tavsiye edilir. - Kontrolün 5 μL'sini yükleyin ve Nanoblade ile işlenmiş PCR reaksiyonlarını ethidyum bromür ile lekelenmiş% 1 (ağırlık / hacim) agarose jelinde yükleyin. Göç ettikten sonra, jeli bir UV-transilluminator üzerinde görüntüleyin.
NOT: Homoloji rekombinasyonu başarılıysa ve 1 bp'den fazla genetik materyalin yerleştirilmesine karşılık geliyorsa, kontrol ile Nanoblade ile tedavi edilen örnek arasında PCR ampliconlarının moleküler ağırlığında bir fark olmalıdır. HDR'nin verimliliği% 100'e ulaşmadığı için, Nanoblade ile işlenmiş numunede iki bant görünmelidir (düzenlenmemiş alaşağala karşılık gelen kontrol PCR amplicon'a benzer boyutta ve darbe alaşmasına karşılık gelen daha yüksek moleküler ağırlıklardan biri, bkz. Şekil 3B orta panel).
- Darbe bölgesini kapsayan 400-700 bp'lik bir bölgeyi güçlendirmek için PCR astarları tasarlayın.
- Kontrolün sanger dizilimini ve Nanoblade ile işlenmiş PCR ampliconlarını gerçekleştirin.
- TIDER protokolünü kullanarak darbe verimliliğini ölçün17.
10. Vivo nanoblade teslimat
- Farelerle çalışıyorsanız, 3.5.1 adımından retro yörünge enjeksiyonuna veya kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla 100 μL'ye kadar 25 μL'ye kadar konsantre Nanoblades sunun.
NOT: Hayvan deneylerini içeren tüm prosedürler (genom düzenleme amaçlı Nanoblade enjeksiyonları dahil) yerel bir etik komitesinden onaylanmış bir protokol gerektirir. - Transgenik farelerin üretimi için, daha önce açıklandığı gibi 4.4 adımından fare oositlerinin perivitelline alanına 1 pL ila 10 pL konsantre Nanoblades sunmak için bir mikro enjektör kullanın.
NOT: Perivitelline enjeksiyonu için, mikro enjektörün tıkanmasını önlemek için Nanoblades'i bir sakkaroz yastığı üzerinde arındırmak ve konsantre etmek önemlidir.
Representative Results
Nanoblade hazırlama protokolü oldukça basittir ve doku kültürü başlığına, CO2 inkübatörüne ve sallanan kova santrifüjüne veya ultracentrifuge'a erişimin yanı sıra basit laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bununla birlikte, bazı adımlar, üretici hücrelerin kaynağı ve işlenmesi ve transdüksiyon koşulları gibi özellikle dikkat gerektirir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, hücrelerin plakaya homojen bir şekilde dağıtılması ve transfeksiyon gününde ~% 70-80 izdihama ulaşması için tohumlanması önemlidir (hücre kümelerine sahip olmaktan kaçının). Transfectiondan yirmi dört saat sonra (Şekil 1B,C), üretici hücreler birden fazla çekirdekle daha büyük boyutlu hücrelere yol açan senksitia oluşturacaktır. Transfectiondan kırk saat sonra (Şekil 1D), plakadaki çoğu hücre senksitia oluşturmuş ve plakadan ayırmaya başlayacaktır.
Bu son derece normaldir ve komşu hücreler arasında füzyona neden olan zarf glikoproteinin ifadesinden kaynaklanır. Santrifüjleme ile konsantrasyon üzerine (hatta doğrudan üretici hücrelerin üstnatanından), Nanoblades içinde yüklenen Cas9 miktarı, referans olarak rekombinant Cas9 kullanılarak bir nitroselüloz membranındaki nokta lekesi ile mutlak bir şekilde ölçülebilir (Şekil 2). Bu adım, hedef hücrelerin transdüksiyon için kullanılacak doğru nanoblades miktarını belirlemek için önemlidir. Nokta-blot testini gerçekleştirirken, yalnızca standart eğrinin doğrusal aralığına giren okumaları göz önünde bulundurmak önemlidir. Bununla birlikte, Nanoblades'te bulunan Cas9 miktarından bağımsız olarak, T7 endonuclease testi (Şekil 3) veya Sanger dizilimini kullanarak genom düzenleme verimliliğini doğrudan hedef hücreler üzerinde test etmek önemlidir.
Şekil 3'te gösterildiği gibi, Nanoblades'in verimliliği toplu işlemden toplu işleme farklılık gösterebilir, ancak genellikle Cas9 miktarıyla ilişkilidir. Şekil 3'te gösterilen örnekte, şerit 1'den gelen toplu iş genel düzenleme verimliliğine %20, şerit 3'ten gelen toplu iş ise %60 verimliliğe yol açar. Bu durumda, toplu iş 3'tekine benzer bir düzenleme verimliliği elde etmek için toplu iş 1'den kullanılan Nanoblades'in hacmini artırmak mümkündür. Şekil 4, farklı birincil hücre türlerinde Nanoblades kullanılarak elde edilen maksimum düzenleme verimliliğini gösterir. Verimliliğin, kullanılan sgRNA'nın sırasına ve hedef erişilebilirliğe bağlı olarak değişebileceğini unutmayın.
Şekil 1: Nanoblade üretimi sırasında üretici hücrelerin morfolojisi. (A) HEK293T hücreleri% 70-80 birleştiğinde 24 saat kaplama. (B ve C) HEK293T hücre morfolojisi transfeksiyondan sonra 24 saat. (D) Hek293T hücre morfolojisi transfeksiyondan 40 saat sonra. Ölçek çubukları = 400 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nanoblades içindeki Cas9 yüklemesinin nokta-blot ile ölçülmesi. (A) Rekombinant Cas9 veya 100x konsantre (ultracentrifugation ile) Nanoblade örnekleri (#1, #2 ve #3) 2 kat ardışık olarak seyreltilir ve anti-Cas9 HRP bağlantılı antikorlarla inkübasyondan önce bir nitroselüloz zar üzerinde tespit edilir. Sinyal gelişmiş kemimuminesans ile ortaya çıkardı. (B) Kemimuminesans sinyali, nitroselüloz membranda tespit edilen bilinen Cas9 miktarına göre çizilen rekombinant Cas9 seyreltmeleri ve sinyal yoğunluğu için elde edilir ve ölçülür. Doğrusal aralık içinde olan seyreltmeler için bir regresyon eğrisi hesaplanır (bkz. mavi haçlar), doğrusal aralığın dışındaki tüm konsantrasyonlar hariç (bkz. kırmızı haçlar). (C) Her Nanoblade preparatında cas9 konsantrasyonu (nM), (B) içinde elde edilen doğrusal regresyon denklemi kullanılarak tahmin edildi. Bunun için, sadece regresyon eğrisinin doğrusal aralığına giren Nanoblade seyreltmelerinden gelen nicel sinyali kullanmak önemlidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Transdüksiyon üzerine düzenleme verimliliğinin izlenmesi. (A) Nanoblade ile işlenmiş hücrelerde bölünme verimliliğini ölçen T7 endonuclease tahlil. EMX1 genini hedef alan Nanoblades ile transdüklenen hücreler T7 endonuclease tahlili ile analiz edildi. Şerit 1: Nanoblade hazırlama grubu #1 (%20 bölünme verimliliği); Şerit 2: Kontrol hücreleri; Şerit 3: Nanoblade hazırlama grubu #2 (%60 bölünme verimliliği). (B) DDX3 açık okuma çerçevesinde bayrak etiketi sırasının çalınması. DDX3 lokusu hedefleyen bir sgRNA ile programlanmış konsantre Nanoblades, farklı HEK293T klonlarından (#1, #2) üretildi ve bir Flag-DDX3 ssODN şablonunun artan dozları ve HEK293T hedef hücrelerinin transdüksiyon için kullanılan elde edilen komplekslerle karmaşık hale getirildi. Transdüksiyon üzerine, hücreler genomik DNA ve toplam proteinleri çıkarmak için toplanmadan önce üç gün boyunca yetiştirildi. Flag-DDX3 proteinleri anti-Flag agarose boncukları kullanılarak immün özürlü hale getirildi ve ardından geri kazanılan proteinlerin anti-Flag antikoru (üst panel) kullanılarak batı lekesi analizi yapıldı. Bayrak etiketinin Ddx3 lokusunda siteye yönlendirilmiş olarak eklenmesi, ekleme alanını (orta panel) kuşaten astarlar kullanılarak veya Bayrak etiketi sırasını tanıyan bir ileri astar ve Bayrak ekleme sitesinin Ddx3 lokus aşağı akışına özgü bir ters astar (alt panel) kullanılarak PCR tarafından da test edildi. Kısaltmalar: EMX1 = Boş Spiracles Homeobox 1; DDX3 = DEAD-box RNA helicase 3; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; ODN = oligodeoksinükleotid; ssODN = şarkılı ODN; sgRNA = tek kılavuzlu RNA; IP = immün önksepitasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nanoblades kullanılarak farklı birincil hücre tiplerinde elde edilen verimliliği düzenleme. Kısaltmalar: PBL = periferik kan lenfosit; IL = interleukin; CD = farklılaşma kümesi; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Nanoblades, hücre hatlarında ve birincil hücrelerde Cas9/sgRNA RNP kompleksinin hızlı ve doza bağımlı olarak teslimine izin verir. Klasik transfeksiyon ve diğer viral iletim vektörlerinin aksine, ancak protein elektroporasyon gibi, Nanoblades de Cas9 / sgRNA RNP'nin transgene içermeyen bir şekilde geçici olarak teslim etme avantajına sahiptir. Nanoblades, protein dağıtımı için sürekli genişleyen CRISPR varyantları ailesine kolayca ve hızlı bir şekilde uyarlanabilen çok yönlü, basit ve ucuz bir platform sunar. Nanoblades HEK293T hücre hattında veya türevlerinde üretilebilir. Burada kullanılan HEK293T hücre hatları retroviral ve lentiviral partikül üretimini en üst düzeye çıkarmak için geliştirilmiştir ( bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, HEK293T hücrelerinin diğer kaynakları uygun olsa da, HEK293T hücre kaynağına bağlı olarak parçacık üretiminde büyük farklılıklar gözlendiği için kullanıcılar farklı kaynaklardan GELEN HEK293T hücrelerini test etmeli ve karşılaştırmalıdır. Hücreler ayrıca parçacık üretimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan aşırı etkiyi önlemek için sık sık Mikoplazma kontaminasyonu açısından kontrol edilmelidir ve her üç günde bir (klasik olarak 1/8 seyreltme) geçilmelidir.
Hücreler 20'den fazla pasaj için muhafaza edilmelidir. Hücre kültürü için glikoz, penisilin/streptomisidin, glutamin ve %10 ayrışmış fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM kullanıldı. Serum orijini Nanoblade preparatının kalitesini etkileyebileceğinden, büyük ölçekli üretimden önce farklı serum partileri test edilmelidir. Nanoblades, transfection'dan sonraki gün DMEM'in yerini alabilen minimum esansiyel ortamın RPMI veya serumsuz modifikasyonları gibi diğer mecralarda verimli bir şekilde üretilebilir. Aşağıda belirtildiği gibi, transfeksiyondan sonra bazı DNA transfeksiyon reaktifleri ile orta değişim isteğe bağlı olsa da, özellikle parçacık preparatında serum izlerini sınırlamak için VLP'lerin salındığı ortamı değiştirmek faydalı olabilir. Bununla birlikte, transfeksiyondan önceki gün azaltılmış serum minimum esansiyel ortamda hücrelerin yetiştirilmesi henüz denenmemiştir.
Belirtildiği gibi, Nanoblades, üretici hücrelerde plazmidlerin bir karışımının aşırı ifade edildikten sonra üretilir. Aşırı ifade, optimum üretim için gerekli görünüyor. Gerçekten de, bu laboratuvar Gag-Pol ifade yapısı antibiyotik seçimi ile stabilize edildiği bir üretici hücre hattı geliştirdi; ancak, bu sistem önemli miktarda Nanoblades üretemedi. Benzer bir gözlem, sgRNA kodlama yapısı üretici hücrelerin genomuna bıçaklanarak entegre edildiğinde de yapılmıştır. Diğer parçacık üretim sistemleri için açıklandığı gibi, Nanoblades üretiminde yer alan en azından bazı yapıları ifade eden kararlı bir hücre hattı yararlı olabilir; bununla birlikte, bu kesinlikle büyük hacimli süpernatantın işlenmesini ve parçacıkları arındırmak için uygun bir teknik gerektirecektir. Yukarıdaki protokol, belirli transfeksiyon reaktiflerinden yararlanan Nanoblades üretmek için tercih edilen yordamı özetlemektedir ( bkz. Malzeme Tablosu).
Diğer üreticilerin transfeksiyon reaktifleri de başarıyla test edilmiş olsa da, bu grubun Nanoblades ile elde ettiği sonuçların büyük çoğunluğu burada açıklanan prosedürü takip eder. Kalsiyum fosfat reaktifleri kullanılarak düşük maliyetli transfeksiyon elde edilebilir ve iyi üretim verimliliği sağlayabilir; bununla birlikte, bu yöntem kesinlikle transfeksiyondan sonraki gün transfeksiyon ortamının değiştirilmesini gerektirir ve çökelmiş parçacık preparatında kalsiyum fosfat kalıntıları bırakabilir. Üretici hücrelerdeki Nanoblade bileşenleri için yüksek ekspresyon seviyelerinin gerekliliği ile tutarlı olarak, Cas9 proteini ile ilişkili sgRNA miktarının verimli genom düzenleme için sınırlayıcı bir faktör olabileceği gözlemidir. SgRNA yüklemesini iyileştirmek için, nanoblades'e benzer protein dağıtım vektörleri kullanan bağımsız gruplar tarafından son zamanlarda iki teknik yaklaşım geliştirilmiştir. Bunlar, sgRNA6'nın T7 polimeraz bağımlı sitoplazmik ekspresyonunun kullanılmasına veya Gag poliprotein6'ya bağlanmaya aracılık etmek için sgRNA dizisine retroviral kapsülleme sinyali eklenmesine dayanır. Bu yaklaşımlar, henüz test edilmiş olmasalar da Nanoblades içinde sgRNA yüklemesini gerçekten iyileştirebilir.
Hedef hücrelerin transdüksiyonunun prosedürde kritik bir adım olduğu sonucuna varılması. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının çoğunda, Nanoblades ile transdüksiyonun sitopatik etkisi çok azdır veya hiç yoktur. Bununla birlikte, birincil hücrelerde toksisite bir sorun olabilir. Bu nedenle transdüksiyonun her hücre tipi için en iyi duruma getirilmelidir. Özellikle, Nanoblades'e maruz kalma süresi, transdüksiyon protokolünü optimize ederken değiştirilmesi gereken önemli bir faktördür. Birincil nöronlar veya kemik iliği hücreleri gibi hassas hücreler için, ortamı değiştirmeden önce Nanoblades ile 4-6 saat inkübasyon, hücre toksisitesini en aza indirirken Cas9 proteininin verimli bir şekilde teslim edilmesine izin verir. Ayrıca, katyonik polimerler gibi yardımcılar, diğerlerinin yanı sıra, bazı hücrelerde transdüksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırabilir ( bkz. Malzeme Tablosu). Nanoblades'in VLP'ler olduğunu ve immünojenik bir yanıta neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Bu, Nanoblades ile inkübasyonun gen ifadesinde ve hücrelerin fenotipinde önemli değişikliklere neden olabileceği makrofajlar veya dendritik hücreler gibi belirli birincil hücre türleriyle çalışıyorsa bir sınırlama olabilir. Makrofajlar ve dendritik hücreler hematopoetik kök hücre öncüllerinden (fare kemik iliği hücreleri gibi) türetilmişse, Nanoblades'e karşı hücresel bir yanıta neden olmamak için hücrelerin tamamen farklılaştırılmadan önce Nanoblades ile transdüse olması tercih edilir. Aksi takdirde, Cas9 protein elektroporasyon farklılaştırılmış bağışıklık hücreleri ile çalışırken uygun bir alternatif temsil edebilir.
Nanoblades, transgenik hayvanlar üretmek için fare zigotlarını veya embriyolarını transdüse etmek için in vivo olarak kullanılabilir. Klasik retroviral veya lentiviral vektörlere benzer şekilde, yetişkin hayvanlardan dokulara doğrudan enjekte edilebilirler. Bununla birlikte, Nanoblades (retroviral ve lentiviral vektörlere benzer) konakçı hayvanın bağışıklık tepkisi ile inaktive edilebilir; bu nedenle, enjekte edilecek doz her uygulama için optimize edilmelidir. Bu immün yanıt, fonksiyonel VLP'lerin enjeksiyon bölgesine yakın dokulara dağılımını da sınırlayabilir. Son olarak, lentiviral vektörlerin aksine, Nanoblades transgene içermez ve Cas9'u sınırlı bir zaman diliminde teslim eder. Bu nedenle, hücre seçimi sırasında sgRNA'ların yüksek verimli dizilimini gerektiren genom çapında fonksiyonel taramalar yapmak için kullanılamazlar. Nanoblades hızlı, doza bağımlı ve transgene içermeyen genom düzenleme gerektiğinde faydalıdır20. Ayrıca, protein elektroporasyonuna benzer şekilde, Nanoblades DNA transfeksiyonu veya klasik viral vektörler aracılığıyla Cas9 /sgRNA'nın uzun süreli ekspresyonuna göre daha az hedef dışı etkiye yol açar3. Nanoblades'in gelecekteki gelişimi, temel düzenleme ve RNA hedefleme gibi farklı teknolojik uygulamalar için Cas9 varyantlarını birleştirmeye odaklanmıştır.
Disclosures
Philippe E. Mangeot ve Emiliano P. Ricci, Nanoblades teknolojisi ile ilgili bir patentte mucit olarak adlandırılır (patent başvuru sahipleri: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; başvuru numarası: WO 2017/068077 Al; patent durumu: yayınlanan, 27 Nisan 2017; makalenin tüm yönleri patent başvurusu kapsamındadır. Geri kalan yazarlar rakip çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR), Fondation FINOVI, tarafından işletilen Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) programı dahilinde Université de Lyon'dan Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) tarafından finanse edildi. Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) ve Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programları kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG-LS6-805500 ila E.P.R.) tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).
- Mangeot, P. E., et al. Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature Communications. 10 (1), 45 (2019).
- Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases. eLife. 3, 01911 (2014).
- Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).
- Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications. 11, 1334 (2020).
- Indikova, I., Indik, S. Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts. Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).
- Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (17), 99 (2019).
- Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell. 59 (1), 103-112 (1989).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing. Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders. Journal of Visualized Experiments. (140), e57609 (2018).
- Montagna, C., et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).
- Marnef, A., et al. A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair. Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).
