Summary
Vi har utviklet en enkel og billig protokoll for å laste Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoprotein komplekser innen viruslignende partikler. Disse partiklene, kalt "Nanoblades", tillater effektiv levering av Cas9 / sgRNA-komplekset i udødelige og primære celler så vel som in vivo.
Abstract
Det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)-Cas-systemet har demokratisert genomredigering i eukaryote celler og førte til utvikling av mange innovative applikasjoner. Levering av Cas9-proteinet og enveis RNA (sgRNA) i målceller kan imidlertid være teknisk utfordrende. Klassiske virale vektorer, for eksempel de som er avledet fra lentivirus (LVs) eller adeno-assosierte virus (AAVs), muliggjør effektiv levering av transgeneskoding for Cas9-proteinet og dets tilhørende sgRNA i mange primære celler og in vivo. Likevel kan disse vektorene lide av ulemper som integrering av transgene i målcellegenomet, begrenset lastekapasitet og langsiktig uttrykk for Cas9-proteinet og guide RNA i målceller.
For å overvinne noen av disse problemene ble en leveringsvektor basert på murin Leukemia-viruset (MLV) utviklet for å pakke Cas9-proteinet og den tilhørende guiden RNA i fravær av kodingstransgene. Ved å fusjonere Cas9-proteinet til C-terminus av strukturproteinet Gag fra MLV, ble viruslignende partikler (VLPer) lastet med Cas9-proteinet og sgRNA (kalt "Nanoblades") dannet. Nanoblader kan samles inn fra kulturmediet til produsentceller, renses, kvantifiseres og brukes til å transdusere målceller og levere det aktive Cas9/sgRNA-komplekset. Nanoblader leverer sin ribonucleoprotein (RNP) last forbigående og raskt i et bredt spekter av primære og udødelige celler og kan programmeres for andre applikasjoner, for eksempel forbigående transkripsjonsaktivering av målrettede gener, ved hjelp av modifiserte Cas9-proteiner. Nanoblader er i stand til in vivo genomredigering i leveren av injiserte voksne mus og i oocytter for å generere transgene dyr. Til slutt kan de bli komplekset med donor-DNA for "transfection-free" homologi-rettet reparasjon. Nanoblade forberedelse er enkel, relativt rimelig, og kan enkelt utføres i ethvert cellebiologisk laboratorium.
Introduction
Sammenlignet med andre programmerbare nukleaser forenklet CRISPR-Cas-systemet dramatisk og demokratiserte prosedyren for sekvensspesifikk genommålretting og spalting i eukaryote celler. Gjennom det enkle uttrykket av en sgRNA kan brukere programmere Cas9-proteinet (eller optimaliserte varianter) for nesten alle cellulære locus1. I dette scenariet blir levering av Cas9-proteinet og sgRNA hovedbegrensningen når du utfører stedsstyrt mutagenese. I udødelige celler kan sgRNA og Cas-proteinet lett uttrykkes fra transfiserte plasmider for å oppnå effektiv genommålretting i de fleste celler. Konstituerende uttrykk for Cas9/sgRNA-komplekset kan imidlertid øke off-target aktiviteten til Cas9-proteinet og introdusere uønskede endringer i ikke-spesifikk loci2. I primærceller kan DNA-transfeksjon være teknisk vanskelig å oppnå og føre til dårlig uttrykk eller en liten prosentandel av transfekterte celler. Alternativer til klassisk DNA-transfeksjon omfatter bruk av virale vektorer som leverer en transgene koding for Cas9 og sgRNA eller elektroporasjon av rekombinant Cas9-protein koblet til en syntetisk sgRNA. Imidlertid kan disse tilnærmingene føre til transgene integrasjon i cellevertens genom (som det er tilfelle for klassiske retrovirale og lentivirale uttrykksvektorer), begrensning av cellulære faktorer, og føre til konstituerende uttrykk for Cas9-proteinet og sgRNA.
Elektroporasjon av Cas9/sgRNA RNP-komplekset kan overvinne de fleste av disse problemene og føre til effektiv og forbigående levering i primærceller og in vivo, samt tillate en doseavhengig respons. Likevel er det vanligvis avhengig av dyrt utstyr og reagenser og er også vanskelig å oppskalere hvis et stort antall celler må behandles. Som et alternativ til de ovennevnte teknikkene har disse forfatterne utviklet "Nanoblades"-en retroviral leveringsvektor for Cas9-proteinet og sgRNA3 som er konseptuelt lik andre viral-avledede capsid proteinleveringssystemer4,5,6,7,8. Nanoblader utnytter den naturlige kapasiteten til Gag-polyproteinet fra retrovirus for å produsere, når de uttrykkes alene i dyrkede celler, VIP-er som frigjøres i det ekstracellulære mediet9. Ved å fusjonere Cas9-proteinet til C-terminalenden av murin leukemiviruset (MLV) Gag polyprotein og samtidig uttrykke sgRNA og virale konvoluttglykoproteiner, kan Cas9-proteinet innkapsles innen utgitte VLPer eller Nanoblades. Ved rensing kan Nanobladene inkuberes med målceller eller injiseres in vivo for å megle raskt, forbigående og doseavhengig levering av Cas9/sgRNA RNP-komplekset3.
Nanoblader kan programmeres med flere sgRNAer for samtidig redigering på forskjellige loci eller med Cas9-varianter for å utføre andre applikasjoner som målspesifikk transkripsjonsaktivering eller undertrykkelse3. I motsetning til proteinelektroporasjon, som er avhengig av rekombinant uttrykk, kan nylig beskrevne Cas-varianter fra litteraturen lett klones inn i Gag fusion-uttrykksvektoren, noe som gjør den til en allsidig plattform. Nanoblader kan bli ytterligere kompleks eller lastet med enkeltstrengede og dobbeltstrengede oligodeoksynukleotider (ssoder) for å utføre homologi-rettet reparasjon3. Nanoblade produksjon er relativt enkel og billig. Videre kan Nanoblades lagres ved 4 °C i mange dager eller ved -80 °C for langtidslagring. Vanligvis formidler Nanoblades effektiv, transgenefri genomredigering i de mest udødelige og primære dyrkede cellene. Noen primærceller kan imidlertid være følsomme for tilstedeværelsen av viruspartikler, noe som resulterer i økt dødelighet. Celler i det medfødte immunsystemet kan også reagere på tilstedeværelsen av Nanoblades (på grunn av deres virale opprinnelse) og bli aktivert. I disse tilfellene må transduksjonsprotokollen optimaliseres for å begrense eksponeringstiden for Nanoblades og minimere ikke-spesifikke effekter. Nanoblader representerer et levedyktig og lett å implementere alternativ til andre tilgjengelige CRISPR-leveringsmetoder.
Protocol
1. sgRNA Design og kloning
MERK: Retningslinjer for utforming av sgRNAer kan fås fra flere kilder som https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing eller fra Hanna og Doench10.
- Når de 20 nukleotid sgRNA-sekvensene er designet, kan du bestille følgende enkeltstrengede DNA-oligonukleotider:
- Fremover: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N tilsvarer det målrettede locus uten protospacer-tilstøtende motiv (PAM) sekvens)
- Omvendt: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC 3' (N tilsvarer det omvendte komplementet til det målrettede locus uten PAM-sekvensen)
MERK: Ingen spesielle modifikasjoner er nødvendig ved bestilling av oligonukleotider (ingen krav til 5' fosfat).
- Hybridiser de to DNA-oligonukleotidene i et 0,2 ml polymerasekjedereaksjonsrør (PCR) ved å blande 5 μL glødebuffer (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 ved 25 °C), 1 μL av hvert DNA oligonukleotid (100 μM lagerløsning i vann) og 42 μL vann.
- På en PCR-blokk inkuberer du prøver ved 95 °C i 15 s og reduserer deretter temperaturen til 20 °C med en rampe på 0,5 °C/s. Oppbevars ved romtemperatur eller oppbevars ved -20 °C.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. - Fordøye 10 μg av BLADE eller SUPERBLADE sgRNA uttrykk plasmider med 10 enheter av BsmBI-v2 begrensning enzym for 3 h ved 55 °C i et totalt reaksjonsvolum på 50 μL.
MERK: Den fordøyde vektoren skal frigjøre en DNA-innsats på ~ 1,9 kb og et annet DNA-fragment på ~ 3,3 kb. - Last begrensningsreaksjonen på en 1% agarose gel farget med 5 μg /ml ethidiumbromid (eller en sikrere alternativ DNA gelflekk).
MERK: Bruk passende beskyttelsesutstyr når du manipulerer ethidiumbromid, som mistenkes for å forårsake genetiske defekter.- På et ultrafiolett (UV) bord satt til en bølgelengde på 312 nm (for å unngå å skade DNA), kutt 3,3 kb DNA-fragmentet fra gelen, og legg det i et 1,5 ml mikrosenterrør.
MERK: Bruk passende beskyttelsesutstyr (hansker og UV-vernebriller) når du manipulerer ethidiumbromid og arbeider på UV-bordet. - Trekk ut DNA fra den skiver gelen som inneholder 3,3 kb DNA-fragmentet ved hjelp av et dedikert DNA gel ekstraksjonssett (se materialtabellen). Kvantifisere mengden renset DNA ved hjelp av et spektrofotometer.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
- På et ultrafiolett (UV) bord satt til en bølgelengde på 312 nm (for å unngå å skade DNA), kutt 3,3 kb DNA-fragmentet fra gelen, og legg det i et 1,5 ml mikrosenterrør.
- Ligate hybridisert fremover og omvendt DNA oligonukleotider fra trinn 1.2 til BsmB1-fordøyd, gel-renset BLADES eller SUPERBLADE vektor fra trinn 1.5.2. For dette legger du til 2 μL T4 DNA-ligasebuffer, 50 ng av den gelrensede vektoren (fra trinn 1,5,2), 1 μL av hybridiserte DNA-oligonukleotider (fra trinn 1,2), vann for å utgjøre volumet til 19 μL og 1 μL T4 DNA-ligaer. Inkuber reaksjonen ved 25 °C i 10 minutter.
- Forvandle ligationproduktet til kompetente bakterier (se materialtabellen) som beskrevet i11. Plate de transformerte bakteriene på en ampicillin Luria Bertani agar plate og inkuber over natten ved 37 °C.
- Velg flere isolerte kolonier på agarplaten for å utføre DNA-minipreparasjon11 (se materialtabellen), og utfør Sanger-sekvensering ved hjelp av en U6 fremoverprimer (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') for å se etter riktig ligasjon av sgRNA-variabelsekvensen.
MERK: Andre sgRNA-uttrykksplasmider kan brukes hvis de ikke koder for Cas9-proteinet, noe som kan forstyrre Nanoblade-produksjonen.
2. Plasmid forberedelse
- Utfør maxipreparasjon (se materialtabellen) av alle nødvendige plasmider, og lag 10 μg aliquots ved 1 μg / ml for å lagre ved -20 °C. Unngå gjentatte fryse-/opptiningssykluser i plasmidene; bruk aliquots to ganger før du kaster dem.
3. Nanoblade forberedelse
- På dag 1, frø mellom 3,5 og 4 × 106 HEK293T celler (se materialtabellen) i 10 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) som inneholder høy glukose, natriumpyuvat, L-glutamin, 10% foster bovint serum (FBS), og penicillin /streptomycin i en 10 cm cellekultur. Beveg 10 cm platen forsiktig bakover og fremover, deretter fra høyre til venstre (gjenta denne sekvensen 5x) for å fordele celler homogent over kulturretten. Inkuber celler ved 37 °C i en celleinkubator med 5 % CO2.
MERK: Alle prosedyrer knyttet til håndtering av dyrkede celler og Nanoblades bør utføres under en cellekultur laminær strømningshette for å unngå forurensning. - Dag 2: Plasmid transfeksjon
- Celler skal være 70-80% sammenfallende 24 timer etter plating (figur 1A). Bytt ut mediet med 10 ml fersk DMEM som inneholder høy glukose, natriumpyuvatt, L-glutamin, 10% FBS (penicillin og streptomycin kan utelates selv om det ikke er obligatorisk) før transfeksjon.
MERK: På dette trinnet er det viktig at cellene ikke er sammenfallende. Ellers kan transfeksjonseffektivitet samt partikkelproduksjon reduseres. - For hver 10 cm plate, lag følgende mengder plasmider i et 1,5 ml rør: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg BLADES eller SUPERBLADES plasmid koding av klonede sgRNA (eller 2,2 μg hver hvis du bruker to sgRNAer).
- Tilsett 500 μL transfeksjonsbuffer (se materialtabellen), virvel i 10 s, og sentrifuger deretter i 1 s. Tilsett 20 μL av transfeksjonsreagenset (se materialtabellen), virvel røret i 1 s, og sentrifuger deretter i 1 s.
- Inkuber i 10 min ved romtemperatur, og tilsett hele løsningen dråpevis til cellene i DMEM-medium ved hjelp av en P1000 pipettor. Beveg 10 cm platen forsiktig bakover og fremover, deretter fra høyre til venstre (gjenta denne sekvensen 5x) for å fordele transfeksjonsreagensen jevnt over cellene. Inkuber celler ved 37 °C i minst 40 timer i en celleinkubator med 5 % CO2.
MERK: Om ønskelig kan mediet skiftes 4 timer etter transfeksjon.
- Celler skal være 70-80% sammenfallende 24 timer etter plating (figur 1A). Bytt ut mediet med 10 ml fersk DMEM som inneholder høy glukose, natriumpyuvatt, L-glutamin, 10% FBS (penicillin og streptomycin kan utelates selv om det ikke er obligatorisk) før transfeksjon.
- På dag 3, sjekk morfologien til de transfekterte cellene under mikroskopet.
MERK: Produsentceller begynner å smelte sammen. Dette er en normal forekomst på grunn av uttrykket av fusogene virale konvolutter (figur 1B, C). - Dag 4: Høsting nanoblader
MERK: Minst 40 timer etter transfeksjonen ville cellene ha smeltet sammen på grunn av uttrykk for de fusogene virale konvoluttene, og noen ganger er cellene helt løsrevet fra platestøtten (figur 1D).- Samle 9 ml av kulturmediets supernatant ved hjelp av en 10 ml pipette.
MERK: Nanoblader er VLPer som er i stand til å levere Cas9-proteinet og dets tilhørende sgRNA i primærceller og in vivo. Selv om de ikke betraktes som genetisk modifiserte organismer, da de er blottet for genetisk materiale, kan de indusere genetiske endringer. Derfor må de manipuleres med forsiktighet for å unngå kontakt med brukere (spesielt hvis de er programmert til å målrette tumordempergener). Brukere anbefales å følge sine lokale sikkerhetsretningslinjer for manipulering av retrovirale vektorer og arbeide i et BSL-2-nivå laboratorium når de forbereder VLPer og utfører transduksjonsforsøk. Nanoblader kan inaktiveres med 70% etanol eller 0,5% natriumhypokloritt. Det anbefales også å behandle alt plastavfall (pipettespisser, vevskulturplater, sentrifugeringsrør) med 0,5% natriumhypokloritt i minst 10 minutter for å inaktivere Nanobladene. - Sentrifuger den oppsamlede supernatanten ved 500 × g i 5 minutter for å fjerne cellulært rusk og gjenopprette supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
MERK: Hvis Nanoblader skal brukes på primærceller, filtrerer du supernatanten med et filter på 0,45 μm eller 0,8 μm. Vær oppmerksom på at dette trinnet reduserer Nanoblade-titeret drastisk, da en betydelig brøkdel vil bli blokkert i filtermembranen. - Pellet nanobladene over natten (12-16 h) i en svingende bøtterotor på 4.300 × g eller ved 209.490 × g i en ultracentrifuge i 75 min ved 4 °C (se Materialtabellen).
MERK: Hvis målceller kan vokse i DMEM, er det mulig å inkubere dem direkte med supernatanten oppnådd etter trinn 3.4.2 uten å konsentrere Nanobladene.
- Samle 9 ml av kulturmediets supernatant ved hjelp av en 10 ml pipette.
- Dag 5: Resuspension og lagring av Nanoblades
- Etter sentrifugering aspirerer du sakte mediet og resuspenderer den hvite pelletsen med 100 μL kald 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Dekk røret med parafilm, og inkuber i 1 time ved 4 °C med forsiktig agitasjon før du bruker pelletsen på nytt ved å pipettere opp og ned.
MERK: Et hvitt viskøst materiale kan vises ved resuspension; Dette er normalt og påvirker ikke effektiviteten av transduksjon betydelig. - Oppbevar Nanobladene ved 4 °C hvis du planlegger å bruke dem innen fire uker. Ellers, snap-frys Nanoblades i flytende nitrogen og lagre dem ved -80 °C.
MERK: Bruk vernebriller og kryogenhansker når du manipulerer flytende nitrogen. Snap-frysing og lagring ved -80 °C fører til en betydelig reduksjon i Nanoblade-effektiviteten. Videre bør tinte Nanoblades ikke fryses igjen. Protokollen kan settes på pause her.
- Etter sentrifugering aspirerer du sakte mediet og resuspenderer den hvite pelletsen med 100 μL kald 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Dekk røret med parafilm, og inkuber i 1 time ved 4 °C med forsiktig agitasjon før du bruker pelletsen på nytt ved å pipettere opp og ned.
4. Konsentrasjon av nanoblader på en sukrose-pute
MERK: Som et alternativ til nattsentrifugering eller ultracentrifugation (trinn 3.4.3) kan Nanobladene konsentreres om en sukrosepute. Dette gir en renere brøkdel av Nanoblades, selv om det totale beløpet som er gjenvunnet vil være lavere.
- Forbered en 10% sukroseløsning (vekt til volum) i 1x PBS, og filtrer den gjennom et 0,2 μm sprøytefilter (se materialtabellen).
- Begynn prosessen med å konsentrere Nanoblades på sukroseputen.
- Plasser 9 ml VLP-inneholdende prøve (fra trinn 3.4.3) i et ultracentrifugerør (se materialtabellen). Bruk en 3 ml sprøyte og kanyle, lag sakte 2,5 ml av 10% sukrose under prøven, og prøv å ikke blande den VLP-inneholdende prøven og sukroseoppløsningen.
- Alternativt kan du plassere 2,5 ml 10 % sukrose i et ultrasenterrifugerør (se materialtabellen). Vipp røret og legg langsomt til 9 ml VLP-inneholdende prøve (fra trinn 3.4.3) med en lavhastighets pipettor. Under denne operasjonen øker du røret gradvis til vertikal stilling.
- Sentrifuger prøvene ved 209 490 × g i en ultracentrifuge i 90 min ved 4 °C.
MERK: Denne teknikken kan tilpasses for lavhastighets sentrifugering (4300 × g) over natten som beskrevet i 12. - Etter sentrifugering, fjern supernatanten forsiktig og legg røret opp ned på vevspapir for å fjerne eventuell gjenværende væske. Etter 1 min, tilsett 100 μL 1x PBS og plasser røret ved 4 °C med et parafilmdeksel i en rørholder på et agitasjonsbord i 1 time (se materialtabellen) før du bruker pelletsen på nytt ved å pipettere opp og ned.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
5. Overvåking av Cas9-lasting i Nanoblades av dot-blot
- Forbered fortynningsbufferen ved å tilsette 1 volum lysisbuffer som inneholder et ikke-ionisk overflateaktivt middel (se materialtabellen) i 4 volumer med 1x PBS. Fortynn 2 μL konsentrerte nanoblader i 50 μL fortynningsbuffer, virvel kort, og overfør 25 μL av denne blandingen til et nytt rør som inneholder 25 μL fortynningsbuffer. Gjenta denne operasjonen for å få 4 rør nanoblade fortynning (2 ganger fortynningstrinn).
- For standardkontrollene fortynnes 2 μL rekombinant Cas9-kjernease (se materialtabellen) til 50 μL for fortynningsbuffer, virvel kort, og fortsett å lage åtte serielle fortynninger (2 ganger fortynning for hvert trinn).
- Vend forsiktig 2,5 μL av hver VLP-fortynning og 2,5 μL av hver standard på en nitrocellulosemembran med en flerkanalspipet (et større volum kan resultere i overlappende flekker).
MERK: En metanolbehandlet polyvinyldifluoridmembran kan også brukes. - Når partiklene er absorbert på membranen, blokker membranen med 1x Tris-bufret saltvann som inneholder et ikke-ionisk overflateaktivt middel (TBS-T) supplert med ikke-fett tørrmelk (5% m / v) i 45 minutter ved romtemperatur.
MERK: Protokollen kan settes på pause her, og membranen lagres ved 4 °C i 1x TBS-T. - Kast 1x TBST supplert med ikke-fett tørrmelk, og inkuber membranen over natten ved 4 °C med Cas9-pepperrotperoksidaseantistoffet (1/1000 fortynning i 1x TBST, 5% melk). Vask membranen 3x med TBS-T, og visualiser signalet ved hjelp av et forbedret chemiluminescent substratsett.
- Kvantifisere prikkintensiteten for Nanoblades og rekombinante Cas9-standardfortynninger ved hjelp av den proprietære programvaren som følger med gelavbildningsstasjonen eller imageJ13. Definer en lineær kurve som kobler punktintensiteten til Cas9-konsentrasjonen. Bruk funksjonen til den oppnådde kurven til å ekstrapolere Cas9-innholdet i hvert preparat.
MERK: Mengden rekombinant Cas9-proteinkontroll kan mette avlesningen for de mest konsentrerte prøvene av standardfortynningssett (figur 2). Det anbefales derfor, når du definerer den lineære kurven, å fjerne avlesningen fra de ufortynne prøvene (og noen ganger de første fortynningstrinnene) hvis de ikke er i det lineære området med hensyn til den kjente konsentrasjonen av Cas9 som ble oppdaget. På samme måte, når du ekstrapolerer mengden Cas9 i Nanoblade-prøvene, bruker du bare avlesningene som er innenfor det lineære området til standardkurven.
6. Transduksjon av målceller med Nanoblades (prosedyre for transduksjon i en 12-brønns plate)
- I en 12-brønns plate frø 100.000-200.000 celler (enten primære eller udødelige adherentceller) per brønn i 1 ml av riktig cellekulturmedium. La cellene feste seg til plateoverflaten før transduksjon.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsettes 5-20 μL konsentrerte Nanoblades (fra trinn 3.5.1 eller 4.4) til 500 μL cellekulturmedium, og bland ved å pipettere opp og ned med en P1000 pipettor. Fjern mediet fra celler, og erstatt det med 500 μL av denne Nanoblade-blandingen.
MERK: Transduksjon må optimaliseres for hver celletype. Det er viktig å bruke det minste mulige volumet av medium (samtidig som du unngår tørking av målcellene) slik at Nanobladene forblir svært konsentrerte. Adherent celler må transduseres direkte mens de er festet til platen (ikke transduser i suspensjon, da dette vil redusere transduksjonseffektiviteten betydelig). Noen celler tolererer langvarig eksponering for Nanoblades (24-48 h), mens andre er svært følsomme og kan danne liten synytia. I dette tilfellet må Nanoblades inkuberes med celler bare i 4-6 timer før du erstatter mediet. Spinokulasjon14 kan også forbedre transduksjon for celler som vokser i suspensjon. Adjuvanser som kationiske polymerer (se materialtabellen) kan også forbedre transduksjonseffektiviteten i noen celletyper. - Etter 4-6 h celleinkubasjon i et lavt volum medium som inneholder Nanoblades, øk volumet av medium til normal mengde (1 ml hvis du arbeider med en 12-brønns plate), eller erstatt den med friskt medium hvis cellene er følsomme for VLPer.
MERK: Cellemedium som inneholder nanoblader må inaktiveres med 0,5 % natriumhypokloritt i 10 minutter før det kastes. Bruk hansker og vernebriller når du manipulerer natriumhypokloritt. Hvis Nanoblades induserer celledød, tilpasser du mengden og den totale eksponeringstiden for å redusere celledødeligheten.
7. Måling av CRISPR-effektivitet ved det målrettede locus av T7 endonuclease-analysen
- Design PCR-primere for å forsterke en 400-700 base-pair (bp) region som omfatter CRISPR-cleavage-området.
MERK: Spaltingsstedet bør være fjernt fra amplikonkanten med minst 200 bp og bør skiftes litt fra midten av amfinen slik at ved T7 endonuclease spalting, vil 2 fragmenter av forskjellige størrelser bli utgitt. - Trekk ut genomisk DNA fra celler behandlet med Nanoblades rettet mot genet av interesse og fra kontrollceller behandlet med Nanoblades programmert med en kontroll sgRNA (se materialtabellen).
MERK: Protokollen kan settes på pause her. - Bruk 150 ng genomisk DNA som mal, programmer en PCR-reaksjon på 30 μL volum (sluttvolum) ved å følge produsentens protokoll. Kontroller at PCR-forsterkningen gir en enkelt forsterkning av forventet størrelse ved å kjøre en 2% agarose gel farget med 5 μg/ml ethidiumbromid (eller en sikrere alternativ DNA gelflekk).
MERK: Bruk passende beskyttelsesutstyr når du manipulerer ethidiumbromid, som mistenkes for å forårsake genetiske defekter. Protokollen kan settes på pause her. - Heteroduplex generering og fordøyelse
- I et 0,2 ml PCR-rør, tilsett 5 μL av enzymbufferen (utstyrt med T7 endonuclease I), 20 μL vann og 24 μL av PCR-produktet fra trinn 7.3. Tillat heterodupleksdannelse ved å varme opp prøvene til 94 °C over 3 minutter og deretter ved å redusere temperaturen (2 °C per min) for å nå 40 °C.
- Tilsett 0,5 μL T7-endonuclease I ved romtemperatur til hvert heteroduplexrør, inkludert kontrollen. Inkuber ved 37 °C i 15 minutter. Last den resulterende reaksjonen i en 2,5% (vekt / volum) agarose gel farget av ethidiumbromid. Etter migrering, bilde gelen på en UV-transilluminator.
MERK: Bruk passende beskyttelsesutstyr når du manipulerer ethidiumbromid, som mistenkes for å forårsake genetiske defekter. Bruk UV-vernebriller når du bruker UV-transilluminatoren. - Mål spaltingseffektivitet ved å analysere bildet som følge av fordøyelsesreaksjonen for å kvantifisere intensiteten til hvert bånd med passende programvare (se materialtabellen).
8. Måling av CRISPR-effektivitet ved målrettet locus ved Sanger-sekvensering og TIDE-analyse
MERK: Som et alternativ til T7 endonuclease-analysen kan CRISPR-effektiviteten overvåkes ved analyse og dekonvolusjon av Sanger-sekvenseringsspor basert på TIDE-protokollen15.
- Utfør Sanger-sekvensering av PCR-amlikoner fra trinn 7.3 (inkluderer en kontrolltilstand som tilsvarer ubehandlede celler) enten ved hjelp av den fremre eller omvendte PCR-primeren.
- Analyser Sanger-sekvenseringssporene til kontrolltilstanden (ubehandlede celler) og Nanoblade-behandlede prøver ved hjelp av TIDE-serveren (https://tide.nki.nl) og følg deres analyseretningslinjer.
9. Nanoblade kompleks formasjon med ssODN donorer for homologi-rettet reparasjon (prosedyre for transduksjon i en 12-brønns plate)
MERK: Retningslinjer for utforming av ssODN for effektiv homologistyrt reparasjonsmediert redigering er beskrevet tidligere16.
- I en 12-brønns plate, frø 100.000-200.000 celler per brønn i 1 ml av riktig cellekulturmedium. La cellene feste seg til plateoverflaten før transduksjon.
- Forbered 100 μL av en løsning av kationpolymeren (se materialtabellen) ved 8 μg/ml i 1x PBS.
- Bland 19 μL av den kationiske polymeroppløsningen med 100 pmol av ssODN-malen. Tilsett 20 μL konsentrerte Nanoblades (fra trinn 3.5.1 eller 4.4), og inkuber i 15 min på is.
- Fjern de komplekse Nanoblades/ssODN fra is, og tilsett 500 μL cellekulturmedium (ved 37 °C). Fjern mediet fra målcellene (fra trinn 9.1), og tilsett 500 μL medium som inneholder de komplekse Nanoblades/ssODN. La cellene spre seg i 48 timer før genotyping.
- Trekk ut genomisk DNA fra en brøkdel av cellepopulasjonen ved hjelp av et dedikert ekstraksjonssett (se materialtabellen).
- Design PCR primere for å forsterke en 400-700 bp-region som omfatter knock-in-området.
MERK: PCR-primere bør ikke overlappe med homologiarmene til ssODN for å unngå falske positive resultater som følge av PCR-forsterkning av gjenværende ssODN som fortsatt er til stede i målceller. - Ved hjelp av 150 tonn genomiske DNAer fra kontrollceller (ubehandlet) eller Nanoblade-behandlede celler som mal, programmerer du en 30 μL PCR-reaksjon etter produsentens protokoll.
MERK: ssODN-spor kan være til stede i cellemediet flere dager etter transduksjon med komplekset. Denne ssODN kan fungere som en delvis mal for PCR-analyser som prøver å screene for riktig integrasjon. Derfor er det tilrådelig å passere cellene minst to ganger etter transduksjon, for å unngå eventuelle falske positive analyser. - Last 5 μL av kontrollen og Nanoblade-behandlede PCR-reaksjoner i en 1% (vekt / volum) agarose gel farget av ethidiumbromid. Etter migrering, bilde gelen på en UV-transilluminator.
MERK: Hvis homologirekombinasjonen er vellykket og tilsvarer innsetting av mer enn 1 bp genetisk materiale, bør det være en forskjell i molekylvekten til PCR-amlikonene mellom kontrollen og nanobladbehandlet prøve. Siden effektiviteten til HDR ikke når 100%, bør to bånd være synlige i den Nanoblade-behandlede prøven (en av lignende størrelse som kontrollen PCR-amplikon som tilsvarer den uredigerte allelen og en med høyere molekylvekt som tilsvarer knock-in allelen, se figur 3B midtpanel).
- Design PCR primere for å forsterke en 400-700 bp-region som omfatter knock-in-området.
- Utfør Sanger-sekvensering av kontrollen og Nanoblade-behandlede PCR-amlikoner.
- Kvantifisere knock-in effektivitet ved hjelp av TIDER-protokollen17.
10. Nanoblade levering in vivo
- Lever opptil 25 μL konsentrerte Nanoblades fra trinn 3.5.1 til retro-orbital injeksjon eller opptil 100 μL gjennom hale vene injeksjon, som beskrevet i18, hvis du arbeider med mus.
MERK: Alle prosedyrer som involverer dyreforsøk (inkludert Nanoblade-injeksjoner for genomredigeringsformål) krever en godkjent protokoll fra en lokal etikkkomité. - For generering av transgene mus, bruk en mikroinjektor for å levere fra 1 pL til 10 pL konsentrerte Nanoblades fra trinn 4.4 inn i perivitellinerommet til musoocytter som beskrevet tidligere18.
MERK: For perivitellineinjeksjon er det viktig å rense og konsentrere Nanoblades på en sukrosepute for å unngå tilstopping av mikroinjektoren.
Representative Results
Protokollen for Nanoblade-forberedelse er ganske grei og krever enkelt laboratorieutstyr i tillegg til tilgang til en vevskulturhette, en CO2-inkubator og en svingende bøtte sentrifuge eller en ultracentrifuge. Noen trinn krever imidlertid spesiell oppmerksomhet som kilde og håndtering av produsentceller, samt transduksjonsforhold. Som vist i figur 1A, er det viktig for frøceller slik at de er homogent fordelt i platen og når ~ 70-80% sammenløp på dagen for transfeksjon (unngå å ha klumper av celler). Tjuefire timer etter transfeksjon (figur 1B,C) vil produsentceller danne synytia som fører til celler av større størrelse med flere kjerner. Førti timer etter transfeksjon (figur 1D) vil de fleste cellene i platen ha dannet synytia og begynne å løsne fra platen.
Dette er helt normalt og skyldes uttrykket av konvoluttglykoproteinet, som induserer fusjon mellom nærliggende celler. Ved konsentrasjon ved sentrifugering (eller til og med rett fra overnakant av produsentceller), kan mengden Cas9 lastet i Nanoblades kvantifiseres på en absolutt måte ved dot-blot på en nitrocellulosemembran ved hjelp av rekombinant Cas9 som referanse (figur 2). Dette trinnet er viktig for å bestemme riktig mengde Nanoblades som skal brukes til transduksjon av målceller. Når du utfører dot-blot-analysen, er det viktig å vurdere bare avlesningene som faller innenfor det lineære området til standardkurven. Men uavhengig av mengden Cas9 som finnes i Nanoblades, er det viktig å teste effektiviteten av genomredigering direkte på målceller ved hjelp av T7 endonuclease-analysen (figur 3) eller Sanger-sekvenseringen.
Som vist i figur 3, kan effektiviteten til Nanoblades variere fra batch til batch, selv om den vanligvis er korrelert med mengden Cas9. I eksemplet som vises i figur 3, fører batchen fra bane 1 til 20 % generell redigeringseffektivitet, mens batchen fra bane 3 fører til 60 % effektivitet. I dette tilfellet er det mulig å øke volumet av Nanoblades som brukes fra batch 1 for å oppnå en redigeringseffektivitet som ligner på det fra batch 3. Figur 4 viser maksimal redigeringseffektivitet oppnådd ved hjelp av Nanoblades i forskjellige typer primærceller. Det er viktig å merke seg at effektiviteten kan variere avhengig av sekvensen av sgRNA som brukes og måltilgjengeligheten.
Figur 1: Morfologi av produsentceller under Nanoblade-produksjon. (A) HEK293T celler ved 70-80% samløp 24 timer etter plating. (B og C) HEK293T cellemorfologi 24 timer etter transfeksjon. (D) HEK293T cellemorfologi 40 timer etter transfeksjon. Skalastenger = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantifisering av Cas9-lasting i Nanoblades ved dot-blot. (A) Rekombinant Cas9 eller 100x konsentrert (ved ultracentrifugation) Nanoblade-prøver (#1, #2 og #3) fortynnes 2 ganger sekvensielt og oppdages på en nitrocellulosemembran før de inkuberes med anti-Cas9 HRP-koblede antistoffer. Signalet avsløres av forbedret chemiluminescens. (B) Chemiluminescence signal er anskaffet og kvantifisert for rekombinante Cas9 fortynninger og signalintensitet plottet mot den kjente mengden Cas9 oppdaget på nitrocellulosemembranen. En regresjonskurve beregnes for fortynningene som er innenfor det lineære området (se blå kryss), unntatt alle konsentrasjoner som er utenfor det lineære området (se røde kryss). (C) Cas9-konsentrasjon (nM) i hvert Nanoblade-preparat ble ekstrapolert ved hjelp av ligningen fra den lineære regresjonen oppnådd i (B). For dette er det viktig å bare bruke det kvantifiserte signalet fra Nanoblade-fortynningene som faller innenfor det lineære området til regresjonskurven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Overvåke redigeringseffektivitet ved transduksjon. (A) T7 endonucleaseanalyse som måler spaltingseffektivitet i Nanoblade-behandlede celler. Celler transdusert med Nanoblades rettet mot EMX1-genet ble analysert av T7 endonucleaseanalyse. Lane 1: Nanoblade forberedelse batch # 1 (20% spalting effektivitet); Bane 2: Kontrollceller; Lane 3: Nanoblade forberedelse batch # 2 (60% spalting effektivitet). (B) Innslag av Flag-tag-sekvensen i DDX3 åpen leseramme. Konsentrerte nanoblader programmert med en sgRNA rettet mot DDX3-locus ble produsert fra forskjellige HEK293T-kloner (#1, #2) og komplekset med økende doser av en Flag-DDX3 ssODN-mal og de oppnådde kompleksene som brukes til transduksjon av HEK293T-målceller. Ved transduksjon ble celler dyrket i tre dager før de samlet dem for å trekke ut genomisk DNA og totale proteiner. Flag-DDX3-proteiner ble immunoprecipitated ved hjelp av anti-Flag agarose perler etterfulgt av vestlig-blot analyse av de gjenvunne proteinene ved hjelp av et antiflagg antistoff (topppanel). Stedsstyrt innsetting av Flagg-koden i Ddx3-locus ble også analysert av PCR ved hjelp av enten primere som flankerer innsettingsstedet (midtpanelet), eller ved hjelp av en fremoverprimer som gjenkjenner Flag-tag-sekvensen og en omvendt primer som er spesifikk for Ddx3-locus nedstrøms for flagginnsettingsstedet (bunnpanelet). Forkortelser: EMX1 = Tom Spiracles Homeobox 1; DDX3 = DEAD-boks RNA helicase 3; PCR = polymerase kjedereaksjon; ODN = oligodeoksynukleotid; ssODN = syngestrenget ODN; sgRNA = enkeltguide RNA; IP = immunoprecipitation. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Redigeringseffektivitet oppnådd i forskjellige primærcelletyper ved hjelp av Nanoblades. Forkortelser: PBL = perifert blodlymfosytt; IL = interleukin; CD = differensieringsklynge; iPSC = indusert pluripotent stamcelle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Nanoblader muliggjør rask og doseavhengig levering av Cas9/sgRNA RNP-komplekset i cellelinjer og primærceller. I motsetning til klassisk transfeksjon og andre virale leveringsvektorer, men som proteinelektroporasjon, har Nanoblades fordelen av forbigående levering av Cas9 / sgRNA RNP på en transgenefri måte. Nanoblader tilbyr en svært allsidig, enkel og rimelig plattform for proteinlevering som enkelt og raskt kan tilpasses den stadig voksende familien av CRISPR-varianter. Nanoblader kan produseres i HEK293T-cellelinjen eller dets derivater. HEK293T cellelinjer som brukes her er utviklet for å maksimere retroviral og lentiviral partikkelproduksjon (se materialtabellen). Selv om andre kilder til HEK293T-celler kan være egnet, må brukerne imidlertid teste og sammenligne HEK293T-celler fra forskjellige kilder, da store forskjeller i partikkelproduksjon er observert avhengig av HEK293T-cellekilden. Celler må også kontrolleres for Mycoplasma-forurensning ofte og passerer hver tredje dag (klassisk 1/8 fortynning) for å unngå overkonfluens, noe som har en negativ innvirkning på partikkelproduksjonen.
Celler bør ikke opprettholdes for over 20 passasjer. DMEM supplert med glukose, penicillin/streptomycin, glutamin og 10 % dekomplementert fostersvinserum ble brukt til cellekultur. Siden serumopprinnelse kan påvirke kvaliteten på Nanoblade-preparatet, bør forskjellige partier serum testes før storskala produksjon. Nanoblader kan produseres effektivt i andre medier som RPMI eller serumfrie modifikasjoner av minimum viktig medium som kan erstatte DMEM dagen etter transfeksjon. Som angitt nedenfor, selv om middels erstatning etter transfeksjon med noen DNA-transfeksjonsreagenser er valgfritt, kan det være gunstig å endre mediet som VLPene frigjøres i, spesielt for å begrense serumspor i partikkelpreparatet. Dyrking av celler i redusert serum minimum viktig medium dagen før transfeksjon er ennå ikke forsøkt.
Som nevnt produseres Nanoblades ved overekspressering av en blanding av plasmider i produsentceller. Overtrykket ser ut til å være nødvendig for optimal produksjon. Faktisk utviklet dette laboratoriet en produsentcellelinje der Gag-Pol-uttrykkende konstruksjon ble stabilisert ved antibiotikavalg; Dette systemet klarte imidlertid ikke å produsere betydelige mengder Nanoblades. En lignende observasjon ble gjort da sgRNA-kodingskonstruksjonen ble stabilt integrert i genomet til produsentceller. Som beskrevet for andre partikkelproduksjonssystemer, kan en stabil cellelinje som uttrykker minst noen konstruksjoner involvert i Nanoblades-produksjonen være nyttig; Dette vil imidlertid sikkert kreve behandling av store mengder supernatant og en passende teknikk for å rense partikler. Protokollen ovenfor skisserer den foretrukne prosedyren for å produsere Nanoblades som utnytter spesifikke transfeksjonsreagenser (se materialtabellen).
Selv om transfeksjonsreagenser fra andre produsenter også har blitt testet med suksess, følger de aller fleste av denne gruppens resultater med Nanoblades prosedyren som er beskrevet her. Lavkostnadstransfeksjon kan oppnås ved hjelp av kalsiumfosfatreagenser og gi god produksjonseffektivitet; Denne metoden krever imidlertid absolutt utskifting av transfeksjonsmedium dagen etter transfeksjon og kan etterlate kalsiumfosfatrester i sedimentert partikkelpreparat. I samsvar med nødvendigheten av høye uttrykksnivåer for Nanoblade-komponenter i produsentceller er observasjonen at mengden sgRNAer forbundet med Cas9-proteinet kan være en begrensende faktor for effektiv genomredigering. For å forbedre sgRNA-lasting har to tekniske tilnærminger nylig blitt utviklet av uavhengige grupper ved hjelp av proteinleveringsvektorer som ligner nanoblader. Disse er avhengige av bruk av T7 polymeraseavhengig cytoplasmisk uttrykk for sgRNA6 eller gjennom tilsetning av et retroviralt innkapslingssignal til sgRNA-sekvensen for å megle binding til Gag polyprotein6. Disse tilnærmingene kan faktisk forbedre sgRNA-lasting i Nanoblades selv om de ikke er testet ennå.
Transduksjon av målceller er et kritisk trinn i prosedyren. I de fleste udødelige cellelinjer har transduksjon med Nanoblades liten eller ingen cytopatisk effekt. Men i primære celler kan toksisitet være et problem. Transduksjon må derfor optimaliseres for hver celletype. Spesielt er eksponeringstiden for Nanoblades en viktig faktor for å endre når du optimaliserer transduksjonsprotokollen. For følsomme celler som primære nevroner eller benmargsceller, gir 4-6 h inkubasjon med Nanoblades før du erstatter mediet, effektiv levering av Cas9-proteinet samtidig som celletoksisitet minimeres. Videre kan adjuvanser som kationiske polymerer, blant annet, forbedre effektiviteten av transduksjon i noen celler (se materialtabellen). Det er viktig å merke seg at Nanoblades er VLPer og kan indusere en immunogen respons. Dette kan være en begrensning hvis du arbeider med visse typer primærceller, for eksempel makrofager eller dendrittiske celler, der inkubasjon med Nanoblades kan indusere viktige endringer i genuttrykk og fenotypen til cellene. Hvis makrofager og dendrittiske celler er avledet fra hematopoietiske stamcelleforløpere (for eksempel musebenmargsceller), er det å foretrekke å transdusere celler med Nanoblades før de er fullt differensiert for å unngå å indusere en cellulær respons mot Nanoblades. Ellers kan Cas9 proteinelektroporasjon representere et levedyktig alternativ når du arbeider med differensierte immunceller.
Nanoblader kan brukes in vivo for å transdusere muszygoter eller embryoer for å generere transgene dyr. I likhet med klassiske retrovirale eller lentivirale vektorer, kan de også injiseres direkte i vev fra voksne dyr. Nanoblades (lik retrovirale og lentivirale vektorer) kan imidlertid inaktiveres av vertsdyrets immunrespons; Derfor må dosen som skal injiseres optimaliseres for hver applikasjon. Denne immunresponsen kan også begrense fordelingen av funksjonelle VLPer til vev nær injeksjonsstedet. Til slutt, i motsetning til lentivirale vektorer, er Nanoblades transgenefrie og leverer Cas9 i en begrenset tidsramme. Derfor kan de ikke brukes til å utføre genomomfattende funksjonelle screeninger som krever sekvensering av sgRNAer med høy gjennomstrømning ved valg av celler. Nanoblader er nyttige når rask, doseavhengig og transgenefri genomredigering er nødvendig20. Videre, i likhet med proteinelektroporasjon, fører Nanoblades til færre off-target effekter enn langvarig uttrykk for Cas9 / sgRNA gjennom DNA-transfeksjon eller klassiske virale vektorer3. Fremtidig utvikling av Nanoblades er fokusert på å innlemme Cas9-varianter for forskjellige teknologiske applikasjoner som baseredigering og RNA-målretting.
Disclosures
Philippe E. Mangeot og Emiliano P. Ricci er navngitt som oppfinnere på et patent relatert til Nanoblades-teknologien (patentsøkere: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; søknadsnummer: WO 2017/068077 Al patentstatus; publisert, 27 april 2017; Alle aspekter av manuskriptet dekkes av patentsøknaden. De resterende forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) av Université de Lyon, innenfor programmet Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) drevet av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) og av Det europeiske forskningsrådet (ERC-StG-LS6-805500 til E.P.R.) under EUs forsknings- og innovasjonsprogrammer Horizon 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).
- Mangeot, P. E., et al. Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature Communications. 10 (1), 45 (2019).
- Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases. eLife. 3, 01911 (2014).
- Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).
- Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications. 11, 1334 (2020).
- Indikova, I., Indik, S. Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts. Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).
- Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (17), 99 (2019).
- Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell. 59 (1), 103-112 (1989).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing. Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders. Journal of Visualized Experiments. (140), e57609 (2018).
- Montagna, C., et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).
- Marnef, A., et al. A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair. Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).
