Summary
Vi har utvecklat ett enkelt och billigt protokoll för att ladda Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteinkomplex inom virusliknande partiklar. Dessa partiklar, som kallas "Nanoblades", möjliggör effektiv leverans av Cas9/sgRNA-komplexet i odödliga och primära celler samt in vivo.
Abstract
Det grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitionerna (CRISPR)-Cas-systemet har demokratiserat genomredigering i eukaryota celler och lett till utvecklingen av många innovativa applikationer. Leverans av Cas9-proteinet och enkelstyrnings-RNA (sgRNA) till målceller kan dock vara tekniskt utmanande. Klassiska virala vektorer, såsom de som härrör från lentivirus (LVs) eller adeno-associerade virus (AAV), möjliggör effektiv leverans av transgenes kodning för Cas9 proteinet och dess associerade sgRNA i många primära celler och in vivo. Ändå kan dessa vektorer drabbas av nackdelar som integration av transgenet i målcellsgenomet, en begränsad lastkapacitet och ett långsiktigt uttryck för Cas9-proteinet och vägleda RNA i målceller.
För att övervinna några av dessa problem utvecklades en leveransvektor baserad på murin leukemiviruset (MLV) för att paketera Cas9-proteinet och dess tillhörande guide RNA i avsaknad av kodande transgen. Genom att smälta Cas9-proteinet till C-ändstationen av det strukturella proteinet Gag från MLV bildades virusliknande partiklar (VLPs) laddade med Cas9-proteinet och sgRNA (med namnet "Nanoblades). Nanoblad kan samlas in från odlingsmediet av producentceller, renas, kvantifieras och användas för att omvandla målceller och leverera det aktiva Cas9/sgRNA-komplexet. Nanoblad levererar sin ribonukleproteinlast (RNP) övergående och snabbt i ett brett spektrum av primära och odödliga celler och kan programmeras för andra tillämpningar, såsom övergående transkriptionell aktivering av riktade gener, med hjälp av modifierade Cas9-proteiner. Nanoblad kan in vivo genomredigering i levern hos injicerade vuxna möss och i äggceller för att generera transgena djur. Slutligen kan de komplexeras med donator-DNA för "transfektfri" homologistyrd reparation. Nanoblade preparat är enkelt, relativt billigt, och kan enkelt utföras i alla cellbiologiska laboratorier.
Introduction
Jämfört med andra programmerbara nukleaser förenklade crispr-cas-systemet dramatiskt och demokratiserade förfarandet för sekvensspecifik genominriktning och klyvning i eukaryota celler. Genom det enkla uttrycket av ett sgRNA kan användare programmera Cas9-proteinet (eller optimerade varianter) för nästan alla cellulära locus1. I detta scenario blir leverans av Cas9-proteinet och sgRNA den största begränsningen när man utför platsstyrd mutagenes. I odödliga celler kan sgRNA och Cas-proteinet enkelt uttryckas från transfected plasmider för att uppnå effektiv genominriktning i de flesta celler. Konstituerande uttryck av Cas9/sgRNA-komplexet kan dock öka cas9-proteinets off-target-aktivitet och införa oönskade förändringar i icke-specifika lokus2. I primärceller kan DNA-transfektion vara tekniskt svår att uppnå och leda till dåligt uttryck eller en liten andel transfekterade celler. Alternativ till klassisk DNA-transfektion omfattar användning av virusvektorer som levererar en transgenekodning för Cas9 och sgRNA eller elektroporation av rekombinant Cas9-protein kopplat till ett syntetiskt sgRNA. Dessa metoder kan dock leda till transgene integration inom cellen värd genom (som är fallet för klassiska retrovirala och lentiviral uttryck vektorer), begränsning av cellulära faktorer och leda till konstituerande uttryck av Cas9 protein och sgRNA.
Elektroporation av Cas9/sgRNA RNP-komplexet kan övervinna de flesta av dessa problem och leda till effektiv och övergående leverans i primärceller och in vivo samt möjliggöra ett dosberoende svar. Ändå förlitar det sig vanligtvis på dyr utrustning och reagenser och är också svårt att skala upp om ett stort antal celler måste behandlas. Som ett alternativ till de ovan nämnda teknikerna har dessa författare utvecklat "Nanoblades"-en retroviral leveransvektor för Cas9-proteinet och sgRNA3 som är konceptuellt lik andra viralt härledda kapsidproteinleveranssystem4,5,6,7,8. Nanoblad utnyttjar den naturliga kapaciteten hos Gag polyprotein från retrovirus för att producera, när de uttrycks ensam i odlade celler, VLPs som frigörs i det extracellulära medium9. Genom att smälta Cas9-proteinet till C-terminaländen av murinleukemiviruset (MLV) Gag polyprotein och co-expressing sgRNA och virala kuvert glykoproteiner, Cas9 proteinet kan kapslas in i släppta VLPs eller Nanoblades. Vid rening kan Nanoblades inkuberas med målceller eller injiceras in vivo för att förmedla snabb, övergående och dosberoende leverans av Cas9/sgRNA RNP-komplexet3.
Nanoblad kan programmeras med flera sgRNAs för samtidig redigering vid olika lokus eller med Cas9-varianter för att utföra andra applikationer som målspecifik transkriptionsaktivering eller repression3. I motsats till proteinelektroporation, som förlitar sig på rekombinant uttryck, kan nyligen beskrivna Cas-varianter från litteraturen enkelt klonas till Gag fusion-uttrycksvektorn, vilket gör den till en mångsidig plattform. Nanoblad kan ytterligare komplexeras eller laddas med enkelsträngade och dubbelsträngade olideoxynucleotides (ssODNs) för att utföra homologistyrd reparation3. Nanobladeproduktionen är relativt enkel och billig. Dessutom kan Nanoblades förvaras vid 4 °C i många dagar eller vid -80 °C för långtidslagring. Vanligtvis förmedlar Nanoblades effektiv, transgenefri genomredigering i de flesta odödliga och primära odlade celler. Vissa primärceller kan dock vara känsliga för förekomst av viruspartiklar, vilket resulterar i ökad dödlighet. Celler i det medfödda immunsystemet kan också reagera på närvaron av Nanoblades (på grund av deras virala ursprung) och aktiveras. I dessa fall måste transduktionsprotokollet optimeras för att begränsa exponeringstiden för Nanoblades och minimera ospecificerade effekter. Nanoblades representerar ett livskraftigt och lättimpant alternativ till andra tillgängliga CRISPR-leveransmetoder.
Protocol
1. sgRNA Design och kloning
OBS: Riktlinjer för utformning av sgRNAs kan erhållas från flera källor som https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing eller från Hanna och Doench10.
- När de 20 nukleotidsgRNA-sekvenserna har utformats, beställ följande enkelsträngade DNA-oligonukleotider:
- Framåt: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N motsvarar den riktade locusen utan den protospacer-angränsande motivsekvensen (PAM)
- Omvänd: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC 3' (N motsvarar det omvända komplementet av den riktade locus utan PAM-sekvensen)
OBS: Inga särskilda ändringar krävs vid beställning av oligonukleotider (inget krav på 5' fosfat).
- Hybridisera de två DNA-oligonukleotiderna i ett 0,2 mL polymeraskedjereaktionsrör (PCR) genom att blanda 5 μL glödgningsbuffert (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-olikleotid(40 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-olikleotid(40 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-olikleotid( 90 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-olikleotid( 40 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-olikleotid( 90 ml av varje DNA-olikleotid) och 10 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-olikleotid( 100 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-oliukleotid( 100 mM DTT; pH 7,9 vid 25 °C), 1 μL av varje DNA-olikleotid( 90 mM
- På ett PCR-block, inkubera prover vid 95 °C i 15 s och minska sedan temperaturen till 20 °C med en ramp på 0,5 °C/s. Förvara vid rumstemperatur eller förvara vid -20 °C.
PROTOKOLLET kan pausas här. - Smält 10 μg av BLADE eller SUPERBLADE sgRNA uttryck plasmider med 10 enheter BsmBI-v2 restriktionsenzym för 3 h vid 55 °C i en total reaktionsvolym på 50 μL.
OBS: Den smälta vektorn ska frigöra ett DNA-skär på ~ 1,9 kb och ett andra DNA-fragment på ~ 3,3 kb. - Ladda begränsningsreaktionen på en 1% agarosegel fläckad med 5 μg/ml etidiumbromid (eller en säkrare alternativ DNA-gelfläck).
OBS: Använd lämplig skyddsutrustning vid manipulering av etidiumbromid, som misstänks orsaka genetiska defekter.- På ett ultraviolett (UV) bord som dukas vid en våglängd på 312 nm (för att undvika att skada DNA), skär 3,3 kb DNA-fragmentet från gelén och placera det i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör.
OBS: Använd lämplig skyddsutrustning (handskar och UV-skyddsglasögon) när du manipulerar etidiumbromid och arbetar på UV-bordet. - Extrahera DNA från den skivade gelen som innehåller 3,3 kb DNA-fragmentet med hjälp av ett dedikerat DNA-gelextraktionskit (se materialtabellen). Kvantifiera mängden renat DNA med hjälp av en spektrofotometer.
PROTOKOLLET kan pausas här.
- På ett ultraviolett (UV) bord som dukas vid en våglängd på 312 nm (för att undvika att skada DNA), skär 3,3 kb DNA-fragmentet från gelén och placera det i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör.
- Liga de hybridiserade framåt- och omvända DNA-oligonukleotiderna från steg 1.2 till BsmB1-smälta, gelrenade BLAD eller SUPERBLADE-vektor från steg 1.5.2. Tillsätt för detta 2 μL T4 DNA-ligasbuffert, 50 ng av den gelrenade vektorn (från steg 1.5.2), 1 μL av de hybridiserade DNA-oligonukleotiderna (från steg 1.2), vatten för att utgöra volymen till 19 μL och 1 μL T4 DNA-ligas. Inkubera reaktionen vid 25 °C i 10 min.
- Omvandla ligaturprodukten till kompetenta bakterier (se materialtabellen) enligt beskrivningen i11. Plätera de omvandlade bakterierna på en ampicillin Luria Bertani agarplatta och inkubera över natten vid 37 °C.
- Välj flera isolerade kolonier på agarplattan för att utföra DNA-minipreparation11 (se tabellen över material) och utför Sanger-sekvensering med en U6-främre primer (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') för att kontrollera om det finns korrekt ligatur av sgRNA-variabelsekvensen.
OBS: Andra sgRNA-uttrycksplasmider kan användas om de inte kodar för Cas9-proteinet, vilket kan störa Nanoblade-produktionen.
2. Plasmidpreparat
- Utför maxipreparation (se materialtabellen) av alla erforderliga plasmider och förbered 10 μg alikvoter vid 1 μg/ml för att lagra vid -20 °C. Undvik upprepade frysnings-/upptiningscykler av plasmiderna; använd alikvoter två gånger innan de kasseras.
3. Nanoblade beredning
- På dag 1, frö mellan 3,5 och 4 × 106 HEK293T celler (se tabellen över material) i 10 ml av Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller hög glukos, natrium pyruvat, L-glutamin, 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och penicillin / streptomycin i en 10 cm cellodlingsfat. Flytta 10 cm-plattan försiktigt bakåt och framåt, sedan från höger till vänster (upprepa denna sekvens 5x) för att fördela cellerna homogent över odlingsskålen. Inkubera celler vid 37 °C i en cellinkubator med 5% CO2.
OBS: Alla procedurer som rör hantering av odlade celler och nanoblad bör utföras under en cellkultur laminär flödeshuv för att undvika att de kontamineras. - Dag 2: Plasmid transfection
- Cellerna ska vara 70-80% sammanflöde 24 h efter plätering (figur 1A). Ersätt mediet med 10 ml färskt DMEM som innehåller högt glukos, natriumpyveuvat, L-glutamin, 10% FBS (penicillin och streptomycin kan utelämnas även om det inte är obligatoriskt) före transfektion.
OBS: I detta steg är det viktigt att cellerna inte är sammanflöde. Annars skulle växlingseffektiviteten och partikelproduktionen kunna minskas. - För varje 10 cm platta, förbered följande mängder plasmider i ett 1,5 mL-rör: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg BLADES eller SUPERBLADES plasmid.
- Tillsätt 500 μL transfektbuffert (se materialtabellen), virvel i 10 s och centrifugera sedan i 1 s. Tillsätt 20 μL av transfektreagenset (se materialtabellen), virvla röret i 1 s och centrifugera sedan i 1 s.
- Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur och tillsätt hela lösningen droppvis till cellerna i DMEM-medium med hjälp av en P1000 pipettor. Flytta 10 cm-plattan försiktigt bakåt och framåt, sedan från höger till vänster (upprepa denna sekvens 5x) för att jämnt fördela transfektreagensen över cellerna. Inkubera celler vid 37 °C i minst 40 timmar i en cellinkubator med 5% CO2.
OBS: Om så önskas kan medium ändras 4 h efter transfektion.
- Cellerna ska vara 70-80% sammanflöde 24 h efter plätering (figur 1A). Ersätt mediet med 10 ml färskt DMEM som innehåller högt glukos, natriumpyveuvat, L-glutamin, 10% FBS (penicillin och streptomycin kan utelämnas även om det inte är obligatoriskt) före transfektion.
- På dag 3 kontrollerar du morfologin hos de transfekterade cellerna under mikroskopet.
OBS: Producentcellerna börjar smälta samman. Detta är en normal förekomst på grund av uttrycket av fusogenic virala kuvert (figur 1B,C). - Dag 4: Skörd av nanoblad
OBS: Minst 40 h efter transfektion skulle cellerna ha smält samman på grund av uttryck av de fusogena viruskuverten, och ibland är cellerna helt avskilda från plåtstödet (figur 1D).- Samla 9 ml av odlingsmediet supernatant med en 10 mL pipett.
OBS: Nanoblad är VLPs som kan leverera Cas9 proteinet och dess tillhörande sgRNA till primära celler och in vivo. Även om de inte anses vara genetiskt modifierade organismer eftersom de saknar genetiskt material, kan de inducera genetiska förändringar. Därför måste de manipuleras med försiktighet för att undvika kontakt med användare (särskilt om de är programmerade att rikta in sig på tumör suppressorgener). Användare rekommenderas att följa sina lokala säkerhetsriktlinjer för manipulering av retrovirala vektorer och arbeta i ett BSL-2-laboratorium när de förbereder VLPs och utför transduktionsexperiment. Nanoblad kan inaktiveras med 70% etanol eller 0,5% natriumhypoklorit. Det är också tillrådligt att behandla allt plastavfall (pipettspetsar, vävnadsodlingsplattor, centrifugeringsrör) med 0,5% natriumhypoklorit i minst 10 minuter för att inaktivera Nanoblades. - Centrifugera den insamlade supernatanten vid 500 × g i 5 minuter för att avlägsna cellulärt skräp och återställa supernatanten utan att störa cellpelleten.
OBS: Om nanoblad är avsedda att användas på primärceller, filtrera supernatanten med ett filter på 0,45 μm eller 0,8 μm. Tänk på att detta steg drastiskt minskar Nanoblade titer eftersom en betydande fraktion kommer att blockeras i filtermembranet. - Pellet nanobladen över natten (12-16 h) i en svängande hinkrotor vid 4 300 × g eller vid 209 490 × g i en ultracentrifuge i 75 min vid 4 °C (se materialtabellen).
OBS: Om målceller kan växa i DMEM är det möjligt att inkubera dem direkt med det supernatant som erhålls efter steg 3.4.2 utan att koncentrera nanobladen.
- Samla 9 ml av odlingsmediet supernatant med en 10 mL pipett.
- Dag 5: Resuspension och lagring av Nanoblades
- Efter centrifugering aspirerar du långsamt medlet och återanvänder den vita pelleten med 100 μL kall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Täck röret med parafilm och inkubera i 1 h vid 4 °C med mild omrörning innan du återanvänder pelleten genom pipettering upp och ner.
OBS: Ett vitt trögflytat material kan förekomma vid återupplivning; Detta är normalt och påverkar inte väsentligt transduktionens effektivitet. - Förvara Nanoblades vid 4 °C om du planerar att använda dem inom fyra veckor. I annat fall, snap-freeze Nanoblades i flytande kväve och lagra dem vid -80 °C.
OBS: Använd skyddsglasögon och kryogena handskar när du manipulerar flytande kväve. Snapfrysning och lagring vid -80 °C leder till en betydande minskning av Nanoblades effektivitet. Dessutom bör tinade nanoblad inte frysas igen. Protokollet kan pausas här.
- Efter centrifugering aspirerar du långsamt medlet och återanvänder den vita pelleten med 100 μL kall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Täck röret med parafilm och inkubera i 1 h vid 4 °C med mild omrörning innan du återanvänder pelleten genom pipettering upp och ner.
4. Koncentration av nanoblad på en sackaroskudde
OBS: Som ett alternativ till centrifugering över natten eller ultracentrifugation (steg 3.4.3) kan Nanoblades koncentreras på en sackaroskudde. Detta ger en renare fraktion av Nanoblades, även om den totala mängden som återvinns kommer att vara lägre.
- Förbered en 10% sackaroslösning (vikt till volym) i 1x PBS och filtrera den genom ett 0,2 μm sprutfilter (se materialtabellen).
- Börja processen med att koncentrera Nanoblades på sackaroskudden.
- Placera 9 ml VLP-innehållande prov (från steg 3.4.3) i ett ultracentrifugerör (se materialförteckningen). Använd en 3 ml spruta och kanyl, lagerför långsamt 2,5 ml av 10% sackaros under provet, försök att inte blanda DET VLP-innehållande provet och sackaroslösningen.
- Alternativt kan du placera 2,5 ml 10% sackaros i ett ultracentrifugerör (se materialtabellen). Luta röret och tillsätt långsamt 9 ml VLP-innehållande prov (från steg 3.4.3) med en låghastighetspipetor. Under denna operation höjer du röret gradvis till vertikalt läge.
- Centrifugera proverna vid 209 490 × g i en ultracentrifuge i 90 min vid 4 °C.
OBS: Denna teknik kan anpassas för centrifugering med låg hastighet (4 300 × g) över natten enligt beskrivningen i 12. - Efter centrifugering, ta försiktigt bort supernatanten och placera röret upp och ner på vävnadspapper för att avlägsna eventuell återstående vätska. Efter 1 min tillsätt 100 μL 1x PBS och placera röret vid 4 °C med ett parafilmskydd i en rörhållare på ett omrörningsbord i 1 h (se materialtabellen) innan pelleten återanvänds genom pipettering upp och ner.
PROTOKOLLET kan pausas här.
5. Övervakning av Cas9-lastning inom Nanoblades med prick-blot
- Förbered utspädningsbufferten genom att tillsätta 1 volym lysbuffert som innehåller ett icke-joniskt tensid (se materialtabellen) i 4 volymer 1x PBS. Späd ut 2 μL koncentrerade Nanoblades i 50 μL utspädningsbuffert, virvel kort, och överför 25 μL av denna blandning till ett nytt rör som innehåller 25 μL utspädningsbuffert. Upprepa denna operation så att den har 4 rör nanobladeutspädningar (2-faldiga utspädningssteg).
- För standardkontrollerna späd 2 μL rekombinant Cas9-nukleas (se materialregistret) till 50 μL utspädningsbuffert, virvel kort och fortsätt att göra åtta seriella utspädningar (2-faldig utspädning för varje steg).
- Placera försiktigt 2,5 μL av varje VLP-utspädning och 2,5 μL av varje standard på ett nitrocellulosamembran med ett flerkanaligt rör (en större volym kan resultera i överlappande fläckar).
OBS: Ett metanolbehandlat polyvinyldifluoridmembran kan också användas. - När partiklarna absorberas på membranet, blockera membranet med 1x Tris-buffrad saltlösning som innehåller ett icke-joniskt tensid (TBS-T) kompletterat med fettfri torrmjölk (5% w/v) i 45 min vid rumstemperatur.
OBS: Protokollet kan pausas här, och membranet lagras vid 4 °C i 1x TBS-T. - Kassera 1x TBST kompletterad med fettfri torrmjölk och inkubera membranet över natten vid 4 °C med cas9-pepparrotsperoxidasantikroppen (1/1000 utspädning i 1x TBST, 5% mjölk). Tvätta membranet 3x med TBS-T och visualisera signalen med hjälp av ett förbättrat chemiluminescent substratsats.
- Kvantifiera prickintensiteten för Nanoblades och rekombinanta Cas9 standardutspädningar med hjälp av den egenutvecklade programvaran som medföljer gelavbildningsstationen eller imageJ13. Definiera en linjär kurva som kopplar prickintensiteten till Cas9-koncentrationen. Använd funktionen hos den erhållna kurvan och extrapolera Cas9-innehållet i varje förberedelse.
OBS: Mängden rekombinant Cas9-proteinkontroll kan mätta avläsningen för de mest koncentrerade proverna av standardutspädningsuppsättningen (figur 2). Det rekommenderas därför att vid definitionen av den linjära kurvan ta bort avläsningen från de outspädda proverna (och ibland de första utspädningsstegen) om de inte ligger i det linjära intervallet med avseende på den kända koncentrationen av Cas9 som upptäcktes. På samma sätt, när du extrapolerar mängden Cas9 i Nanoblade-proverna, använd bara de avläsningar som ligger inom standardkurvans linjära intervall.
6. Transduktion av målceller med nanoblad (förfarande för transduktion i en 12-brunnsplatta)
- I en 12-brunnsplatta, frö 100.000-200.000 celler (antingen primära eller odödliga vidhäftande celler) per brunn i 1 ml av lämpligt cellodlingsmedium. Låt cellerna fästa på plåtytan före flyttning.
- Tillsätt 5–20 μL koncentrerade nanoblad (från steg 3,5,1 eller 4,4) till 500 μL cellodlingsmedium i ett mikrocentriskt rör på 1,5 mL och blanda genom pipettering upp och ner med en P1000-piptor. Ta bort mediet från cellerna och ersätt det med 500 μL av denna Nanoblade-blandning.
Växling måste optimeras för varje celltyp. Det är viktigt att använda minsta möjliga volym medium (samtidigt som man undviker torkning av målcellerna) så att nanobladen förblir mycket koncentrerade. Vidhäftande celler måste överföras direkt när de är fästa på plattan (omled inte i suspension eftersom detta avsevärt minskar transduktionseffektiviteten). Vissa celler tolererar långvarig exponering för Nanoblades (24-48 h) medan andra är mycket känsliga och kan bilda liten syncytia. I detta fall får Nanoblades inkuberas med celler endast i 4-6 timmar innan mediet byts ut. Spinoculation14 kan också förbättra transduktionen för celler som odlas i suspension. Adjuvanser som katjonpolymerer (se materialtabellen) kan också förbättra flyttningseffektiviteten i vissa celltyper. - Efter 4-6 h cellinkubation i en låg volym mediuminnehållande Nanoblades, öka volymen av medium till normal mängd (1 ml om du arbetar med en 12-välplatta) eller ersätt den med färskt medium om cellerna är känsliga för VLPs.
OBS: Cellmediet som innehåller nanoblad måste inaktiveras med 0,5% natriumhypoklorit i 10 minuter innan det kasseras. Använd handskar och skyddsglasögon när du manipulerar natriumhypoklorit. Om Nanoblades inducerar celldöd, anpassa mängden och den totala exponeringstiden för att minska celldödligheten.
7. Mätning av CRISPR-effektiviteten vid den riktade locus av T7 endonuclease-analys
- Designa PCR-primers för att förstärka en 400-700 baspar (bp) region som omfattar CRISPR-klyvningsplatsen.
OBS: Klyvningsplatsen bör vara avlägsen från ampliconkanten med minst 200 bp och bör flyttas något från mitten av amplicon så att vid T7 endonukleas klyvning, 2 fragment av olika storlekar kommer att släppas. - Extrahera genomiskt DNA från celler som behandlats med Nanoblades som riktar sig mot den av intressegenen och från kontrollceller som behandlats med nanoblad programmerade med ett kontrollsgRNA (se materialtabellen).
PROTOKOLLET kan pausas här. - Använd 150 ng genomiskt DNA som mall och programmera en PCR-reaktion på 30 μL volym (slutlig volym) genom att följa tillverkarens protokoll. Kontrollera att PCR-förstärkningen ger en enda amplicon av den förväntade storleken genom att köra en 2% agarosegel fläckad med 5 μg/ml etidiumbromid (eller en säkrare alternativ DNA-gelfläck).
OBS: Använd lämplig skyddsutrustning vid manipulering av etidiumbromid, som misstänks orsaka genetiska defekter. Protokollet kan pausas här. - Heteroduplex generation och matsmältning
- Tillsätt 5 μL av enzymbufferten (medföljer T7 endonukleas I), 20 μL vatten och 24 μL pcr-produkten från steg 7.3 i ett 0,2 mL PCR-rör och 24 μL av PCR-produkten från steg 7.3. Tillåt heteroduplexbildning genom uppvärmning av proverna till 94 °C under 3 minuter och sedan genom att temperaturen (2 °C per min) sjunker till 40 °C.
- Tillsätt 0,5 μL T7-endonukleas I vid rumstemperatur till varje heteroduplexrör, inklusive kontrollen. Inkubera vid 37 °C i 15 min. Ladda den resulterande reaktionen i en 2,5% (vikt/volym) agarosgel fläckad av etidiumbromid. Efter migreringen, avbilda gelén på en UV-transilluminator.
OBS: Använd lämplig skyddsutrustning vid manipulering av etidiumbromid, som misstänks orsaka genetiska defekter. Använd UV-skyddsglasögon när du använder UV-transilluminatorn. - Mät klyvningseffektiviteten genom att analysera bilden som härrör från matsmältningsreaktionen för att kvantifiera intensiteten hos varje band med lämplig programvara (se materialtabellen).
8. Mätning av CRISPR-effektiviteten vid riktad locus by Sanger sekvensering och TIDE-analys
OBS: Som ett alternativ till T7 endonuclease-analysen kan CRISPR-effektiviteten övervakas genom analys och dekonvolution av Sanger-sekvenseringsspår baserade på TIDE-protokollet15.
- Utför Sanger-sekvensering av PCR-ampliconer från steg 7.3 (inkludera ett kontrolltillstånd som motsvarar obehandlade celler) med antingen den främre eller omvända PCR-primern.
- Analysera Sangers sekvenseringsspår av kontrolltillståndet (obehandlade celler) och Nanoblade-behandlade prover med hjälp av TIDE-servern (https://tide.nki.nl) och följ deras analysriktlinjer.
9. Nanoblade komplexbildning med ssODN-givare för homologistyrd reparation (förfarande för transduktion i en 12-brunnsplatta)
OBS: Riktlinjer för design av ssODN för effektiv homologi-riktad reparationsmedierad redigering har beskrivits tidigare16.
- I en 12-brunnsplatta, frö 100.000-200.000 celler per brunn i 1 ml av lämpligt cellodlingsmedium. Låt cellerna fästa på plåtytan före flyttning.
- Förbered 100 μL av en lösning av den katjoniska polymeren (se materialtabellen) vid 8 μg/ml i 1x PBS.
- Blanda 19 μL av den katjoniska polymerlösningen med 100 pmol ssODN-mallen. Tillsätt 20 μL koncentrerade Nanoblad (från steg 3.5.1 eller 4.4) och inkubera i 15 minuter på is.
- Ta bort de komplexa Nanoblades/ssODN från isen och tillsätt 500 μL cellodlingsmedium (vid 37 °C). Ta bort mediet från målcellerna (från steg 9.1) och tillsätt 500 μL medium som innehåller de komplexa Nanoblades/ssODN. Låt cellerna föröka sig i 48 timmar innan de genotypas.
- Extrahera genomiskt DNA från en bråkdel av cellpopulationen med hjälp av ett dedikerat extraktionskit (se tabellen över material).
- Designa PCR-primers för att förstärka en 400-700 bp-region som omfattar knock-in-platsen.
OBS: PCR-primers bör inte överlappa ssODN:s homologiarmar för att undvika falskt positiva resultat till följd av PCR-förstärkningen av eventuella kvarvarande ssODN som fortfarande finns i målcellerna. - Med hjälp av 150 ng genomiska DLAS från kontrollceller (obehandlade) eller Nanoblade-behandlade celler som mall, programmera en 30 μL PCR-reaktion enligt tillverkarens protokoll.
OBS: ssODN spår kan finnas i cellmediet flera dagar efter transduktion med komplexet. Detta ssODN kan fungera som en partiell mall för PCR-analyser som försöker screena för rätt integration. Därför är det lämpligt att passage cellerna minst två gånger efter transduktion, för att undvika eventuella falskt positiva analyser. - Ladda 5 μL av manövern och Nanoblade-behandlade PCR-reaktioner i en 1% (vikt/volym) agarosgel som färgas av etidiumbromid. Efter migreringen, avbilda gelén på en UV-transilluminator.
OBS: Om homologi rekombination är framgångsrik och motsvarar införandet av mer än 1 bp genetiskt material, bör det finnas en skillnad i molekylvikten hos PCR-ampikonerna mellan kontrollen och nanoblad-behandlade provet. Eftersom HDR:s effektivitet inte når 100 % bör två band vara synliga i det Nanoblade-behandlade provet (ett av liknande storlek som den pcr-amplicon som motsvarar den oredigerade allelen och ett med högre molekylvikt motsvarande knock-in-allelen, se figur 3B mittpanel).
- Designa PCR-primers för att förstärka en 400-700 bp-region som omfattar knock-in-platsen.
- Utför Sanger-sekvensering av kontrollen och Nanoblade-behandlade PCR-ampliconer.
- Kvantifiera knock-in-effektiviteten med hjälp av TIDER-protokollet17.
10. Nanoblade leverans in vivo
- Leverera upp till 25 μL koncentrerade Nanoblad från steg 3.5.1 genom retro-orbital injektion eller upp till 100 μL genom svansveninjektion, enligt beskrivningen i18, om du arbetar med möss.
OBS: Alla förfaranden som involverar djurförsök (inklusive Nanoblade-injektioner för genomredigering) kräver ett godkänt protokoll från en lokal etikkommitté. - För generering av transgena möss, använd en mikroinjektor för att leverera från 1 pL till 10 pL koncentrerade Nanoblad från steg 4.4 till det perivitellin utrymmet av musoocyter som beskrivits tidigare18.
OBS: För perivitellininjektion är det viktigt att rena och koncentrera Nanoblades på en sackaroskudde för att undvika igensättning av mikroinjektorn.
Representative Results
Protokollet för Nanoblade-beredning är ganska enkelt och kräver enkel laboratorieutrustning förutom tillgång till en mjukpapperskulturhuv, en CO2-inkubator och en svängande hinkcentrifu eller en ultracentrifuge. Vissa steg kräver dock särskild uppmärksamhet, t.ex. Som visas i figur 1A är det viktigt att så celler så att de fördelas homogent i plattan och når ~ 70-80% sammanflöde på dagen för transfektion (undvik att ha klumpar av celler). Tjugofyra timmar efter transfektion (figur 1B,C) kommer producentceller att bilda syncytia som leder till celler av större storlek med flera kärnor. Fyrtio timmar efter transfektion (figur 1D) kommer de flesta celler i plattan att ha bildat syncytia och börja lossna från plattan.
Detta är helt normalt och orsakas av uttrycket av kuvertet glykoprotein, vilket inducerar fusion mellan närliggande celler. Vid centrifugeringskoncentration (eller till och med direkt från övernatanten av producentceller) kan mängden Cas9 som laddas i Nanoblades kvantifieras på ett absolut sätt genom punktfläck på ett nitrocellulosamembran med rekombinant Cas9 som referens (figur 2). Detta steg är viktigt för att bestämma rätt mängd nanoblad som ska användas för flyttning av målceller. När du utför dot-blot-analysen är det viktigt att endast överväga de avläsningar som faller inom standardkurvans linjära intervall. Oberoende av mängden Cas9 som finns i Nanoblades är det dock viktigt att testa effektiviteten av genomredigering direkt på målceller med hjälp av T7 endonuclease-analysen (figur 3) eller Sanger-sekvensering.
Som visas i figur 3 kan nanobladens effektivitet skilja sig från parti till parti även om den vanligtvis är korrelerad till mängden Cas9. I exemplet som visas i figur 3 leder batchen från körfält 1 till 20 % total redigeringseffektivitet medan batchen från körfält 3 leder till 60 % effektivitet. I det här fallet är det möjligt att öka volymen nanoblad som används från batch 1 för att uppnå en redigeringseffektivitet som liknar den från batch 3. Bild 4 visar den maximala redigeringseffektiviteten som erhålls med hjälp av Nanoblades i olika typer av primärceller. Det är viktigt att notera att effektiviteten kan variera beroende på sekvensen av det sgRNA som används och måltillgängligheten.
Figur 1: Morfologi av producentceller under nanobladeproduktion. (A) HEK293T-celler vid 70-80% sammanflöde 24 h efter plätering. (B och C) HEK293T cellmorfologi 24 h efter transfektion. D) HEK293T cellmorfologi 40 h efter transfektion. Skalningsstaplar = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av Cas9-lastning i nanoblad med punkt (A) Rekombinant Cas9 eller 100x koncentrerad (genom ultracentrifugation) Nanobladeprover (#1, #2 och #3) späds 2-faldigt sekventiellt och upptäcks på ett nitrocellulosamembran innan de inkuberas med anti-Cas9 HRP-kopplade antikroppar. Signalen avslöjas av förbättrad chemiluminescens. B) Chemiluminescenssignalen förvärvas och kvantifieras för rekombinanta Cas9-utspädningar och signalintensitet som plottas mot den kända mängd Cas9 som siktas på nitrocellulosamembranet. En regressionskurva beräknas för de utspädningar som ligger inom det linjära intervallet (se blå kors), exklusive alla koncentrationer som ligger utanför det linjära intervallet (se röda kors). (C) Cas9-koncentrationen (nM) i varje Nanobladepreparat extrapolerades med hjälp av ekvationen från den linjära regression som erhållits i (B). För detta är det viktigt att endast använda den kvantifierade signalen från nanobladesutspädningarna som faller inom regressionskurvans linjära intervall. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Övervakning av redigeringseffektiviteten vid flyttning. (A) T7 endonukleasanalys som mäter klyvningseffektiviteten i nanobladbehandlade celler. Celler transduced med Nanoblades inriktning EMX1 genen analyserades av T7 endonuclease analys. Lane 1: Nanoblade beredningssats #1 (20% klyvningseffektivitet); Bana 2: Kontrollceller; Lane 3: Nanoblade beredningssats #2 (60% klyvningseffektivitet). (B) Knock-in av flaggtag-sekvensen inom den öppna läsramen DDX3 . Koncentrerade Nanoblades programmerade med en sgRNA som riktar sig till DDX3 locus producerades från olika HEK293T kloner (#1, #2) och komplexed med ökande doser av en Flag-DDX3 ssODN mall och de erhållna komplex som används för flyttning av HEK293T målceller. Vid transduktion odlades cellerna i tre dagar innan de samlades in för att extrahera genomiskt DNA och totala proteiner. Flag-DDX3 proteiner var immunoprecipitated med anti-Flag agarose pärlor följt av western-blot analys av de återvunna proteinerna med hjälp av en anti-Flag antikropp (övre panel). Platsstyrd insättning av flaggtaggen i Ddx3-locusen analyserades också av PCR med hjälp av antingen primers som flankerar insättningsplatsen (mittpanelen) eller med hjälp av en framåt primer som känner igen flagg-taggsekvensen och en omvänd primer som är specifik för Ddx3-locus nedströms flagginfogningsplatsen (nedre panelen). Förkortningar: EMX1 = Empty Spiracles Homeobox 1; DDX3 = DEAD-box RNA helicase 3; PCR = polymeraskedjereaktion; ODN = oligodeoxynucleotide; ssODN = sing-strandad ODN; sgRNA = enkelstyrnings-RNA; IP = immunoprecipitation. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Redigeringseffektivitet som uppnås i olika primära celltyper med hjälp av Nanoblades. Förkortningar: PBL = perifer blodlymfocyt; IL = interleukin; CD = differentieringskluster; iPSC = inducerad pluripotent stamcell. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Nanoblad möjliggör snabb och dosberoende leverans av Cas9/sgRNA RNP-komplexet i cellinjer och primärceller. I motsats till klassisk transfektion och andra virala leveransvektorer, men liksom proteinelektroporation, nanoblades har fördelen av övergående leverans av Cas9/sgRNA RNP på ett transgene-fritt sätt. Nanoblades erbjuder en mycket mångsidig, enkel och billig plattform för proteinleverans som enkelt och snabbt kan anpassas till den ständigt växande familjen av CRISPR-varianter. Nanoblad kan produceras i HEK293T-cellinjen eller dess derivat. HEK293T-cellinjer som används här har utvecklats för att maximera retroviral och lentiviral partikelproduktion (se tabellen över material). Även om andra källor till HEK293T-celler kan vara lämpliga, måste användarna dock testa och jämföra HEK293T-celler från olika källor eftersom stora skillnader i partikelproduktion har observerats beroende på HEK293T-cellkällan. Celler måste också kontrolleras för Mycoplasma kontaminering ofta och passages var tredje dag (klassiskt 1/8 utspädning) för att undvika överkonfluens, vilket har en negativ inverkan på partikelproduktionen.
Celler bör inte underhållas i över 20 passager. DMEM kompletteras med glukos, penicillin/streptomycin, glutamin och 10% decomplemented fetala nötkreatur serum användes för cellodling. Eftersom serumursprung kan påverka nanobladpreparatets kvalitet bör olika serumpartier testas före storskalig produktion. Nanoblad kan effektivt produceras i andra medier som RPMI eller serumfria modifieringar av minsta väsentliga medium som kan ersätta DMEM dagen efter transfektion. Som anges nedan, även om medium ersättning efter transfektion med vissa DNA-transfektering reagenser är valfritt, kan det vara fördelaktigt att ändra det medium i vilket VLPs släpps ut, särskilt för att begränsa serumspår i partikelpreparatet. Odling av celler i reducerat serum minimum väsentligt medium dagen före transfection har dock ännu inte försökts.
Som nämnts produceras Nanoblades vid överuttryck av en blandning av plasmider i producentceller. Överuttryck verkar krävas för optimal produktion. Detta laboratorium utvecklade faktiskt en producentcelllinje där Gag-Pol-uttryckskonstruktionen stabiliserades genom antibiotikaval. Detta system kunde dock inte producera betydande mängder nanoblad. En liknande observation gjordes när sgRNA-kodningskonstruktionen var stabilt integrerad i arvsmassan hos producentceller. Som beskrivs för andra partikelproduktionssystem kan en stabil cellinje som uttrycker åtminstone vissa konstruktioner som är involverade i Nanoblades produktion vara användbar. Detta skulle dock säkert kräva bearbetning av stora volymer supernatant och en lämplig teknik för att rena partiklar. I ovanstående protokoll beskrivs det förfarande som föredras för att producera nanoblad som utnyttjar specifika reagenser för transfekt (se materialförteckningen).
Även om transfektreagenser från andra tillverkare också har testats med framgång, följer de allra flesta av denna grupps resultat med Nanoblades proceduren som beskrivs häri. Lågkostnadstransfektering kan uppnås med hjälp av kalciumfosfatreagenser och ge god produktionseffektivitet. Denna metod kräver dock absolut utbyte av transfekteringsmedium dagen efter transfektion och kan lämna kalciumfosfatrester i sedimenterat partikelpreparat. I överensstämmelse med behovet av höga uttrycksnivåer för Nanoblade-komponenter i producentceller är observationen att mängden sgRNAs associerade med Cas9-proteinet kan vara en begränsande faktor för effektiv genomredigering. För att förbättra sgRNA-lastning har två tekniska metoder nyligen utvecklats av oberoende grupper som använder proteinleveransvektorer som liknar Nanoblades. Dessa förlitar sig på användning av T7 polymerasberoende cytoplasmiskt uttryck av sgRNA6 eller genom tillsats av en retroviral inkapslingssignal till sgRNA-sekvensen för att medla bindning till Gag polyprotein6. Dessa metoder kan verkligen förbättra sgRNA-belastningen inom Nanoblades även om de inte har testats ännu.
Transduktion av målceller är ett kritiskt steg i förfarandet. I de flesta odödliga cellinjer har transduktion med Nanoblades liten eller ingen cytopatisk effekt. Men i primärceller kan toxicitet vara ett problem. Transduktionen måste därför optimeras för varje celltyp. Specifikt är exponeringstiden för Nanoblades en viktig faktor att ändra när flyttningsprotokollet optimeras. För känsliga celler som primära nervceller eller benmärgsceller möjliggör 4-6 h inkubation med Nanoblades innan du byter ut mediet effektiv leverans av Cas9-proteinet samtidigt som celltoxiciteten minimeras. Dessutom kan adjuvanser som bland annat katjonpolymerer avsevärt förbättra effektiviteten av transduktion i vissa celler (se materialförteckningen). Det är viktigt att notera att Nanoblades är VLPs och kan inducera ett immunogenic svar. Detta kan vara en begränsning om arbete med vissa typer av primärceller, såsom makrofager eller dendritiska celler, där inkubation med Nanoblades kan inducera viktiga förändringar i genuttryck och cellernas fenotyp. Om makrofager och dendritiska celler härrör från hematopoetiska stamcellsprekursorer (såsom musbensceller), är det att föredra att omföra celler med Nanoblades innan de är helt differentierade för att undvika att inducera ett cellulärt svar mot Nanoblades. Annars kan Cas9 proteinelektroporation utgöra ett genomförbart alternativ när man arbetar med differentierade immunceller.
Nanoblad kan användas in vivo för att omvandla muszygoter eller embryon för att generera transgena djur. I likhet med klassiska retrovirala eller lentivirala vektorer kan de också injiceras direkt i vävnader från vuxna djur. Nanoblad (som liknar retrovirala och lentivirala vektorer) kan dock inaktiveras av värddjurets immunsvar. Därför måste dosen som ska injiceras optimeras för varje applikation. Detta immunsvar kan också begränsa fördelningen av funktionella VLPs till vävnader nära injektionsstället. Slutligen, till skillnad från lentiviral vektorer, nanoblades är transgene-fria och levererar Cas9 inom en begränsad tidsram. Därför kan de inte användas för att utföra genomomfattande funktionella screenings som kräver hög genomströmning sekvensering av sgRNAs vid val av celler. Nanoblad är användbara när snabb, dosberoende och transgenefri genomredigering krävs20. I likhet med proteinelektroporation leder Nanoblades dessutom till färre off-target effekter än långvarigt uttryck av Cas9/sgRNA genom DNA-transfektion eller klassiska virusvektorer3. Framtida utveckling av Nanoblades är inriktad på att införliva Cas9-varianter för olika tekniska applikationer som basredigering och RNA-inriktning.
Disclosures
Philippe E. Mangeot och Emiliano P. Ricci nämns som uppfinnare på ett patent som rör Nanoblades-tekniken (patentsökande: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; ansökningsnummer: WO 2017/068077 Al; patentstatus: offentliggjordes den 27 april 2017; alla aspekter av manuskriptet omfattas av patentansökan. De återstående författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) vid Université de Lyon, inom programmet Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) som drivs av den franska nationella forskningsbyrån (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) och europeiska forskningsrådet (ERC-StG-LS6-805500 till E.P.R.) under Europeiska unionens forskningsprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).
- Mangeot, P. E., et al. Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature Communications. 10 (1), 45 (2019).
- Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases. eLife. 3, 01911 (2014).
- Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).
- Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications. 11, 1334 (2020).
- Indikova, I., Indik, S. Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts. Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).
- Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (17), 99 (2019).
- Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell. 59 (1), 103-112 (1989).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing. Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders. Journal of Visualized Experiments. (140), e57609 (2018).
- Montagna, C., et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).
- Marnef, A., et al. A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair. Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).
