Summary
Nous avons développé un protocole simple et peu coûteux pour charger des complexes ribonucléoprotéiques Cas9/SINGLE-GUIDE ARN (sgRNA) dans des particules de type virus. Ces particules, appelées « Nanolames », permettent une livraison efficace du complexe Cas9/sgRNA dans les cellules immortalisées et primaires ainsi qu’in vivo.
Abstract
Le système CRISPR (Short Palindromic Repeats) -Cas (Regular Interspaced) a démocratisé l’édition du génome dans les cellules eucaryotes et a conduit au développement de nombreuses applications innovantes. Cependant, l’administration de la protéine Cas9 et de l’ARN monoguide (ARNg) dans les cellules cibles peut être techniquement difficile. Les vecteurs viraux classiques, tels que ceux dérivés de lentivirus (LV) ou de virus adéno-associés (AAV), permettent une livraison efficace de transgènes codant pour la protéine Cas9 et son ARNg associé dans de nombreuses cellules primaires et in vivo. Néanmoins, ces vecteurs peuvent souffrir d’inconvénients tels que l’intégration du transgène dans le génome de la cellule cible, une capacité de chargement limitée et l’expression à long terme de la protéine Cas9 et de l’ARN guide dans les cellules cibles.
Pour surmonter certains de ces problèmes, un vecteur d’administration basé sur le virus de la leucémie murine (MLV) a été développé pour emballer la protéine Cas9 et son ARN guide associé en l’absence de tout transgène codant. En fusionnant la protéine Cas9 à la terminaison C de la protéine structurelle Gag de MLV, des particules virales (VLP) chargées de la protéine Cas9 et de l’ARNng (appelées « Nanolames ») ont été formées. Les nanolames peuvent être collectées dans le milieu de culture des cellules productrices, purifiées, quantifiées et utilisées pour transduire les cellules cibles et délivrer le complexe Actif Cas9/SGRNA. Les nanolames délivrent leur cargaison de ribonucléoprotéines (RNP) de manière transitoire et rapide dans un large éventail de cellules primaires et immortalisées et peuvent être programmées pour d’autres applications, telles que l’activation transcriptionnelle transitoire de gènes ciblés, à l’aide de protéines Cas9 modifiées. Les nanolames sont capables d’éditer in vivo le génome dans le foie de souris adultes injectées et dans les ovocytes pour générer des animaux transgéniques. Enfin, ils peuvent être complexés avec de l’ADN de donneur pour une réparation dirigée par homologie « sans transfection ». La préparation de Nanoblade est simple, relativement peu coûteuse et peut être facilement effectuée dans n’importe quel laboratoire de biologie cellulaire.
Introduction
Comparé à d’autres nucléases programmables, le système CRISPR-Cas a considérablement simplifié et démocratisé la procédure de ciblage et de clivage du génome spécifique à la séquence dans les cellules eucaryotes. Grâce à la simple expression d’un ARNg, les utilisateurs peuvent programmer la protéine Cas9 (ou des variantes optimisées) pour presque tous les locus cellulaires1. Dans ce scénario, l’administration de la protéine Cas9 et de l’ARNg devient la principale limitation lors de la mutagénèse dirigée par le site. Dans les cellules immortalisées, l’ARNg et la protéine Cas peuvent être facilement exprimés à partir de plasmides transfectés pour atteindre un ciblage efficace du génome dans la plupart des cellules. Cependant, l’expression constitutive du complexe Cas9/sgRNA peut augmenter l’activité hors cible de la protéine Cas9 et introduire des changements indésirables dans les loci2 non spécifiques. Dans les cellules primaires, la transfection de l’ADN peut être techniquement difficile à réaliser et conduire à une mauvaise expression ou à un faible pourcentage de cellules transfectées. Les alternatives à la transfection classique de l’ADN comprennent l’utilisation de vecteurs viraux qui délivrent un transgène codant pour le Cas9 et l’ARNg ou l’électroporation de la protéine Cas9 recombinante couplée à un ARNg synthétique. Cependant, ces approches peuvent conduire à l’intégration transgénique dans le génome de l’hôte cellulaire (comme c’est le cas pour les vecteurs d’expression rétroviraux et lentiviraux classiques), à la restriction par des facteurs cellulaires et à l’expression constitutive de la protéine Cas9 et de l’ARNg.
L’électroporation du complexe Cas9/sgRNA RNP peut surmonter la plupart de ces problèmes et conduire à une administration efficace et transitoire dans les cellules primaires et in vivo ainsi que permettre une réponse dose-dépendante. Néanmoins, il repose généralement sur des équipements et des réactifs coûteux et est également difficile à mettre à l’échelle si un grand nombre de cellules doivent être traitées. Comme alternative aux techniques mentionnées ci-dessus, ces auteurs ont développé des « Nanoblades » - un vecteur d’administration rétrovirale pour la protéine Cas9 et sgRNA3 qui est conceptuellement similaire à d’autres systèmes d’administration de protéines de capside dérivées du virus4,5,6,7,8. Les nanolames exploitent la capacité naturelle de la polyprotéine Gag des rétrovirus à produire, lorsqu’elles sont exprimées seules dans des cellules cultivées, des VLP qui sont libérés dans le milieu extracellulaire9. En fusionnant la protéine Cas9 à l’extrémité C-terminale de la polyprotéine Gag du virus de la leucémie murine (MLV) et en co-exprimant l’ARNs sg et les glycoprotéines de l’enveloppe virale, la protéine Cas9 peut être encapsidée dans des VLP ou des nanolames libérés. Lors de la purification, les Nanoblades peuvent être incubées avec des cellules cibles ou injectées in vivo pour assurer l’administration rapide, transitoire et dose-dépendante du complexe Cas9/sgRNA RNP3.
Les nanolames peuvent être programmées avec plusieurs sgRNA pour une édition simultanée à différents loci ou avec des variantes Cas9 pour effectuer d’autres applications telles que l’activation ou la répression transcriptionnelle spécifique à la cible3. Contrairement à l’électroporation des protéines, qui repose sur l’expression recombinante, les variantes Cas nouvellement décrites dans la littérature peuvent être facilement clonées dans le vecteur d’expression de fusion Gag, ce qui en fait une plate-forme polyvalente. Les nanolames peuvent être complexées ou chargées d’oligodésoxynucléotides simple brin et double brin (ssODN) pour effectuer une réparation dirigée par homologie3. La production de Nanoblade est relativement simple et bon marché. De plus, les Nanoblades peuvent être stockées à 4 °C pendant plusieurs jours ou à -80 °C pour un stockage à long terme. En règle générale, les Nanoblades interviennent dans l’édition efficace et sans transgène du génome dans la plupart des cellules immortalisées et de culture primaire. Cependant, certaines cellules primaires peuvent être sensibles à la présence de particules virales, ce qui entraîne une augmentation de la mortalité. Les cellules du système immunitaire inné peuvent également réagir à la présence de Nanolames (en raison de leur origine virale) et s’activer. Dans ces cas, le protocole de transduction doit être optimisé pour limiter le temps d’exposition aux Nanoblades et minimiser les effets non spécifiques. Les nanolames représentent une alternative viable et facile à mettre en œuvre aux autres méthodes d’administration CRISPR disponibles.
Protocol
1. Conception et clonage de l’ARNng
REMARQUE: Les directives pour la conception des sgRNA peuvent être obtenues auprès de plusieurs sources telles que https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing ou de Hanna et Doench10.
- Une fois que les 20 séquences d’ARNng nucléotidiques ont été conçues, ordonnez les oligonucléotides d’ADN simple brin suivants :
- En avant : 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N correspond au locus ciblé sans la séquence PAM (protospacer-adjacent motif)
- Inverse : 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNc 3' (N correspond au complément inverse du locus ciblé sans la séquence PAM)
REMARQUE: Aucune modification particulière n’est requise lors de la commande des oligonucléotides (pas besoin de phosphate 5').
- Hybrider les deux oligonucléotides d’ADN dans un tube de réaction en chaîne par polymérase (PCR) de 0,2 mL en mélangeant 5 μL de tampon de recuit (500 mM de NaCl; 100 mM de Tris-HCl; 100 mM de MgCl2; 10 mM de TNT; pH 7,9 à 25 °C), 1 μL de chaque oligonucléotide d’ADN (solution mère de 100 μM dans l’eau) et 42 μL d’eau.
- Sur un bloc PCR, incuber les échantillons à 95 °C pendant 15 s, puis diminuer la température à 20 °C avec une rampe de 0,5 °C/s. Conserver à température ambiante ou conserver à -20 °C.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. - Digérer 10 μg des plasmides d’expression de l’ARNs SGELI BLADE ou SUPERBLADE avec 10 unités d’enzyme de restriction BsmBI-v2 pendant 3 h à 55 °C dans un volume de réaction total de 50 μL.
REMARQUE: Le vecteur digéré doit libérer un insert d’ADN de ~ 1,9 kb et un deuxième fragment d’ADN de ~ 3,3 kb. - Chargez la réaction de restriction sur un gel d’agarose à 1% coloré avec 5 μg / mL de bromure d’éthidium (ou une coloration de gel d’ADN alternative plus sûre).
REMARQUE: Portez un équipement de protection approprié lorsque vous manipulez du bromure d’éthidium, soupçonné de causer des défauts génétiques.- Sur une table ultraviolette (UV) fixée à une longueur d’onde de 312 nm (pour éviter d’endommager l’ADN), coupez le fragment d’ADN de 3,3 kb du gel et placez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
REMARQUE: Portez un équipement de protection approprié (gants et lunettes de protection UV) lorsque vous manipulez du bromure d’éthidium et travaillez sur la table UV. - Extraire l’ADN du gel tranché contenant le fragment d’ADN de 3,3 kb à l’aide d’un kit d’extraction de gel ADN dédié (voir la Table des matériaux). Quantifiez la quantité d’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
- Sur une table ultraviolette (UV) fixée à une longueur d’onde de 312 nm (pour éviter d’endommager l’ADN), coupez le fragment d’ADN de 3,3 kb du gel et placez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Ligaturer les oligonucléotides d’ADN hybrides avant et arrière de l’étape 1.2 vers le vecteur BLADES ou SUPERBLADE digéré par BsmB1, purifié en gel ou SUPERBLADE à partir de l’étape 1.5.2. Pour cela, ajoutez 2 μL de tampon d’ADN ligase T4, 50 ng du vecteur purifié en gel (à partir de l’étape 1.5.2), 1 μL des oligonucléotides d’ADN hybridés (à partir de l’étape 1.2), de l’eau pour composer le volume à 19 μL et 1 μL d’ADN ligase T4. Incuber la réaction à 25 °C pendant 10 min.
- Transformez le produit de ligature en bactéries compétentes (voir le tableau des matériaux) comme décrit au point 11. Plaquer les bactéries transformées sur une plaque de gélose ampicilline Luria Bertani et incuber pendant la nuit à 37 °C.
- Sélectionnez plusieurs colonies isolées sur la plaque de gélose pour effectuer la minipréparation de l’ADN11 (voir la table des matériaux) et effectuez le séquençage de Sanger à l’aide d’une amorce avant U6 (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') pour vérifier la ligature correcte de la séquence variable sgRNA.
REMARQUE: D’autres plasmides d’expression de l’ARNg peuvent être utilisés s’ils ne codent pas pour la protéine Cas9, ce qui pourrait interférer avec la production de Nanoblade.
2. Préparation plasmidique
- Effectuer une préparation maximale (voir le tableau des matériaux) de tous les plasmides requis et préparer des aliquotes de 10 μg à 1 μg/mL à conserver à -20 °C. Éviter les cycles répétés de congélation/décongélation des plasmides; utilisez des aliquotes deux fois avant de les jeter.
3. Préparation de Nanoblade
- Le jour 1, semer entre 3,5 et 4 × 106 cellules HEK293T (voir la Table des matériaux) dans 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant un taux élevé de glucose, du pyruvate de sodium, de la L-glutamine, du sérum fœtal bovin (FBS) à 10 % et de la pénicilline/streptomycine dans un plat de culture cellulaire de 10 cm. Déplacez doucement la plaque de 10 cm vers l’arrière et vers l’avant, puis de droite à gauche (répétez cette séquence 5x) pour répartir les cellules de manière homogène sur la boîte de culture. Incuber des cellules à 37 °C dans un incubateur cellulaire avec 5% de CO2.
REMARQUE: Toutes les procédures liées à la manipulation des cellules cultivées et des nanolames doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire de culture cellulaire pour éviter leur contamination. - Jour 2 : Transfection des plasmides
- Les cellules doivent être confluentes à 70-80 % 24 h après le placage (Figure 1A). Remplacer le milieu par 10 mL de DMEM frais contenant un taux élevé de glucose, de pyruvate de sodium, de L-glutamine, de FBS à 10 % (la pénicilline et la streptomycine peuvent être omises bien que ce ne soit pas obligatoire) avant la transfection.
REMARQUE: À cette étape, il est important que les cellules ne soient pas confluentes. Sinon, l’efficacité de la transfection ainsi que la production de particules pourraient être réduites. - Pour chaque plaque de 10 cm, préparer les quantités suivantes de plasmides dans un tube de 1,5 mL : 0,3 μg de pCMV-VSV-G, 0,7 μg de pBaEVRless, 2,7 μg de MLV Gag/Pol, 1,7 μg de BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg de plasmide BLADES ou SUPERBLADES codant pour l’ARNg cloné (ou 2,2 μg chacun si vous utilisez deux sgRNA).
- Ajouter 500 μL de tampon de transfection (voir le tableau des matériaux), vortex pendant 10 s, puis centrifuger pendant 1 s. Ajouter 20 μL du réactif de transfection (voir le tableau des matériaux), vortexer le tube pendant 1 s, puis centrifuger pendant 1 s.
- Incuber pendant 10 min à température ambiante et ajouter la solution entière goutte à goutte aux cellules en milieu DMEM à l’aide d’un pipetteur P1000. Déplacez doucement la plaque de 10 cm vers l’arrière et vers l’avant, puis de droite à gauche (répétez cette séquence 5x) pour répartir uniformément le réactif de transfection sur les cellules. Incuber des cellules à 37 °C pendant au moins 40 h dans un incubateur cellulaire contenant 5 % de CO2.
REMARQUE: Si vous le souhaitez, le milieu peut être changé 4 h après la transfection.
- Les cellules doivent être confluentes à 70-80 % 24 h après le placage (Figure 1A). Remplacer le milieu par 10 mL de DMEM frais contenant un taux élevé de glucose, de pyruvate de sodium, de L-glutamine, de FBS à 10 % (la pénicilline et la streptomycine peuvent être omises bien que ce ne soit pas obligatoire) avant la transfection.
- Le jour 3, vérifiez la morphologie des cellules transfectées au microscope.
REMARQUE: Les cellules de producteur commenceront à fusionner. Il s’agit d’un phénomène normal dû à l’expression d’enveloppes virales fusogéniques (Figure 1B,C). - Jour 4 : Récolte des nanolames
REMARQUE: Au moins 40 heures après la transfection, les cellules auraient fusionné en raison de l’expression des enveloppes virales fusogéniques, et parfois, les cellules sont complètement détachées du support de la plaque (Figure 1D).- Recueillir 9 mL du surnageant du milieu de culture à l’aide d’une pipette de 10 mL.
REMARQUE: Les nanolames sont des VLP capables de délivrer la protéine Cas9 et son sgRNA associé dans les cellules primaires et in vivo. Bien qu’ils ne soient pas considérés comme des organismes génétiquement modifiés car ils sont dépourvus de matériel génétique, ils peuvent induire des changements génétiques. Par conséquent, ils doivent être manipulés avec prudence pour éviter tout contact avec les utilisateurs (surtout s’ils sont programmés pour cibler les gènes suppresseurs de tumeurs). Il est conseillé aux utilisateurs de suivre leurs directives de sécurité locales pour la manipulation de vecteurs rétroviraux et de travailler dans un laboratoire de niveau BSL-2 lors de la préparation des VLP et de la réalisation d’expériences de transduction. Les nanolames peuvent être inactivées avec 70% d’éthanol ou 0,5% d’hypochlorite de sodium. Il est également conseillé de traiter tous les déchets plastiques (embouts de pipette, plaques de culture tissulaire, tubes de centrifugation) avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant au moins 10 min pour inactiver les Nanoblades. - Centrifuger le surnageant collecté à 500 × g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires et récupérer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
REMARQUE: Si les nanolames sont destinées à être utilisées sur des cellules primaires, filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 μm ou 0,8 μm. Sachez que cette étape réduit considérablement le titre Nanoblade car une fraction importante sera bloquée dans la membrane filtrante. - Abattez les Nanoblades pendant la nuit (12-16 h) dans un rotor à godet oscillant à 4 300 × g ou à 209 490 × g dans une ultracentrifugeuse pendant 75 min à 4 °C (voir le Tableau des matériaux).
REMARQUE: Si les cellules cibles peuvent se développer dans le DMEM, il est possible de les incuber directement avec le surnageant obtenu après l’étape 3.4.2 sans concentrer les Nanoblades.
- Recueillir 9 mL du surnageant du milieu de culture à l’aide d’une pipette de 10 mL.
- Jour 5 : Remise en suspension et stockage des Nanoblades
- Après centrifugation, aspirer lentement le milieu et remettre en suspension la pastille blanche avec 100 μL de solution saline froide 1x tamponnée au phosphate (PBS). Couvrir le tube avec un parafilm et incuber pendant 1 h à 4 °C avec une agitation douce avant de remettre la pastille en repoussant par pipetage de haut en bas.
REMARQUE: Un matériau visqueux blanc peut apparaître lors de la remise en pension; ceci est normal et n’affecte pas de manière significative l’efficacité de la transduction. - Conservez les Nanoblades à 4 °C si vous prévoyez de les utiliser dans les quatre semaines. Sinon, congelez les Nanoblades dans de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C.
REMARQUE: Portez des lunettes de protection et des gants cryogéniques lorsque vous manipulez de l’azote liquide. La congélation instantanée et le stockage à -80 °C entraînent une diminution significative de l’efficacité de Nanoblade. De plus, les Nanolames décongelées ne doivent pas être congelées à nouveau. Le protocole peut être mis en pause ici.
- Après centrifugation, aspirer lentement le milieu et remettre en suspension la pastille blanche avec 100 μL de solution saline froide 1x tamponnée au phosphate (PBS). Couvrir le tube avec un parafilm et incuber pendant 1 h à 4 °C avec une agitation douce avant de remettre la pastille en repoussant par pipetage de haut en bas.
4. Concentration de Nanoblades sur un coussin de saccharose
REMARQUE: Comme alternative à la centrifugation de nuit ou à l’ultracentrifugation (étape 3.4.3), les Nanoblades peuvent être concentrées sur un coussin de saccharose. Cela donne une fraction plus pure de Nanoblades, bien que la quantité totale récupérée soit inférieure.
- Préparez une solution de saccharose à 10 % (poids par volume) dans 1x PBS et filtrez-la à travers un filtre à seringue de 0,2 μm (voir la Table des matériaux).
- Commencez le processus de concentration des Nanoblades sur le coussin de saccharose.
- Placer 9 mL d’échantillon contenant du VLP (de l’étape 3.4.3) dans un tube ultracentrifuge (voir la table des matériaux). À l’aide d’une seringue et d’une canule de 3 mL, superposer lentement 2,5 mL de saccharose à 10 % sous l’échantillon, en essayant de ne pas mélanger l’échantillon contenant du VLP et la solution de saccharose.
- Alternativement, placez 2,5 mL de saccharose à 10% dans un tube ultracentrifuge (voir le Tableau des matériaux). Inclinez le tube et ajoutez lentement les 9 mL d’échantillon contenant du VLP (à partir de l’étape 3.4.3) avec un pipetteur à basse vitesse. Au cours de cette opération, soulevez progressivement le tube en position verticale.
- Centrifuger les échantillons à 209 490 × g dans une ultracentrifugeuse pendant 90 min à 4 °C.
REMARQUE: Cette technique peut être adaptée pour la centrifugation à basse vitesse (4 300 × g) pendant la nuit, comme décrit au point 12. - Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant et placez le tube à l’envers sur du papier de soie pour éliminer tout liquide restant. Après 1 min, ajouter 100 μL de 1x PBS et placer le tube à 4 °C avec un couvercle de parafilm dans un porte-tube sur une table d’agitation pendant 1 h (voir la table des matériaux) avant de remettre la pastille en recourant de haut en bas.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
5. Surveillance du chargement de Cas9 dans Nanoblades par dot-blot
- Préparer le tampon de dilution en ajoutant 1 volume de tampon de lyse contenant un tensioactif non ionique (voir le tableau des matériaux) dans 4 volumes de 1x PBS. Diluer brièvement 2 μL de Nanolames concentrées dans 50 μL de tampon de dilution, vortex, et transférer 25 μL de ce mélange dans un nouveau tube contenant 25 μL de tampon de dilution. Répétez cette opération pour avoir 4 tubes de dilutions Nanoblade (2 étapes de dilution).
- Pour les témoins standard, diluer brièvement 2 μL de nucléase Cas9 recombinante (voir le tableau des matériaux) en 50 μL de tampon de dilution, vortex brièvement, et procéder à huit dilutions en série (dilution 2 fois pour chaque étape).
- Repérez soigneusement 2,5 μL de chaque dilution VLP et 2,5 μL de chaque étalon sur une membrane de nitrocellulose avec un pipet multicanal (un volume plus important peut entraîner des taches qui se chevauchent).
REMARQUE: Une membrane de polyvinyldifluorure traitée au méthanol peut également être utilisée. - Une fois les particules absorbées sur la membrane, bloquez la membrane avec 1 solution saline tamponnée Tris contenant un tensioactif non ionique (TBS-T) complété par du lait sec non gras (5% p/v) pendant 45 min à température ambiante.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici, et la membrane stockée à 4 ° C dans 1x TBS-T. - Jeter le 1x TBST complété par du lait sec non gras et incuber la membrane pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps cas9-raifort peroxydase (dilution 1/1000 dans 1x TBST, 5% de lait). Lavez la membrane 3x avec TBS-T et visualisez le signal à l’aide d’un kit de substrat chimiluminescent amélioré.
- Quantifiez l’intensité des points pour les Nanoblades et les dilutions standard Cas9 recombinantes à l’aide du logiciel propriétaire fourni avec la station d’imagerie sur gel ou imageJ13. Définissez une courbe linéaire reliant l’intensité des points à la concentration cas9. En utilisant la fonction de la courbe obtenue, extrapoler la teneur en Cas9 dans chaque préparation.
REMARQUE : La quantité de protéine cas9 recombinante témoin peut saturer la lecture pour les échantillons les plus concentrés de l’ensemble de dilution standard (Figure 2). Il est donc conseillé, lors de la définition de la courbe linéaire, de retirer la lecture des échantillons non dilués (et parfois celle des premières étapes de dilution) s’ils ne se situent pas dans la plage linéaire par rapport à la concentration connue de Cas9 qui a été repérée. De même, lorsque vous extrapolez la quantité de Cas9 dans les échantillons Nanoblade, n’utilisez que les lectures qui se trouvent dans la plage linéaire de la courbe standard.
6. Transduction des cellules cibles avec des Nanoblades (procédure de transduction dans une plaque de 12 puits)
- Dans une plaque de 12 puits, ensemencez 100 000 à 200 000 cellules (primaires ou immortalisées adhérentes) par puits dans 1 mL du milieu de culture cellulaire approprié. Laissez les cellules adhérer à la surface de la plaque avant la transduction.
- Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, ajouter 5 à 20 μL de Nanolames concentrées (de l’étape 3.5.1 ou 4.4) à 500 μL de milieu de culture cellulaire et mélanger en pipetant de haut en bas avec un pipeteur P1000. Retirez le milieu des cellules et remplacez-le par les 500 μL de ce mélange Nanoblade.
REMARQUE : La transduction doit être optimisée pour chaque type de cellule. Il est important d’utiliser le plus petit volume possible de milieu (tout en évitant le séchage des cellules cibles) afin que les Nanolames restent très concentrées. Les cellules adhérentes doivent être transduites directement lorsqu’elles sont attachées à la plaque (ne transduisez pas en suspension car cela réduira considérablement l’efficacité de la transduction). Certaines cellules tolèrent une exposition prolongée aux Nanoblades (24-48 h) tandis que d’autres sont très sensibles et peuvent former de petites syncyties. Dans ce cas, les Nanoblades doivent être incubées avec des cellules uniquement pendant 4-6 h avant de remplacer le milieu. La spinoculation14 peut également améliorer la transduction des cellules cultivées en suspension. Les adjuvants tels que les polymères cationiques (voir le Tableau des matériaux) peuvent également améliorer l’efficacité de la transduction dans certains types de cellules. - Après 4 à 6 heures d’incubation cellulaire dans un faible volume de milieu contenant des nanolames, augmentez le volume du milieu à la quantité normale (1 mL si vous travaillez avec une plaque de 12 puits) ou remplacez-le par un milieu frais si les cellules sont sensibles aux VLP.
REMARQUE: Le milieu cellulaire contenant des Nanoblades doit être inactivé avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 10 minutes avant de le jeter. Utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous manipulez de l’hypochlorite de sodium. Si les nanolames induisent la mort cellulaire, adaptez la quantité et le temps total d’exposition pour réduire la mortalité cellulaire.
7. Mesure de l’efficacité CRISPR au locus ciblé par le dosage de l’endonucléase T7
- Concevez des amorces PCR pour amplifier une région de paires de bases (pb) de 400 à 700 englobant le site de clivage CRISPR.
REMARQUE: Le site de clivage doit être éloigné du bord de l’amplicon d’au moins 200 pb et doit être légèrement décalé du centre de l’amplicon de sorte que lors du clivage de l’endonucléase T7, 2 fragments de tailles différentes soient libérés. - Extraire l’ADN génomique de cellules traitées avec des Nanoblades ciblant le gène d’intérêt et de cellules de contrôle traitées avec des Nanoblades programmées avec un sgRNA de contrôle (voir la Table des Matériaux).
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. - En utilisant 150 ng d’ADN génomique comme modèle, programmez une réaction PCR de 30 μL de volume (volume final) en suivant le protocole du fabricant. Vérifiez que l’amplification PCR donne un seul amplicon de la taille attendue en exécutant un gel d’agarose à 2% coloré avec 5 μg / mL de bromure d’éthidium (ou une coloration de gel d’ADN alternative plus sûre).
REMARQUE: Portez un équipement de protection approprié lorsque vous manipulez du bromure d’éthidium, soupçonné de causer des défauts génétiques. Le protocole peut être mis en pause ici. - Génération et digestion hétéroduplex
- Dans un tube PCR de 0,2 mL, ajouter 5 μL du tampon enzymatique (fourni avec l’endonucléase T7 I), 20 μL d’eau et 24 μL du produit PCR de l’étape 7.3. Permettre la formation d’hétéroduplexes en chauffant les échantillons à 94 °C pendant 3 min, puis en diminuant la température (2 °C par min) pour atteindre 40 °C.
- Ajouter 0,5 μL de T7-endonucléase I à température ambiante à chaque tube hétéroduplex, y compris le témoin. Incuber à 37 °C pendant 15 min. Chargez la réaction résultante dans un gel d’agarose à 2,5 % (poids/volume) coloré par du bromure d’éthidium. Après la migration, imagez le gel sur un transilluminateur UV.
REMARQUE: Portez un équipement de protection approprié lorsque vous manipulez du bromure d’éthidium, soupçonné de causer des défauts génétiques. Utilisez des lunettes de protection UV lorsque vous utilisez le transilluminateur UV. - Mesurer l’efficacité du clivage en analysant l’image résultant de la réaction de digestion pour quantifier l’intensité de chaque bande avec un logiciel approprié (voir le Tableau des matériaux).
8. Mesure de l’efficacité CRISPR au locus ciblé par séquençage sanger et analyse TIDE
REMARQUE: Comme alternative au test d’endonucléase T7, l’efficacité de CRISPR peut être surveillée par l’analyse et la déconvolution des traces de séquençage de Sanger basées sur le protocole TIDE15.
- Effectuer le séquençage Sanger des amplicons PCR à partir de l’étape 7.3 (inclure une condition de contrôle correspondant aux cellules non traitées) à l’aide de l’amorce PCR avant ou inverse.
- Analyser les traces de séquençage Sanger de l’état de contrôle (cellules non traitées) et les échantillons traités par Nanoblade à l’aide du serveur TIDE (https://tide.nki.nl) et en suivant leurs directives d’analyse.
9. Formation de complexes nanolames avec des donneurs de ssODN pour la réparation dirigée par homologie (procédure de transduction dans une plaque de 12 puits)
REMARQUE: Des lignes directrices pour la conception de ssODN pour une édition efficace médiée par réparation dirigée par homologie ont été décrites précédemment16.
- Dans une plaque de 12 puits, ensemencez 100 000 à 200 000 cellules par puits dans 1 mL du milieu de culture cellulaire approprié. Laissez les cellules adhérer à la surface de la plaque avant la transduction.
- Préparer 100 μL d’une solution du polymère cationique (voir la table des matériaux) à 8 μg/mL dans 1x PBS.
- Mélanger 19 μL de la solution de polymère cationique avec 100 pmol du gabarit ssODN. Ajouter 20 μL de Nanolames concentrées (à partir de l’étape 3.5.1 ou 4.4) et incuber pendant 15 min sur de la glace.
- Retirer les Nanoblades/ssODN complexés de la glace et ajouter 500 μL de milieu de culture cellulaire (à 37 °C). Retirez le milieu des cellules cibles (à partir de l’étape 9.1) et ajoutez les 500 μL de milieu contenant les Nanolames/ssODN complexées. Laissez les cellules proliférer pendant 48 h avant le génotypage.
- Extraire l’ADN génomique d’une fraction de la population cellulaire à l’aide d’un kit d’extraction dédié (voir le Tableau des matériaux).
- Concevez des amorces PCR pour amplifier une région de 400 à 700 pb englobant le site d’inction.
REMARQUE: Les amorces de PCR ne doivent pas chevaucher les bras d’homologie du ssODN pour éviter les résultats faussement positifs résultant de l’amplification par PCR de tout ssODN résiduel encore présent dans les cellules cibles. - En utilisant 150 ng d’ADN génomiques provenant de cellules témoins (non traitées) ou de cellules traitées par Nanoblade comme modèle, programmez une réaction PCR de 30 μL en suivant le protocole du fabricant.
REMARQUE: des traces de ssODN peuvent être présentes dans le milieu cellulaire plusieurs jours après la transduction avec le complexe. Ce ssODN peut servir de modèle partiel pour les tests PCR qui tentent de dépister l’intégration correcte. Par conséquent, il est conseillé de passer les cellules au moins deux fois après la transduction, afin d’éviter d’éventuels essais faussement positifs. - Chargez 5 μL des réactions PCR témoins et traitées par Nanoblade dans un gel d’agarose à 1% (poids/volume) coloré par du bromure d’éthidium. Après la migration, imagez le gel sur un transilluminateur UV.
REMARQUE: Si la recombinaison homologique est réussie et correspond à l’insertion de plus de 1 pb de matériel génétique, il devrait y avoir une différence de poids moléculaire des amplicons PCR entre le témoin et l’échantillon traité par Nanoblade. Comme l’efficacité du HDR n’atteint pas 100 %, deux bandes doivent être visibles dans l’échantillon traité par Nanoblade (l’une de taille similaire à l’amplicon PCR de contrôle correspondant à l’allèle non édité et l’autre de poids moléculaire plus élevé correspondant à l’allèle knock-in, voir le panneau central de la figure 3B).
- Concevez des amorces PCR pour amplifier une région de 400 à 700 pb englobant le site d’inction.
- Effectuer le séquençage Sanger des amplicons DE CONTRÔLE et de PCR traités par Nanoblade.
- Quantifiez l’efficacité de l’entraînement à l’aide du protocole TIDER17.
10. Livraison de Nanoblade in vivo
- Délivrer jusqu’à 25 μL de Nanolames concentrées à partir de l’étape 3.5.1 par injection rétro-orbitale ou jusqu’à 100 μL par injection de veine caudale, comme décrit en 18, si vous travaillez avec des souris.
REMARQUE: Toutes les procédures impliquant l’expérimentation animale (y compris les injections de Nanoblade à des fins d’édition du génome) nécessitent un protocole approuvé par un comité d’éthique local. - Pour la génération de souris transgéniques, utilisez un micro-injecteur pour délivrer de 1 pL à 10 pL de Nanoblades concentrées à partir de l’étape 4.4 dans l’espace périvitelline des ovocytes de souris comme décrit précédemment18.
REMARQUE: Pour l’injection de périvitelline, il est essentiel de purifier et de concentrer les Nanoblades sur un coussin de saccharose pour éviter le colmatage du micro-injecteur.
Representative Results
Le protocole de préparation de Nanoblade est assez simple et nécessite un équipement de laboratoire simple en plus de l’accès à une hotte de culture tissulaire, un incubateur à CO2 et une centrifugeuse à godet oscillant ou une ultracentrifugeuse. Cependant, certaines étapes nécessitent une attention particulière telles que la source et la manipulation des cellules productrices, ainsi que les conditions de transduction. Comme le montre la figure 1A, il est important d’ensemencer les cellules afin qu’elles soient réparties de manière homogène dans la plaque et atteignent environ 70 à 80% de confluence le jour de la transfection (évitez d’avoir des amas de cellules). Vingt-quatre heures après la transfection (Figure 1B, C), les cellules productrices formeront une syncytie conduisant à des cellules de plus grande taille avec plusieurs noyaux. Quarante heures après la transfection (Figure 1D), la plupart des cellules de la plaque auront formé une syncytie et commenceront à se détacher de la plaque.
Ceci est parfaitement normal et est causé par l’expression de la glycoprotéine d’enveloppe, qui induit la fusion entre les cellules voisines. Lors de la concentration par centrifugation (ou même directement à partir du surnageant des cellules productrices), la quantité de Cas9 chargée dans les Nanoblades peut être quantifiée de manière absolue par transfert de points sur une membrane de nitrocellulose en utilisant cas9 recombinant comme référence (Figure 2). Cette étape est importante pour déterminer la quantité correcte de Nanolames à utiliser pour la transduction des cellules cibles. Lors de l’exécution du test point-blot, il est important de ne prendre en compte que les lectures qui se situent dans la plage linéaire de la courbe standard. Cependant, indépendamment de la quantité de Cas9 présente dans les Nanoblades, il est essentiel de tester l’efficacité de l’édition du génome directement sur les cellules cibles en utilisant le test de l’endonucléase T7 (Figure 3) ou le séquençage de Sanger.
Comme le montre la figure 3, l’efficacité des Nanoblades peut différer d’un lot à l’autre, bien qu’elle soit généralement corrélée à la quantité de Cas9. Dans l’exemple illustré à la figure 3, le lot de la voie 1 conduit à une efficacité d’édition globale de 20 % tandis que le lot de la voie 3 conduit à une efficacité de 60 %. Dans ce cas, il est possible d’augmenter le volume de Nanoblades utilisées à partir du lot 1 pour obtenir une efficacité d’édition similaire à celle du lot 3. La figure 4 montre l’efficacité d’édition maximale obtenue à l’aide de Nanoblades dans différents types de cellules primaires. Il est important de noter que l’efficacité peut varier en fonction de la séquence de l’ARNg utilisé et de l’accessibilité de la cible.
Figure 1 : Morphologie des cellules productrices lors de la production de Nanoblade. (A) Cellules HEK293T à 70-80% de confluence 24 h après le placage. (B et C) Morphologie des cellules HEK293T 24 h après la transfection. (D) Morphologie des cellules HEK293T 40 h après la transfection. Barres d’échelle = 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Quantification de la charge en Cas9 dans les Nanoblades par dot-blot. (A) Les échantillons de Nanoblade recombinants Cas9 ou 100x concentrés (par ultracentrifugation) (#1, #2 et #3) sont dilués 2 fois séquentiellement et repérés sur une membrane de nitrocellulose avant d’être inculés avec des anticorps couplés hrP anti-Cas9. Le signal est révélé par une chimiluminescence accrue. (B) Le signal de chimiluminescence est acquis et quantifié pour les dilutions cas9 recombinantes et l’intensité du signal tracée par rapport à la quantité connue de Cas9 repérée sur la membrane de nitrocellulose. Une courbe de régression est calculée pour les dilutions qui se trouvent dans la plage linéaire (voir croix bleues), à l’exclusion de toutes les concentrations qui se trouvent en dehors de la plage linéaire (voir croix rouges). (C) La concentration de Cas9 (nM) dans chaque préparation de Nanoblade a été extrapolée à l’aide de l’équation de la régression linéaire obtenue en (B). Pour cela, il est important de n’utiliser que le signal quantifié des dilutions Nanoblade qui se situent dans la plage linéaire de la courbe de régression. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Surveillance de l’efficacité de l’édition lors de la transduction. (A) Dosage de l’endonucléase T7 mesurant l’efficacité du clivage dans les cellules traitées par Nanoblade. Les cellules transduites avec des Nanoblades ciblant le gène EMX1 ont été analysées par dosage de l’endonucléase T7. Voie 1 : Lot de préparation nanolames #1 (efficacité de clivage de 20 %); Voie 2 : Cellules de contrôle; Voie 3 : Lot de préparation nanolames #2 (efficacité de clivage de 60 %). (B) Knock-in de la séquence Flag-tag dans le cadre de lecture ouvert DDX3. Des nanolames concentrées programmées avec un sgRNA ciblant le locus DDX3 ont été produites à partir de différents clones HEK293T (#1, #2) et complexées avec des doses croissantes d’un modèle ssODN Flag-DDX3 et les complexes obtenus utilisés pour la transduction des cellules cibles HEK293T. Lors de la transduction, les cellules ont été cultivées pendant trois jours avant de les collecter pour extraire l’ADN génomique et les protéines totales. Les protéines Flag-DDX3 ont été immunoprécipitées à l’aide de billes d’agarose anti-Flag, suivies d’une analyse par transfert western des protéines récupérées à l’aide d’un anticorps anti-Flag (panneau supérieur). L’insertion dirigée par site de la balise Flag dans le locus Ddx3 a également été testée par PCR à l’aide soit d’amorces flanquant le site d’insertion (panneau central), soit à l’aide d’une amorce avant qui reconnaît la séquence Flag-tag et d’une amorce inverse spécifique au locus Ddx3 en aval du site d’insertion Flag (panneau inférieur). Abréviations: EMX1 = Empty Spiracles Homeobox 1; DDX3 = hélicase d’ARN en boîte morte 3; PCR = réaction en chaîne par polymérase; ODN = oligodésoxynucléotide; ssODN = ODN briné; SGRNA = ARN monoguide; IP = immunoprécipitation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Efficacité d’édition obtenue dans différents types de cellules primaires à l’aide de Nanoblades. Abréviations: PBL = lymphocyte du sang périphérique; IL = interleukine; CD = groupe de différenciation; iPSC = cellule souche pluripotente induite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Les nanolames permettent une administration rapide et dose-dépendante du complexe Cas9/sgRNA RNP dans les lignées cellulaires et les cellules primaires. Contrairement à la transfection classique et à d’autres vecteurs d’administration virale, mais comme l’électroporation des protéines, les nanolames ont l’avantage d’administrer transitoirement le RNP Cas9 / sgRNA d’une manière sans transgène. Les nanolames offrent une plate-forme très polyvalente, simple et peu coûteuse pour l’administration de protéines qui peut être facilement et rapidement adaptée à la famille sans cesse croissante de variantes CRISPR. Les nanolames peuvent être produites dans la lignée cellulaire HEK293T ou ses dérivés. Les lignées cellulaires HEK293T utilisées ici ont été développées pour maximiser la production de particules rétrovirales et lentivirales (voir le Tableau des matériaux). Cependant, bien que d’autres sources de cellules HEK293T puissent convenir, les utilisateurs doivent tester et comparer les cellules HEK293T de différentes sources, car des différences majeures dans la production de particules ont été observées en fonction de la source cellulaire HEK293T. Les cellules doivent également être vérifiées fréquemment pour la contamination par les mycoplasmes et passées tous les trois jours (dilution classique 1/8) pour éviter la surconfluence, qui a un impact négatif sur la production de particules.
Les cellules ne doivent pas être maintenues pendant plus de 20 passages. Le DMEM complété par du glucose, de la pénicilline/streptomycine, de la glutamine et du sérum bovin fœtal décompilé à 10 % a été utilisé pour la culture cellulaire. Comme l’origine du sérum peut affecter la qualité de la préparation Nanoblade, différents lots de sérum doivent être testés avant la production à grande échelle. Les nanolames peuvent être produites efficacement dans d’autres milieux tels que le RPMI ou des modifications sans sérum d’un milieu essentiel minimum qui peuvent remplacer le DMEM le lendemain de la transfection. Comme indiqué ci-dessous, bien que le remplacement du milieu après la transfection par certains réactifs de transfection d’ADN soit facultatif, il peut être avantageux de modifier le milieu dans lequel les VLP sont libérés, en particulier pour limiter les traces sériques dans la préparation des particules. Cependant, la culture de cellules dans un milieu essentiel minimum sérique réduit la veille de la transfection n’a pas encore été tentée.
Comme mentionné, les nanolames sont produites lors de la surexpression d’un mélange de plasmides dans les cellules productrices. La surexpression semble être nécessaire pour une production optimale. En effet, ce laboratoire a développé une lignée cellulaire productrice où la construction exprimant Gag-Pol a été stabilisée par sélection d’antibiotiques ; cependant, ce système n’a pas réussi à produire des quantités importantes de Nanoblades. Une observation similaire a été faite lorsque la construction codant pour l’ARNg a été intégrée de manière stable dans le génome des cellules productrices. Comme décrit pour d’autres systèmes de production de particules, une lignée cellulaire stable exprimant au moins certaines constructions impliquées dans la production de Nanoblades peut être utile; cependant, cela nécessiterait certainement le traitement de grands volumes de surnageant et une technique appropriée pour purifier les particules. Le protocole ci-dessus décrit la procédure préférée pour produire des Nanolames qui exploitent des réactifs de transfection spécifiques (voir la Table des matériaux).
Bien que les réactifs de transfection d’autres fabricants aient également été testés avec succès, la grande majorité des résultats de ce groupe avec Nanoblades suivent la procédure décrite ici. Une transfection à faible coût peut être réalisée à l’aide de réactifs au phosphate de calcium et produire une bonne efficacité de production; cependant, cette méthode nécessite absolument le remplacement du milieu de transfection le lendemain de la transfection et peut laisser des résidus de phosphate de calcium dans la préparation de particules sédimentées. Conformément à la nécessité de niveaux d’expression élevés pour les composants nanolames dans les cellules productrices, on observe que la quantité d’ARNg associés à la protéine Cas9 peut être un facteur limitant pour une édition efficace du génome. Pour améliorer la charge en SGRNA, deux approches techniques ont été récemment développées par des groupes indépendants utilisant des vecteurs d’administration de protéines similaires aux Nanoblades. Ceux-ci reposent sur l’utilisation de l’expression cytoplasmique dépendante de la polymérase T7 de sgRNA6 ou par l’ajout d’un signal d’encapsidation rétrovirale à la séquence d’ARNg pour arbitrer la liaison à la polyprotéine Gag6. Ces approches pourraient en effet améliorer la charge d’ARNg dans les Nanoblades bien qu’elles n’aient pas encore été testées.
La transduction des cellules cibles est une étape critique de la procédure. Dans la plupart des lignées cellulaires immortalisées, la transduction avec Nanoblades a peu ou pas d’effet cytopathique. Cependant, dans les cellules primaires, la toxicité peut être un problème. La transduction doit donc être optimisée pour chaque type de cellule. Plus précisément, le temps d’exposition aux Nanoblades est un facteur important à modifier lors de l’optimisation du protocole de transduction. Pour les cellules sensibles telles que les neurones primaires ou les cellules de la moelle osseuse, 4 à 6 h d’incubation avec des Nanoblades avant de remplacer le milieu permettent une livraison efficace de la protéine Cas9 tout en minimisant la toxicité cellulaire. En outre, les adjuvants tels que les polymères cationiques, entre autres, peuvent améliorer considérablement l’efficacité de la transduction dans certaines cellules (voir la Table des matériaux). Il est important de noter que les Nanoblades sont des VLP et peuvent induire une réponse immunogène. Cela peut être une limitation si vous travaillez avec certains types de cellules primaires, telles que les macrophages ou les cellules dendritiques, dans lesquelles l’incubation avec des nanolames pourrait induire des changements importants dans l’expression des gènes et le phénotype des cellules. Si les macrophages et les cellules dendritiques sont dérivés de précurseurs de cellules souches hématopoïétiques (comme les cellules de moelle osseuse de souris), il est préférable de transduire les cellules avec les Nanolames avant qu’elles ne soient complètement différenciées pour éviter d’induire une réponse cellulaire contre les Nanolames. Sinon, l’électroporation de la protéine Cas9 pourrait représenter une alternative viable lorsque l’on travaille avec des cellules immunitaires différenciées.
Les nanolames peuvent être utilisées in vivo pour transduire des zygotes de souris ou des embryons afin de générer des animaux transgéniques. Semblables aux vecteurs rétroviraux ou lentiviraux classiques, ils peuvent également être injectés directement dans les tissus d’animaux adultes. Cependant, les nanolames (similaires aux vecteurs rétroviraux et lentiviraux) peuvent être inactivées par la réponse immunitaire de l’animal hôte; par conséquent, la dose à injecter doit être optimisée pour chaque application. Cette réponse immunitaire peut également limiter la distribution des VLP fonctionnels aux tissus proches du site d’injection. Enfin, contrairement aux vecteurs lentiviraux, les Nanoblades sont sans transgène et délivrent le Cas9 dans un délai restreint. Par conséquent, ils ne peuvent pas être utilisés pour effectuer des criblages fonctionnels à l’échelle du génome qui nécessitent un séquençage à haut débit des sgRNA lors de la sélection des cellules. Les nanolames sont utiles lorsqu’une édition rapide, dose-dépendante et sans transgène du génome est requise20. De plus, à l’instar de l’électroporation des protéines, les nanolames entraînent moins d’effets hors cible que l’expression prolongée de Cas9/sgRNA par transfection d’ADN ou vecteurs viraux classiques3. Le développement futur de Nanoblades est axé sur l’intégration de variantes Cas9 pour différentes applications technologiques telles que l’édition de base et le ciblage de l’ARN.
Disclosures
Philippe E. Mangeot et Emiliano P. Ricci sont désignés comme inventeurs sur un brevet relatif à la technologie Nanoblades (demandeurs de brevet : Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Supérieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex ; numéro de demande : WO 2017/068077 Al ; statut du brevet : publié, 27 avril 2017; tous les aspects du manuscrit sont couverts par la demande de brevet. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) de l’Université de Lyon, dans le cadre du programme Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) géré par l’Agence nationale Français de la recherche (ANR), la Fondation FINOVI, l’Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) et par le Conseil européen de la recherche (ERC-StG-LS6-805500 à E.P.R.) dans le cadre des programmes de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
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